KR102167386B1 - 피부 장벽 강화, 피부 보습 또는 항노화를 위한 조성물 - Google Patents

피부 장벽 강화, 피부 보습 또는 항노화를 위한 조성물 Download PDF

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Abstract

일 양태로서 제공되는 조성물은 신종 균주, 이의 용해물 또는 배양물을 포함하고 있어 피부 장벽 강화, 피부 보습 또는 항노화에 우수한 효과를 발휘할 수 있어, 화장료 조성물 또는 건강기능식품 등에 활용될 수 있다.

Description

피부 장벽 강화, 피부 보습 또는 항노화를 위한 조성물{Composition for strengthening skin barrier, moisturizing skin or anti-aging}
피부 장벽 강화, 피부 보습 또는 항노화를 위한 조성물에 관한 것이다.
피부의 생태계는 미생물에게 다양한 형태의 서식처를 제공하며, 광범위한 미생물들이 살고 있다. 숙주인 인간은 이들과 공생관계를 이루고 있으며, 숙주에 많은 긍정적인 영향을 미친다고 알려져 있다. 피부는 함입부, 특화되어 있는 틈새 등 다양한 형태의 서식처를 구성하고 있으며, 넓은 분포의 미생물이 자랄 수 있도록 돕는다. 기본적으로 피부는 물리적인 막을 형성하며, 외부로부터 잠재적인 위험요소 및 독성물질들로부터 방어를 하도록 도와준다. 피부는 외부환경과의 접속지점이 되며, 다양한 미생물들(진균, 세균, 바이러스 및 작은 유충)의 집합소이기도 하다. 물리적, 화학적 기능의 선택에 맞게 미생물들은 특화된 틈새에 적응하여 서식처를 마련한다. 일반적으로 피부는 차갑고, 산성 성질을 나타내며, 건조된 상태로 유지된다. 구조적으로 표피(epidermis)는 피부장벽을 이루고 있으며, 미생물과 독소가 침투하는 것을 차단하고, 수분을 유지하는 중요한 역할을 한다. 표피의 최상위층은 각질층(stratum corneum)으로 구성되어있다. 표피는 일명 ‘벽돌과 몰탈 구조’라고 불리는 형태를 띠고 있는데, 피부 조직은 계속적인 자가 회복 과정을 거치고, 분화과정의 마지막을 거친 squames는 끊임없이 피부조직에서 탈락되는 과정을 반복하게 된다.
프로바이오틱스(Probiotics)는 인체에 유익한 작용을 하는 미생물을 총칭하는 말로 우리 몸에 유익(benefit)을 주는 미생물을 말한다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 유산균으로 알려져 있다. 프로바이오틱스는 인체에 여러 가지 유익작용을 통해 효과적인 효능이 발생되는 것으로 보고되었지만, 피부상재균과 피부의 상호관계에 대한 연구는 미비한 실정이다.
피부장벽은 죽은 각질세포와 세포간 지질로 구성되어 있고, 외부 자극으로부터 피부를 보호하며 피부에서 수분이 증발하는 것을 막아주는 피부 보호막으로서 피부건강에 핵심적인 기능을 담당한다. 즉, 체내에서 지나친 수분 방출을 막고 화학물질이나 미생물처럼 해로운 물질이 우리 몸 안으로 들어오는 것을 막아준다. 죽은 각질세포의 표면을 구성하는 각질세포 외피에는 세포간 지질의 안정성에 중요한 역할을 한다. 각질형성세포는 분화를 통해 각질화 과정을 통해 피부 장벽을 만든다. 피부장벽 기능은 노화가 진행되거나 외부 요소들에 의해 파괴될 수 있으며, 피부 장벽의 손상은 피부 수분량 감소와 주름을 일으킬 수 있다.
이에, 본 발명자들은 성인의 피부로부터 신규한 스트렙토코커스 속 균주를 분리 및 동정하고 이의 피부 개선 효과를 확인함으로써 발명을 완성하였다.
한국등록특허 제1914157호
신종 균주, 이의 용해물 또는 배양물을 포함하는 피부 장벽 강화, 피부 보습 또는 항노화를 위한 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
일 양태로서, 기탁번호 KCCM12642P의 스트렙토코커스 인판티스(Streptococcus infantis) 균주를 제공한다.
상기 균주는 서열번호 1의 서열로 이루어진 16S rRNA를 가지고 있어 스트렙토코커스 인판티스 균주로 명명되는 것일 수 있다.
일 양태로서, 기탁번호 KCCM12642P의 스트렙토코커스 인판티스(Streptococcus infantis) 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 피부 장벽 강화용 조성물을 제공한다.
상기 균주는 서열번호 1의 서열로 이루어진 16S rRNA를 가지고 있어 스트렙토코커스 인판티스 균주로 명명되는 것일 수 있다.
상기 배양물은 상기 균주를 당업계 통상의 기술자에 널리 알려진 스트렙토코커스 인판티스 배양 방법으로 배양하여 수득한 것이라면 특별한 제한은 없으나, 예를 들면, 트립톤을 처리한 대두 배지(Tryptic Soy Media)인 MRS 배지에서 배양하여 수득한 것일 수 있다.
상기 배양은 20 내지 60℃, 20 내지 55℃, 20 내지 50℃, 20 내지 45℃, 20 내지 44℃, 20 내지 43℃, 20 내지 42℃, 20 내지 41℃ 또는 20 내지 40℃의 온도에서 수행할 수 있고, 보다 바람직하게는 20 내지 42℃에서 수행할 수 있으나, 반드시 이에 제한되지는 않는다.
상기 배양은 30 내지 60, 35 내지 60, 30 내지 55, 40 내지 55, 40 내지 60, 40 내지 50, 45 내지 60, 45 내지 55 또는 45 내지 50시간 동안 수행할 수 있고, 보다 바람직하게는 45 내지 50시간 동안 수행할 수 있으나, 반드시 이에 제한되지는 않는다.
상기 배양물은 피부 장벽 강화능을 나타낼 수 있는 다양한 성분의 물질을 포함할 수 있고, 그 중 스퍼미딘(Spermidine)을 포함할 수 있는데, 이는 상기 배양물이 콜라겐의 발현량을 증대시키고, 피부 장벽 강화 관련 유전자의 발현량을 증대시키는 주된 원인일 수 있다.
상기 균주 또는 이의 배양물은 조성물 총 중량 대비 0.1 내지 90 중량%, 0.1 내지 85 중량%, 0.1 내지 80 중량%, 0.2 내지 90 중량%, 0.2 내지 85 중량%, 0.2 내지 80 중량%, 0.3 내지 90 중량%, 0.3 내지 85 중량%, 0.3 내지 80 중량%, 0.4 내지 90 중량%, 0.4 내지 85 중량%, 0.4 내지 80 중량%, 0.5 내지 90 중량%, 0.5 내지 85 중량%, 0.5 내지 80 중량%, 0.6 내지 90 중량%, 0.6 내지 85 중량% 또는 0.6 내지 80 중량%로 포함될 수 있고, 보다 바람직하게는 0.5 내지 80 중량% 포함될 수 있으나, 반드시 이에 제한되지는 않는다.
일 양태로서, 상기 조성물을 포함하는 피부 장벽 강화용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 약학적 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈, 덱스트로즈, 수크로스, 덱스트린, 말토덱스트린, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제되나, 이에 제한되지 않는다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며 이에 제한되지는 않으나, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
일 양태로서, 상기 조성물을 포함하는 피부 장벽 강화용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 화장료 조성물은, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
상기 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.
일 양태로서, 상기 조성물을 포함하는 피부 장벽 강화용 건강기능식품을 제공한다.
상기 건강기능식품은 피부 장벽 강화를 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
상기 건강기능식품이라 함은, 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
상기 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 식품 첨가물 공전에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 상기 조성물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 상기 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 상기 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 상기 조성물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 상기 조성물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류. 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복함제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
일 양태로서, 기탁번호 KCCM12642P의 스트렙토코커스 인판티스(Streptococcus infantis) 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 피부 보습용 조성물을 제공한다.
일 양태로서, 상기 조성물을 포함하는 피부 보습용 약학적 조성물을 제공한다.
일 양태로서, 상기 조성물을 포함하는 피부 보습용 화장료 조성물을 제공한다.
일 양태로서, 상기 조성물을 포함하는 피부 보습용 건강기능식품을 제공한다.
상기 피부 보습은 상기 조성물의 피부 장벽 강화로 인해 피부 내 존재하는 수분의 손실량을 억제하고 보유량을 증대시킴에 따른 효과일 수 있다.
상기 균주, 배양물, 약학적 조성물, 화장료 조성물, 건강기능식품 등에 관련된 구체적인 설명은 상술한 바와 같다.
일 양태로서, 기탁번호 KCCM12642P의 스트렙토코커스 인판티스(Streptococcus infantis) 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 항노화용 조성물을 제공한다.
일 양태로서, 상기 조성물을 포함하는 항노화용 화장료 조성물을 제공한다.
일 양태로서, 상기 조성물을 포함하는 항노화용 건강기능식품을 제공한다.
상기 항노화는 상기 조성물의 피부 장벽 강화로 인해 노화에 따라 손실되는 피부 장벽을 회복시키고, 이에 노화에 의해 낮아진 피부 장벽 유지를 위한 인자들의 발현을 다시 증대시키는 등에 따른 효과일 수 있다.
상기 균주, 배양물, 약학적 조성물, 화장료 조성물, 건강기능식품 등에 관련된 구체적인 설명은 상술한 바와 같다.
일 양태로서 제공되는 조성물은 신종 균주, 이의 용해물 또는 배양물을 포함하고 있어 피부 장벽 강화, 피부 보습 또는 항노화에 우수한 효과를 발휘할 수 있어, 화장료 조성물 또는 건강기능식품 등에 활용될 수 있다.
도 1은 노인과 젊은이의 피부 미생물 군집을 비교한 것이다.
도 1a는 속(genus) 수준에서 안면 피부 마이크로바이옴(microbiome)의 상대적인 풍부도를 나타낸 것으로서, 상위 5개의 속이 제시된 것이다(F는 과(family)를 의미).
도 1b는 노인과 젊은이 개개인에서 스트렙토코커스 속의 리드 수를 나타내는 박스플롯이다.
도 1c는 LEfSe로부터 얻은 LDA 점수의 분류학적 플롯으로서, 노인과 젊은이 사이에서 유의하게 다른 서열화된 미생물 군집을 보여준다(|LDA 점수|>3.5; g는 속, s는 종).
도 1d는 개개인의 나이 대비 탄력지수를 나타내는 박스플롯이다.
도 1e는 노인과 젊은이에서 탄성 비율 대비 스트렙토코커스의 리드 수를 나타낸 것으로서, 피어슨 상관 검정은 통계적 유의성 계산에 사용되었다.
도 2는 스트렙토코커스 배양 배지를 처리한 후, HDF와 HEK의 유전자 발현 증가를 나타낸 것이다.
도 2a는 HDF에서 탄성에 중요한 콜라겐 연관 유전자의 상대적 mRNA 발현수준을 나타낸 것이다.
도 2b는 HDF에서 탄성 섬유 관련 유전자의 상대적 mRNA 발현수준을 나타낸 것이다.
도 2c는 HDF에서 피부 장벽 기능 및 수분에 중요한 밀착 접합 관련 유전자의 상대적 mRNA 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 2d는 HDF에서 지질 장벽 관련 유전자의 상대적 mRNA 발현 수준을 나타낸 것이다. 여기서의 값은 β-액틴과 관련이 있으며, 평균 ± 표준편차를 나타낸다. Student's two-tailed t-검정을 사용하여 통계적 유의성을 계산하였다(*p < 0.01, **p < 0.001).
도 2e는 상이한 스트렙토코커스 배양 배지로 처리된 HEK의 나일 레드 지질 염색 결과를 나타낸 것이다. 현미경 이미지는 100x 배율로 찍은 것이다.
도 3은 스트렙토코커스 속의 유전자 온톨로지(Gene Ontology; GO) 용어 및 경로의 게놈 특성 및 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 4개의 스트렙토코커스 후보 사이의 평균 뉴클레오티드 동일성(Average nucleotide identity; ANI)을 나타낸 것이다.
도 3b는 스트렙토코커스 써모필러스에 포함되지 않지만, 스트렙토코커스 뉴모니아, 스트렙토코커스 인판티스 및 스트렙토코커스 미티스에 포함된 유전자를 선택하는 절차를 나타낸 것이다.
도 3c 내지 3e는 밀접한 ANI 점수 후보로부터의 중요한 유전자의 생물학적 경로에 대한 GO 용어를 나타낸 것이다(도 3c: 스트렙토코커스 인판티스; 도 3d: 스트렙토코커스 뉴모니아; 도 3e: 스트렙토코커스 미티스).
도 3f는 스트렙토코커스 뉴모니아, 스트렙토코커스 인판티스 및 스트렙토코커스 미티스의 생합성 과정을 나타낸 것이다.
도 4는 UPLC-QTOF-ESI-MS 크로마토그램을 사용하여 St 용액에서의 스퍼미딘을 검출하는 것을 나타내는 것이다(도 4a: 10배 희석된 TSB 대조군 배지; 도 4b: 1000배 희석된 스트렙토코커스 인판티스 St 용액; 도 4c: 1000배 희석된 스트렙토코커스 뉴모니아 St 용액; 도 4d: 1000배 희석된 스트렙토코커스 미티스 St 용액; 도 4e: 1000배 희석된 스트렙토코커스 써모필러스 St 용액).
도 5는 스트렙토코커스 에멀젼 적용 후 임상적인 안면 파라미터 개선도를 나타낸 것이다.
도 5a 내지 5e는 노인 대 젊은이, 대조군 대 St 에멀젼 처리군에 대한 피부 파라미터를 도시한 박스플롯으로, 5a는 탄력, 5b는 TEWL, 5c는 수분, 5d는 광택, 5e는 피부박리를 나타낸 것이다.
도 5f는 St 에멀젼 처리의 0일 및 28일(4주)에 후보 S01과 S05에서 볼 표면의 박리에 대한 직접적인 관찰결과를 나타낸 것이다.
도 5e는 St 에멀젼 처리 28일(4주) 후에 후보 스트렙토코커스 및 스트렙토코커스 인판티스의 증가를 나타낸 것이다. 짝비교(paired comparison)에 대한 통계적 계산은 Wilcoxon signed-rank 검정에 의해 수행되었고, 상호비교(inter comparison)는 Wilcoxon-Mann-Whitney 검정에 의해 수행되었다(A.U: arbitrary unit; DSC; diffuse scattering correction; D.I: desquamation index). 백색 면적은 각질세포이고, 면적은 ImageJ를 사용하여 계산하였다. 현미경 이미지는 20배 확대로 촬영하였다.
도 6은 문(phylum) 수준에서 노인과 젊은이의 피부 샘플상의 미생물 조성을 나타낸이다.
도 6a는 젊은이와 노인 개개인의 문(phylum)의 구성을 나타낸 것으로서, 상대적인 존재비(%)는 각 개인에 대해 표시하였다.
도 6b는 모든 개인에서 상위 5개의 가장 풍부한 문(phyla)의 분포를 설명하는 것으로서, y축은 각 문에 대한 리드의 수를 나타낸 것이다. Mann-Whitney U 검정을 통계적 유의성 계산에 사용하였다.
도 7은 노인과 젊은이 개개인의 피부 미생물 군의 속(genus) 수준에서의 미생물 거리(microbial distance) 및 조성을 나타낸 것이다.
도 7a는 노인과 젊은이 후보에서 피부 미생물 군집의 베타 다양성을 나타낸 것으로, 왼쪽은 Bray-Curtis 거리를 나타낸 것이고, 오른쪽은 가중된 UniFrac 거리를 나타낸 것이다. 통계적 계산은 999개의 순열을 갖는 PERMANOVA에 의해 수행되었다.
도 7b는 노인과 젊은이 개개인에 있어서 나이와 스트렙토코커스 간 상관관계를 나타낸 것으로서, 피어슨 상관 검정이 통계적 유의성 계산에 사용되었다.
도 7c는 노인과 젊은이 개개인에서 가장 풍부한 5대 속의 분포를 나타낸 것으로서, F는 과(family)를 의미하고, y축은 각 속에 대한 리드의 수를 의미한다. Mann-Whitney U 검정이 통계적 유의성 계산에 사용되었다.
도 8은 탄력정도에 따른 개개인 피부 샘플의 문(phylum) 수준의 미생물 조성을 나타낸 것이다.
도 8a는 탄성의 높고 낮음에 따르는 개개인의 문 구성을 나타낸 것이다.
도 8b는 탄성의 높고 낮음에 따르는 피부 미생물 군집의 베타 다양성을 나타낸 것으로, 상단은 Bray-Curtis 거리를 나타낸 것이고, 하단은 가중된 UniFrac 거리를 나타낸 것이다. 통계적 계산은 999개의 순열을 갖는 PERMANOVA에 의해 수행되었다.
도 8c, 8d는 각각 스트렙토코커스와 스트렙토코커스 인판티스의 리드 수를 나타낸 것으로서, 풍부도를 비교하기 위해 통계적 유의성을 Mann-Whitney U 검정을 이용하여 계산하였다.
도 9는 안면 표면의 상태가 개인 피부의 미생물 특성에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 9a는 다른 피부 표면 상태에 따른 피부 미생물 군집의 베타 다양성을 나타낸 것으로서, 불량(5), 정상(27), 거친 상태(3), 부드러운 상태(17)가 나타난다. 왼쪽은 Bray-Curtis 거리를 나타낸 것이고, 오른쪽은 가중된 UniFrac 거리를 나타낸 것이다.
도 9b는 다양한 얼굴 표면 상태와 관련한 스트렙토코커스(왼쪽)와 스트렙토코커스 인판티스(오른쪽)의 분포를 나타낸 것이다.
도 9c는 다양한 안면 수분 조건에서 피부 미생물 군집의 베타 다양성을 나타낸 것으로서, 건조(25), 극도로 건조(4), 정상(23) 상태가 나타난다. 왼쪽은 Bray-Curtis 거리를 나타낸 것이고, 오른쪽은 가중된 UniFrac 거리를 나타낸 것이다.
도 9d는 다양한 안면 수분 조건에서 스트렙토코커스(왼쪽)과 스트렙토코커스 인판티스(오른쪽)의 분포를 설명하는 박스플롯으로서, 베타 다양성의 통계적 계산은 999개의 순열을 갖는 PERMANOVA에 의해 수행되었다(NS: non-significant; **p < 0.01; ***p < 0.001). 풍부도를 비교하기 위해 통계적 유의성을 Mann-Whitney U 검정을 이용하여 계산하였다.
도 10은 스트렙토코커스 배양 상청액의 독성학적 스크리닝 결과이다.
도 10a는 HDF(왼쪽) 및 HEK(오른쪽)의 스트렙토코커스(St) 용액으로 독성을 검사한 결과로서, St 용액의 각 처리 부피는 총 배지 부피의 10%에 해당하였다. 값은 평균 ± 표준오차를 나타낸다.
도 10b는 HDF를 처리하기 위한 최적 농도의 St 용액을 선택하기 위한 스크리닝 테스트 결과로서, COL1A1, COL3A1, ELN 및 FBN1의 mRNA 수준을 판독 값으로 사용하였다. 값은 β-액틴과 관련성이 있으며, 평균 ± 표준오차를 나타낸다. 통계학적 유의성을 계산하기 위해 Student's two-tailed t 검정을 사용하였다(*p < 0.01, **p < 0.001).
도 10c는 COL1A1, COL3A1, ELN 및 FBN1의 mRNA 수준에 대한 배지 처리의 효과를 나타낸 것이다.
도 10d는 스트렙토코커스 써모필러스 배양 상청액의 처리가 DSC2, FLG, GBA 및 ABCA12의 mRNA 수준에 미치는 영향을 나타낸 것이고, 값은 평균 ± 표준오차를 나타낸다(**p < 0.01).
도 11은 St 용액을 처리한 후 노화 유도된 피부 층의 다차원 모델에 관한 것이다. 도 11a는 무처리군, 11b는 1ppm의 Poly I:C 처리군, 11c는 1ppm의 Poly I:C와 스트렙토코커스 인판티스의 상청액 처리군, 11d는 1ppm의 Poly I:C와 스트렙토코커스 뉴모니아의 상청액 처리군, 11e는 1ppm의 Poly I:C와 스트렙토코커스 미티스의 상청액 처리군의 표피층 두께를 나타낸 것이다. 현미경 이미지는 100x 배율로 촬영하였다.
도 12는 스트렙토코커스 써모필러스의 GO 용어를 분석한 것으로서, 도 12a는 전체 게놈 분석으로부터 각 스트렙토코커스 후보의 COG를 나타낸 것이고, 도 12b는 스트렙토코커스 써모필러스에 대한 생물학적 경로 GO 용어의 개요를 나타낸 것이다.
도 13은 UPLCQTOF-ESI-MS 크로마토그램을 이용하여 St 용액 내 스퍼미딘을 검출한 결과를 나타낸 것으로서, 왼쪽은 스퍼미딘에 대한 검정곡선(2.68분에서 용리됨)이고, 오른쪽은 검정곡선을 플롯하는데 사용된 200ppb의 스퍼미딘의 UPLC-QTOF-ESI-MS 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 14는 St 에멀젼 및 대조군 에멀젼 각각을 적용한 후 안면 표면 상태의 변화를 나타낸 것이다.
도 14a 내지 14e는 대조군 에멀젼을 적용한 후 0일과 28일 각각에 탄력성, TEWL, 수분, 광택 및 피부박리를 나타낸 것이다.
도 14f는 피부 밝기를 나타낸 것으로서, 왼쪽부터 오른쪽으로 각각 대조군 에멀젼 적용시, St 에멀젼 적용시, 대조군 에멀젼 대 St 에멀젼 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 14g는 피부 투명도를 나타낸 것으로서, 왼쪽부터 오른쪽으로 각각 대조군 에멀젼 적용시, St 에멀젼 적용시, 대조군 에멀젼 대 St 에멀젼 비교 결과를 나타낸 것이다. 짝비교(paired comparison)에 대한 통계적 계산은 Wilcoxon signed-rank 검정에 의하였고, 상호비교(inter comparison)에 대한 통계적 계산은 Wilcoxon-Mann-Whitney 검정에 의하였다(A.U, arbitrary unit; DSC, diffuse scattering correction; D.I, desquamation index)
이하, 보다 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실험방법
1. 균유전체 분석을 위한 미생물 샘플 수집 및 준비
연구에 참여한 26명의 늙고 26명의 젊은 지원자들의 안면으로부터 멸균된 테이프(Elizabeth pack; Cell lab, 한국)를 이용하여 미생물 군집 샘플을 수집하였다. 이어, 상기 테이프를 제조사의 권장사항에 따라, 액체 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지(Benton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)에 침지시켰다. 37℃에서 48시간 동안 박테리아를 성장시킨 후, 배지를 6000rpm에서 10분 동안 원심분리 하였다. 수집된 펠렛(pellet)을 제조업체의 권장사항에 따라, Quick-DNATM 곰팡이/박테리아 미니프렙 키트(Zymo Research, Orange, CA, USA)로 미생물 DNA를 추출하였다. DNA 순도 및 양은 NanoDrop One 분광 광도계(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 추정하였다.
2. 균유전체 분석을 위한 16S rRNA PCR 증폭 및 시퀀싱
박테리아 16S rRNA 유전자의 V3-V4 영역은 어탭터 오버행 서열이 추가된 하기 표 1의 프라이머를 사용하여, Illumina 16S Metagenomic Sequencing Library 준비 가이드(Illumina, San Diego, CA, USA)에 의해 증폭되었다.
프라이머 서열(5'→3')
순방향(Forward) TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG
역방향(Reverse) GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC
PCR은 2μL의 게놈 DNA(10 ng/μL), 0.5μL의 각 프라이머(10μM), 12.5μL의 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix (Kapa Biosystems, MA, Wilmington, MA) 및 9.5μL의 증류수를 포함하는 25μL 반응부피로 수행하였다. PCR 조건은 다음과 같았다: 95℃에서 3분 동안 초기 변성; 95℃에서 30초 동안의 변성, 55℃에서 30초 동안의 어닐링, 72℃에서 30초 동안의 연장으로 이루어진 25 사이클; 72℃에서 5분 동안 최종 연장. PCR 산물은 제조사의 프로토콜에 따라 AMPure XP Beads(Beckman Coulter, Brea, CA, USA)로 정제하였다. 이중 인덱스 서열(dual-index sequences)과 Illumina 어댑터의 부착은 5μL의 PCR 생성물, 5μL의 Illumina Nextera XT 인덱스 프라이머 1(N7xx), 5μL의 Nextera XT 인덱스 프라이머 2(S5xx), 25μL의 2x KAPA HiFi HotStart Ready Mix 및 10μL의 뉴클레아제(nuclease)가 제거된 물을 이용하여 수행하였다. 열순환은 다음과 같았다: 95℃에서 3분; 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초로 8 사이클; 72℃에서 5분 동안의 최종 연장. PCR 생성물을 AMPure XP 비드로 정제하고, Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 16S 균유전체 라이브러리에 대한 품질관리를 수행하였다. 라이브러리는 MiSeq 플랫폼 (Illumina)에서의 시퀀싱을 위해, 표준 Illumina 시퀀싱 프로토콜에 따라, 2x250bp paired-end 시퀀싱으로 정규화되고(normalized) 풀링되었다(pooled).
3. 균유전체 분석
원시서열(raw sequence) 리드의 품질을 FastQC를 사용하여 분석하였다. Paired-end 리드(read)의 Illumina 어댑터 서열은 cutadapt 버전 2.2를 이용하여 제거하였다. 그 다음, QIIME2 버전 2019.4를 사용하여 트리밍된(trimmed) 서열을 처리하였다. 간단히, 고유 인덱스에 따라 각 샘플에 리드를 할당하였고; QIIME2의 가져오기 도구를 이용하여 원래 DNA 조각에서의 리드 쌍을 병합했다. 순방향 및 역방향 리드에 대해 각각 230bp, 220bp의 서열을 갖도록 품질관리와 트리밍을 수행하였다. 리드의 말단에서 낮은 품질의 염기를 제거하기 위해, DADA2 소프트웨어 패키지를 적용하였다. FASTAQ 파일에서 키메라를 제거하기 위해, DADA2에 구현된 컨센서스 방법(consensus method)을 사용하였다. 베타 다양성은 Bray-Curtis 거리와 가중된 UniFrac 메트릭을 사용한 주요 요인 분석(principal coordinate analysis)으로 비교하였다. 그룹 간 유사성은 999개의 순열(permutation)을 갖는 PERMANOVA(permutational multivariate analysis of variance)를 사용하여 평가하였다. 분류학적 주석은 하기 프라이머로 트레이닝 레퍼런스 세트(training reference set)에 매핑하고, GreenGenes 버전 13.8을 사용하여 V3-V4 영역을 추출함으로써 수행하였다.
프라이머 서열(5'→3')
순방향(Forward) CCTACGGGNGGCWGCAG
역방향(Reverse) GACTACHVGGGTATCTAATCC
Galaxy implementation을 이용한 LDA(Linear Discriminant Analysis) 점수를 기반으로, 그룹 간 종 수준에서의 차별적인 특성을 LEfSe(Linear Discriminant Effect Size Analysis)를 수행하여 확인하였다. 통계 플롯 및 계산은 ggplot2 패키지를 사용하여 R 스튜디오에서 생성하였다.
4. 안면에서 스트렙토코커스의 분리, 식별 및 기탁
멸균수를 사용하여 실험자의 안면을 씻은 다음, 멸균수를 고체 TSA 배지에 뿌렸다. 단일 콜로니를 수거하고, 72시간 동안 37℃에서 액체 TSB 배지에서 정지배양(stationary culture)하였다. 이어, 각 샘플을 6000rpm에서 30분 동안 원심분리하고, 펠렛을 수집하였으며, 제조업체의 권장사항에 따라 Quick-DNATM 곰팡이/박테리아 미니프렙 키트로 미생물 DNA를 추출하였다. DNA 순도 및 양은 NanoDrop One 분광 광도계를 사용하여 추정하였다. 박테리아 16S rRNA 유전자를 하기 프라이머로 증폭하였다.
프라이머 서열(5'→3')
순방향(Forward) AGAGTTTGATCMTGGCTCAG
역방향(Reverse) TACGGYTACCTTGTTACGACTT
PCR은 2μL의 게놈 DNA(10 ng/μL), 0.5μL의 각 프라이머(10μM), 12.5μL의 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix (Kapa Biosystems, MA, Wilmington, MA) 및 9.5μL의 증류수를 포함하는 25μL 반응부피로 수행하였다. PCR 조건은 다음과 같았다: 95℃에서 3분 동안 초기 변성; 95℃에서 1분 동안의 변성, 55℃에서 1분 동안의 어닐링, 75℃에서 90초 동안의 연장으로 이루어진 30 사이클; 72℃에서 8분 동안 최종 연장. PCR 생성물은 ABI-3730XL DNA 시퀀서(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 시퀀싱하였고, 시퀀스 리드는 메가-BLAST를 갖는 NCBI 미생물 뉴클레오티드 BLAST를 사용하여 확인하였다.분리된 스트렙토코커스 속 균주인 스트렙토코커스 뉴모니아는 2017년 4월 3일 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM12005P를 부여받았고, 스트렙토코커스 인판티스는 2019년 12월 18일 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM12642P를 부여받았으며, 스트렙토코커스 미티스는 2020년 1월 15일 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM12656P를 부여받았다.
5. 세포의 배양 및 처리
HDF 및 HEK는 PromoCell(Heidelberg, Germany)에서 구입했다. HDF 및 HEK는 각각 PromoCell의 보충제 믹스가 있는 섬유 아세포 성장배지 2와 보충제 믹스가 있는 각질세포 성장배지 2에서 배양하였다. St 용액의 처리를 위해, 세포를 80% 컨플루언스(confluence)로 6-웰 플레이트에 시딩하고, 37℃에서 5% 이산화탄소 환경에서 배양하였다. 24시간 후, 세포를 인산 완충 식염수로 1회 세척하고, 10% 조절배지(conditioned media)를 보충제가 없는 배지와 함께 세포에 첨가한 후, 24시간 동안 배양하였다.
6. 세포 생존력 분석
HDF 및 HEK를 48-웰 플레이트에 시딩하고, 1mL 완전배지(complete medium)에서 24시간 배양하였으며, 스트렙토코커스 배양 상청액의 10%를 세포에 첨가하고, 이를 추가적으로 72시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 1회 세척한 후, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨브로마이드(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide; MTT) 용액을 각 웰에 첨가한 후, 4시간 동안 배양하였다. 이어서, 배지를 버리고, 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 포르마잔(formazan) 결정을 용해시켰다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 570nm에서 광학밀도를 측정하고, 미처리 대조군에 대해 정규화하였다.
7. RNA 분리 및 실시간 PCR
제조사의 지침에 따라 TRIzol 시약을 사용하여 세포에서 총 RNA를 분리하였다(TaKaRa, Shiga, Japan). cDNA는 1μg의 총 RNA로부터 역전사 프리믹스(Elpis-biotech, Daejeon, Republic of Korea)를 사용하여 다음의 반응 조건 하 합성되었다: 45℃에서 45분, 95℃에서 5분. 유전자 발현을 실시간 PCR로 정량하고, 데이터를 StepOne PlusTM 소프트웨어(Applied Biosystems)를 이용하여 분석하였다. 사전혼합된 ROX(Applied Biosystems)와 함께 SYBR Green PCR Master Mix를 사용하여 실시간 PCR 증폭반응을 수행하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 ABI 7300 사이클러에서 수행한 반응에 다음 프라이머 쌍(Bioneer, 대전, 한국)이 사용되었다.
유전자 프라이머 서열(5'→3')
β-actin 순방향(Forward) GGCCATCTCTTGCTCGAAGT
역방향(Reverse) GACACCTTCAACACCCCAGC
COL1A1 순방향(Forward) GAGGGCCAAGACGAAGACATC
역방향(Reverse) CAGATCACGTCATCGCACAAC
COL3A1 순방향(Forward) TGGAGGATGGTTGCACGAAA
역방향(Reverse) ACAGCCTTGCGTGTTCGATA
ELN 순방향(Forward) CACCTTGCCCTTGTAGAATCCA
역방향(Reverse) CCATGACAGGTCAACCAGGTT
FBN1 순방향(Forward) AATGTCAGACGAAGCCAGGG
역방향(Reverse) GATTTGGTGACGGGGTTCCT
DSC2 순방향(Forward) AGTGTGAGTTTGTTCATCACAGGTC
역방향(Reverse) CCATGGCCTCACAGCCTTTA
GBA 순방향(Forward) GCTAGGCTCCTGGGATCGAG
역방향(Reverse) GTTCAGGGCAAGGTTCCAGTCA
FLG 순방향(Forward) AGTGCACTCAGGGGGCTCACA
역방향(Reverse) CCGGCTTGGCCGTAATGTGT
ABCA12 순방향(Forward) ACAGGAATGGCCTTCATCAC
역방향(Reverse) AACATGGTGCCCTGAGAAAC
(COL1A1, collagen type l alpha 1 chain; COL3A1, collagen type 3 alpha 1 chain; ELN, elastin; FBN, fibrillin; DSC2, desmocollin 2; FLG, filaggrin; GBA, glucosylceramidase beta; ABCA12, ATP binding cassette subfamily A member 12)반응조건은 다음과 같았다: 50℃에서 2분 및 95℃에서 10분으로 개시; 95℃에서 10초 및 60℃에서 1분으로 40사이클. β-액틴을 내부 대조군으로 사용하였다.
8. SC 중성지질에 대한 나일 레드 염색
세포 지질 염색 분석을 위해, HEK를 6-웰 플레이트에 시딩하였다. 24시간 후, 10%의 스트렙토코커스 배양용액을 세포에 첨가하고, 이를 24시간 더 배양하였다. 세척 후, 나일 레드 염색을 사용하여 HEK에서 중성지질을 정량하였따. 아세톤 중의 나일레드(1 mg/mL) 저장용액(stock solution)을 제조하고, 암실조건에서 -20℃에서 저장하였다. 1μl의 저장용액을 1mL의 PBS에 첨가한 다음, 500μl의 혼합물을 각각의 웰에 분취하여 새로운 염색용액을 제조하였다. 암실, 실온 조건에서 10분 후, 세포를 형광현미경(Axio Observer Z1; Carl Jeniss, Jena, Germany)을 사용하여 확인하였다. 중성지질은 적색 형광구조로서 시각화되었다.
9. 정상인의 3D 피부 모델
정상인의 각질세포(keratinocyte) 및 정상인의 섬유아세포를 포함하는, 전체 두께에서의 정상인 3D 피부모델(Epiderm-FT; MatTek Co., Ashland, MA, USA)을 배양하였다. 조직을 6-웰 플레이트로 옮기고, 5μg/mL의 겐타마이신 B(gentamicin B; MatTek Co., MA, USA), 0.25μg/mL의 암포테리신 B(amphotericin B; MatTek Co., MA, USA) 및 기타 성장인자들을 포함하는 DMEM(MatTek Co., MA, USA)에서 37℃의 5%의 이산화탄소 조건에서 밤새 배양하였다.
10. 노화 유도 및 시료 처리
정상인의 3D 피부모델을 6-웰 플레이트로 안정화시키고, 37℃에서 밤새 5% 이산화탄소 환경에서 배양하였다. 3D 피부모델을 폴리 I:C(1ppm)로 처리한 후, 조직을 St 용액으로 처리하였다.
11. 유전체 분석
리드의 길이가 151bp paired-end인 Illumina HiSeq 4000 시퀀서를 이용하여 DNA를 시퀀싱하였다. 라이브러리는 TruSeq 나노 DNA 키트(Illumina)로 제작하였다. 리드들은 trimmomatic-0.38에 의해 트리밍되고, SPAdes v3.9.060을 이용하여 조립되었다. 100 뉴클레오티드보다 짧은 조립된 단편을 perl 스크립트(removesmalls.pl)를 이용하여 여과하였다. 조립되고 여과된 게놈에 대해, Prokka v1.1361을 사용하여 유전자 예측을 수행하였다. COG를 사용하여 스트렙토코커스 종 사이의 공통 유전자를 검색하였다. 선택된 유전자에 대한 기능적으로 그룹화된 주석 네트워크는 Cytoscape plug-in ClueGO v2.5.462를 이용하여 구성하였다. 대장균의 생물학적 과정에 대해 기능적으로 관련된 GO 용어(버전: 2016년 11월 18일)는 네트워크 특이도가 4 내지 10이면서, 카파 점수가 0.4를 초과하는 것을 기준으로 그룹화하였다. 통계적 유의성은 two-sided 초 기하함수 테스트를 사용하여 계산하였고, 오발견률은 Benjamini-Hochberg 방법을 이용하여 수정하였다.
12. St 용액에서의 스퍼미딘 정량분석
TSB 배지(대조군) 및 St 용액을 1x108 CFU/ml로 수집하고, 10분 동안 6000rpm에서 원심분리 하였다. 이어서, 상청액을 여과하고(0.22μm 막 필터, Woongki Science Co., Ltd., 서울, 한국), 각각의 여과된 용액의 10μl 분취량을 Ultimate 3000(Thermo Fisher Scientific Inc., Sunnyvale, CA, USA)에 주입하였다. 사용된 컬럼은 Thermo Hypersil Gold 컬럼(50 Х 2.1 mm, 1.9 μm, Thermo Fisher Scientific Inc.)이다. 이동상(용매 A: 수중 0.1% 헵타플루오로부티르산(heptafluorobutyric acid; HFBA), 용매 B: 아세토니트릴 중 HFBA)을 다음의 용매 B의 용리 구배로 0.4 mL/분의 유속으로 용리시켰다: 10%(0.01분)→10%(0.5분)→100%(5분)→100%(6.5분). 다음으로, MS/MS 분석은 전기 분무 이온화(electrospray ionization; ESI) 소스를 이용하여, 양이온 모드에서 작동하는 Triple TOF 5600+(AB Sciex, Framingham, MA, USA)에 의해 수행하였다. 스퍼미딘(spermidine)은 146m/z(Q1)에서 72m/z(Q3)으로의 질량전이와 함께 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring; MRM)을 이용하여 정량화되었다. 동작 파라미터는 다음과 같이 설정되었다: 고분해능 MS; MRM 모드; 전자 분무 이온화(ESI); 분무 가스 50 psi; 가열 가스 50 psi; 커튼 가스 25 psi; 탈 용매 온도 500℃; 이온 스프레이 전압 플로팅 4.5kV; 충돌 가스 3.5m Torr.
13. 임상 분석
20 내지 59세의 총 22명 여성의 건강한 자원봉사자들의 사전 동의를 얻은 후 연구를 진행하였다. 첫날, 시험 에멀전을 적용하기 전에 모든 개인을 방문하여 기저 피부상태를 측정하였다. 각 지원자에게 대조 에멀전과 St 용액을 함유하는 에멀전을 제공하였다. 각 에멀전을 4주 동안 매일 각각의 볼에 도포하고, 1일, 14일, 28일 후에 검사하였다. 에멀전의 적용 및 검사 모두 20 내지 24℃, 45 내지 55% 상대습도 조건에서 수행하였다. 각질세포 영역(백색 영역)을 ImageJ를 사용하여 측정하였다.
안면의 앞면 영역의 밝기는 Mark-Vu 기구(PSIPLUS Co., LTD, Suwon, KOREA)와 연속 광원을 사용하여 측정하였다. 데이터를 Imax 플러스 소프트웨어로 분석하고 L값으로 표현하였다.
볼의 투명도는 반투명도 측정기(TLS850; Dia-Stron, Andover, UK)를 이용하여 측정하였다. 피부층에서 산란된 광의 강도는 광섬유 면판으로 측정하였다.
볼의 TEWL(trans-epidermal water loss)은 TEwameter TM300(Courage + Khazaka electronic GmbH, Koln, Germany)을 이용하여 25초 동안 측정하였다. TEWL은 피부의 보습 능력과 장벽 기능을 나타낸다.
안면의 광택은 Glossymeter GL200(Courage + Khazaka electronic GmbH)으로 5회 측정하였고, 평균값은 자동으로 계산되었다.
안면의 수분을 Corneometer CM825(Courage + Khazaka electronic GmbH)로 3회 측정하였고, 평균값은 자동으로 계산되었다. 물과 측정영역 사이의 유전상수 차이가 사용되었다.
안면의 탄성은 Cutometer Dual MPA580 (Courage + Khazaka electronic GmbH)으로 3회 측정하였고, 평균값은 자동으로 계산되었다. 부압(450mbar)의 적용 후, 신장된 피부층의 길이를 측정하였다. 단위 R2는 Ua/Uf로 정의하였고, Ua는 최종 후퇴, Uf는 최종 변형을 의미한다.
피부층의 박리는 D-squame 표준 샘플링 디스크(D100; Clinical & Derm, Texas, USA)와 Visioscan VC98(Courage + Khazaka electronic GmbH)를 이용하여 박리된 피부세포를 수확하여 측정하였다. D.I는 하기 수학식을 이용하여 계산하였다:
[수학식 1]
Figure 112020048868684-pat00001
(A는 각질영역의 비율(%), Tn은 두께와 연관된 각질세포의 비율, n은 두께수준(1에서 5)).
14. 통계적 분석
Wilcoxon-Mann-Whitney 검정을 이용하여 비모수 데이터에 대한 그룹 간 차이의 유의성을 계산하였다. Wilcoxon 부호있는 순위 검정은 짝 비교에 사용하였다. 각 테스트는 해당 도면 범례에서 식별되고, 피어슨 상관관계는 상관관계 분석에 사용하였으며, Student's two-tailed t 검정은 in vitro 세포분석에 사용하였다.
실험결과
1. 안면 피부 노화 관련 주요 미생물 군집 구성의 확인
실험 대상자를 노인(40 내지 53세)과 젊은이(20 내지 39세)의 두 그룹으로 나누었다. 먼저 미생물 조성을 정량하고, 나이와 관련하여 전체 안면 미생물 군을 평가했다. 안면 피부 샘플의 16S rRNA 시퀀싱을 수행하고, 26명의 노인과 26명의 젊은이를 비교한 결과, 동일한 5개의 가장 풍부한 문(phyla)가 양 그룹에 존재했다(도 6). 나이와 관련된 계층화의 부재는 미생물 거리(microbial distance) 측정에 의해 확인하였다(도 7a). 속(genus) 수준에서는 스트렙토코커스(Streptococcus) 만이 노인보다 젊은이에 풍부한 경향이 있었고(도 1a, 1b, 7b), 다른 속에서는 유의한 차이가 관찰되지 않았다(도 7c). 특히, 스트렙토코커스 인판티스(Streptococcus infantis)와 몇몇의 분류되지 않은 스트렙토코커스 종은 젊은이들에 상당히 풍부했다(도 1c). 이는, 스트렙토코커스 인판티스를 포함하는 스트렙토코커스 종들이 안면 피부 노화와 밀접한 관련이 있을 수 있음을 의미한다.
2. 스트렙토코커스와 안면의 생물리학적 특성 간 관계 확인
잠재적인 피부 노화 결정인자로서 스트렙토코커스의 선택을 위해 피부의 생물물리학적 특성을 확인하였다.
탄력은 안면 피부상태의 중요한 지표이며, 나이와 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 스트렙토코커스가 다양한 얼굴 탄력을 가진 개개인들 사이에서 얼마나 풍부한지 여부를 조사했다. 0에서 1까지로 탄성을 측정한 후, 탄성지수를 낮음(0 내지 0.3), 보통(0.4 내지 0.6), 높음(0.7 내지 1)의 세 그룹으로 나누었다. 탄력성이 높은 개인의 대부분은 젊은이 그룹에 속하였다(도 1d). 스트렙토코커스와 안면 피부 탄력 사이의 관계를 확인하기 위해, 연령 대비 탄성의 비율에 대한 스트렙토코커스의 상대적 풍부도를 다양한 개인으로부터 플로팅한 결과, 양의 상관관계를 산출했다(도 1e). 미생물 구성과 미생물 거리는 탄성이 낮거나 높은 개개인 사이에서 크게 다르지 않았으나(도 8), 스트렙토코커스 인판티스를 포함하여 스트렙토코커스는 저 탄력을 갖는 그룹에 비해 고 탄력을 갖는 그룹에서 현저하게 더 풍부하였다(도 8c, 8d).
안면의 수분 및 표면상태와 같은 다른 변수의 비교결과, 미생물 거리에 의존하지 않는 것으로 나타났다(도 9a, 9c). 스트렙토코커스 인판티스를 포함하는 스트렙토코커스는 매끄러운 피부 표면을 가진 개인에서 더 풍부하였으나(도 9b), 수분은 일부 역할을 하지 않는 것으로 나타났다(도 9d).
이러한 결과는, 스트렙토코커스가 안면의 피부 상태를 개선시킬 가능성이 높음을 나타내는 것이다.
3. 스트렙토코커스 산물의 피부 상태 관련 요인들의 조절능력 확인
젊은 개인의 안면에 사는 스트렙토코커스가 피부 노화와 관련이 있는지 여부를 확인하고자, 젊은 개인의 안면 피부에서 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 인판티스(Streptococcus infantis), 스트렙토코커스 미티스(Streptococcus mitis) 및 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)를 분리하였다. 피부상태에 대한 스트렙토코커스 후보들의 기능적 역할을 입증하기 위해, 스트렙토코커스 배양액의 상청액(St 용액)으로 1차 인간 피부 섬유아세포(primary human dermal fibroblasts; HDFs) 및 인간 상피 각질세포(human epidermal keratinocytes; HEKs)를 처리하였다.
분석에 앞서, St 용액이 상기 두가지 세포 유형에 독성이 없는지 확인하였고, 최대 10% St 용액으로 처리하는 것으로 후속 실험에 대한 최적 농도를 결정하였다(도 10a, 10b).
피부 노화에 대한 St 용액의 효과를 평가하기 위해, 진피 구조에 관여하는 유전자의 발현을 분석하였다. 스트렙토코커스 인판티스, 스트렙토코커스 뉴모니아 및 스트렙토코커스 미티스 용액은 세포 외 기질의 두가지 주요 성분인 COL1A1과 COL3A1의 발현을 유의하게 증가시켰다(도 2a).
또한, 주요 피부 탄성 섬유 유전자인 ELN 및 FBN1 역시 인간 피부 섬유아세포에서 St 용액에 의해 상당히 유도되었다(도 2b). 그 중, 스트렙토코커스 뉴모니아의 배양 배지는 가장 강력한 효과를 나타내었다.
또한, Poly I:C(Polyinosinic:polycytidylic acid)로 유도된 노화 피부 모델에 St 용액을 처리한 결과, 피부층의 다차원 모델은 보다 두꺼운 표피층을 보여주었다(도 11a 내지 11e).
게다가, St 용액으로 처리한 후, 피부의 장벽 기능을 담당하는 DSC2와 FLG와 같은 유전자의 mRNA 발현수준이 증가하였다(도 2c). 층판소체(lamellar body)와 세라마이드 합성을 가능하게 하는 GBA와 ABCA12 유전자에서도 유사한 경향이 관찰되었다(도 2d).
더 나아가, 피부 지질합성에 대한 St 용액의 거시적 영향과, 결과적인 HEK의 건강한 장벽유지능을 평가하였는데, 스트렙토코커스 인판티스, 스트렙토코커스 뉴모니아, 특히 스트렙토코커스 미티스 용액은 지질 축적을 증가시켜, 지질 합성 유전자의 발현 프로파일을 확인할 수 있었다(도 2e). 그러나, 배지만으로 처리하거나, 스트렙토코커스 써모필러스를 포함하는 배양 상청액으로 처리한 경우에는 동일한 결과를 얻을 수 없었다(도 10c, 10d).
4. 스트렙토코커스 후보군과 생물학적 경로 확인
스트렙토코커스 후보의 게놈 및 기능적 특성을 연구하기 위해, 전체 게놈을 분석한 결과, 세포 분석 결과와 일관되게 스트렙토코커스 인판티스와 스트렙토코커스 미티스는 가장 가까운 게놈 거리(genomic distance)를 보여주었고, 그 다음으로는 스트렙토코커스 뉴모니아와 가까웠다(도 3a). 이에, 스트렙토코커스 종을 2개의 그룹으로 나누었다: 1그룹(스트렙토코커스 인판티스, 스트렙토코커스 뉴모니아, 스트렙토코커스 미티스), 2그룹(스트렙토코커스 써모필러스).
게놈 단편에 주석(annotation)을 달고, 공통 유전자를 선택하기 위해 전체 게놈 분석을 수행하여 이들의 오솔로그(orthologous) 군집 클러스터를 비교하였으며, 그들의 기능적 역할을 확인하였다(도 3b, 도 12a). 스트렙토코커스 인판티스는 단일 유기체 탄수화물 대사과정, 글리세르알데히드-3-포스페이트 대사과정, L-아스코르브산 수송 및 글리코겐 생합성 과정과 같은 유전자 온톨로지(ontology) 용어가 풍부했다(도 3c). 스트렙토코커스 뉴모니아는 단당 대사과정, L-아스코르브산 이화과정 및 헥소오스 대사과정과 같은 유전자 온톨로지(ontology) 용어가 풍부했다(도 3d). 스트렙토코커스 미티스는 글리세르알데히드-3-포스페이트 대사과정, 글리코겐 생합성 과정, 글리세롤-3-포스페이트 대사과정 및 스퍼미딘 생합성 과정와 같은 유전자 온톨로지(ontology) 용어가 풍부했다(도 3e).
공통적인 용어에는 스퍼미딘 생합성 과정, 인지질 생합성 과정 및 글리코겐 생합성 과정이 포함되었다. 또한, 스퍼미딘 생합성 경로를 식별하는 게놈 분석을 입증하기 위해, St 용액을 이용하여 얻은 검정곡선(calibration curve)에 기초하여, 피크의 강도로부터 St 용액에서의 스퍼미딘을 정량화하였다(도 13). 2.68분으로 용리된(eluted) 스퍼미딘의 검정곡선은 5가지 농도(1 내지 5000 μg/L)를 이용하여 만들어졌다(도 13). St 용액 중 스퍼미딘의 함량은 332.8 μg/mL(TSB), 361.3 μg/mL(스트렙토코커스 인판티스), 635.3 μg/mL(스트렙토코커스 뉴모니아), 1026.9 μg/mL(스트렙토코커스 미티스), 208.8 μg/mL(스트렙토코커스 써모필러스)로 각각 측정되었다(도 4a 내지 4e).
5. 스트렙토코커스 산물의 복합적 피부생리의 개선능력 확인
상기 결과를 피부층의 개선과 연계시키기 위해, 피부 질환이 없는 건강한 지원자의 양 볼에 St 용액으로 구성된 에멀젼(St 에멀젼)을 처리하였다.
4주 후, St 에멀젼은 다양한 피부 파라미터를 유의하게 개선시켰다(도 5).
콜라겐 및 엘라스틴 유전자 발현의 증가로부터 예상할 수 있듯, St 에멀젼의 적용은 피부의 탄력을 증가시킨 반면(평균 ± 표준편차; 0.06 ± 0.041; 12.1%), 대조군의 경우 큰 차이를 보이지 않았고 테스트 기간 동안 피부 탄력이 기준치로 유지되었다(평균 ± 표준편차; 0.008 ± 0.030)(도 5a, 도 14a).
피부 보습에 대한 St 에멀젼의 효과를 TEWL 및 각질층 수분 함량을 분석하여 확인한 결과, St 에멀젼 처리군의 경우 TEWL 점수가 처리전 대비 4주 후 2.451 ± 3.304(평균 ± 표준편차; 11.3%) 감소한 반면, 대조군의 경우 유의하게 감소하지 않았다(도 5b, 도 14b). 또한, St 용액 처리군의 피부 수화정도는 처리 전 대비 4주 후에 유의하게 더 높았고(52.40 ± 0.379 A.U 에서 66.386 ± 7.729 A.U; 28.7% 증가), 대조군 대비(51.833 ± 8.745 A.U 에서 57.965 ± 7.675 A.U; 13.3% 증가) 그 증가도가 유의하게 더 높았다(도 5c, 도 14c).
증가된 피부 지질의 함량으로부터의 효과를 확인하기 위해, 안면 광택을 평가하였다. 기준 피부 광택 값은 St 에멀젼 처리군의 경우 9.160 ± 1.682, 대조군 에멀젼 처리군의 경우 9.259 ± 1.782였다. 처리 4주 후, St 에멀젼 처리군의 경우 19.1% 증가하였고, 대조군 에멀젼 처리군의 경우 11.8% 증가함을 확인하였고, 이로써 St 에멀젼이 피부 광택을 유의하게 향상시켰음을 확인할 수 있다(도 5d, 도 14d).
이러한 St 에멀젼 처리군에 있어서의 수분과 지질 조성의 개선은 또한, 일반적으로 고령자에서 증가하는 박리작용을 감소시켰다. 각질세포 면적의 감소를 통해 확인한 결과, St 에멀젼 처리군에서의 박리지수(Desquamation Index; DI)는 처리 전 대비 처리 4주 후 기준선에 비해 18.4% 급격히 감소한 반면, 대조군의 박리지수는 9.7%만 감소하는 데에 그쳤다.
또한, St 에멀젼 처리군에서, 처리 전 대비 처리 4주 후, 피부의 밝기가 1.784만큼 유의하게 증가하였고(대조군의 경우, 0.909 증가; 도 14f), 피부의 투명도가 6.280%만큼 감소하였다(도 14g).
이러한 결과는, 상기 St 에멀젼이 노화 및 장벽 기능 관련 피부 생리학적 파라미터를 효율적으로 개선하면서, 다중 피부층의 피부 상태를 개선시킬 수 있음을 시사하는 것이다.
6. 분리된 균주의 물질 이용능 분석
상기 분리한 균주(스트렙토코커스 뉴모니아, 스트렙토코커스 인판티스, 스트렙토코커스 미티스)의 물질 이용능을 분석하기 위해서 하기와 같이 수행하였다. BioLOG GP2, API 50 를 사용하여 확인하였으며, 시험 방법은 Omnilog, Biomeriuse 에서 제공되는 시험방법을 참고하여 사용하였다. 배양온도 및 배양 배지는 해당 균주에 맞는 온도를 사용하여 배양하였으며, 48시간 배양된 집락 콜로니 5개를 취하여 시약에 현탁하여 사용하였다. 접종량은 150μl 이었다. 현탁액은 각 제조사에서 제공되는 키트의 구성품을 사용하였다. 균주를 접종하지 않았을 때는 투명한 액체상태이다. 접종된 플레이트 및 스트립은 37℃에서 48시간 배양하여 확인하였으며, 최대 72시간까지 배양된 결과를 확인하였다. 접종 당시 투명한 액체였지만 보라색 또는 붉은색으로 변환된 웰은 양성으로 판단하였다. 상기와 같이 실험한 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
S.infantis
(CX-2)		 S.infantis
(CX-4)		 S.mitis
(CX-8)
Negative Control
D-Raffinose +
α-D-Glucose + + +
D-Sorbitol
Gelatin
Pectin + + +
p-Hydroxy-Phenylacetic Acid
Tween 40 + +
Dextrin + + +
α-D-Lactose + + +
D-Mannose + + +
D-Mannitol
Glycyl-L-Proline
D-Galacturonic Acid +
Methyl Pyruvate
γ-Amino-Butyric Acid
D-maltose + + +
D-Melibiose +
D-Fructose + + +
D-Arabitol
L-Alanine
L-Galactonic Acid Lactone +
D-Lactic Acid Methyl Ester
α-Hydroxy-Butyric Acid +
D-Trehalose
β-Methyl-D-Glucoside
D-Galactose + +
myo-Inositol
L-Arginine
D-Gluconic Acid
L-Lactic Acid
β-Hydroxy-D,L-Butyric Acid
D-Cellobiose + + +
D-Salicin +
3-Methyl Glucose
Glycerol +
L-Aspartic Acid
D-Glucuronic Acid
Citric Acid
α-Keto-Butyric Acid
Gentiobiose + +
N-Acetyl-D-Glucosamine + +
D-Fucose
D-Glucose-6-PO4
L-Glutamic Acid
Glucuronamide + +
α-keto-Glutaric Acid
Acetoacetic Acid + + +
Sucrose + + +
N-Acetyl-β-D-Mannosamine + + +
L-Fucose
D-Fructose-6-Po4 +
L-Histidine
Mucic Acid
D-Malic Acid
Propionic Acid +
D-Turanose +
N-Acetyl-D-Galactosamine +
L-Rhamnose
D-Aspartic Acid
L-Pyroglutamic Acid
Quinic Acid
L-Malic Acid
Acetic Acid + +
Stachyose + + +
N-Acetyl Neuraminic Acid + +
Inosine +
D-Serine
L-Serine
D-Saccharic Acid
Bromo-Succinic Acid
Formic Acid +
Positive control + + +
pH 6 + + +
pH 5
1% NaCl + + +
4% NaCl +
8% NaCl +
1% Sodium Lactate + + +
Fusidic acid + +
D-Serine + +
Troleandomycin + +
Rifamycin SV + +
Minocycline + +
Lincomycin + +
Guanidine HCl +
Niaproof 4
Vancomycin + +
Tetrazolium Violet + +
Tetrazolium Blue + +
Nalidixic Acid + + +
Lithium Chloride +
Potassium Tellurite + + +
Aztreonam + + +
Sodium Butyrate +
Sodium Bromate
한국미생물보존센터(국외) KCCM12642P 20191218
<110> COSMAX INC. <120> Composition for strengthening skin barrier, moisturizing skin or anti-aging <130> PN132881KR <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptococcus infantis 16S rRNA <400> 1 gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtagaac gctgaaggag gagcttgctc 60 ttctggatga gttgcgaacg ggtgagtaac gcgtaggtaa cctgcctggt agcgggggat 120 aactattgga aacgatagct aataccgcat aacagtagat atcgcatgat agctgcttga 180 aaggtgcaat tgcaccacta ccagatggac ctgcgttgta ttagctagtt ggtgaggtaa 240 cggctcacca aggcaacgat acatagccga cctgagaggg tgatcggcca cactgggact 300 gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttcggca atggacggaa 360 gtctgaccga gcaacgccgc gtgagtgaag aaggttttcg gatcgtaaag ctctgttgta 420 agagaagaac gagtgtgaga gtggaaagtt cacactgtga cggtatctta ccagaaaggg 480 acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt cccgagcgtt gtccggattt 540 attgggcgta aagcgagcgc aggcggttag ataagtctga agttaaaggc tgtggcttaa 600 ccatagtacg ctttggaaac tgtttaactt gagtgcaaga ggggagagtg gaattccatg 660 tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggag gaacaccggt ggcgaaagcg gctctctggc 720 ttgtaactga cgctgaggct cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag 780 tccacgccgt aaacgatgag tgctaggtgt tagacccttt ccggggttta gtgccgaagc 840 taacgcatta agcactccgc ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc aaaggaattg 900 acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt 960 accaggtctt gacatccctc tgaccgctct agagatagag ttttccttcg ggacagaggt 1020 gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1080 cgagcgcaac ccctattgtt agttgccatc atttagttgg gcactctagc gagactgccg 1140 gtaataaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc 1200 tacacacgtg ctacaatggt tggtacaacg agtcgcaagc cggtgacggc aagctaatct 1260 cttaaagcca atctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg cctacatgaa gtcggaatcg 1320 ctagtaatcg cggatcagca cgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1380 cgtcacacca cgagagtttg taacacccga agtcggtgag gtaaccattt ggagccagcc 1440 gcctaaggtg ggatagatga ttggggtg 1468

Claims (20)

  1. 스퍼미딘(Spermidine) 생산능을 갖는, 기탁번호 KCCM12642P의 스트렙토코커스 인판티스(Streptococcus infantis) 균주.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 서열로 이루어진 16S rRNA를 갖는 것인 균주.
  3. 기탁번호 KCCM12642P의 스트렙토코커스 인판티스(Streptococcus infantis) 균주, 이의 용해물 또는 배양물을 포함하는 피부 장벽 강화용 화장료 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 배양물은 스퍼미딘(Spermidine)을 포함하는 것인 화장료 조성물.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 균주, 이의 용해물 또는 배양물을 조성물 총 중량 대비 0.5 내지 80 중량%로 포함하는 화장료 조성물.
  6. 기탁번호 KCCM12642P의 스트렙토코커스 인판티스(Streptococcus infantis) 균주, 이의 용해물 또는 배양물을 포함하는 피부 장벽 강화용 건강기능식품.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 배양물은 스퍼미딘(Spermidine)을 포함하는 것인 건강기능식품.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 균주, 이의 용해물 또는 배양물을 조성물 총 중량 대비 0.5 내지 80 중량%로 포함하는 건강기능식품.
  9. 기탁번호 KCCM12642P의 스트렙토코커스 인판티스(Streptococcus infantis) 균주, 이의 용해물 또는 배양물을 포함하는 피부 보습용 화장료 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 배양물은 스퍼미딘(Spermidine)을 포함하는 것인 화장료 조성물.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 균주, 이의 용해물 또는 배양물을 조성물 총 중량 대비 0.5 내지 80 중량%로 포함하는 화장료 조성물.
  12. 기탁번호 KCCM12642P의 스트렙토코커스 인판티스(Streptococcus infantis) 균주, 이의 용해물 또는 배양물을 포함하는 피부 보습용 건강기능식품.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 배양물은 스퍼미딘(Spermidine)을 포함하는 것인 건강기능식품.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 균주, 이의 용해물 또는 배양물을 조성물 총 중량 대비 0.5 내지 80 중량%로 포함하는 건강기능식품.
  15. 기탁번호 KCCM12642P의 스트렙토코커스 인판티스(Streptococcus infantis) 균주, 이의 용해물 또는 배양물을 포함하는 피부 탄력 증진용 화장료 조성물.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 배양물은 스퍼미딘(Spermidine)을 포함하는 것인 화장료 조성물.
  17. 청구항 15에 있어서, 상기 균주, 이의 용해물 또는 배양물을 조성물 총 중량 대비 0.5 내지 80 중량%로 포함하는 화장료 조성물.
  18. 기탁번호 KCCM12642P의 스트렙토코커스 인판티스(Streptococcus infantis) 균주, 이의 용해물 또는 배양물을 포함하는 피부 탄력 증진용 건강기능식품.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 배양물은 스퍼미딘(Spermidine)을 포함하는 것인 건강기능식품.
  20. 청구항 18에 있어서, 상기 균주, 이의 용해물 또는 배양물을 조성물 총 중량 대비 0.5 내지 80 중량%로 포함하는 건강기능식품.
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