KR102184867B1

KR102184867B1 - 산돌배나무 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102184867B1
Application number: KR1020180135841A
Authority: KR
Inventors: 박혜윤; 손연경; 김선여; 심원식; 조교희; 이욱주; 암나파르빈
Original assignee: 가천대학교 산학협력단; 대한민국(환경부 국립생물자원관장)
Priority date: 2018-11-07
Filing date: 2018-11-07
Publication date: 2020-12-02
Also published as: KR20200053048A

Abstract

본 발명은 산돌배나무 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 산돌배나무 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 세포 독성이 없으면서도 세포의 염증 관련 인자의 생성을 억제하고, 아토피 피부염 동물모델의 피부염 증상을 개선하므로, 아토피 피부염 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

산돌배나무 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising fraction of Pyrus ussuriensis extracts as an active ingredient}

본 발명은 산돌배나무 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

주로 환경적 요인에 의해 발생하는 아토피 피부염은 난치성 면역질환으로, 최근 발병율이 증가하고 있다. 이는 도시인들의 생활환경이 변화함에 따라 집 진드기, 먼지, 황사, 미세먼지, 꽃가루 등과 같이 면역 과민반응을 유발할 수 있는 다양한 알레르겐에 노출될 기회가 증가하기 때문이다.

일반적으로, 아토피 피부염은 림프구, 대식세포 및 과립화된 비만세포가 병변부위에 과하게 침투됨으로써, 환자의 혈액 내의 호산구 수 및 혈청 내의 면역글로불린 E(IgE)의 수준을 증가시킨다. 아토피 피부염은 유전적, 환경적, 약리학적 및 면역학적 요인들을 모두 포함하는 복잡한 발병기전을 가지나, 특히, 염증관련 인자인 산화질소(NO), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-1β(IL-1β) 등이 이에 관여한다.

아토피 피부염의 가장 적합한 치료제는 면역억제제이며, 그중에서도 스테로이드 제제가 주로 사용된다. 그러나 스테로이드 제제를 장기간 사용하면 피부 위축과 같은 다양한 부작용을 유발시켜 더욱 안전하고 효과적인 약물의 개발이 요구되고 있다. 이에, 최근에는 천연물의 추출물을 이용하여 아토피 피부염을 치료하기 위한 연구가 증가하고 있다.

한편, 한국에는 크게 돌배나무(Pyrus pyrifolia Nakai), 산돌배나무(Pyrus ussuriensis Maximowicz) 및 콩배나무(Pyrus calleryana)의 3종류의 배나무가 분포한다. 이중에서, 돌배나무 및 산돌배나무가 널리 분포되어 있다. 특히, 돌배나무는 남부지방에 일부 한정적으로 분포되어 있으나, 산돌배나무는 전국에, 주로 북부지방에 분포되어 있다. 상기 돌배나무, 산돌배나무 및 콩배나무는 장미과에 속하는 낙엽교목이다.

예로부터 산돌배나무의 열매는 구토, 개선(疥癬) 및 고열의 치료에 사용되었다. 이의 성분으로서는 줄기로부터 분리된 플라보노이드가 보고되어 있다(Pavlii and Makarova, 1968). 이와 관련하여, 대한민국 특허공개 제2012-24262호는 산돌배나무 추출물의 항산화 용도를 개시하고 있다.

한편, 돌배나무의 열매는 산리(山梨)라 불리며, 갈증해소, 변비, 구토, 기침 등의 치료에 사용되었다. 그러나, 콩배나무의 약리학적 효과에 관한 연구는 미비한 실정이다.

대한민국 특허공개 제2012-24262호

본 발명의 목적은 산돌배나무 추출물의 분획물의 아토피 피부염 치료 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산돌배나무 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 산돌배나무 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 산돌배나무 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 산돌배나무 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 피부외용제를 제공한다.

본 발명의 산돌배나무 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 세포 독성이 없으면서도 세포의 염증 관련 인자의 생성을 억제하고, 아토피 피부염 동물모델의 피부염 증상을 개선하므로, 아토피 피부염 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 산돌배나무 잎 추출물, 이의 분획물 및 이의 소분획물의 제조 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 대식세포주 RAW264.7 세포주에서 산돌배나무 잎 추출물(Total) 및 이의 에틸아세테이트 분획물(EA)의 세포독성을 확인한 그래프이다.
도 3은 인간각질형성세포주 HaCaT 세포주에서 산돌배나무 잎 추출물(Total) 또는 이의 에틸아세테이트 분획물(EA)의 세포독성을 평가한 결과이다.
도 4는 대식세포주 RAW264.7 세포주에서 산돌배나무 잎 추출물(total), 이의 헥산 분획물(hexane), 클로로포름 분획물(chloroform), 에틸아세테이트 분획물(ethyl acetate), 부탄올 분획물(butanol) 및 물 분획물(water)의 NO 억제 효과를 평가한 결과이다.
도 5는 대식세포주 RAW264.7 세포주에서 산돌배나무 잎 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 14개의 소분획물로 분리하고, 분리한 소분획물의 NO 억제 효과를 평가한 결과이다.
도 6은 산돌배나무 잎 추출물(total) 및 이의 에틸아세테이트 분획물(EA)의 염증관련 인자(IL-6 및 IL-1β)의 생성 억제 효과를 평가한 결과이다.
도 7은 아토피 피부염 동물모델에 산돌배나무 잎 추출물 또는 이의 에틸아세테이트 분획물을 처리하는 일정을 나타낸 도이다.
도 8은 아토피 피부염 동물모델에서 산돌배나무 잎 추출물(total extract) 또는 이의 에틸아세테이트 분획물(ethyl acetate) 처리에 따른 긁는 횟수를 평가한 결과이다.
도 9는 아토피 피부염 동물모델에 산돌배나무 잎 추출물(total extract) 또는 이의 에틸아세테이트 분획물(ethyl acetate) 처리한 지 4일 째에 시간에 따른 긁는 횟수를 평가한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 산돌배나무 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 산돌배나무 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다:

1) 산돌배나무에 추출 용매를 가하여 추출하는 단계;

2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계; 및

3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하는 단계.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 산돌배나무는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한없이 사용할 수 있다.

상기 제조방법에서, 산돌배나무는 산돌배나무의 잎, 줄기 및 열매로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 구체적으로, 산돌배나무는 산돌배나무의 잎일 수 있다.

또한, 상기 단계 1)의 추출 용매는 물, C₁ 내지 C₂의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매일 수 있다. 상기 C₁ 내지 C₂의 저급 알코올은 메탄올 또는 에탄올일 수 있고, 구체적으로, 에탄올일 수 있으며, 더 구체적으로 70% 에탄올일 수 있다.

상기 단계 1)의 추출 방법은 진탕추출, Soxhlet 추출 또는 환류추출일 수 있다. 이때, 추출 온도는 15 내지 35℃일 수 있고, 구체적으로 17 내지 33℃, 더 구체적으로 20 내지 30℃, 더 구체적으로 22 내지 28℃일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 또한, 상기 추출 용매는 추출에 사용되는 산돌배나무의 중량 1 g 당 5 내지 15 ㎖의 양으로 첨가될 수 있고, 구체적으로, 8 내지 12 ㎖의 양으로 첨가될 수 있고, 더 구체적으로, 9 내지 11 ㎖의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 추출 시간은 12 내지 36시간일 수 있고, 구체적으로 15 내지 33시간일 수 있고, 더 구체적으로 18 내지 30시간일 수 있고, 더 구체적으로 20 내지 28시간일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 아울러, 추출 횟수는 1 내지 5회일 수 있고, 구체적으로 1 내지 3회일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출 온도, 추출 시간 또는 추출 횟수의 조건을 벗어난 범위에서는 추출이 충분히 이루어지지 않아 산돌배나무 추출물 내에 유효성분의 함량이 미미할 수 있다. 또는 더 이상 추출 수율이 증가하지 않아 추출 작업의 효율이 떨어질 수 있다.

상기 단계 3)의 감압 농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용할 수 있다. 또한, 상기 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조일 수 있다.

상기 산돌배나무 추출물의 분획물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다.

1) 산돌배나무에 추출 용매를 가하여 산돌배나무 추출물을 수득하는 단계; 및

2) 단계 1)의 추출물을 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 분획물을 얻는 단계.

상기 단계 1)의 산돌배나무 추출물은 상술한 방법을 수행하여 얻을 수 있다.

구체적으로, 상기 분획물은 상기 단계 1)에서 얻은 산돌배나무 추출물을 용매에 현탁시킨 후, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올을 순차적으로 첨가하여 각각의 층을 분리한 다음, 각 층을 감압 농축 및 건조시켜 각 분획물을 수득하는 것이 바람직하다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 산돌배나무 잎 추출물을 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 얻은 에틸아세테이트 분획물(10, 50 ㎍/㎖)은 대식세포 및 인간각질형성세포에서 세포 독성을 나타내지 않음을 확인하였다 (도 2 및 3 참조).

또한, 본 발명자들은 산돌배나무 잎 추출물의 에틸아세테이트 분획물이 NO의 생성을 억제하고 염증관련 인자의 생성을 억제함을 확인하였다 (도 4 내지 도 6 참조).

또한, 본 발명자들은 산돌배나무 잎 추출물의 에틸아세테이트 분획물이 아토피 피부염 동물모델의 아토피 피부염 증상을 개선함을 확인하였다 (도 7 내지 도 9 참조).

따라서, 본 발명의 산돌배나무 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 아토피 피부염 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 산돌배나무 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 담체는 Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등과 같은 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

상기 조성물을 제제화하는 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 첨가할 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구용 제제 또는 비경구용 제제로 제형화될 수 있다. 경구용 제제로는 고형 제제 및 액상 제제가 포함될 수 있다. 상기 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 또는 트로키제일 수 있고, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제를 첨가하여 조제할 수 있다. 상기 부형제는 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 윤활제를 포함할 수 있고, 그 예로는 마그네슘 스티레이트, 탈크등이 있다. 한편, 상기 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제일 수 있다. 이때, 상기 액상 제제에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.

상기 비경구용 제제는 주사제, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 파우더 및 크림 등을 포함할 수 있다. 상기 주사제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등을 포함할 수 있다. 이때, 비수성용제 또는 현탁용제로서는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름이나, 에틸올레이트와 같이 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내 또는 흉부내 주사 방식을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.0001 내지 100 ㎎/㎏, 구체적으로 0.001 내지 10 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회 수회일 수 있다.

본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.

본 발명에 따른 산돌배나무 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 상기 서술한 바와 같다. 일례로, 상기 산돌배나무 추출물은 물, C₁ 내지 C₂의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출될 수 있다. 상기 C₁ 내지 C₂의 저급 알코올은 메탄올 또는 에탄올일 수 있고, 구체적으로, 에탄올일 수 있으며, 더 구체적으로 70% 에탄올일 수 있다. 상기 에틸아세테이트 분획물은 산돌배나무 추출물을 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 얻은 분획물 중 에틸아세테이트 분획물일 수 있다.

상기 산돌배나무는 산돌배나무의 잎, 줄기 및 열매로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 구체적으로, 산돌배나무는 산돌배나무의 잎일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 산돌배나무 잎 추출물의 에틸아세테이트 분획물(10, 50 ㎍/㎖)은 대식세포 및 인간각질형성세포에서 세포 독성을 나타내지 않으면서도 NO의 생성 및 염증관련 인자의 생성을 억제하고, 아토피 피부염 동물모델의 아토피 피부염 증상을 개선함을 확인하였다 (도 2 내지 도 9 참조). 따라서, 본 발명의 산돌배나무 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 아토피 피부염 개선에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있다. 이때, 첨가되는 유효성분의 함량은 목적에 따라 결정될 수 있고, 일반적으로는 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부일 수 있다.

건강기능식품의 형태 및 종류는 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환의 형태일 수 있다. 상기 건강기능식품은 추가성분으로서 여러 가지 향미제, 감미제 또는 천연 탄수화물을 포함할 수 있다. 상기 감미제는 천연 또는 합성 감미제일 수 있고, 천연 감미제의 예로는 타우마틴, 스테비아 추출물 등이 있다. 한편, 합성 감미제의 예로는 사카린, 아스파르탐 등이 있다. 또한, 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 올리고당 및 당알코올 등일 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 상기 서술한 추가성분 외에, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙스탄 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등을 더 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물의 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 산돌배나무 잎 추출물의 에틸아세테이트 분획물(10, 50 ㎍/㎖)은 대식세포 및 인간각질형성세포에서 세포 독성을 나타내지 않으면서도 NO의 생성 및 염증관련 인자의 생성을 억제하고, 아토피 피부염 동물모델의 아토피 피부염 증상을 개선함을 확인하였다 (도 2 내지 도 9 참조). 따라서, 본 발명의 산돌배나무 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 아토피 피부염 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 상기 산돌배나무 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 0.1 내지 50 중량%, 구체적으로 1 내지 10 중량%로 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물은 아토피 피부염의 개선을 목적으로 피부에 직접 도포될 수 있다.

화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 화장료 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 크림, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있다. 구체적으로는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 하이드록시드, 칼슘 실리케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 특히, 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하이드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체로서 용매, 용매화제, 유탁화제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 이의 예로는, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜, 소르비탄 지방산 에스테르 등이 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미세결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라가칸트 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르설페이드, 알칼아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체, 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 담체 성분 이외에도, 보조제로서 항산화제, 안정화제, 용해화제, 보습제, 안료, 향료, 자외선 차단제, 발색제, 계면활성제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 상기 보조제는 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 물질이라면 모두 사용가능하다.

본 발명의 피부외용제는 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제를 포함할 수 있다. 상기 담체 및 부형제는 방부제, 안정화제, 수화제, 유화 촉진제 및 완충제 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 부형제는 유당, 덱스트린, 전분, 만니톨, 소르비톨, 글루코스, 사카로스, 미세결정 셀룰로스, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 또는 이의 혼합물일 수 있다. 상기 피부외용제는 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 적절히 제조될 수 있다. 상기 피부외용제는 파우더, 젤, 연고, 크림, 액체 및 에어로졸의 형태로 제조될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 산돌배나무 잎 추출물 및 그의 분획물의 제조

먼저, 산돌배나무(강원도, 대한민국)의 잎을 분쇄하였다. 상기 잎의 분쇄물 5 kg에 5 ℓ의 70% 에탄올을 첨가하여 실온에서 24시간 동안 침지시킨 후, 여과하여 산돌배나무의 잎 추출물(525 g)을 제조하였다. 분별 깔대기에 제조된 추출물과 헥산을 1:1로 혼합한 후 헥산 분획물(55 g)을 분리하였으며, 남은 분획물에 클로로포름을 1:1로 혼합한 후 클로로포름분획물(23 g)을 분리하였다. 동일한 방법으로, 남은 분획물에 에틸아세테이트를 1:1로 혼합한 후 에틸아세테이트 분획물(41 g)을 분리하였고, 남은 분획물에 부탄올을 1:1로 혼합한 후 부탄올 분획물(5 g)과 물 분획물(287 g)을 얻었다. 제조된 분획물을 여과, 농축하여 동결건조 파우더로 만들어 4℃에 냉장 보관하여 실험에 사용하였다.

< 실시예 2> 산돌배나무 잎의 에틸아세테이트 분획물의 소분획물 제조

상기 실시예 1에서 제조한 에틸아세테이트 분획물로부터 소분획물을 제조하였다.

구체적으로, 세파덱스 충진제를 넣은 오픈컬럼에 실시예 1에서 제조한 에틸아세테이트 분획물(41 g)을 넣고, 이동상인 메탄올(10% 내지 100%)의 양을 증가시켜가면서 첨가하였다. 받아진 분획물을 TLC(thin layer chromatograph)로 확인하여 같은 패턴을 보이는 분획물을 순차적으로 합쳐 14개의 소분획물을 얻었으며, 각 소분획물의 번호는 분획물이 받아진 순서대로 정하였다.

< 실험예 1> 산돌배나무 잎의 에틸아세테이트 분획물의 세포독성 확인

상기 실시예 1에서 제조한 산돌배나무 잎의 에틸아세테이트 분획물의 세포독성을 MTT 분석을 이용하여 확인하였다.

먼저, 대식세포주인 RAW264.7 세포주를 10% FBS, 1% 페니실린 및 1% 스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지에 배양하여 준비하였다. 준비된 세포를 웰 당 5x10⁵개가 되도록 96웰 플레이트에 분주하고, 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 24시간 동안 배양하였다. 배양한 세포에 LPS를 10 ng/㎖ 의 농도로 처리한 후, 30분 뒤에 산돌배나무 잎의 에틸아세테이트 분획물을 농도별(1, 10 또는 25 ㎍/㎖)로 첨가하고 상기와 동일한 조건에서 배양하였다. 24시간 후, 배양한 세포의 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척한 뒤, 0.1 ㎍/㎖의 MTT 시약(Sigma, 미국)을 첨가하였다. 이를 상기와 같은 조건하에서 4시간 동안 반응시킨 뒤, MTT 시약을 제거하고 DMSO를 첨가하여 동일한 조건하에서 30분 동안 두었다. 반응이 끝난 세포를 마이크로스펙트로포토미터를 이용하여 540 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정한 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 대부분의 산돌배나무 잎의 에틸아세테이트 분획물은 1, 10 또는 25 ㎍/㎖의 농도에서도 대식세포주에서 세포독성을 나타내지 않았다.

한편, 인간각질형성세포주인 HaCaT 세포주를 10% FBS, 1% 페니실린 및 1% 스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지에 배양하여 준비하였다. 준비된 세포를 웰 당 5x10⁵개가 되도록 96웰 플레이트에 분주하고, 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 24시간 동안 배양하였다. 배양한 세포에 산돌배나무 잎의 에틸아세테이트 분획물을 농도별(10, 50 또는 100 ㎍/㎖)로 첨가하고 1시간 후, 10 ng/㎖의 TNF-α를 처리하여 상기와 동일한 조건에서 배양하였다. 18시간 후, 배양한 세포의 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척한 뒤, 0.1 ㎍/㎖의 MTT 시약(Sigma, 미국)을 첨가하였다. 이를 상기와 같은 조건하에서 4시간 동안 반응시킨 뒤, MTT 시약을 제거하고 DMSO를 첨가하여 동일한 조건하에서 30분 동안 두었다. 반응이 끝난 세포를 마이크로스펙트로포토미터를 이용하여 540 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정한 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 산돌배나무 잎의 에틸아세테이트 분획물 10, 50 ㎍/㎖의 농도에서도 인간각질형성세포주에서 세포독성을 나타내지 않았다.

< 실험예 2> 산돌배나무 잎 분획물 및 그 소분획물의 염증억제 효과 확인

상기 실시예 1 내지 2에서 제조한 산돌배나무 잎의 분획물 및 그 소분획물이 염증관련 인자의 생성에 미치는 영향을 확인하였다.

<2-1> 산화질소(NO) 억제 효과 확인

먼저, RAW264.7 세포주를 실시예 1과 같은 조건으로 배양하여 준비하였다. 준비된 세포를 웰 당 2x10⁵개가 되도록 48웰 플레이트에 분주하고, 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 24시간 동안 배양하였다. 배양한 세포에 산돌배나무 잎의 분획물 또는 그 소분획물을 농도별(1, 10, 25 ㎍/㎖)로 첨가하고 상기와 동일한 조건에서 배양하였다. 이때, 대조군은 아무것도 첨가하지 않았다. 1시간 후, 상기 세포에 1 ㎍/㎖의 리포폴리사카라이드(LPS)를 첨가하고, 동일한 조건에서 24시간을 더 배양하였다. 50 ㎕의 배양된 세포의 배양액에 50 ㎕의 Griess 시약(Sigma, 미국)을 첨가한 뒤, 540 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정한 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.

도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, 산돌배나무 잎의 분획물 또는 그 소분획물이 유의적으로 NO의 생성을 억제하였으며, 산돌배나무 잎 분획물 중 에틸아세테이트 분획물의 NO 생성 억제 효과가 가장 우수하였고, 소분획물 중 6번 및 13번 소분획물의 NO 생성 억제 효과가 우수하였다.

<2-2> 염증관련 인자 억제 효과 확인

산돌배나무 잎 에틸아세테이트 분획물이 염증 관련 인자인 IL-6 및 IL-1β의 발현을 억제하는지 여부를 ELISA를 통해 하기와 같은 방법으로 확인하였다.

먼저, HaCaT 세포주를 실시예 1과 같은 조건으로 배양하여 준비하였다. 준비된 세포를 웰 당 2x10⁵개가 되도록 48웰 플레이트에 분주하고, 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 24시간 동안 배양하였다. 배양한 세포에 산돌배나무 잎의 분획물 및 그 소분획물을 농도별(1, 10, 25 또는 100 ㎍/㎖)로 첨가하고 상기와 동일한 조건에서 배양하였다. 이때, 대조군은 아무것도 첨가하지 않았다. 1시간 후, 상기 세포에 10 ng/㎖의 TNF-α를 처리하고, 동일한 조건에서 18시간을 더 배양하였다. 배양된 세포의 배양액을 사용하여 IL-6 및 IL-1β의 양을 ELISA 키트(R&D system, 미국)를 사용하여 제조사의 프로토콜대로 수행하여, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 산돌배나무 잎의 에틸아세테이트 분획물이 농도의존적으로 IL-6 및 IL-1β의 발현을 억제하였다.

< 실험예 3> 산돌배나무 잎 분획물 및 그 유효물질의 아토피 피부염 개선 효과 확인

상기 실시예 1에서 제조한 산돌배나무 잎의 추출물 및 이의 에틸아세테이트 분획물의 아토피성 피부염 치료 효과를 아토피 피부염 동물모델을 사용하여 확인하였다.

먼저, 오리엔트바이오에서 구입한 6주령의 수컷 ICR 마우스를 일주일에 순화과정(acclimation period)을 거치고, 산돌배나무 잎 추출물 또는 이의 에틸아세테이트 분획물을 주사하기 3일 전에 마우스의 등을 제모하였다. 실시예 1에서 제조한 산돌배나무 잎 추출물 또는 이의 에틸아세테이트 분획물을 제모한 지 3일 후인 날(1일차)에 마우스에 200 mg/kg의 용량으로 복강내 주사(intraperitoneal injection)하였다. 동일한 방법으로 4일차, 11일차, 18일차에 산돌배나무 잎 추출물 또는 이의 에틸아세테이트 분획물을 투여하였다.

30분 후 0.15%의 DNFB(1-chloro 2,4-dinitrobenzene, Aldrich, 미국) 150 ㎕를 등에 도포하여 가려움증을 유발하였다. 산돌배나무 잎 추출물 또는 분획물 처리한 지 27일째 되는 날에 각각 가려움증으로 인한 환부 긁는 횟수를 측정하였다. 긁는 횟수 측정은 마우스에 10분 동안 적응기간을 준 다음 30분 동안의 긁는 횟수를 측정한 것이다. 대조군은 DNFB만 도포한 그룹이다.

그 결과, 산돌배나무 잎의 에틸아세테이트 분획물은 아토피 피부염 마우스 모델의 가려움증을 현저하게 완화시켰다(도 8). 또한, 산돌배나무 잎의 에틸아세테이트 분획물을 처리한 지 4일차에, 아토피 피부염 동물 모델은 투여 15분부터 가려움증으로 인한 환부 긁는 횟수가 줄어드는 것으로 나타났다(도 9).

Claims

산돌배나무 에탄올 추출물을 헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 순차적으로 분획하여 얻은 분획물 중 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이되, 상기 에틸아세테이트 분획물은
1) 산돌배나무의 잎, 줄기 및 열매로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 분쇄물에 에탄올을 첨가하여 침지시킨 후, 여과하여 산돌배나무 추출물을 제조하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물과 헥산을 1:1로 혼합한 후 헥산 분획물을 분리하는 단계;
3) 단계 2)에서 남은 분획물에 클로로포름을 1:1로 혼합한 후 클로로포름을 분리하는 단계; 및
4) 단계 3)에서 남은 분획물에 에틸아세테이트를 1:1로 혼합한 후 에틸아세테이트 분획물을 분리하는 단계;로 분획되는 것을 특징으로 하는, 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 산돌배나무는 산돌배나무의 잎인, 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
산돌배나무 에탄올 추출물을 헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 순차적으로 분획하여 얻은 분획물 중 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 건강기능식품이되, 상기 에틸아세테이트 분획물은
1) 산돌배나무의 잎, 줄기 및 열매로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 분쇄물에 에탄올을 첨가하여 침지시킨 후, 여과하여 산돌배나무 추출물을 제조하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물과 헥산을 1:1로 혼합한 후 헥산 분획물을 분리하는 단계;
3) 단계 2)에서 남은 분획물에 클로로포름을 1:1로 혼합한 후 클로로포름을 분리하는 단계; 및
4) 단계 3)에서 남은 분획물에 에틸아세테이트를 1:1로 혼합한 후 에틸아세테이트 분획물을 분리하는 단계;로 분획되는 것을 특징으로 하는, 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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산돌배나무 에탄올 추출물을 헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 순차적으로 분획하여 얻은 분획물 중 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 화장료 조성물이되, 상기 에틸아세테이트 분획물은
1) 산돌배나무의 잎, 줄기 및 열매로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 분쇄물에 에탄올을 첨가하여 침지시킨 후, 여과하여 산돌배나무 추출물을 제조하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물과 헥산을 1:1로 혼합한 후 헥산 분획물을 분리하는 단계;
3) 단계 2)에서 남은 분획물에 클로로포름을 1:1로 혼합한 후 클로로포름을 분리하는 단계; 및
4) 단계 3)에서 남은 분획물에 에틸아세테이트를 1:1로 혼합한 후 에틸아세테이트 분획물을 분리하는 단계;로 분획되는 것을 특징으로 하는, 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
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산돌배나무 에탄올 추출물을 헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 순차적으로 분획하여 얻은 분획물 중 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 피부외용제이되, 상기 에틸아세테이트 분획물은
1) 산돌배나무의 잎, 줄기 및 열매로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 분쇄물에 에탄올을 첨가하여 침지시킨 후, 여과하여 산돌배나무 추출물을 제조하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물과 헥산을 1:1로 혼합한 후 헥산 분획물을 분리하는 단계;
3) 단계 2)에서 남은 분획물에 클로로포름을 1:1로 혼합한 후 클로로포름을 분리하는 단계; 및
4) 단계 3)에서 남은 분획물에 에틸아세테이트를 1:1로 혼합한 후 에틸아세테이트 분획물을 분리하는 단계;로 분획되는 것을 특징으로 하는, 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 피부외용제.
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