KR102173789B1

KR102173789B1 - 탈티렐린 및 이의 중간체의 신규한 제조방법

Info

Publication number: KR102173789B1
Application number: KR1020180174132A
Authority: KR
Inventors: 김병수; 최혁; 주소경; 노현철; 김미정; 김완주
Original assignee: 주식회사 메디포럼제약
Priority date: 2018-12-31
Filing date: 2018-12-31
Publication date: 2020-11-03
Also published as: KR20200082987A

Abstract

본 발명에서는 탈티렐린 및 이의 중간체의 신규한 제조방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 Fmoc(플루오레닐메톡시카르보닐)-트리틸(trityl)-히스티딘을 출발물질로 사용하고 인시츄(In situ) 반응으로 탈티렐린 중간체인 히스티딜-트리틸-프롤린아미드를 제조하는 공정을 거쳐 탈티렐린을 제조함으로써, 종래의 기술 대비하여 단시간에 고수율·고순도로 탈티렐린을 제조할 수 있어 산업적 대량 생산에 적합한 제조방법 및 이를 위한 히스티딜-트리틸-프롤린아미드의 제조방법이 개시된다.

Description

탈티렐린 및 이의 중간체의 신규한 제조방법 {Novel Process for Preparing Taltirelin and Its Intermediates}

본 발명은 탈티렐린 및 이의 중간체의 신규한 제조방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 Fmoc(플루오레닐메톡시카르보닐)-트리틸(trityl)-히스티딘을 출발물질로 사용하고 인시츄(In situ) 반응으로 탈티렐린 중간체인 히스티딜-트리틸-프롤린아미드를 제조하는 공정을 거쳐 탈티렐린을 제조함으로써, 종래의 기술 대비하여 훨씬 단시간에 고수율·고순도로 탈티렐린을 제조할 수 있어 산업적 대량 생산에 적합한 제조방법 및 이를 위한 히스티딜-트리틸-프롤린아미드의 제조방법에 관한 것이다.

탈티렐린 (Taltirelin; N-[[(4S)-Hexahydro-1-methyl-2,6-dioxo-4-pyrimidin yl]carbonyl]-L-histidyl-L-prolinamide)은 트롬빈-방출 호르몬(thyrotropin-releasing hormone; TRH) 유사체로서, TRH의 생리작용을 모방하면서 훨씬 더 긴 반감기 및 효과의 지속기간을 가지고 장기 투여에 따른 내성 발생이 거의 없다. 탈티렐린은 척수소뇌변성증(spinocerebellar degeneration)의 경구용 치료제로 사용되고 있으며, 척수성 근위축증과 같은 신경퇴행성 질환에도 효용성이 밝혀지고 있다.

탈티렐린의 API(Active Pharmaceutical Ingredient)는 탈티렐린 수화물(taltirelin hydrate)이며 α-형의 결정형을 갖는 것으로 알려져 있다 (Chemical engineering Journal 75 (1999), 193-200).

종래 개발된 탈티렐린의 제조방법은 비효율적이고 낮은 생산성으로 산업적 대량생산에 적용하기에는 한계가 있었다. 그 일례로 유럽공개특허 EP168042A에 개시된 탈티렐린의 제조방법은 세 개의 반응공정을 거치는데, 커플링 반응시 사용되는 DCC(dicyclohexylcarbodiimide)는 공정중 라세미화 반응으로 인해 광학순도가 떨어지고, 보호기 없이 반응시켜 불순물이 다량으로 발생하여 복잡한 정제 공정을 거쳐야하기 때문에 장시간이 소요되고(임율이 높고) 수율이 현저히 떨어지는 문제점이 있었다. 대안으로 고순도의 탈티렐린을 제조할 수 있는 고체상 합성법이 개발되었으나(공개특허 2012-0055840호), 사용되는 중간체가 상업적으로 유용하지 않으며 prep-HPLC를 사용하여 정제해야 하므로 산업적 대량생산에는 적용할 수 없었다.

따라서 산업적 대량생산에 적용가능한 액체상 제조방법으로써 단시간에 고수율·고순도로 탈티렐린을 제조할 수 있는 새로운 제조방법의 개발이 당업계에 절실히 요구되어 왔다.

이에 본 발명자들은 종래기술의 문제점들을 해결하고자 연구를 지속한 결과, Fmoc-트리틸-히스티딘을 출발물질로 사용하고 인시츄 반응으로 탈티렐린 중간체인 히스티딜-트리틸-프롤린아미드를 제조하는 공정을 개발하고, 이 중간체를 이용하여 제조시간을 단축하여 종래의 기술 대비하여 단시간(50% 이하)에 고수율·고순도로 탈티렐린을 제조할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 Fmoc-트리틸-히스티딘을 출발물질로 사용하고 인시츄 반응으로 탈티렐린 중간체인 히스티딜-트리틸-프롤린아미드를 제조하는 공정을 이용하여 단시간에 고수율·고순도로 탈티렐린을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 Fmoc-트리틸-히스티딘으로부터 인시츄 반응으로 탈티렐린 중간체인 히스티딜-트리틸-프롤린아미드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

ⅰ) 화학식 1의 Fmoc-트리틸(Trt)-히스티딘과 화학식 2의 프롤린아미드를 용매 메틸렌클로라이드 하에 순차적으로 커플링제 및 탈보호제를 사용하는 인시츄 반응을 진행하여 커플링과 탈보호(Fmoc-)하여 화학식 3의 히스티딜-트리틸-프롤린아미드를 얻는 단계;

ⅱ) 화학식 3의 히스티딜-트리틸-프롤린아미드를 화학식 4의 1-메틸-4,5-디히드로오로트산과 커플링하여 화학식 5의 트리틸-탈티렐린을 얻는 단계; 및

ⅲ) 트리플루오르아세트산 또는 염산을 사용하여 화학식 5의 트리틸-탈티렐린의 트리틸 보호기를 제거하여 화학식 6의 탈티렐린을 얻는 단계;

를 포함하는 탈티렐린의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 탈티렐린의 제조방법은, 필요에 따라서, ⅳ) 화학식 6의 탈티렐린을 물에서 재결정하여 화학식 7의 탈티렐린 4수화물로 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

상기 화학식에서 Fmoc은 플루오레닐메톡시카르보닐(9H-fluoren-9-yl methoxycarbonyl)을 나타내고; Trt는 트리페닐메틸(triphenylmethyl; (C₆H₅)₃-C-)을 나타낸다.

본 발명에 따른 탈티렐린의 제조방법은 개략적으로 나타내면 다음 반응식 1과 같다:

[반응식 1]

단계 i): 히스티딜-트리틸-프롤린아미드의 인시츄 제조

화학식 1의 Fmoc-트리틸(Trt)-히스티딘과 화학식 2의 프롤린아미드를 용매 메틸렌클로라이드 하에 순차적으로 커플링제 및 탈보호제를 사용하는 인시츄 반응을 진행하여 커플링과 탈보호(Fmoc-)하여 중간체인 화학식 3의 히스티딜-트리틸-프롤린아미드를 얻는다.

단계 i)에서 사용되는 용매는 메틸렌클로라이드(MC)이다. 메틸렌클로라이드는 커플링 반응과 탈보호(Fmoc-) 반응 모두의 용매로 작용할 수 있어서 인시츄 제조가 가능하다.

용매로 MC를 사용시 커플링 반응 후에 별도의 워크업(work-up) 과정 없이 탈보호(Fmoc-) 반응을 바로 진행할 수 있어 화학식 3의 중간체를 단시간에 손쉽게 제조할 수 있다. 또한 본 방법으로 생성되는 화학식 3의 중간체는 불순물의 함량이 낮고, 결정화가 용이하다 (표 1).

커플링 및 탈보호(Fmoc) 인시츄 반응 농도는 Fmoc-트리틸-히스티딘 중량 대비 MC의 중량이 5 ~ 20배인 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 5 ~ 10배 이다. MC를 5배 미만으로 사용하면, 탈보호(Fmoc-) 반응 시 불순물의 생성이 많아 질 수 있다.

상기 커플링제로는 바람직하게는 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(피롤이디노)-포스포니움 헥사플루오로포스페이트 (Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(pyrrolidino)-phosphonium hexafluorophos-phate: PyBOP), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포니움 헥사플루오로포스페이트 (Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluoro-phosphate: BOP), 트리스(디메틸아미노)(3H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-일옥시)포스포러스 헥사플루오로포스페이트 (Tris(dimethylamino)(3H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridin-3-yloxy) phosphorus hexafluorophosphate; AOP), (7-아자벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤이디노포스니움 헥사플루오로포스페이트 ((7-Azabenzotriazol-1-yloxy)tri- pyrrolidinophosphonium hexafluorophos-phate; PyAop), 2-(7-아자-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트 (2-(7-Aza-1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyl-uroniumhexa-fluorophosphate; HATU), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트 (2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate; HBTU) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 PyBOP이 사용된다. 상기 커플링제는 화학식 1의 Fmoc-트리틸-히스티딘 1.0 당량에 대하여 1.0 ~ 1.5 당량을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 1.0 ~ 1.2 당량을 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 1.2 당량을 사용한다.

상기 커플링 반응은 0 ~ 30℃의 온도조건에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 10 ~ 25℃ 이다. 반응 시간은 10 ~ 24시간일 수 있고 바람직하게는 10 ~ 17시간이다.

반응속도를 증가시키기 위해서 염기를 첨가할 수 있으며, 사용가능한 염기로는 N-메틸모폴린, 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민 (Diisopropylethyl-amine), 피리딘 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 N-메틸모폴린이다. 염기 첨가량은 화학식 1의 Fmoc-트리틸-히스티딘 1.0 당량에 대하여 1.0 내지 2.0 당량으로 사용될 수 있으며, 바람직하게는 1.0 내지 1.5 당량, 가장 바람직하게는 1.5 당량을 사용한다.

상기 Fmoc 탈보호제는 바람직하게는 피페리딘, 시클로헥실아민, 에탄올아민, 피페라진, sec-부틸아민, tert-부틸아민, 트리에틸아민 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 피페리딘이 사용된다. 상기 탈보호제는 화학식 1의 Fmoc-트리틸-히스티딘 1.0 당량에 대하여 5 ~ 10 당량을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 6 ~ 8 당량을 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 8 당량을 사용한다.

상기 탈보호 반응은 0 ~ 15 ℃의 온도조건에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 5 ~ 10℃ 이다. 반응 시간은 0.5 ~ 3 시간일 수 있고 바람직하게는 1 ~ 2 시간이다.

단계 i)에서 반응 종료 후, 화학식 3의 중간체는 추출, 결정화, 용매제거, 여과, 세척, 건조를 통한 워크업(work-up)을 통해 수득될 수 있으며, 그 후 별도의 정제 없이 다음 단계에 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서 중간체들 또는 최종 목적화합물의 추출, 결정화, 용매제거, 여과, 세척, 건조는 이 기술분야에서 통상적으로 사용하는 방법으로 수행될 수 있다.

본 발명에 있어서 중간체들 또는 최종 목적화합물의 결정화는 이 기술분야에서 통상적으로 사용하는 방법(예컨대, 침전 및 결정 형성 방식)을 통하여 수행될 수 있다, 예를 들면, 반응 종료 후 통상적인 추출 방법을 통해 얻어진 조(crude) 화합물에 대하여 결정화 용매(solvent)를 사용하여 침전을 형성시키는 방법으로 워크업(work-up) 할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 상기 결정화 용매로는 메틸터틸 부틸에테르, 석유에테르, 이소프로필에테르, 디에틸에테르 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 위와 같은 방법으로 침전을 생성시킨 후 이것을 여과, 건조하여 결정을 수득할 수 있다.

단계 ⅱ): 트리틸 - 탈티렐린 제조

화학식 3의 히스티딜-트리틸-프롤린아미드를 화학식 4의 1-메틸-4,5-디히드로오로트산과 커플링하여 화학식 5의 트리틸-탈티렐린을 얻는다.

상기 커플링을 위해 사용될 수 있는 커플링제로는 화학식 4의 1-메틸-4,5-디히드로오로트산 내 카르보닐기의 히드록시를 치환시킬 수 있는 시약이면 사용될 수 있으며, 바람직하게는 PyBOP, Bop, AOP, PyAop, HATU, HBTU 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 PyBOP 이다.

상기 커플링제는 화학식 4의 1-메틸-4,5-디히드로오로트산 1.0 당량에 대하여 0.8 내지 2.0당량을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 0.9 내지 1.5당량을 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 1.0 당량을 사용한다.

반응 속도를 증가시키기 위해 사용가능한 염기로는 N-메틸모폴린, 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민(Diisopropylethylamine), 피리딘 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 N-메틸모폴린이다. 염기 첨가량은 화학식 4의 1-메틸-4,5-디히드로오로트산 1.0 당량에 대하여 0.5 내지 2.0 당량으로 사용될 수 있으며, 바람직하게는 0.9 내지 1.5당량, 가장 바람직하게는 1.0당량을 사용한다.

상기 커플링 반응 용매로는 테트라히드로퓨란, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴, 에틸아세테이트 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 에틸아세테이트이다.

반응 온도는 0 ~ 30℃에서 실시가능하나 5 ~ 25℃에서 수행하는 것이 바람직하다. 반응 시간은 2 ~ 8 시간일 수 있고 바람직하게는 2 ~ 4시간이다.

단계 ii)에서 반응 종료 후, 화학식 5의 트리틸-탈티렐린은 상기 설명된 바와 같은 추출, 결정화, 용매제거, 여과, 세척, 건조를 통한 워크업(work-up)을 통해 수득될 수 있으며, 그 후 별도의 정제 없이 다음 단계에 사용될 수 있다.

단계 ⅲ): 트리틸 보호기 제거 반응

트리플루오르아세트산 또는 염산을 사용하여 화학식 5의 트리틸-탈티렐린에서 트리틸 보호기를 제거하여 화학식 6의 탈티렐린을 얻는다.

트리틸 보호기의 제거는 사용하는 산에 따라서 2가지 방식으로 진행될 수 있다.

< 트리플루오르아세트산 사용>

트리플루오르아세트산을 사용하는 탈보호 반응은

a) 트리플루오르아세트산으로 트리틸-탈티렐린의 트리틸 보호기를 제거하는 단계;

b) 생성된 탈티렐린 트리플루오르산염을 결정화하여 수거하고, 탈보호된 트리틸기는 제거하는 단계;

c) 염기로 pH를 6.5~7.5로 조정하여 염이 없는(salt free) 탈티렐린을 생성하는 단계; 및

d) 레진을 사용하여 잔류 유기염을 제거하는 단계를 포함하여 이루어진다.

단계 a)에서 트리플루오르아세트산은 반응시약 및 용매로 사용된다. 트리플루오르아세트산은 트리틸-탈티렐린과 반응하여 탈티렐린 트리플루오르산 염을 생성하고, 트리틸기를 탈리시킨다.

본 반응에는 유기용매로 메틸렌클로라이드가 추가될 수 있으며, 반응 촉매로 1,2-에탄싸이올이 사용될 수 있다. 가장 바람직하게는 트리플루오르아세트산과 촉매를 함께 사용하는 것이다.

반응조건은 트리틸-탈티렐린 1.0당량에 대해 1,2-에탄싸이올 0.3 내지 2.0당량, 트리플루오르아세트산 2 내지 20당량, 메틸렌클로라이드는 중량비로 0.5 ~ 5배 사용한다. 반응온도는 -10 ~ 30℃에서 가능하나 -5 ~ 25℃에서 수행하는 것이 바람직하다. 반응시간은 4 ~ 12시간이 바람직하다.

단계 b): 상기 반응용액을 결정화 용매에 분산시켜 탈티렐린 트리플루오르산염을 결정화하고 여과하여 수거하고, 탈보호된 트리틸기는 여액으로 제거한다. 결정화 용매는 상기에서 상술한 바와 같다.

단계 c): 탈티렐린 트리플루오르산염을 5 ~ 10배 부피의 정제수에 현탁하고, 염기로 pH를 조정하여 염이 없는(salt free) 탈티렐린을 생성한다.

상기 염기는 탄산나트륨, 탄산칼륨, 트리에틸아민, 트리부틸아민 및 수산화나트륨, 및 수산화칼륨으로 이루어지는 군으로부터 선택되어지는 하나 이상의 염기이며, pH는 6.5~7.5로 조정하여 1시간 이상 교반하여 염이 없는 탈티렐린을 생성한다.

단계 d): 레진을 사용하여 잔류 유기염을 제거하고 염이 없는 탈티렐린을 회수하여 조(crude) 탈티렐린(화학식 6)을 얻는다.

상기 레진은 HP-20 resin, Amberlite Xad-16N resin, Amberlite Xad-1600N resin등 Styrene과 DVB(Divinyl benzene)의 공중합체의 high Porous Type의 합성흡착제를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 Amberlite Xad-16N를 사용한다. 레진은 탈티렐린 트리플루오르산염 대비 10 ~ 30배의 부피로 사용할 수 있으며, 바람직하게는 15 ~ 25배의 부피로 사용하고, 가장 바람직하게는 20배 부피로 사용한다.

상기 염이 없는 탈티렐린의 회수는 탈티렐린 트리플루오르산염을 레진에 흡착시킨 후 초순수로 더 이상 염이 검출되지 않을 때까지 세척하여 주고, 메탄올 10~50% 수용액을 로딩하여 염이 없는 탈티렐린이 녹아있는 용액을 회수하는 것으로 수행될 수 있다.

<염산 사용>

염산을 사용하는 탈보호 반응은 염산과 유기용매를 사용하여 트리틸-탈티렐린에서 트리틸 보호기를 제거한 후, 염기로 pH를 조정하여 염이 없는 탈티렐린을 생성하는 것으로 수행한다.

상기 유기용매는 탄소수 1~3의 저급 알코올 일수 있으며, 바람직하게는 에탄올 또는 메탄올을 사용하고, 염산의 농도는 0.05 ~ 3M을 사용 할 수 있으며, 바람직하게는 0.05 ~ 0.5M을 사용한다.

반응조건은 트리틸-탈티렐린 대한 중량비로 유기용매 3 ~ 15배 존재 하에 0.05 ~ 0.5M 염산을 3 ~ 15배 사용한다. 반응온도는 -10 ~ 100℃에서 가능하나 0 ~ 50℃에서 수행하는 것이 바람직하다. 반응시간은 0.5 ~ 10시간이 바람직하다.

상기 염기는 탄산나트륨, 탄산칼륨, 수산화나트륨, 수산화칼륨으로 이루어지는 군으로부터 선택되어지는 하나 이상의 염기이며, pH는 6.5~7.5로 조정하여 1시간 이상 교반하여 염이 없는 탈티렐린(화학식 6)을 얻는다.

상기와 같이 염산을 사용하여 탈보호 반응을 진행할 경우 레진을 사용한 정제가 필요없어 공정이 매우 간단하고 단시간에 진행될 수 있고, 생산 비용을 감축할 수 있다.

단계 ⅳ): 탈티렐린 수화물 제조

화학식 6의 탈티렐린을 물에서 재결정하여 화학식 7의 탈티렐린 4수화물로 제조한다.

상기 재결정은 탈티렐린에 2 ~ 4배 (w/v)의 물에 용해시킨 후, 염기를 사용하여 pH를 8 ~ 9로 조절하고, 탈티렐린 수화물 종자(seed)를 넣어 결정화하고, 추가로 동일하게 반복하여 재결정하는 것으로 수행될 수 있다.

pH 조절제로 사용되는 염기는 탄산나트륨, 탄산칼륨, 수산화나트륨, 및 수산화칼륨으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.

결정화 반응 온도는 0 ~ 15℃, 반응 시간은 1 ~8시간이 바람직하다.

반응 종료 후, 생성된 결정은 통상의 방법으로 여과하고 감압 건조하여 화학식 7의 탈티렐린 수화물을 얻는다.

또한 본 발명의 또 다른 목적에 따라서, 본 발명은

화학식 1의 Fmoc-트리틸(Trt)-히스티딘과 화학식 2의 프롤린아미드를 메틸렌클로라이드에 현탁하는 단계: 및

순차적으로 커플링제 및 탈보호제를 사용하는 인시츄 반응을 진행하여 커플링과 탈보호(Fmoc-)하여 화학식 3의 히스티딜-트리틸-프롤린아미드를 얻는 단계;

를 포함하는 히스티딜-트리틸-프롤린아미드의 제조방법을 제공한다.

커플링제, 탈보호제 등과 반응조건은 상기 단계 i)에서 정의된 바와 같다.

본 발명에 따른 제조방법은 Fmoc-트리틸-히스티딘을 출발물질로 사용하고 인시츄 반응으로 탈티렐린 중간체인 히스티딜-트리틸-프롤린아미드를 얻는 공정을 경유함으로써 종래기술 대비 50% 이상 제조시간을 단축하여 생산 임율이 낮아지는 효과를 가져 오고, 또한 각 단계마다 별도의 크로마토그래피를 통한 정제없이 사용하여 각각의 중간체들을 고수율로 수득할 수 있기 때문에 목적화합물 수율을 현저히 개선할 수 있어, 매우 경제적이며 탈티렐린의 대량 생산에 적용하기에 매우 적합하다.

본 발명에 따르면, 99.5% 이상의 고순도의 탈티렐린 수화물을 30%에 달하는 고수율로 보다 용이하고 효율적으로 얻을 수 있다.

도 1a은 본 발명에 따라서 제조된 탈티렐린 4수화물의 XRD 분석 결과를 나타낸다.
도 1b는 탈티렐린의 α-결정형과 β-결정형에 해당하는 XRD 패턴을 나타낸다.

다음의 실시예들에 의해 본 발명이 더 상세히 설명된다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되어서는 안된다.

실시예 1. 화학식 3의 중간체 (His( Trt )-Pro-NH ₂ )의 제조

N-플루오레닐메톡시카르보닐-N'-트리틸-L-히스티딘(Fmoc-His(Trt)-OH) 10g 및 L-프롤린아미드(H-Pro-NH₂) 2.03g을 메틸렌클로라이드(MC) 50ml에 현탁시키고, 5~15℃로 냉각했다. 이 혼합용액에 PyBOP (benzotriazol-1-yl- oxytripyrrolidino- phosphonium hexafluorophosphate) 10.08g을 첨가하고, N-메틸몰포린 2.45g을 30분 동안 적가하였고, 동일한 온도에서 1시간 교반 후 실온에서 12시간 교반하였다.

반응 종결 후 혼합용액의 온도를 5~15℃로 냉각하고, 메틸렌클로라이드 8.8ml에 희석된 피페리딘 10.99g을 30분 동안 적가하였다. 동일한 온도에서 1~2시간 교반하고, 5% 구연산 수용액 30ml, 포화소금물 20ml, 3% 탄산나트륨 수용액 30ml, 포화소금물 20ml 순서로 세척하였다. 세척된 유기층을 황산나트륨으로 건조하고 여과한 후, 20~25℃에서 부피가 40~60ml가 되도록 감압농축하였다. 농축된 용액을 5~10℃로 냉각된 3차 부틸메틸에테르 400ml에 15분 동안 적가하여 결정을 생성하였다. 생성된 결정을 여과하고, 최종 부피가 40~60ml가 되도록 메틸렌클로라이드에 용해시켜 결정화 공정을 1회 더 수행한 후, 최종 여과물을 20~25 ℃에서 진공 감압건조하여, L-히스티딜-트리틸-L-프롤린아미드 9.22g(수율:80%, 함량:69%)을 얻었다. 순도, 불순물 함량 및 공정시간을 표 1에 나타냈다.

T.L.C.(클로로포름:메탄올:아세트산/10:1:1)=0.5

비교예 1: 화학식 3의 중간체의 제조

비교를 위하여 종래기술에 따른 공정에 따라서 화학식 3의 중간체를 제조하였다.

구체적으로는 Fmoc-His(Trt)-OH 10.0g과 H-Pro-NH₂ 2.0g를 테트라하이드로퓨란(THF) 100ml에 용해시키고, 커플링제로 DCC(dicyclohexylcarbodiimide) 4.29g과 N-히드록시숙신이미드(Hydroxysuccinimide) 2.2g을 투입하여 실온에서 10분간 교반하고 N-메틸몰포린 2.43g를 30분동안 적가하였다. 적가 완료 후 20∼25℃에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후 40℃에서 감압농축하였고, 에틸렌아세테이트(EA) 50ml에 용해한 후 5% 시트르산 수용액, 5% NaHCO₃ 수용액, Brine 순서로 세척하고 MgSO₄로 건조하여 여과하였다. 여과액을 40℃에서 감압농축하여 컬럼 정제하여 Fmoc-His(Trt)-Pro-NH₂ 8.09g(수율: 70%)을 수득하였다.

Fmoc-His(Trt)-Pro-NH₂ 8.09g에 메틸렌클로라이드 80ml를 첨가하여 교반 한 후, 혼합용액을 5∼10℃로 냉각하고, 피페리딘 7.4g를 2시간 동안 서서히 적가 하여 동일한 온도에서 5시간 교반하였다. 반응 종결 후 감압 농축하여 메틸렌클로라이드를 40ml 가량 제거한 후 용액을 800mL 이소프로필에테르를 넣은 반응기에 1시간 동안 적가 하였다. 1시간 교반하고 여과하여 이소프로필에테르로 세척하였다. 실온에서 24시간 감압건조하여 6.0g(수율: 87%)을 수득하였다. 중간체 제조의 전체수율은 60.9% 이다. 순도, 불순물 함량 및 공정시간을 표 1에 나타냈다.

	비교예	실시예 1	개선사항(%)
HPLC 순도	73.8%	94.6%	순도 20.8% 향상
불순물 함량	26.2%	I5.4%	불순물 20.8% 감소
공정(작업) 시간	40시간	18시간 40분	21시간 20분(53.3% 단축)

실시예 2. 화학식 5의 중간체 ( Trt - Taltirelin )의 제조

1-메틸-L-4,5-디히드로오로트산 2.22g을 아세트산에틸 39.56ml에 현탁하고, 온도를 5~15℃로 냉각했다. 현탁액에 PyBOP 7.05g을 첨가하고, 아세트산에틸 8.8ml에 희석된 N-메틸몰포린 1.44g을 30분 동안 적가하였다. 동일한 온도에서 1~2시간 교반하고, L-히스티딜- 트리틸-L-프롤린아미드 9.22g(함량:69%)을 5회에 걸쳐 첨가했다. PyBOP 1.34g을 추가로 첨가하고, 아세트산에틸 1.31ml에 희석된 N-메틸몰포린 0.28g을 20분 동안 적가한 후, 아세트산에틸 23.02ml를 첨가하고, 실온에서 4시간 교반하였다.

반응 종결 후 혼합용액을 5% 구연산 수용액 14.24ml, 포화소금물 14.24ml, 3% 탄산나트륨 수용액 14.24ml, 포화소금물 20ml 순서로 세척한 후, 세척된 유기층을 황산나트륨으로 건조하고 여과하였다. 여과된 용액을 20~25℃에서 진공 감압건조하여 N-[(4S)-1-메틸-2,6-디옥소헥사하이드로피리미딘-4-카보닐]- 3-(트리페닐메틸-L-히스티딜-L-프롤린아마이드 10.03g을 (수율:80% 함량:67%) 얻었다.

T.L.C.(염화메틸렌:메탄올/20:1)=0.4

실시예 3. 화학식 6의 탈티렐린의 제조 (염산을 사용한 탈보호)

화학식 5의 트리틸-탈트렐린 10.03g(함량:67%)에 에탄올 50.15ml를 첨가하여 교반하였다. 1M 염산수용액 13.44ml를 첨가하고, 혼합 용액을 1시간 동안 환류했다. 반응 후 용액을 35℃에서 감압농축한 후, 농축잔사에 정제수 3ml를 첨가하고, 생성된 고체를 여과하여 제거하였다. 여과된 용액은 포화 탄산나트륨 수용액으로 pH를 7로 조정하여 메틸렌클로라이드 20ml로 세척하고, 수용액 층을 감압농축하였다. 농축잔사에 무수에탄올 35ml를 첨가하고, 불용성 고체를 여과하여 제거한 후, 여액을 감압농축하여 조(Crude) 탈티렐린 3.36g(수율:80%)을 얻었다.

HPLC 순도: 90.4%

T.L.C.(n-부탄올:물:아세트산/4:1:1)=0.4

실시예 4. 화학식 6의 탈티렐린의 제조 (TFA를 사용한 탈보호)

화학식 5의 트리틸-탈트렐린 10.74g(함량:67%)을 0~5℃로 냉각된 트리플루오르아세트산(TFA) 45ml에 1,2-에탄싸이올(1,2-ethanedithiol) 1ml를 추가한 혼합용액에 소량씩 나누어 첨가하였다. 트리플루오르아세트산 10ml를 추가 첨가하고, 20~25℃에서 2시간 교반하였다. 반응 종결 후 반응용액에 이소프로필에테르 100ml를 내부온도 30℃ 이내에서 적가하고, 20~25℃에서 1시간 교반하여 결정을 생성하고 여과하였다. 여과물을 24시간 감압 건조하고 수득한 탈티렐린 트리플루오르아세트산염(Taltirelin TFA salt) 8g을 정제수 40ml에 현탁하여 10℃로 냉각하였다. 포화 탄산나트륨 수용액을 소량씩 첨가하여 pH 6.5 ~ 7.0으로 조정하고, 정제수 60ml를 첨가하여 1시간 교반하였다. 생성물을 여과하고, 여과된 여액을 35℃에서 감압 농축하였다. 농축잔사를 정제수 10ml에 용해하여 레진(Amberlite Xad-16N) 컬럼에 통과시켜 흡착시키고, 초순수 320ml를 용리액의 전도도 100ms/s 이하까지 흘려주었다. 그리고 나서 50% 메탄올 수용액을 탈티렐린이 LC상 검출되지 않을 때까지 흘려주었다. 탈티렐린이 녹아있는 용리액을 35℃에서 감압농축하여 조(crude) 탈티렐린 3.19g(수율:71%)을 얻었다.

HPLC 순도: 88.35%

T.L.C.(n-부탄올:물:아세트산/4:1:1)=0.4

실시예 5. 화학식 7의 탈티렐린 4수화물의 제조

화학식 6의 (조) 탈티렐린 3.36g을 정제수 5ml에 현탁하고 30℃로 가온하여 완전 용해시켰다. 포화 탄산나트륨 수용액을 소량씩 첨가하여 pH 8.5 ~ 9.0으로 조정하고, 탈티렐린 종자(seed)를 넣었다. 용액을 2시간에 걸쳐 서서히 10℃로 냉각시킨 후, 같은 온도에서 3시간 더 교반하여 결정을 생성하여 여과하고, 소량의 정제수로 세척한 후, 동일한 조건으로 반복하여 재결정을 하였다. 최종 여과물을 35℃에서 감압 건조하여 순수한 탈티렐린 사수화물 2.37g(수율:60%)을 얻었다.

¹H-NMR(CDCl₃) : 1.97(m, 2H), 2.50(m, 1H), 2.80(m, 1H), 2.91(s, 3H) 3.21(m, 3H), 3.40(m, 2H), 3.55(m, 1H), 4.05(t, 1H), 4.20(t, 1H), 4.60(t, 1H), 6.91(s, 1H),7.85(s, 1H), 8.40(s, 1H), 12.00(brs, 1H).

순도 99.75%; 함량(무수물로서) 100.42%; 총 유연물질 0.25%;

비선광도(무수물로서) -23.91°; 수분 14.84%;

수율(Fmoc-His(Trt)-OH 기준) 30.72%

제조된 탈티렐린 4수화물을 XRD(X-선 결정구조해석) 분석하여 그 결과를 도 1a에 나타냈다. 도 1b에 도시한 표준 탈티렐린의 α-결정형과 XRD 패턴이 동일한 바를 확인할 수 있다.

Claims

ⅰ) 화학식 1의 Fmoc-트리틸(Trt)-히스티딘과 화학식 2의 프롤린아미드를 용매 메틸렌클로라이드 하에 순차적으로 커플링제 및 탈보호제를 사용하는 인시츄 반응을 진행하여 커플링과 탈보호(Fmoc-)하여 화학식 3의 히스티딜-트리틸-프롤린아미드를 얻는 단계;
ⅱ) 화학식 3의 히스티딜-트리틸-프롤린아미드를 화학식 4의 1-메틸-4,5-디히드로오로트산과 커플링하여 화학식 5의 트리틸-탈티렐린을 얻는 단계; 및
ⅲ) 염산과 탄소수 1~3의 저급 알코올을 사용하여 화학식 5의 트리틸-탈티렐린에서 트리틸 보호기를 제거한 후, 염기로 pH를 6.5~7.5로 조정하여 화학식 6의 탈티렐린을 얻는 단계;
를 포함하는 탈티렐린의 제조방법:
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

상기 화학식에서, Fmoc은 플루오레닐메톡시카르보닐(9H-fluoren-9-yl- methoxycarbonyl)을 나타내고; Trt는 트리페닐메틸(triphenylmethyl)을 나타내고,
단계 i)에서, 커플링제는 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(피롤이디노)-포스포니움 헥사플루오로포스페이트 (Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(pyrrolidino)-phosphonium hexafluorophosphate; PyBOP)이다.
제 1항에 있어서, ⅳ) 화학식 6의 탈티렐린을 물에서 재결정하여 화학식 7의 탈티렐린 4수화물로 제조하는 단계를 추가로 포함하는 것인 탈티렐린의 제조방법:
[화학식 7]

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삭제
제 1항에 있어서, 단계 i)에서, Fmoc 탈보호제는 피페리딘, 시클로헥실아민, 에탄올아민, 피페라진, sec-부틸아민, tert-부틸아민 및 트리에틸아민으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것인 탈티렐린의 제조방법.
제 1항에 있어서, 단계 i)에서, 커플링제와 함께 N-메틸모폴린, 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민 및 피리딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 염기를 첨가하는 것인 탈티렐린의 제조방법.
제 1항에 있어서, 단계 ⅱ)에서, 커플링제는
벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(피롤이디노)-포스포니움 헥사플루오로포스페이트 (Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(pyrrolidino)-phosphonium hexafluorophos-phate: PyBOP),
벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포니움 헥사플루오로포스페이트 (Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluoro-phosphate: BOP),
트리스(디메틸아미노)(3H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-일옥시)포스포러스 헥사플루오로포스페이트 (Tris(dimethylamino)(3H-1,2,3-triazolo[4,5-b] pyridin-3-yloxy)phosphorus hexafluorophosphate; AOP),
(7-아자벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤이디노포스니움 헥사플루오로포스페이트 ((7-Azabenzotriazol-1-yloxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophos-phate; PyAop),
2-(7-아자-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트 (2-(7-Aza-1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyl-uroniumhexa-fluorophosphate; HATU), 및
2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트 (2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate; HBTU)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나인 것인 탈티렐린의 제조방법.
제 1항에 있어서, 단계 ⅱ)에서, 용매는 에틸아세테이트인 것인 탈티렐린의 제조방법.
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제 1항에 있어서, 단계 ⅲ)에서 염산은 0.05~3M 농도이며, 탄소수 1~3의 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올이며, 상기 염기는 탄산나트륨, 탄산칼륨, 수산화나트륨 및 수산화칼륨으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 탈티렐린의 제조방법.
제 2항에 있어서, 상기 재결정은 탈티렐린을 2 ~ 4배 (w/v)의 물에 용해시킨 후, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 수산화나트륨 및 수산화칼륨으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염기를 사용하여 pH를 8 ~ 9로 조절하고, 탈티렐린 수화물 종자(seed)를 넣어 결정화하는 공정을 2회 반복 수행하는 것인 탈티렐린의 제조방법.
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