KR102153535B1

KR102153535B1 - 동맥경화증 치료를 위한 화물치환 분해성 나노바이오소재

Info

Publication number: KR102153535B1
Application number: KR1020180141853A
Authority: KR
Inventors: 박지호; 김희곤
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2018-03-30
Filing date: 2018-11-16
Publication date: 2020-09-08
Also published as: KR20190114720A

Abstract

본 발명은 동맥경화증 치료를 위한 화물치환 분해성 나노바이오소재에 관한 것으로서, 본 발명의 사이클로덱스트린 또는 사이클로덱스트린 유도체, 및 스타틴계 화합물의 복합체는 콜레스테롤 결정으로부터 콜레스테롤과 스타틴을 치환함으로써 콜레스테롤 결정을 분해하고, 대식세포 및 포말세포로 흡수되어 세포사멸을 유도함으로써, 죽종형성을 억제하고 동맥경화반을 퇴행시키므로, 동맥경화증의 예방 또는 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.

Description

동맥경화증 치료를 위한 화물치환 분해성 나노바이오소재{Cargo-switching dissociable nanobiomaterial for treatment of atherosclerosis}

본 발명은 동맥경화증 치료를 위한 화물치환 분해성 나노바이오소재에 관한 것이다.

동맥경화증(atherosclerosis)은 죽상경화증 또는 죽상동맥경화증이라고도 하며, 주로 혈관 내막에 콜레스테롤이 침착하고, 내피세포의 증식이 일어나면서 죽종(atheroma)이 형성되는 혈관질환을 말하며, 죽종에 의하여 혈관의 지름이 좁아지거나 혈관이 막히게 되어, 말초로의 혈류 장애를 초래하는 만성 질환이다. 동맥경화증은 주로 심장에 혈액을 공급하는 관상동맥, 뇌에 혈액을 공급하는 뇌동맥과 경동맥, 신장의 신동맥 및 말초혈관 등에 나타난다.

동맥경화증의 발생 및 진행에는 콜레스테롤의 대사 이상 및 만성 염증반응이 큰 영향을 끼친다. 혈중 저밀도 지단백(low-density lipoprotein, LDL)이 내피하조직(subendothelium)의 세포외 기질(extracellular matrix)에 축적된 후, 조직 내에서 경도로 산화되며, 이는 내피세포에 작용하여 단핵구의 유입을 증가시킨다. 유입된 단핵구는 대식세포(macrophages)로 분화되고, 활성화되어 저밀도 지단백을 더욱 산화시키며, 이를 다량 섭취하여 포말세포(foam cell)로 분화한다. 포말세포가 다량 형성된 후 M2 대식세포에 의해 세포 외로 적절히 제거되지 못하면, 내막에 콜레스테롤과 함께 쌓이면서 죽종을 형성하고, 이를 감싸는 동맥경화반(atherosclerotic plaque)이 형성된다. 불안정해진 동맥경화반이 파열하게 되면, 혈전증 등 급성 심혈관계 질환으로 이어지게 된다.

따라서, 동맥경화반의 주요 성분이자 염증반응을 유발하는 콜레스테롤 결정 및 대식세포의 축적을 억제하는 것이 동맥경화증의 개선 또는 치료를 위한 중요한 표적이 된다. 그럼에도, 현재까지 콜레스테롤 결정을 직접적으로 분해함과 동시에 대식세포 사멸을 유도하여 제거할 수 있는 동맥경화증 치료제는 보고된 바가 없다.

한편, 스타틴(statin)은 콜레스테롤 합성 단계 중 HMG-CoA (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A)가 메발론산(mevalonic acid)으로 변환되는 단계에서 촉매작용을 하는 율속효소(rate-limiting enzyme)인 HMG-CoA 환원효소(reductase)를 경쟁적으로 억제하여 세포내 콜레스테롤의 합성을 줄이는 약물이다. 간세포 내 콜레스테롤 합성이 억제되어 농도가 감소하면 그 보상기전으로 간세포 표면에 있는 LDL 수용체의 발현이 증가하고 혈장으로부터 LDL 및 LDL 전구체(precursor)의 간세포 내로의 유입(uptake)이 증가하며, 결과적으로는 혈장 LDL-콜레스테롤 농도가 감소한다(Jun, J. 등, Korean Circulation J. 31(9), 849-856 (2001)). 이에, 스타틴계 약물들은 심혈관계 질환(cardiovascular disease) 및 관상동맥성 심장질환(coronary heart disease)을 조절하기 위한 콜레스테롤 저하제(cholesterol-lowering drugs)로 널리 이용되고 있다.

현재 사용되고 있는 스타틴계 약물로는 아토바스타틴(atorvastatin), 심바스타틴(simvastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 피타바스타틴(pitavastatin), 로바스타틴(lovastatin), 프라바스타틴(pravastatin), 로수바스타틴(rosuvastatin), 세리바스타틴(cerivastatin) 및 메바스타틴(mevastatin) 등이 있다. 스타틴은 LDL 콜레스테롤 저하 효과 외에도, 간세포에서 아포지단백(apolipoprotein; Apo) B-100의 합성을 억제하며, 트리글리세리드가 풍부한 지단백(triglyceride rich lipoproteins)의 합성 및 분비도 감소시킨다고 보고되는 등 다양한 항동맥경화 효과가 제시되고 있다. 다만, 스타틴계 약물은 경구 투여 시, 생체이용률(bioavailability)이 낮고 고농도에서는 근육 및 간에 대한 심각한 부작용이 있다는 문제점이 있다. 이에, 스타틴의 생체이용률을 높이거나 스타틴을 동맥경화반의 대식세포에 선택적으로 도달시키기 위한 연구가 진행되어 왔으나, 이러한 연구들은 주로 스타틴의 항동맥경화 효과를 증가시키는데 집중되어 있다.

본 발명의 목적은 화물치환 분해성 나노바이오소재를 이용한 동맥경화증의 예방 또는 치료 용도 및 상기 나노바이오소재의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사이클로덱스트린(cyclodextrin) 또는 사이클로덱스트린 유도체, 및 스타틴계 화합물의 복합체(complex)를 유효성분으로 함유하는 동맥경화증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 사이클로덱스트린 또는 사이클로덱스트린 유도체 및 스타틴계 화합물을 각각 용매에 용해시킨 후 혼합하는 단계; 2) 상기 혼합액을 진공 하에서 건조시킨 후, 다시 수화시켜 복합체를 형성하는 단계; 및 3) 상기 복합체를 인지질로 코팅하는 단계를 포함하는 화물치환 나노입자의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 사이클로덱스트린 또는 사이클로덱스트린 유도체, 스타틴계 화합물 및 인지질을 각각 용매에 용해시킨 후 혼합하는 단계; 2) 상기 혼합액을 진공 하에서 건조시키는 단계; 및 3) 상기 건조물을 다시 수화시키는 단계를 포함하는 화물치환 나노입자의 대량 제조방법을 제공한다.

본 발명의 사이클로덱스트린 또는 사이클로덱스트린 유도체, 및 스타틴계 화합물의 복합체는 콜레스테롤 결정으로부터 콜레스테롤과 스타틴을 치환함으로써 콜레스테롤 결정을 분해하고, 대식세포 및 포말세포로 흡수되어 세포사멸을 유도함으로써, 죽종형성을 억제하고 동맥경화반을 퇴행시키므로, 동맥경화증의 예방 또는 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 화물치환 나노입자(cargo-switching nanoparticle, CSNP)의 준비 및 이의 콜레스테롤-민감성(cholesterol-sensitive) 치료 특성을 도식화한 것이다.
((a) 화물치환 나노입자의 제조과정; (b) 화물치환 나노입자의 콜레스테롤-민감성 치료 특성; ST: 스타틴(statin); CD: 사이클로덱스트린(cyclodextrin); PEG: 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol); 및 CC: 콜레스테롤 결정(cholesterol crystal)).
도 2는 사이클로덱스트린과 스타틴의 복합체(CD-ST) 및 사이클로덱스트린과 콜레스테롤의 복합체(CD-CHOL)의 유체역학적 크기(hydrodynamic size)를 나노입자분석기(dynamic light scattering)로 측정하여 나타낸 도이다.
도 3은 사이클로덱스트린-콜레스테롤(CD-CHOL) 및 사이클로덱스트린-스타틴(CD-ST) 복합체(complex)의 형성 및 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 결과를 나타낸 도이다.
((a) 콜레스테롤 응집체(CHOL aggregate), 사이클로덱스트린-콜레스테롤 복합체(CD-CHOL complex), 스타틴 응집체(ST aggregate) 및 사이클로덱스트린-스타틴 복합체(CD-ST complex)의 형성 및 PD-10 탈염 칼럼(PD-10 desalting column)에의 통과 여부에 대한 모식도; (b) 사이클로덱스트린 존재 여부에 따른 콜레스테롤의 용출 프로파일(elution profile); 및 (c) 사이클로덱스트린 존재 여부에 따른 스타틴의 용출 프로파일)
도 4는 콜레스테롤(CHOL) 및 스타틴(ST)의 사이클로덱스트린(CD)에 대한 경쟁적 결합을 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
((a) 실험 과정에 대한 모식도; (b) 스타틴 존재 여부에 따른 콜레스테롤의 용출 프로파일(elution profile; 위) 및 콜레스테롤 존재 여부에 따른 스타틴의 용출 프로파일 (아래); 및 (c) 총 용출량 중 콜레스테롤 및 스타틴이 사이클로덱스트린과 결합하여 용출된 비율을 계산한 그래프)
도 5는 사이클로덱스트린(CD)-스타틴(ST) 복합체(complex)의 화물치환 특성을 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
((a) 실험 과정에 대한 모식도; (b) 배양 시간에 따른 콜레스테롤 (위) 및 스타틴 (아래)의 용출 프로파일(elution profile); (c) 총 용출량 중 콜레스테롤 및 스타틴이 사이클로덱스트린과 결합하여 용출된 비율을 계산하여 배양 시간에 따라 나타낸 그래프; PBS: 인산염 완충액; 및 CHOL: 콜레스테롤)
도 6은 화물치환 나노입자(CSNP)의 인지질 농도 최적화 실험 결과 및 화물치환 나노입자의 특성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
((a) 인지질의 농도 및 코팅 시간에 따른 코팅된 사이클로덱스트린-스타틴 복합체의 유체역학적 크기(hydrodynamic size)를 나노입자분석기(dynamic light scattering)로 측정한 결과를 나타낸 그래프; (b) 화물치환 나노입자의 유체역학적 크기 분포; (c) 화물치환 나노입자의 제타 포텐셜(zeta potential) 분포; (d) 화물치환 나노입자의 투과전자현미경(transmission electron microscopy, TEM) 사진. 기준자는 200 nm이며, 확대사진의 기준자는 20 nm이다; (e) 화물치환 나노입자의 혈청 안정성(serum stability) 확인 결과; (f) 화물치환 나노입자의 화물치환 특성을 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)로 분석하여, 총 용출량 중 콜레스테롤(CHOL) 및 스타틴(ST)이 사이클로덱스트린(CD)과 결합하여 용출된 비율을 계산하여 배양 시간에 따라 나타낸 그래프; 및 (g) 화물치환 나노입자의 ¹H-HNR 분석 결과)
도 7은 시험관 내(in vitro)에서 화물치환 나노입자(CSNP)의 콜레스테롤 결정(cholesterol crystal, CC)에 대한 결합 및 분해 효과를 나타낸 도이다.
((a) 콜레스테롤 결정(녹색)에 결합한 화물치환 나노입자(붉은색)의 공초점 형광 현미경(confocal fluorescence microscope) 사진. 기준자는 50 ㎛이다; (b) 화물치환 나노입자, 사이클로덱스트린(CD) 및 사이클로덱스트린 + 리포좀(liposome) 혼합물(CD+LP)의 콜레스테롤 결정 분해 효과를 사이클로덱스트린 농도에 따라 나타낸 그래프(좌) 및 사이클로덱스트린의 농도가 3 mM인 화물치환 나노입자를 콜레스테롤 결정과 24시간 반응시킨 전(CSNP-) 및 후(CSNP+)의 명시야 현미경(bright-field microscope) 사진(우); (c) 화물치환 나노입자의 콜레스테롤 결정에 대한 분해 효과를 반응 시간에 따라 나타낸 그래프; 및 DIC: 차등간섭대비(differential interference contrast))
도 8은 화물치환 나노입자(CSNP)의 대식세포(Raw 264.7 및 J774A.1)에 대한 흡수 및 세포독성을 나타낸 도이다.
((a) Raw 264.7 세포에서 LysoTracker로 염색한 리소좀(lysosome, 녹색) 및 형광 표지된 화물치환 나노입자(붉은색)의 공초점 형광 현미경(confocal fluorescence microscope) 사진. 기준자는 10 ㎛이다; (b) J774A.1 세포에서 LysoTracker로 염색한 리소좀(녹색) 및 형광 표지된 화물치환 나노입자(붉은색)의 공초점 형광 현미경 사진. 기준자는 10 ㎛이다; (c) Raw 264.7 세포에 화물치환 나노입자, 스타틴(ST) 또는 리포좀(LP)을 처리한 후의 세포생존율(cell viability)을 MTT 분석법으로 측정하여, 처리 시간(1, 2 및 3일)에 따라 나타낸 그래프; (d) J774A.1 세포에 화물치환 나노입자, 스타틴 또는 리포좀을 처리한 후의 세포생존율을 MTT 분석법으로 측정하여, 처리 시간(1, 2 및 3일)에 따라 나타낸 그래프; (e) Raw 264.7 세포에 화물치환 나노입자를 처리한 후의 세포생존율을 MTT 분석법으로 측정하여 스타틴의 농도에 따라 나타낸 그래프; (f) J774A.1 세포에 화물치환 나노입자를 처리한 후의 세포생존율을 MTT 분석법으로 측정하여 스타틴의 농도에 따라 나타낸 그래프; 및 DIC: 차등간섭대비(differential interference contrast))
도 9는 화물치환 나노입자(CSNP)의 활성화된 대식세포(포말세포(foam cell) 및 전염증성 대식세포(proinflammatory macrophages))에 대한 세포독성 증폭 여부를 나타낸 도이다.
((a) 저밀도 지단백(low-density lipoprotein, LDL)을 처리한 Raw 264.7 세포를 Oil-Red-O 및 헤마톡실린(hematoxylin)으로 염색한 명시야 현미경(bright-field microscope) 사진. 기준자는 20 ㎛이다; (b) 화물치환 나노입자의 Raw 264.7 세포에 대한 세포독성이 LDL 전처리 여부에 따라 증폭되는 효과를 MTT 분석법으로 확인한 그래프 (**p < 0.01, unpaired two-tailed Student's t test); (c) 화물치환 나노입자의 Raw 264.7 세포에 대한 세포독성이 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS) 전처리 여부와 무관함을 MTT 분석법으로 확인한 그래프 (NS, not sifnificant, unpaired two-tailed Student's t test); (d) Raw 264.7 세포에서 형광 표지된 LDL(녹색)을 전처리 한 후, 형광 표지된 화물치환 나노입자(붉은색)를 처리한 뒤의 공초점 형광 현미경(confocal fluorescence microscope) 사진. 기준자는 20 ㎛이다; 및 DIC: 차등간섭대비(differential interference contrast))
도 10은 화물치환 나노입자(CSNP)의 혈중 반감기(blood half-life) 및 부분 경동맥 결찰 마우스 모델(partial carotid ligation mouse model)에서의 생체 내 분포(biodistribution), 좌측 경동맥(left carotid artery, LCA)에서의 콜레스테롤과의 상호작용, 대식세포로의 흡수 및 대식세포에 대한 세포사멸 유도 효과를 나타낸 도이다.
((a) wild-type 마우스에서 화물치환 나노입자의 혈중 반감기; (b) 부분 경동맥 결찰 마우스 모델에서의 실험 일정; (c) 부분 경동맥 결찰 마우스 모델에서 화물치환 나노입자의 생체 내 분포; (d) 부분 경동맥 결찰 마우스 모델에서 적출한 경동맥의 명시야(bright-field) 및 형광(fluorescence) 현미경 사진; (e) 부분 경동맥 결찰 마우스 모델의 좌측 경동맥(LCA) 및 우측 경동맥(RCA) 절편에서 Filipin으로 염색된 콜레스테롤(푸른색)의 이광자 현미경(two-photon microscope) 사진 및 형광 표지된 화물치환 나노입자(붉은색)의 공초점 현미경(confocal microscope) 사진. 기준자는 200 ㎛이다; (f) 부분 경동맥 결찰 마우스 모델의 좌, 우 경동맥 절편에서 CD68로 염색된 대식세포(붉은색) 및 형광 표지된 화물치환 나노입자(녹색)의 공초점 현미경 사진. 기준자는 200 ㎛이다; (g) 부분 경동맥 결찰 마우스 모델의 좌, 우 경동맥 절편에서 CD68로 염색된 대식세포(붉은색) 및 TUNEL로 염색된 세포사멸 중인 세포(녹색)의 공초점 현미경 사진. 기준자는 200 ㎛이다; (h) 부분 경동맥 결찰 마우스 모델의 좌측 경동맥 절편에서 화물치환 나노입자의 처리 여부에 따른 세포사멸 중인 세포의 정량 그래프 (*p < 0.05, unpaired two-tailed Student's t test); 및 (i) 부분 경동맥 결찰 마우스 모델의 좌측 경동맥 절편에서 화물치환 나노입자의 투여 여부에 따른 CD68로 염색된 대식세포(붉은색) 및 TUNEL로 염색된 세포사멸 중인 세포(녹색)의 공초점 형광 현미경 사진. 두번째 및 세번째 열의 사진은 첫번째 열의 사각형 표시한 부분의 확대도이며, 기준자는 200 ㎛이다.)
도 11은 부분 경동맥 결찰 모델(partial carotid ligation mouse model)에서 화물치환 나노입자(CSNP)의 죽종형성(atherogenesis) 억제 효과를 나타낸 도이다.
((a) 약물 투여 일정; (b) Oil-Red-O로 염색한 좌측 경동맥(left carotid artery, LCA) 절편의 명시야 현미경(bright-field microscope) 사진. 기준자는 200 ㎛이다; (c) 적출된 경동맥의 명시야 현미경 사진; (d) 전체 좌측 경동맥 부위에 대한 동맥경화반(atherosclerotic plaque) 병변 영역의 비율을 나타낸 그래프 (*p < 0.05, one-way ANOVA and Tukey's multiple comparisons test); (e) 좌측 경동맥 절편에서 동맥경화반 영역을 정량하여 나타낸 그래프 (***p < 0.001, one-way ANOVA and Tukey's multiple comparison test); (f) 좌측 경동맥 절편에서 대식세포를 CD68로 염색한 후, 대식세포 영역을 정량하여 나타낸 그래프 (***p < 0.001, one-way ANOVA and Tukey's multiple comparison test); (g) 혈장 콜레스테롤 농도를 측정하여 나타낸 그래프 (NS, not significant, one-way ANOVA and Tukey's multiple comparison test); (h) 실험 기간 동안의 각 군별 마우스의 몸무게 변화; (i) 혈중 alanine transaminase (ALT) 농도 측정 결과 (NS, not significant, one-way ANOVA and Tukey's multiple comparisons test); (j) 혈중 aspartate transaminase (AST) 농도 측정 결과 (NS, not significant, one-way ANOVA and Tukey's multiple comparisons test); CD: 사이클로덱스트린; ST: 스타틴; 및 LP-ST: 리포좀 및 스타틴의 혼합물)
도 12는 고지방 식이 유도 동맥경화증 마우스 모델(high-fat diet(HFD)-induced atherosclerosis mouse model)에서 화물치환 나노입자(CSNP)의 동맥경화반 퇴행(plaque regression) 효과를 나타낸 도이다.
((a) 적출된 대동맥(aortic tree)의 명시야(bright-field) 및 형광(fluorescence) 현미경 사진; (b) 약물 투여 일정; (c) Oil-Red-O로 염색한 완두동맥(brachiocephalic artery) 및 대동맥궁(aortic arch) 절편의 명시야 현미경 사진. 기준자는 200 ㎛이다; (d) 완두동맥 절편에서 동맥경화반(atherosclerotic plaque) 영역을 정량한 결과 (*p < 0.05, unpaired two-tailed Student's t test); (e) 대동맥궁 절편에서 동맥경화반 영역을 정량한 결과 (*p < 0.05, unpaired two-tailed Student's t test); (f) 혈장 콜레스테롤 농도를 측정하여 나타낸 그래프 (NS, not significant, unpaired two-tailed Student's t test); (g) 실험 기간 동안의 각 군별 마우스의 몸무게 변화; (h) 혈중 alanine transaminase (ALT) 농도 측정 결과 (NS, not significant, unpaired two-tailed Student's t-test); (i) 혈중 aspartate transaminase (AST) 농도 측정 결과 (NS, not significant, unpaired two-tailed Student's t-test); 및 (j) 상대적 HMG-CoA reductase (HMGCR) 활성 측정 결과 (**p < 0.01, unpaired two-tailed Student's t test))
도 13은 고지방 식이 유도 동맥경화증 마우스 모델에서 화물치환 나노입자의 동맥경화반 형성 억제 및 퇴행 효과를 나타낸 도이다.
((a) 실험 일정, (b) Oil-Red-O로 염색한 대동맥 조직 절편 및 대동맥 조직 사진, (c) 대동맥 기부(aortic root)의 손상 영역을 측정한 결과 그래프, (d) 대동맥궁(aortic arch)의 손상 영역을 측정한 결과 그래프, 및 (e) 흉대동맥(thoracic aorta)의 손상 영역을 측정한 결과 그래프)
도 14는 실시예 2 및 실시예 5의 제조방법으로 제조된 각 화물치환 나노입자(CSNP)의 콜레스테롤 결정 분해 효과(a) 및 대식세포에 대한 세포독성(b)을 측정한 결과 그래프이다.
도 15는 화물치환 나노입자(CSNP)의 사람에서의 동맥경화증 치료 효과에 대한 개략도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 사이클로덱스트린 또는 사이클로덱스트린 유도체, 및 스타틴계 화합물의 복합체를 유효성분으로 함유하는 동맥경화증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 사이클로덱스트린 유도체는 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 유도체를 모두 포함할 수 있으며, 구체적으로 메틸-β-사이클로덱스트린(methyl-β-cyclodextrin)일 수 있다.

상기 스타틴계 화합물은 아토바스타틴(atorvastatin), 심바스타틴(simvastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 피타바스타틴(pitavastatin), 로바스타틴(lovastatin), 프라바스타틴(pravastatin), 로수바스타틴(rosuvastatin), 세리바스타틴(cerivastatin) 및 메바스타틴(mevastatin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 복합체는 사이클로덱스트린 또는 사이클로덱스트린 유도체, 및 스타틴계 화합물을 몰농도 비로서 0.5 내지 15:1, 0.8 내지 15:1, 1 내지 15:1, 2 내지 15:1, 4 내지 15:1, 0.5 내지 12:1, 0.8 내지 12:1, 1 내지 12:1, 2 내지 12:1, 4 내지 12:1, 0.5 내지 11:1, 0.8 내지 11:1, 1 내지 11:1, 2 내지 11:1, 4 내지 11:1, 0.5 내지 8:1, 0.8 내지 8:1, 1 내지 8:1, 2 내지 8:1, 4 내지 8:1, 0.5 내지 7:1, 0.8 내지 7:1, 1 내지 7:1, 2 내지 7:1 또는 4 내지 7:1로 배합하여 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 복합체는 코팅된 것일 수 있다. 또한, 상기 코팅은 친수성 및 소수성을 갖는 분자로서 소포체 형태를 형성할 수 있는 분자로 실시될 수 있으며, 구체적으로 인지질로 실시될 수 있다.

상기 인지질은 포스파티딜콜린(Phosphatidylcholine), 포스파티딜글리세롤(Phosphatidylglycerol), 포스파티딜에탄올아민(Phosphatidylethanolamine) 및 포스파티딜세린(Phosphatidylserine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 포스파티딜콜린은 DDPC (1,2-Didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DLPC (1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DMPC (1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DPPC (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DSPC (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 또는 DEPC (1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)일 수 있다.

상기 포스파티딜글리세롤은 DMPG (1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol)), DPPG (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol)), DSPG (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol)) 또는 POPG (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol))일 수 있다.

상기 포스파티딜에탄올아민은 DMPE (1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DPPE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DSPE (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) 또는 DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)일 수 있다.

상기 포스파티딜세린은 DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoserine)일 수 있다.

또한, 상기 인지질은 염(salt)화 또는 탈염되거나, 수소화 또는 부분 수소화되거나, 또는 천연, 반합성 또는 합성일 수 있으며, 수용성 또는 친수성 중합체가 컨쥬게이션될 수 있다. 상기 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)일 수 있으며, 통상적으로 사용되는 시판 PEG로는 PEG 350, PEG 550, PEG 750, PEG 1000, PEG 2000, PEG 3000 및 PEG 5000이 포함된다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 인지질은 DOPC 및 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG)가 혼합된 지질 필름일 수 있다.

상기 인지질로 코팅된 복합체는 나노입자화한 것일 수 있다. 또한, 상기 나노입자화는 압출에 의해 이루어질 수 있다.

상기 나노입자의 유체역학적 크기는 70 내지 130 nm 일 수 있으며, 제타 포텐셜(zeta potential)은 -25 내지 -15 mV일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 사이클로덱스트린-스타틴 복합체를 제조하여, 상기 복합체의 콜레스테롤 및 스타틴의 치환 특성을 확인하였다(도 5 참조). 또한, 상기 복합체를 인지질로 코팅하고 나노입자화하여 화물치환 특성을 갖는 나노입자를 제조하였다(도 6f 참조)

본 발명자들은 상기 나노입자가 그 화물치환 특성에 의하여 콜레스테롤 결정을 분해함을 확인하였으며(도 7 참조), 대식세포 및 포말세포의 사멸을 유도함을 확인하였다(도 8 내지 9 참조).

또한, 본 발명자들은 상기 나노입자가 부분 경동맥 결찰 마우스 모델(partial carotid ligation mouse model)에서 동맥경화 병변이 유발되는 좌측 경동맥(left carotid artery)에 축적되어 대식세포 사멸을 유도하고, 죽종형성(atherogenesis)을 억제하며, 전신 및 간에 대한 독성이 없음을 확인하였다(도 10 내지 11 참조).

또한, 본 발명자들은 상기 나노입자가 고지방 식이 유도 동맥경화증 마우스 모델(high-fat diet(HFD)-induced atherosclerosis mouse model)에서 동맥경화 병변이 유발되는 완두동맥(brachiocephalic artery) 및 대동맥궁(aortic arch)에 축적되어 동맥경화반을 퇴행시키며, 전신 및 간에 대한 독성이 없음을 확인하였다(도 12a 내지 12i 참조).

또한, 본 발명자들은 상기 나노입자가 HMG-CoA 환원효소의 활성을 촉진시켜 기존의 경구 투여된 스타틴과 유사하게 간의 반응을 유도함을 확인하였다(도 12j 참조).

따라서, 본 발명에 따른 사이클로덱스트린 또는 사이클로덱스트린 유도체, 및 스타틴계 화합물의 복합체는 동맥경화증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 사이클로덱스트린 또는 사이클로덱스트린 유도체, 및 스타틴계 화합물의 복합체를 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 담체는 Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등과 같은 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

상기 조성물을 제제화하는 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 첨가할 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구용 제제 또는 비경구용 제제로 제형화될 수 있다. 경구용 제제로는 고형 제제 및 액상 제제가 포함될 수 있다. 상기 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 또는 트로키제일 수 있고, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제를 첨가하여 조제할 수 있다. 상기 부형제는 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 윤활제를 포함할 수 있고, 그 예로는 마그네슘 스티레이트, 탈크등이 있다. 한편, 상기 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제일 수 있다. 이때, 상기 액상 제제에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.

상기 비경구용 제제는 주사제, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 파우더 및 크림 등을 포함할 수 있다. 상기 주사제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등을 포함할 수 있다. 이때, 비수성용제 또는 현탁용제로서는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름이나, 에틸올레이트와 같이 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내 또는 흉부내 주사 방식을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.0001 내지 1,000 ㎎/㎏, 구체적으로 0.001 내지 500 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회 내지 수회일 수 있다.

본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.

상기 사이클로덱스트린 유도체는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 사이클로덱스트린 유도체는 메틸-β-사이클로덱스트린일 수 있다.

상기 스타틴계 화합물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 스타틴계 화합물은 아토바스타틴, 심바스타틴, 플루바스타틴, 피타바스타틴, 로바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 세리바스타틴 및 메바스타틴으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 단계 1)의 용매는 에탄올일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 1)의 사이클로덱스트린 또는 사이클로덱스트린 유도체, 및 스타틴계 화합물은 0.5 내지 15:1, 0.8 내지 15:1, 1 내지 15:1, 2 내지 15:1, 4 내지 15:1, 0.5 내지 12:1, 0.8 내지 12:1, 1 내지 12:1, 2 내지 12:1, 4 내지 12:1, 0.5 내지 11:1, 0.8 내지 11:1, 1 내지 11:1, 2 내지 11:1, 4 내지 11:1, 0.5 내지 8:1, 0.8 내지 8:1, 1 내지 8:1, 2 내지 8:1, 4 내지 8:1, 0.5 내지 7:1, 0.8 내지 7:1, 1 내지 7:1, 2 내지 7:1 또는 4 내지 7:1의 몰농도 비로 혼합할 수 있다.

상기 단계 3)의 인지질은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 인지질은 포스파티딜콜린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜세린으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 포스파티딜콜린은 DDPC, DLPC, DMPC, DPPC, DSPC, DOPC, POPC 또는 DEPC일 수 있고, 상기 포스파티딜글리세롤은 DMPG, DPPG, DSPG 또는 POPG일 수 있고, 상기 포스파티딜에탄올아민은 DMPE, DPPE, DSPE 또는 DOPE일 수 있고, 상기 포스파티딜세린은 DOPS일 수 있다.

또한, 상기 인지질은 염화 또는 탈염되거나, 수소화 또는 부분 수소화되거나, 또는 천연, 반합성 또는 합성일 수 있으며, 수용성 또는 친수성 중합체가 컨쥬게이션될 수 있다. 상기 중합체는 PEG일 수 있으며, 통상적으로 사용되는 시판 PEG로는 PEG 350, PEG 550, PEG 750, PEG 1000, PEG 2000, PEG 3000 및 PEG 5000이 포함된다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 인지질은 DOPC 및 DSPE-PEG가 혼합된 지질 필름일 수 있다.

상기 인지질은 복합체 내의 사이클로덱스트린 또는 사이클로덱스트린 유도체에 대하여 0.5 내지 15:1, 0.8 내지 15:1, 1 내지 15:1, 2 내지 15:1, 4 내지 15:1, 0.5 내지 12:1, 0.8 내지 12:1, 1 내지 12:1, 2 내지 12:1, 4 내지 12:1, 0.5 내지 11:1, 0.8 내지 11:1, 1 내지 11:1, 2 내지 11:1, 4 내지 11:1, 0.5 내지 8:1, 0.8 내지 8:1, 1 내지 8:1, 2 내지 8:1, 4 내지 8:1, 0.5 내지 7:1, 0.8 내지 7:1, 1 내지 7:1, 2 내지 7:1 또는 4 내지 7:1의 몰농도 비로 사용할 수 있다.

상기 화물치환 나노입자의 제조방법은 단계 2)의 복합체 또는 단계 3)의 코팅된 복합체로부터 비결합 스타틴계 화합물, 및 비결합 사이클로덱스트린 또는 사이클로덱스트린 유도체를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있고, 상기 제거는 PD-10 칼럼을 통해 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 화물치환 나노입자의 제조방법은 상기 코팅된 복합체를 나노입자화하는 단계를 더 포함할 수 있고, 상기 나노입자화는 압출을 통해 이루어질 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 압출은 폴리카보네이트 멤브레인(polycarbonate membrane)을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 1)의 용매는 에탄올 또는 클로로포름일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 1)의 인지질은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 인지질은 포스파티딜콜린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜세린으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 단계 1)의 사이클로덱스트린 또는 사이클로덱스트린 유도체, 및 스타틴계 화합물의 혼합 비율은 0.5 내지 15:1, 0.8 내지 15:1, 1 내지 15:1, 2 내지 15:1, 4 내지 15:1, 0.5 내지 12:1, 0.8 내지 12:1, 1 내지 12:1, 2 내지 12:1, 4 내지 12:1, 0.5 내지 11:1, 0.8 내지 11:1, 1 내지 11:1, 2 내지 11:1, 4 내지 11:1, 0.5 내지 8:1, 0.8 내지 8:1, 1 내지 8:1, 2 내지 8:1, 4 내지 8:1, 0.5 내지 7:1, 0.8 내지 7:1, 1 내지 7:1, 2 내지 7:1 또는 4 내지 7:1의 몰농도 비일 수 있다.

상기 단계 1)의 사이클로덱스트린 또는 사이클로덱스트린 유도체, 및 인지질의 혼합 비율은 0.5 내지 15:1, 0.8 내지 15:1, 1 내지 15:1, 2 내지 15:1, 4 내지 15:1, 0.5 내지 12:1, 0.8 내지 12:1, 1 내지 12:1, 2 내지 12:1, 4 내지 12:1, 0.5 내지 11:1, 0.8 내지 11:1, 1 내지 11:1, 2 내지 11:1, 4 내지 11:1, 0.5 내지 8:1, 0.8 내지 8:1, 1 내지 8:1, 2 내지 8:1, 4 내지 8:1, 0.5 내지 7:1, 0.8 내지 7:1, 1 내지 7:1, 2 내지 7:1 또는 4 내지 7:1의 몰농도 비일 수 있다.

상기 화물치환 나노입자의 대량 제조방법은 단계 1)의 혼합액 또는 단계 3)의 수화물로부터 비결합 스타틴계 화합물, 및 비결합 사이클로덱스트린 또는 사이클로덱스트린 유도체를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있고, 상기 제거는 PD-10 칼럼을 통해 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 화물치환 나노입자의 대량 제조방법은 단계 3)의 수화물을 나노입자화하는 단계를 더 포함할 수 있고, 상기 나노입자화는 압출을 통해 이루어질 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 압출은 폴리카보네이트 멤브레인을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 사이클로덱스트린, 심바스타틴의 복합체를 DOPC 및 DSPE-PEG가 혼합된 지질 필름으로 코팅하고, 폴리카보네이트 멤브레인으로 압출하여 화물치환 나노입자를 수득하고, 이의 동맥경화증에 대한 치료 효과를 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 확인하였다(도 1 내지 13 참조).

또한, 본 발명자들은 사이클로덱스트린, 심바스타틴 및 지질을 혼합하고 건조 및 수화시켜 화물치환 나노입자를 제조하고, 상기 동맥경화증에 대한 치료 효과를 확인한 화물치환 나노입자와 유사한 수준의 콜레스테롤 결정 분해 효과 및 대식세포 독성을 나타냄을 확인하였다(도 14 참조).

따라서, 상기 화물치환 나노입자의 제조방법들은 동맥경화증의 예방 또는 치료를 위한 화물치환 나노입자를 제조하여 대량 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 사이클로덱스트린 포함 복합체(cyclodextrin inclusoin complexes)의 준비 및 특성 확인

<1-1> 사이클로덱스트린 포함 복합체의 제조 및 사이클로덱스트린의 최적 배합 비율 선정

사이클로덱스트린의 최종 농도가 0, 5, 15, 30 및 50 mM이 되도록 사이클로덱스트린(methyl-β-cyclodextrin, Sigma-Aldrich)을 콜레스테롤(5 mM, Avanti Polar Lipids) 또는 스타틴(심바스타틴(simvastatin), 5 mM, Sigma-Aldrich)을 포함하는 1 mL의 에탄올에 용해시켰다. 상기 용액들을 완전히 건조시킨 후, 1 mL의 PBS (phosphate buffered saline)로 다시 수화시키고, 나노입자분석기(dynamic light scattering, Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments)로 유체역학적 크기(hydrodynamic size)를 측정하면서 적절한 복합체의 크기가 형성될 때까지 초음파처리를 하였다. 상기 나노입자분석기를 이용한 측정 결과, 사이클로덱스트린의 몰 비율이 증가할수록 복합체의 크기가 작아짐을 확인한 바(도 2), 최소량의 사이클로덱스트린으로 초미세(submicron) 복합체를 형성할 수 있도록 사이클로덱스트린 대 스타틴 또는 콜레스테롤의 비율을 6으로 하여 이후 모든 실험을 수행하였다.

<1-2> 콜레스테롤, 스타틴 및 이들의 사이클로덱스트린 포함 복합체의 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 분석

콜레스테롤(5 mM, 2% nitrobenzoxadiazole (NBD)-cholesterol 함유; CHOL), 스타틴(5 mM; ST), 사이클로덱스트린(30 mM) + 콜레스테롤(5 mM, 2 % NBD-cholesterol 함유) (CD + CHOL) 및 사이클로덱스트린(30 mM) + 스타틴(5 mM) (CD + ST)을 100 ㎕의 에탄올에 용해하여 준비하였다. 상기 각 용액들은 완전히 건조시킨 후, 1 mL의 PBS로 다시 수화시키고, 복합체(complex) 또는 응집체(aggregates)가 형성될 때까지 초음파처리 하였다. 상기 각 용액 200 ㎕를 PD-10 탈염 칼럼(PD-10 desalting column, GE Healthcare)을 통해 용출시킨 후, 용출액을 96웰 플레이트에 모아 용출된 시료의 콜레스테롤 및 스타틴의 양을 측정하였다. 콜레스테롤의 정량은 NBD-cholesterol의 형광을 측정하고(들뜸 파장: 480 nm, 방출 파장: 530 nm), 스타틴의 정량은 스타틴의 흡광도를 측정하여(파장: 240 nm) 수행하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 비결합 콜레스테롤 및 비결합 스타틴의 경우 PBS 수화 시 응집이 과도하게 일어나 PD-10 칼럼을 통해 용출되지 않은 반면, 이들의 사이클로덱스트린 포함 복합체는 나노 단위의 크기로 형성되어 PD-10 칼럼을 통해 용출되었다. 이는 PD-10 칼럼을 통해 용출된 콜레스테롤 또는 스타틴은 사이클로덱스트린과의 복합체를 형성하고 있는 것임을 제시한다.

<1-3> 콜레스테롤 및 스타틴의 사이클로덱스트린에 대한 경쟁적 결합 확인

콜레스테롤(5 mM, 2 % NBD-cholesterol 함유), 스타틴(5 mM) 및 사이클로덱스트린(30 mM)을 포함하는 100 ㎕의 에탄올 용액을 완전히 건조시킨 후, 1 mL의 PBS로 다시 수화시켜 사이클로덱스트린 포함 복합체를 형성하도록 하였다. 이후, 상기 용액(CD + CHOL + ST) 및 상기 <실시예 1-2>의 초음파처리까지 완료된 사이클로덱스트린-콜레스테롤 복합체(CD + CHOL) 및 사이클로덱스트린-스타틴 복합체(CD + ST) 용액 200 ㎕를 PD-10 칼럼을 통해 용출시킨 후, 용출액을 96웰 플레이트에 모은 뒤, 각 웰의 콜레스테롤 및 스타틴의 양을 측정하였다. 콜레스테롤의 정량은 NBD-cholesterol의 형광을 측정하고(들뜸 파장: 480 nm, 방출 파장: 530 nm), 스타틴의 정량은 스타틴의 흡광도를 측정하여(파장: 240 nm) 수행하였다.

그 결과, 도 4b에 나타난 바와 같이, 콜레스테롤의 용출량은 스타틴의 존재 여부에 영향을 받지 않은 반면, 스타틴의 용출량은 콜레스테롤의 존재로 인해 현저히 감소되었다. 총 용출량을 측정한 결과, 도 4c에 나타난 바와 같이, 스타틴보다 콜레스테롤의 용출량이 현저히 많음을 확인하였다. 이 결과는, 콜레스테롤과 스타틴은 경쟁적으로 사이클로덱스트린에 결합하며, 콜레스테롤이 보다 높은 친화도로 사이클로덱스트린에 결합한다는 것을 제시한다.

<1-4> 사이클로덱스트린-스타틴 복합체의 화물치환 특성 확인

스타틴(5 mM) 및 사이클로덱스트린(30 mM) 을 포함하는 100 ㎕의 에탄올 용액을 완전히 건조시킨 후, 1 mL의 PBS로 다시 수화시켜 사이클로덱스트린-스타틴 복합체를 형성하도록 하였다. 콜레스테롤 응집체(5 mM, 2% NBD-cholesterol 함유)를 사이클로덱스트린-스타틴 복합체에 첨가하고, 이를 1, 6 및 12시간 동안 37℃에서 배양한 후, PD-10 칼럼을 이용하여 용출시켰다. 용해된 콜레스테롤 및 스타틴이 포함된 용출액을 96웰 플레이트에 모은 뒤, 각 웰의 콜레스테롤 및 스타틴의 양을 측정하였다. 콜레스테롤의 정량은 NBD-cholesterol의 형광을 측정하고(들뜸 파장: 480 nm, 방출 파장: 530 nm), 스타틴의 정량은 스타틴의 흡광도를 측정하여(파장: 240 nm) 수행하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 시간이 지날수록 스타틴의 용출량은 감소하는 반면, 콜레스테롤의 용출량은 증가하였다. 이 결과는 사이클로덱스트린-스타틴 복합체에서 사이클로덱스트린-콜레스테롤 복합체로 화물치환이 일어났음을 제시한다.

<실시예 2> 화물치환 나노입자(cargo-switching nanoparticles)의 준비 및 특성 확인

<2-1> 화물치환 나노입자의 준비

사이클로덱스트린과 스타틴(심바스타틴)을 각각 최종농도 30 mM 및 5 mM이 되도록 각각 1 mL의 에탄올에 용해시켰다. 상기 용액을 30분 동안 섞은 후, 진공 하에 1시간 동안 완전히 건조시키고, 1 mL의 PBS로 다시 수화시켜 사이클로덱스트린-스타틴 복합체를 얻었다.

상기 복합체를 인지질로 코팅하여 정맥 주사 시 혈액 내 순환을 향상시키고 약물의 비특이적 작용을 최소화하기 위하여, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, Avanti Polar Lipids) 및 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG, Avanti Polar Lipids)이 95:5의 몰 비로 구성된 지질 필름을 준비하였다.

코팅을 위한 인지질의 혼합 비율을 최적화하기 위하여, 상기 지질필름에서 인지질의 농도를 0.5, 1, 2 또는 4 mM로 하여 준비하고, 이를 6 mM 사이클로덱스트린 및 1 mM 스타틴을 포함하는 사이클로덱스트린-스타틴 복합체 용액에서 수화시켜 코팅되도록 하였다. 상기 인지질로 코팅된 복합체를 PBS에서 1 또는 4시간 동안 방치 후, 그 유체역학적 크기를 나노입자분석기로 측정하였다. 그 결과, 복합체의 크기가 커지지 않는 인지질의 최소농도가 1 mM임을 확인하여, 사이클로덱스트린, 스타틴 및 인지질의 최적 혼합 비율을 6:1:1로 선정하였다(도 6a).

상기 사이클로덱스트린과 스타틴을 각각 최종농도 30 mM 및 5 mM이 되도록 하여 제조한 복합체를 인지질의 농도가 5 mM인 지질필름으로 상기와 같이 코팅한 후, 100 nm 폴리카보네이트 멤브레인(polycarbonate membrane, Whatman)으로 상온에서 압출하여 화물치환 나노입자를 수득하였고, 비결합 스타틴 및 사이클로덱스트린은 PD-10 칼럼을 통해 제거하였다.

나노입자분석기로 측정한 화물치환 나노입자의 평균 유체역학적 크기는 104 ± 13 nm 였고, 평균 제타 포텐셜(zeta potential)은 -20 ± 0.8 mV 였다(도 6b 및 6c). 투과전자현미경(transmission electron microscopy, TEM)을 사용하여 관찰한 화물치환 나노입자를 도 6d에 나타내었다.

<2-2> 화물치환 나노입자의 ¹ H-NMR 분석

화물치환 나노입자에 사이클로덱스트린, 스타틴 및 인지질이 모두 포함되어 있는지 확인하고, 각 실험예에서 사용한 화물치환 나노입자에 함유된 사이클로덱스트린 및 스타틴의 최종농도를 계산하기 위하여, ¹H-NMR 분석을 수행하였다.

구체적으로, 1%의 트리메틸실란(trimethyl silane)을 포함하는 에탄올-d6 용액에 사이클로덱스트린, 스타틴, 인지질 및 상기 <실시예 2-1>에 기재된 방법으로 제조한 화물치환 나노입자를 용해시킨 후, ¹H-NMR 스펙트럼은 Bruker Wide-Bore Avance 300 MHz spectrometer (AV300, Bruker)를 사용하여 얻었고, 스펙트럼의 수집은 TOPSPIN 2.0 software (Bruker)를 사용하였으며, 상(phase), 베이스라인(baseline) 수정 및 정량 분석은 Mnova software (Mestrelab Research)를 사용하였다.

¹H-NMR 분석 결과, 화물치환 나노입자의 피크에 사이클로덱스트린, 스타틴 및 인지질의 피크가 모두 포함되어 나타났으며, 화물치환 나노입자에 사이클로덱스트린, 스타틴 및 인지질이 약 2:1:1.5의 몰 비로 포함되었음을 확인하였다(도 6g). 또한, 각 실험예에서 사용한 화물치환 나노입자에 함유된 사이클로덱스트린 및 스타틴의 최종 농도를 계산하여 처리 군 별 비교에 이용하였다.

<2-3> 화물치환 나노입자의 혈청 안정성(serum stablity) 확인

화물치환 나노입자가 생체 내에서 표적 부위에 도달하기 위해 필요한 혈청 안정성을 확인하고자 하기 실험을 수행하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 2-1>에 기재된 방법으로 제조한 화물치환 나노입자를 PBS 또는 10% 혈청(serum)이 포함된 PBS에서 37℃ 조건으로 72시간까지 배양하고, 그 유체역학적 크기를 나노입자분석기로 측정하였다.

그 결과, 혈청이 포함된 PBS에서 배양된 화물치환 나노입자의 크기는 PBS에서 배양된 화물치환 나노입자의 크기와 유의적인 차이가 없었으며, 시간이 지나도 그 유체역학적 크기가 변하지 않는 것으로 나타났다(도 6e). 즉, 상기 화물치환 나노입자는 혈청의 존재에도 안정적으로 유지됨을 확인하였다.

<2-4> 화물치환 나노입자의 화물치환 특성 확인

상기 <실시예 1-4>에서 확인한 사이클로덱스트린-스타틴 복합체의 콜레스테롤에 대한 화물치환 특성이 상기 <실시예 2-1>에서 제조된 화물치환 나노입자에서 그대로 유지되는지 확인하기 위하여, 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 2-1>에 기재된 방법으로 제조한 화물치환 나노입자에 콜레스테롤 응집체(5 mM, 2% NBD-cholesterol 함유)를 첨가하고, 이를 1, 6 및 12시간 동안 37℃에서 배양한 후, PD-10 칼럼을 이용하여 용출시켰다. 용해된 콜레스테롤 및 스타틴이 포함된 용출액을 96웰 플레이트에 모은 뒤, 각 웰의 콜레스테롤 및 스타틴의 양을 측정하였다. 콜레스테롤의 정량은 NBD-cholesterol의 형광을 측정하고(들뜸 파장: 480 nm, 방출 파장: 530 nm), 스타틴의 정량은 스타틴의 흡광도를 측정하여(파장: 240 nm) 수행하였다.

그 결과, 사이클로덱스트린-스타틴 복합체의 경우와 유사하게, 시간이 지날수록 스타틴의 용출량은 감소하는 반면, 콜레스테롤의 용출량은 증가하였다(도 6f). 이 결과는 화물치환 나노입자의 스타틴이 콜레스테롤과 치환되었음을 제시하며, 결론적으로 사이클로덱스트린-스타틴 복합체의 인지질 코팅 및 나노입자화 과정이 그 화물치환 특성에 유의한 변화를 일으키지 않았음을 제시한다.

<실시예 3> 형광 표지된 화물치환 나노입자의 제조

<3-1> 리사민(lissamine)계 형광으로 표지한 화물치환 나노입자의 제조

상기 <실시예 2-1>의 화물치환 나노입자 제조과정에서 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(리사민 로다민 B 설포닐) (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl, Avanti Polar Lipids)을 지질 필름에 총 인지질의 3 몰%(mol%)로 첨가하여 형광 표지된 화물치환 나노입자를 제조하였다.

<3-2> DiR 형광으로 표지한 화물치환 나노입자의 제조

상기 <실시예 2-1>의 화물치환 나노입자 제조과정에서 친유성 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸 인도트리카르보시아닌 아이오다이드(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindotricarbocyanine iodide (DiR), Invitrogen)를 지질 필름에 총 인지질의 3 몰%(mol%)로 첨가하여 형광 표지된 화물치환 나노입자를 제조하였다.

<실험예 1> 시험관 내( in vitro )에서 화물치환 나노입자의 콜레스테롤 결정(cholesterol crystal)에 대한 결합 및 분해 효과 확인

상기 <실시예 2-4>에서 확인한 화물치환 나노입자의 콜레스테롤 응집체에 대한 화물치환 특성에 따라, 화물치환 나노입자가 콜레스테롤 결정에 대한 용해 능력도 나타내는지 확인하기 위하여 하기 실험들을 수행하였다.

<1-1> 형광 표지된 콜레스테롤 결정의 준비

콜레스테롤(2 mg/mL, Avanti Polar Lipids)을 포함하는 에탄올 용액 1 mL에 25-NBD 콜레스테롤 (Avanti Polar Lipids)을 콜레스테롤과 1:50의 몰 비가 되도록 용해시킨 후, 증류수를 30%(v/v)로 넣고, 진공에서 완전히 건조시켜 결정화하였다. 상기 콜레스테롤 결정은 1 mL의 PBS에 다시 용해시킨 후, 크기 조절을 위해 초음파처리 하였다.

<1-2> 리포좀(liposomes)의 준비

DOPC 및 DSPE-PEG를 95:5의 몰 비로 클로로포름(chloroform)에 용해시킨 후 밤새 완전히 건조시킨 지질 필름을 PBS로 수화시키고, 100 nm 폴리카보네이트 멤브레인으로 압출시켰다. 압출된 리포좀의 유체역학적 크기 및 제타 포텐셜은 나노입자분석기로 측정하였다.

<1-3> 화물치환 나노입자의 콜레스테롤 결정에 대한 결합 확인

상기 <실시예 3-1>에 기재된 방법으로 제조하여 50 μM 사이클로덱스트린을 최종 농도로 함유하는 형광 표지된 화물치환 나노입자 및 상기 <실험예 1-1>에 기재된 방법으로 제조한 형광 표지된 콜레스테롤 결정(50 μM in PBS)을 상온에서 5분 동안 반응시킨 후, 공초점 형광 현미경(confocal fluorescence microscope, Nikon)으로 관찰하였다.

그 결과, 화물치환 나노입자 및 콜레스테롤 결정이 동일한 위치에서 확인되었으며, 이 결과는 화물치환 나노입자와 콜레스테롤 결정이 상호작용함을 제시한다(도 7a).

<1-4> 화물치환 나노입자의 콜레스테롤 결정에 대한 분해 효과 확인

상기 <실험예 2-2>에서 확인한 화물치환 나노입자에 포함된 사이클로덱스트린, 스타틴 및 인지질의 몰 비인 2:1:1.5에 맞추어 사이클로덱스트린, 사이클로덱스트린 및 상기 <실험예 1-2>에 기재된 방법으로 제조한 리포좀의 혼합물, 및 상기 <실시예 2-1>에 기재된 방법과 동일하게 제조한 화물치환 나노입자를 최종 사이클로덱스트린의 농도가 0, 0.1, 0.5, 1 및 3 mM이 되도록 준비하였다. 상기 사이클로덱스트린, 사이클로덱스트린 및 리포좀의 혼합물 또는 화물치환 나노입자를 상기 <실험예 1-1>에 기재된 방법으로 제조한 형광 표지된 콜레스테롤 결정(500 μM in PBS)과 37 ℃에서 밤새 반응시켰다. 또한, 화물치환 나노입자의 콜레스테롤 결정에 대한 시간 의존적 분해 효과를 확인하기 위해, 상기 반응 과정 중 사이클로덱스트린의 농도는 3 mM로 하고, 반응 시간을 0, 2, 6, 12 또는 24시간으로 하여 반응시켰다. 상기 반응 혼합물에서 형광 표지된 콜레스테롤 결정 중 용해되지 않은 것은 제거하고 용해된 콜레스테롤 결정의 형광만을 측정하기 위하여, 0.22 ㎛ 시린지 필터(syringe filter)로 여과한 여과액의 형광을 측정하였다.

그 결과, 도 7b에 나타난 바와 같이, 동일한 사이클로덱스트린의 농도에서 화물치환 나노입자가 사이클로덱스트린 대비 현저한 콜레스테롤 결정의 분해 능력을 보였으며, 사이클로덱스트린에 리포좀만이 첨가된 군도 사이클로덱스트린 대비 현저한 콜레스테롤 결정의 분해 능력을 보였다. 이는 화물치환 나노입자의 화물치환 특성이 콜레스테롤 결정에 대해서도 잘 발휘됨을 의미하며, 사이클로덱스트린 및 리포좀 혼합물의 경우는 PEG-인지질 이중층이 콜레스테롤 결정으로부터 직접적으로 콜레스테롤을 분해할 수 있음에 기인한 결과로 해석된다. 아울러, 도 7c에 나타난 바와 같이, 화물치환 나노입자의 콜레스테롤 결정에 대한 분해 효과가 시간 의존적임을 확인하였다.

<실험예 2> 시험관 내( in vitro )에서 화물치환 나노입자의 대식세포로의 흡수 및 대식세포에 대한 세포독성 확인

대식세포는 염증반응을 유발하며, LDL 콜레스테롤을 섭취하여 포말세포로 분화하며 동맥경화증 진행에 중요한 역할을 한다. 이에, 화물치환 나노입자가 대식세포를 표적으로 하여 동맥경화증 치료 효과를 나타낼 수 있는지 확인하기 위하여, 대식세포로의 흡수 여부 및 대식세포에 대한 세포사멸 유도 여부를 조사하였다.

<2-1> 화물치환 나노입자의 대식세포로의 흡수 확인

2종의 대식세포주(Raw 264.7 및 J774A.1)를 6웰 플레이트에 웰 당 50,000 개의 농도로 24시간 배양한 후, 상기 <실시예 3-1>에 기재된 방법으로 제조하여 제조하여 100 μM 스타틴을 최종 농도로 함유하는 형광 표지된 화물치환 나노입자를 6시간 동안 처리하고, 리소좀(lysosome)을 LysoTracker (Thermo Fisher Scientific)로 염색한 후, 공초점 형광 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 8a 및 8b에 나타난 바와 같이, 화물치환 나노입자와 리소좀이 동일한 위치에서 나타났으며, 이 결과는 화물치환 나노입자가 대식세포의 리소좀에 의해 흡수되었음을 제시한다.

<2-2> 화물치환 나노입자의 대식세포에 대한 세포독성 확인

2종의 대식세포주(Raw 264.7 및 J774A.1)를 48웰 플레이트에 웰 당 20,000 개의 농도로 24시간 배양한 후, 상기 <실험예 1-1>에 기재된 방법으로 제조하여 100 μM 스타틴을 최종 농도로 함유하는 화물치환 나노입자, 스타틴(100 μM) 또는 상기 <실험예 1-2>에 기재된 방법으로 제조한 리포좀(150 μM)을 24, 48 또는 72시간 동안 처리하였다. 각 시간대 별로 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltertrazolium (MTT, Thermo Fisher Scientific) 분석을 수행하여 세포생존율(cell viability)을 측정하였다. 또한, 화물치환 나노입자의 대식세포에 대한 세포독성이 농도의존적으로 나타나는지 확인하기 위하여, 상기 실험 과정 중 화물치환 나노입자의 스타틴 농도를 1, 10, 50 및 100 μM로 하여 24시간 처리한 후, MTT 분석을 수행하여 세포생존율을 측정하였다.

그 결과, 도 8c 및 8d에 나타난 바와 같이, 리포좀은 처리 시간과 무관하게 세포독성이 없었으나, 스타틴은 24시간째에 거의 완전한 세포사멸을, 화물치환 나노입자는 48시간째에 거의 완전한 세포사멸을 유도하였다. 이는 대식세포에 흡수된 화물치환 나노입자로부터 세포 내로 스타틴이 방출되기까지 시간이 필요함을 제시한다. 또한, 도 8e 및 8f에 나타난 바와 같이, 화물치환 나노입자의 대식세포에 대한 세포독성은 스타틴의 농도에 의존적인 것으로 나타났다. 이는 화물치환 나노입자의 대식세포에 대한 세포독성이 스타틴에 의한 것임을 제시한다.

<2-3> 화물치환 나노입자의 활성화된 대식세포에 대한 세포독성 증폭 여부 확인

상기 <실시예 2-1>에서 제조된 화물치환 나노입자의 치료 효과가 동맥경화반 진행(atherosclerotic plaque progression)에 관여하는 M1 대식세포 및 포말세포(foam cells)와 같은 활성화된 대식세포에서 증폭될 수 있는지를 조사하였다.

<2-3-1> 활성화된 대식세포인 포말세포 및 전염증성(proinflammatory) 대식세포의 준비

Raw 264.7 세포에 LDL (50 ㎍/mL, Cat. #. L35354, Thermo Fisher Scientific) 또는 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS, Sigma-Aldrich)를 처리하여 포말세포 또는 전염증성 대식세포를 준비하였다.

구체적으로, 포말세포를 준비하기 위해, Raw 264.7 세포에 LDL을 50 ㎍/mL 농도로 24시간 동안 처리하였다. 포말세포의 지방소립(lipid-droplet) 형성을 관찰하기 위해 상기 LDL 처리한 포말세포를 Oil Red O (Sigma-Aldrich)로 염색하였다. 명시야 현미경으로 포말세포를 관찰한 결과, 도 9a에 나타난 바와 같이, 세포질 내에 콜레스테롤 결정이 형성되었음을 확인하였다. 또한, 전염증성 대식세포를 준비하기 위해, Raw 264.7 세포에 LPS를 100 ng/mL 농도로 24시간 동안 처리하였다.

<2-3-2> 화물치환 나노입자의 포말세포로의 흡수 확인

화물치환 나노입자의 포말세포로의 흡수를 확인하기 위해 Raw 264.7 세포에 Alexa-488 LDL (50 ㎍/mL, Cat. #. L23380, Thermo Fisher Scientific)을 24시간 동안 처리한 후, 상기 <실시예 3-1>에 기재된 방법으로 제조하여 100 μM 스타틴을 최종 농도로 함유하는 형광 표지된 화물치환 나노입자를 4시간 동안 처리하였다. 공초점 형광 현미경으로 상기 포말세포를 관찰한 결과, 도 9d에 나타난 바와 같이, LDL과 화물치환 나노입자가 동일한 위치에서 나타났으며, 이는 화물치환 나노입자가 포말세포 내 콜레스테롤 결정과 상호작용함을 제시한다.

<2-3-3> 화물치환 나노입자의 포말세포에 대한 세포독성 확인

화물치환 나노입자의 포말세포에 대한 세포독성을 평가하기 위해 상기 <실험예 2-3-1>에 기재된 방법과 동일하게 LDL을 처리한 Raw 264.7 세포에 상기 <실시예 2-1>에 기재된 방법으로 제조하여 100 μM 스타틴을 최종 농도로 함유하는 화물치환 나노입자를 24시간 동안 처리한 후, MTT 분석을 수행하여 세포생존율을 측정하였다. 그 결과, 도 9b에 나타난 바와 같이, 화물치환 나노입자는 LDL이 처리되지 않은 대식세포에 비해 LDL이 처리된 대식세포에서 더 강한 세포독성을 보였다. 이는 화물치환 나노입자의 대식세포에 대한 세포독성이 포말세포에서 더욱 증폭됨을 제시한다.

<2-3-4> 화물치환 나노입자의 전염증성 대식세포에 대한 세포독성 확인

화물치환 나노입자의 전염증성 대식세포에 대한 세포독성을 평가하기 위해 상기 <실험예 2-3-1>에 기재된 방법과 동일하게 LPS를 처리한 Raw 264.7 세포에 상기 <실시예 2-1>에 기재된 방법으로 제조하여 100 μM 스타틴을 최종 농도로 함유하는 화물치환 나노입자를 24시간 동안 처리한 후, MTT 분석을 수행하여 세포생존율을 측정하였다. 그 결과, 도 9c에 나타난 바와 같이, 화물치환 나노입자의 전염증성 대식세포에 대한 세포독성은 LPS 처리와 무관함을 확인하였다.

<실시예 4> 동물실험의 준비

<4-1> 실험동물의 준비

10주령의 수컷 Apolipoprotein E (ApoE)^-/- 마우스를 Jackson Laboratory에서 구입하였고, 7주령의 수컷 wild-type C57/BL6 마우스를 코아텍(Koatech)에서 구입하였다. 모든 동물실험은 Emory 대학교 및 KAIST의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 얻어 진행되었다.

<4-2> 마우스 실험을 위한 농축된 화물치환 나노입자의 준비

마우스 실험에 사용하기 위하여, 상기 <실시예 2-1>에 기재된 방법으로 제조한 화물치환 나노입자를 아미콘 초원심분리 필터(Amicon ultracentrifugal filters, Cat. #. UFC910024, Milipore)로 농축시켰다.

<실험예 3> 화물치환 나노입자의 혈중 반감기(blood half-life) 확인

상기 <실시예 3-2>에 기재된 방법으로 제조한 형광 표지된 화물치환 나노입자를 아미콘 초원심분리 필터로 농축시켰다. 상기 형광 표지된 화물치환 나노입자 200 ㎕에 포함된 스타틴의 최종 농도가 15 mg/kg이 되도록 하여 wild-type 마우스 꼬리정맥에 투여한 후, 1, 4, 8, 24, 48 및 72시간 뒤에 안와채혈(retro-orbital bleeding)을 수행하였다. 혈액 시료의 형광을 측정하여 계산한 화물치환 나노입자의 혈중 반감기는 약 9시간이었다(도 10a).

<실험예 4> 화물치환 나노입자의 좌측 경동맥 내 대식세포로의 흡수, 콜레스테롤 결정과의 상호작용 및 대식세포 사멸 유도 효과 확인

부분 경동맥 결찰 마우스 모델에서 화물치환 나노입자가 동맥경화증 병변이 발생하는 좌측 경동맥 부위에 도달하여, 콜레스테롤 결정과 상호작용하고, 대식세포로 흡수되어 대식세포의 사멸을 유도할 수 있는지 확인하기 위하여 하기 실험들을 수행하였다.

<4-1> 부분 경동맥 결찰 모델(partial carotid ligation model)의 제작 및 약물 투여 일정

ApoE^-/- 마우스에 대하여 기존에 공지된 방법(Nat. Rev. Immunol. 2006; 6: 508-519)으로 부분 경동맥 결찰 수술을 수행하였다. 수술 후, ApoE^-/- 마우스에 1.25% 콜레스테롤, 16% 지방 및 0.5% 콜산(cholic acid)을 포함하는 고지방 식이(Paigen's high-fat diet, HFD, Cat. #. D12336, Research Diets)를 2주 동안 섭취시켰다. 상기 마우스 모델에서는 수술 후 2주 내에 좌측 경동맥(left carotid artery, LCA)에 동맥경화증이 발병된다.

상기 <실시예 3-2>에 기재된 방법으로 제조한 형광 표지된 화물치환 나노입자를 아미콘 초원심분리 필터로 농축시켰다. 상기 형광 표지된 화물치환 나노입자에 포함된 사이클로덱스트린 및 스타틴의 최종 농도가 각각 100 mg/kg 및 15 mg/kg이 되도록 하여, 부분 경동맥 결찰 수술 후 8일 뒤부터 3일 간격으로 총 2회 정맥 투여하였고, 마지막 투여 후 3일 뒤에 마우스를 희생시켜 각 장기를 적출하였다(도 10b).

<4-2> 화물치환 나노입자의 생체 내 분포 확인

화물치환 나노입자의 마우스 생체 내 분포를 확인하기 위하여, 적출한 간, 비장, 심장, 폐, 신장 및 좌측 경동맥을 NIR 형광 이미징 시스템(fluorescent imaging system; LI-COR)으로 사진을 촬영하고 형광을 측정하였다. 또한, 화물치환 나노입자가 동맥경화증 발병 부위인 좌측 경동맥에 축적됨을 확인하기 위하여, 적출한 대동맥(aortic tree)을 명시야 현미경 및 형광 현미경 사진을 찍어 관찰하였다.

그 결과, 도 10c에 나타난 바와 같이, 화물치환 나노입자는 마우스 장기 중에서 주로 간, 비장 및 좌측 경동맥에 축적되었음을 확인하였다. 또한, 도 10d에 나타난 바와 같이, 화물치환 나노입자가 마우스의 우측 경동맥에는 거의 존재하지 않고, 좌측 경동맥에만 존재함을 확인하였다. 이 결과들은 본 모델에서 화물치환 나노입자가 동맥경화증이 발병되는 부위인 좌측 경동맥에 잘 도달하였음을 제시한다.

<4-3> 화물치환 나노입자의 좌측 경동맥 내 대식세포로의 흡수, 콜레스테롤 결정과의 상호작용 및 대식세포 사멸 유도 효과 확인

<4-3-1> 경동맥 조직 절편의 제작

약물 처리 종료 후, 경동맥 조직의 콜레스테롤, 대식세포 및 사멸 중인 세포를 형광 염색하기 위하여, 좌, 우 경동맥 조직 절편을 제작하였다. 구체적으로, 약물 투여 종료 후, 좌, 우 경동맥을 적출하여 3.7% 포름알데히드에 고정시켰다. 이후, Tissue-Tek OCT (optimal cutting temperature, Sakura Finetek) 화합물로 포매(embedding)하고, 액체 질소에 얼린 후, 10 ㎛ 두께로 절편을 잘라 사용 전까지 -80 ℃에 보관하였다.

<4-3-2> 화물치환 나노입자의 좌측 경동맥 내 콜레스테롤 결정과의 상호작용 확인

경동맥 조직 절편의 콜레스테롤을 염색하기 위하여, filipin 염색을 하기와 같이 수행하였다. 상기 <실험예 4-3-1>에 기재한 방법으로 제작한 경동맥 조직 절편을 PBS로 씻어준 후, 50 ㎍/mL의 filipin (Sigma-Aldrich)으로 30분 동안 상온에서 반응시킨 후, PBS로 씻어주고, 수용성 마운팅 용액(aqueous mounting medium)을 사용하여 마운팅(mounting)하였다. 화물치환 나노입자는 공초점 현미경으로, filipin은 이광자 현미경(two-photon microscope)으로 사진을 찍어 관찰하였다.

그 결과, 화물치환 나노입자 투여군의 경동맥 조직에서 화물치환 나노입자 및 콜레스테롤이 우측 경동맥에서는 거의 나타나지 않은 반면, 좌측 경동맥에서는 동일한 위치에서 나타남을 확인하였다(도 10e). 이는 좌측경동맥의 콜레스테롤과 화물치환 나노입자가 상호작용함을 제시한다.

<4-3-3> 화물치환 나노입자의 좌측 경동맥 내 대식세포로의 흡수 확인

경동맥 조직 절편의 대식세포를 염색하기 위하여, CD68 항체를 이용한 면역염색을 하기와 같이 수행하였다. 상기 <실험예 4-3-1>에 기재한 방법으로 제작한 경동맥 조직 절편을 blocking solution (1% bovine serum albumin (BSA), 5% goat serum 및 0.02% Tween)에서 60분 동안 상온에서 반응시킨 후, 1차 항체로 rat anti-mouse CD68 항체(2 ㎍/mL in 10% normal goat serum, Cat. #. 137001, Biolegend)를 사용하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. 이후, 2차 항체로 goat anti-rat IgG (4 ㎍/mL in 10% normal goat serum, Cat. #. A16098, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 상온에서 60분 동안 반응시켰다. 이후, 상기 절편을 PBS로 씻고, Hoechst 33342 (5 ㎍/mL in PBS, Thermo Fisher Scientific)로 상온에서 2분 동안 대조염색하였다. 마지막으로 PBS로 씻어준 뒤에 수용성 마운팅 용액을 사용하여 마운팅하였다. 염색 종료 후, 공초점 현미경으로 사진을 찍어 관찰하였다.

그 결과, 화물치환 나노입자 투여군의 경동맥 조직에서 대식세포가 우측 경동맥에서는 거의 나타나지 않은 반면 좌측 경동맥에서는 화물치환 나노입자와 동일한 위치에서 나타남을 확인하였다(도 10f). 이는 화물치환 나노입자가 좌측 경동맥 내 대식세포에 의해 흡수되었음을 제시한다.

<4-3-4> 화물치환 나노입자의 좌측 경동맥 내 대식세포 사멸 유도 효과 확인

경동맥 조직 절편의 사멸 중인 세포(apoptotic cells)를 염색하기 위하여, 상기 <실험예 4-3-1>에 기재한 방법으로 제작한 경동맥 조직 절편 및 Click-it plus terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) 분석 키트(kit, Cat. #. C10617, Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 염색을 수행하였다. 염색 종료 후, 공초점 현미경으로 사진을 찍어 관찰하였으며, TUNEL 분석법으로 사멸 중인 세포를 정량하였다.

그 결과, 화물치환 나노입자 투여군의 경동맥 조직에서 우측 경동맥에서는 대식세포 및 사멸 중인 세포가 전혀 보이지 않은 반면, 좌측 경동맥에서 대식세포가 있는 부위 중 일부가 사멸 중인 세포와 동일한 위치에서 나타났으며(도 10g), 이는 좌측 경동맥 부위의 대식세포에 세포사멸이 유도되었음을 제시한다.

또한, 대조군 및 화물치환 나노입자 투여군의 좌측 경동맥을 비교한 결과, 화물치환 나노입자 투여군에서는 대조군에 비하여 대식세포는 더 적게 나타났고, 사멸 중인 세포는 더 많이 나타났으며, 대식세포와 사멸 중인 세포의 겹치는 영역이 더 넓게 나타났다(도 10i).

또한, 화물치환 나노입자 투여에 의해 세포 사멸이 유의하게 증가한 것으로 나타났다(도 10h). 이는, 화물치환 나노입자의 투여에 의해 좌측 경동맥의 대식세포 사멸이 유도되었음을 의미한다.

결론적으로, 부분 경동맥 결찰 모델에서 동맥경화증 병변 부위인 좌측 경동맥에 화물치환 나노입자가 잘 도달하여, 콜레스테롤 결정과 상호작용하며, 대식세포에 의해 흡수되어 대식세포의 세포사멸을 유도함을 확인하였다.

<실험예 5> 생체 내( in vivo )에서 화물치환 나노입자의 죽종형성(atherogenesis) 억제 효과 및, 전신 및 간에 대한 무독성 확인

화물치환 나노입자의 동맥경화증 치료 효과로서, 죽종형성 억제 효과를 확인하고, 전신 및 간에 대한 독성 여부를 확인하기 위하여, 상기 <실험예 4-1>에 기재된 방법으로 제작한 부분 경동맥 결찰 모델에서 하기 실험들을 수행하였다.

<5-1> 약물 투여 일정

상기 <실시예 4-2>에 기재된 방법으로 제조한 화물치환 나노입자를 사이클로덱스트린 및 스타틴의 최종 농도가 각각 100 mg/kg 및 15 mg/kg이 되도록 준비하였다. 리포좀 및 스타틴의 혼합물을 제조하기 위하여, DOPC 및 DSPE-PEG를 95:5의 몰 비로 클로로포름에 용해시킨 지질필름에 스타틴을 리포좀 대비 1:10의 몰 비가 되도록 추가하여 밤새 완전히 건조시켰다. 상기 건조된 지질필름을 PBS로 수화시키고, 100 nm 폴리카보네이트 멤브레인으로 압출시켰으며, 스타틴의 최종 농도가 15 mg/kg이 되도록 준비하였다.

부분 경동맥 결찰 수술 후 2, 5, 8 및 11일 뒤에 상기 화물치환 나노입자, 상기 리포좀-스타틴 혼합물, 스타틴(15 mg/kg), 사이클로덱스트린(400 mg/kg) 또는 PBS를 정맥 투여하였고, 마지막 투여 후 3일 뒤에 마우스를 희생시켜 전혈을 채취하고, 경동맥 조직을 적출하였다(도 11a).

<5-2> 화물치환 나노입자의 죽종형성 억제 효과 확인

화물치환 나노입자의 죽종형성 억제 효과를 확인하기 위하여, 적출한 경동맥에 대하여 Oil-Red-O 염색을 수행하고, 동맥경화반 영역 및 대식세포 영역을 정량하였다.

<5-2-1> Oil-Red-O 염색을 통한 화물치환 나노입자의 죽종형성 억제 효과 확인

화물치환 나노입자 투여에 의해 좌측 경동맥에서 죽종 형성이 억제되었는지 확인하기 위하여, 상기 <실험예 4-3-1>에 기재된 방법으로 제작한 좌측 경동맥 조직 절편에 대하여 세포 내 축적된 지방을 염색하는 Oil-Red-O 염색을 수행하였다.

구체적으로, 좌측 경동맥 조직 절편을 증류수로 씻어준 후, 60% 이소프로판올(isopropanol, Sigma-Aldrich)로 헹구고, 0.3% Oil-Red-O 용액(Sigma-Aldrich)으로 15분 동안 염색하였다. 이후, 60% 이소프로판올로 헹군 뒤에, 헤마톡실린(hematoxylin, Sigma-Aldrich)으로 2분 동안 대조염색하였다. 마지막으로 증류수로 씻어준 뒤에 수용성 마운팅 용액으로 마운팅하였으며, 이를 광학현미경(Nikon)으로 사진을 찍어 관찰하였다.

그 결과, 도 11b에 나타난 바와 같이, 대조군을 포함한 다른 모든 약물 투여군에서는 붉게 염색된 죽종이 혈관을 거의 막을 정도로 확인된 반면, 화물치환 나노입자의 투여군에서는 죽종형성이 현저히 억제된 것을 확인하였다.

<5-2-2> 화물치환 나노입자의 동맥경화반 영역 감소 효과 확인

화물치환 나노입자가 좌측 경동맥의 동맥경화반 영역을 감소시키는지 확인하기 위하여, 하기와 같이 동맥경화반 영역을 정량하였다. 마우스 희생 시 적출한 대동맥(aortic trees) 조직을 해부현미경(dissection microscope; EMZ-8TRD, Meiji Techno)에 구비된 전하 결합 소자 카메라(charge-coupled device camera, CCD camera)로 3배 확대 사진을 찍어, 동맥경화반으로 덮인 불투명한 영역 및 전체 동맥 영역을 NIH Image J software를 이용하여 정량하였다.

그 결과, 도 11c 내지 11e에 나타난 바와 같이, 다른 모든 약물 투여군에서는 대조군 대비 유의한 차이가 없었으나, 화물치환 나노입자 투여군에서는 동맥경화반 영역이 대조군에 비하여 현저히 감소하였다.

<5-2-3> 화물치환 나노입자의 대식세포 영역 감소 효과 확인

화물치환 나노입자가 좌측 경동맥의 대식세포 영역을 감소시키는지 확인하기 위하여, 상기 <실험예 4-3-1>에 기재된 방법으로 제작한 좌측 경동맥 절편을 상기 <실험예 4-3-3>에 기재된 방법으로 면역염색을 수행하고, 대식세포 영역을 형광 분석으로 정량하였다.

그 결과, 도 11f에 나타난 바와 같이, 다른 모든 약물 투여군에서는 대조군 대비 유의한 차이가 없었으나, 화물치환 나노입자 투여군에서는 대식세포 영역이 대조군에 비하여 현저히 감소하였다.

<5-3> 화물치환 나노입자의 혈장 콜레스테롤 농도에 대한 영향 확인

화물치환 나노입자의 죽종형성 억제의 기전을 조사하기 위하여 마우스의 전혈을 채취하여 혈장 콜레스테롤 농도를 측정하였다.

구체적으로, 약물 투여 종료 후 마우스를 희생시킬 때, 마우스의 전혈을 헤파린 처리된 시린지(heparinized syringes)에 채취하였다. 상기 전혈에 포함된 혈장 지질(총 콜레스테롤, 트리글리세리드(triglycerides), 고밀도 지단백(high-density lipoproteins, HDL) 및 LDL)을 CX7 생화학 분석기(biochemical analyzer; Beckman Coulter)로 분석하였다.

그 결과, 도 11g에 나타난 바와 같이, 혈장 콜레스테롤 농도는 모든 군에서 대조군과 유의한 차이가 없었다. 이는 상기 <실험예 5-2>에서 확인한 화물치환 나노입자의 죽종형성 억제 효과가 주로 동맥경화반에 전달된 화물치환 나노입자의 작용에 기인함을 제시한다.

<5-4> 화물치환 나노입자의 전신 및 간독성 여부 확인

화물치환 나노입자의 투여에 의해 전신 독성이 나타나는지 확인하고자, 실험기간 내 마우스의 몸무게 변화를 측정하였다. 또한, 간세포 내에 있는 효소인 alanine transaminase (ALT) 및 aspartate transaminase (AST)는 간세포의 손상이 있는 경우 혈중으로 흘러나와 혈중 농도가 높아지기 때문에, 그 수치 증가를 간독성의 지표로 본다. 이에, 생체 내에서 화물치환 나노입자의 대부분이 제거되는(clear) 장기인 간에 대한 독성 유무를 확인하고자, 희생시킨 마우스의 전혈에 포함된 ALT 및 AST의 농도를 측정하였다. 구체적으로, 상기 <실험예 5-3>에 기재된 방법으로 마우스 전혈을 채취하여, AU480 화학 분석기(chemistry analyzer; Beckman Coulter)로 혈중 ALT 및 AST의 농도를 측정하였다.

그 결과, 도 11h에 나타난 바와 같이, 모든 군에서 몸무게 변화에 유의적인 차이가 없었다. 또한, 도 11i 및 11j에 나타난 바와 같이, 모든 군에서 혈중 ALT 및 AST 농도에 유의적인 차이가 없었다. 이는 화물치환 나노입자가 죽종형성 억제효과를 보이는 유효 농도에서 전신 및 간에 대해 독성을 나타내지 않음을 제시한다.

<실험예 6> 생체 내( in vivo )에서 화물치환 나노입자의 동맥경화반 퇴행(plaque regression) 효과, 및 전신 및 간에 대한 무독성 확인

상기 <실험예 5>에서 화물치환 나노입자의 죽종형성 억제 효과에 대한 상승작용(synergistic effects)으로서 화물치환 나노입자가 이미 형성된 동맥경화반을 퇴행시키는 효과도 있는지 확인하기 위하여 고지방 식이 유도 동맥경화증 마우스 모델(HFD-induced atherosclerosis mouse model)을 이용하여 다음과 같은 실험들을 수행하였다.

<6-1> 고지방 식이 유도 동맥경화증 모델의 제작

ApoE^-/- 마우스에 상기 <실험예 4-1>에 기재된 조성의 고지방 식이를 8주 동안 섭취시켜 동맥경화증 병변을 유발하였다. 본 모델에서 마우스는 고지방 식이 섭취 후 8주 이내에 완두동맥(brachiocephalic artery) 및 대동맥궁(aortic arch)에서 서서히 동맥경화반을 형성한다.

<6-2> 고지방 식이 유도 동맥경화증 모델에서 화물치환 나노입자의 동맥경화반 내 축적 확인

동맥경화반 내 화물치환 나노입자의 축적을 가시화하기 위하여, 상기 <실험예 6-1>에 기재된 방법으로 동맥경화반을 형성시킨 고지방 식이 유도 모델을 이용하였다. 구체적으로, 상기 <실시예 3-2>에 기재된 방법으로 제조한 형광 표지된 화물치환 나노입자를 아미콘 초원심분리 필터로 농축시켰다. 상기 형광 표지된 화물치환 나노입자에 포함된 사이클로덱스트린 및 스타틴의 최종 농도가 각각 100 mg/kg 및 15 mg/kg이 되도록 하여 고지방 식이 유도 마우스에 정맥 투여 후 48시간 뒤에 대동맥(aortic tree)을 적출하였으며, NIR 형광 이미징 시스템(LI-COR)으로 사진을 찍어 관찰하였다.

그 결과, 도 12a에서 나타난 바와 같이, 상기 <실험에 4-2>에서 확인한 부분 경동맥 결찰 모델에서의 결과와 유사하게, 화물치환 나노입자가 완두동맥 및 대동맥궁의 동맥경화반 병변 내에 축적됨을 확인하였다.

<6-3> 고지방 식이 유도 동맥경화증 모델에서 화물치환 나노입자의 동맥경화반 퇴행 효과 확인

<6-3-1> 약물 투여 일정

상기 <실험예 6-1>에 기재된 방법으로 ApoE^-/- 마우스에 8주 동안 고지방 식이를 섭취시켜 동맥경화증 병변을 유발한 후, 베이스라인(baseline) 군은 희생시키고, 약물 투여 군은 PBS 또는 상기 <실시예 4-2>에 기재된 방법으로 제조하여 사이클로덱스트린 및 스타틴의 최종 농도가 각각 100 mg/kg 및 15 mg/kg이 되도록 한 화물치환 나노입자를 1주일에 2회씩 4주 동안 정맥 투여하였으며, 약물을 투여하는 4주 동안에는 일반 식이를 섭취시켰다. 상기 마우스는 고지방 식이를 섭취시킨 지 12주차에 희생시켰다(도 12b).

<6-3-2> 화물치환 나노입자의 동맥경화반 퇴행 효과 확인

화물치환 나노입자의 동맥경화반 퇴행 효과를 확인하기 위하여, 약물 투여 종료 후 희생시킨 마우스의 완두동맥 및 대동맥궁을 적출하여 상기 <실험예 4-3-1>에 기재된 방법으로 조직 절편을 제작하였다. 이후, 상기 조직 절편의 동맥경화반을 염색하기 위하여 세포 내 축적된 지방을 염색하는 Oil-Red-O 염색을 상기 <실험예 5-2-1>에 기재된 바와 동일한 방법으로 수행하였다. 또한, 완두동맥 및 대동맥궁의 동맥경화반 영역을 상기 <실험예 5-2-2>에 기재된 바와 동일한 방법으로 정량하였다.

그 결과, 도 12c에 나타난 바와 같이, 베이스라인 군의 완두동맥 및 대동맥궁에 형성된 동맥경화반이 대조군에서도 유사하게 나타난 반면, 화물치환 나노입자 투여군에서는 그 영역이 현저하게 감소하였다. 또한, 완두동맥 및 대동맥궁에서의 동맥경화반 영역을 정량한 결과에서도, 화물치환 나노입자 투여군이 대조군보다 현저히 낮은 수치를 나타냈다(도 12d 및 12e). 이는 완두동맥 및 대동맥궁에 형성된 동맥경화반이 화물치환 나노입자의 투여에 의해 퇴행되었음을 제시한다.

<6-3-3> 화물치환 나노입자의 혈장 콜레스테롤 농도에 대한 영향 확인

화물치환 나노입자의 동맥경화반 퇴행의 기전을 조사하기 위하여, 상기 <실험예 5-3>에 기재된 방법으로 마우스의 전혈을 채취하여 혈장 콜레스테롤 농도를 측정하였다.

그 결과, 도 12f에 나타난 바와 같이, 화물치환 나노입자 투여에 의하여 혈장 콜레스테롤 농도에 유의적인 차이가 발생하지 않았다. 이는 상기 <실험예 6-3-2>에서 확인한 화물치환 나노입자의 동맥경화반 퇴행 효과가 주로 동맥경화반에 전달된 화물치환 나노입자의 작용에 기인함을 제시한다.

<6-3-4> 화물치환 나노입자의 전신 및 간독성 여부 확인

화물치환 나노입자의 투여에 의해 전신독성이 나타나는지 확인하고자, 실험기간 내 마우스의 몸무게를 측정하였다. 또한, 화물치환 나노입자의 투여에 의해 간독성이 나타나는지 확인하고자, 상기 <실험예 5-4>에 기재된 방법으로 혈중 ALT 및 AST의 농도를 측정하였다.

그 결과, 도 12g에 나타난 바와 같이, 화물치환 나노입자 투여군의 몸무게는대조군의 몸무게와 유의한 차이를 보이지 않았다. 또한, 도 12h 및 12i에 나타난 바와 같이, 화물치환 나노입자 투여군의 혈중 ALT 및 AST의 농도는 대조군과 유의한 차이를 보이지 않았다. 이는 화물치환 나노입자가 동맥경화반 퇴행 효과를 보이는 유효 농도에서 전신 및 간에 대해 독성을 나타내지 않음을 제시한다.

<실험예 7> 생체 내( in vivo )에서 화물치환 나노입자의 HMG-CoA 환원효소 활성 촉진 효과 확인

wild-type 마우스에 PBS 또는 상기 <실시예 4-2>에 기재된 방법으로 제조하여 사이클로덱스트린 및 스타틴의 최종 농도가 각각 100 mg/kg 및 15 mg/kg이 되도록 한 화물치환 나노입자를 3일 마다 정맥 투여하여 총 4회 투여하였다. 마지막 투여 후 3일 뒤에 마우스를 희생시켜 간조직을 적출하여 PBS에 4℃ 조건으로 두었다가 0.3 M 수크로스(sucrose), 10 mM β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol) 및 10 mM 소듐 EDTA (sodium ethylenediaminetetraacetic acid)를 포함하는 pH 7.4의 차가운 용액에서 TissueLyserII at 20-30 Hz (QIAGEN)를 이용하여 균질화하였다. 이후, 12,000 × g에서 15분 동안 원심분리하여 세포 잔해(debris) 및 미토콘드리아를 제거하고, 상층액을 동일 조건에서 다시 한 번 원심분리하였다. 가용성 효소 및 농축 마이크로좀(concentrate microsomes)을 제거하기 위하여 상층액을 100 kDa MW 물질을 제거하는 아미콘 원심분리 필터(Amicon centrifugal filters with 100 kDa MW cut-off, Cat. #. UFC910024, Milipore)에 옮긴 후, 5,000 × g에서 30분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상기 원심분리는 3회 수행하였고, 마지막 완충용액은 0.3 M 수크로스, 10 mM β-머캅토에탄올, 10 mM 소듐 EDTA 및 10 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol)을 포함하는 용액으로 교체하였다. 단백질 정량은 BCA (bicinchoninic acid) 분석법으로 수행하였고, 시료 농도는 5 mg/mL로 조절하였다. 시료의 HMG-CoA 환원효소 활성은 HMG-CoA 환원효소 분석 키트(HMG-CoA Reductase Assay Kit, Sigma)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 수행하였다.

그 결과, 도 12j에 나타난 바와 같이, 화물치환 나노입자의 투여에 의해 HMG-CoA 환원효소의 활성이 약 10배 정도 증가하였으며, 이는 기존에 사람, 마우스 및 랫드에서 경구 투여된 스타틴이 HMG-CoA 환원효소 활성을 증가시킨다는 보고와 일치하는 결과이다. 이는 전신 투여된 화물치환 나노입자가 경구 투여된 스타틴과 유사하게 간의 반응을 유도함을 제시한다.

<실험예 8> 생체 내( in vivo )에서 화물치환 나노입자의 동맥경화반 형성 억제 및 퇴행 효과 확인

고지방 식이 유도 동맥경화증 마우스 모델에서 화물치환 나노입자 투여에 의한 동맥경화반 형성 억제 효과를 확인하고, 고지방 식이를 보다 장기간 투여하여 유도된 동맥경화반에 대한 퇴행 효과를 하기 실험으로 확인하였다.

<8-1> 고지방 식이 유도 동맥경화증 모델의 제작 및 약물 투여 일정

ApoE^-/- 마우스에 고지방 식이를 12주 동안 섭취시킨 것을 제외하고는 상기 <실험예 6-1>에 기재된 것과 동일하게 고지방 식이 유도 동맥경화증 모델을 제작하였으며, 상기 마우스는 고지방 식이 섭취 후 8주 이내에 완두동맥 및 대동맥궁에서 동맥경화반을 형성한다. 화물치환 나노입자의 동맥경화반 형성 억제 효과를 확인하기 위하여, 고지방 식이를 섭취시키는 12주 동안 1주에 1회씩 PBS 또는 화물치환 나노입자를 총 11회 정맥투여하였다. 화물치환 나노입자는 상기 <실시예 4-2>에 기재된 방법으로 제조하여 사이클로덱스트린 및 스타틴의 최종 농도가 각각 100 mg/kg 및 15 mg/kg이 되도록 한 것을 사용하였다. 12주 동안 형성된 동맥경화반에 대한 퇴행 효과를 확인하기 위하여, 고지방 식이를 12주 동안 섭취시킨 후, 일반 식이 또는 고지방 식이를 4주 동안 섭취시키면서 PBS 또는 상기 화물치환 나노입자를 4주 동안 1주에 2회씩 총 8회 정맥투여하였다(도 13a).

<8-2> 화물치환 나노입자의 동맥경화반 형성 억제 및 퇴행 효과 확인

동맥경화반 형성 억제 효과를 확인하기 위하여 상기 고지방 식이를 12주 동안 섭취시킨 마우스를 희생시키고, 동맥경화반 퇴행 효과를 확인하기 위하여 상기 고지방 식이 12주 섭취 후 4주 동안 일반 식이 또는 고지방 식이를 섭취시킨 마우스를 희생시켰다. 각 마우스의 심장을 적출하여 <실험예 4-3-1>에 기재된 것과 동일한 방법으로 판막 부위가 포함된 대동맥 조직 절편을 제작하였다. 상기 대동맥 조직 절편의 동맥경화반을 염색하기 위하여 <실험예 5-2-1>에 기재된 것과 동일한 방법으로 Oil-Red-O 염색을 수행하여 세포 내 축적된 지방을 염색하였다. 절편으로 제작하지 않은 고정된 대동맥 조직의 동맥경화반을 염색하기 위하여, 고정된 대동맥 조직을 증류수로 씻어준 후, 60% 이소프로판올로 헹구고, 0.3% Oil-Red-O 용액으로 15분 동안 염색하였다. 이후, 60% 이소프로판올로 헹구고, 증류수로 씻어준 후, 해부현미경(EMZ-8TRD, Meiji Techno)에 구비된 전하 결합 소자 카메라(CCD camera)로 사진을 찍어 관찰하였다. 대동맥 조직 절편의 대동맥 기부(aortic root) 부위에서 염색된 영역을 손상 영역으로 정량하여 나타내었고, 대동맥 조직 중 대동맥궁 및 흉대동맥(thoracic aorta) 각각의 전체 영역 중 염색된 영역의 비율을 계산하여 손상 영역으로 나타내었다.

그 결과, 12주 동안 고지방 식이를 섭취한 마우스의 대동맥 내에는 동맥경화반이 많이 형성되었으나, 화물치환 나노입자를 투여한 경우 동맥경화반 형성이 유의하게 감소하였고, 고지방 식이 섭취 12주 이후 일반 식이 또는 고지방 식이를 섭취한 마우스 군 모두에서, 화물치환 나노입자를 투여한 경우가 그렇지 않은 경우에 비하여 유의하게 동맥경화반이 퇴행하였다(도 13b 및 13c). 이는 화물치환 나노입자가 고지방 식이에 의해 유도되는 동맥경화반에 대하여 그 형성을 억제함과 동시에 이미 형성된 동맥경화반을 퇴행시키는 효과도 우수함을 제시한다.

<실시예 5> 제조방법을 단순화시킨 화물치환 나노입자의 제조

본 발명의 <실시예 2>에 기재된 화물치환 나노입자의 제조방법의 경우, 복합체의 코팅에 사용하기 위한 지질 필름은 매우 얇게 만들어야 하고, 복합체 형성 후 이를 지질로 코팅하는 과정을 거쳐야 하므로, 상기 제조방법을 보다 단순화시켜 추후 대량생산에 용이하게 하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

사이클로덱스트린 및 스타틴(심바스타틴)을 각각 30 mM 및 5 mM이 되도록 500 ㎕의 에탄올에 용해시키고, <실시예 2>에 기재된 것과 동일한 방법으로 제조한 인지질의 농도가 5 mM인 지질 필름을 500 ㎕의 클로로포름에 용해시켜 준비하였다. 상기 각 용액을 혼합하여 30분간 섞은 후, 진공 하에 1시간 동안 완전히 건조시켰다. 이후, 형성된 사이클로덱스트린, 스타틴 및 지질로 구성된 필름을 1 mL의 PBS로 다시 수화시킨 후, 100 nm 폴리카보네이트 멤브레인으로 상온에서 압출하여 화물치환 나노입자를 수득하였고, 비결합 스타틴 및 비결합 사이클로덱스트린은 PD-10 컬럼을 통해 제거하였다.

<실험예 9> 두 가지 제조방법에 따른 화물치환 나노입자의 동등성 확인

상기 <실시예 2>에서 제조한 화물치환 나노입자 및 <실시예 5>에서 제조한 화물치환 나노입자의 특성이 서로 동등한지 여부를 콜레스테롤 결정 분해 효과 및 대식세포에 대한 세포독성을 비교하여 확인하였다.

<9-1> 콜레스테롤 결정 분해 효과에 대한 동등성 확인

상기 <실험예 1-4>에 기재된 바와 같이 <실시예 2>에 기재된 방법 및 <실시예 5>에 기재된 방법으로 화물치환 나노입자를 제조하면서 사이클로덱스트린의 농도를 0, 0.5, 1 또는 3 mM이 되도록 준비하고, <실험예 1-4>에 기재된 것과 동일한 방법으로 콜레스테롤 결정에 대한 분해 효과를 비교하였다.

그 결과, 화물치환 나노입자의 콜레스테롤 결정에 대한 분해 효과에 있어 <실시예 2> 및 <실시예 5>의 제조방법 간에 차이가 없음을 확인하였다(도 14a).

<9-2> 대식세포에 대한 세포독성의 동등성 확인

또한, 대식세포주인 Raw264.7 세포에 <실시예 2> 또는 <실시예 5>의 기재된 방법에서 각 구성성분의 몰농도 비율을 맞추어 화물치환 나노입자 내의 스타틴이 100 μM로 포함되도록 제조한 화물치환 나노입자를 처리한 것을 제외하고는 <실험예 2-2>에 기재된 것과 동일한 방법으로 대식세포의 세포생존율을 측정하였다.

그 결과, 두 가지 화물치환 나노입자 모두 대식세포에 대하여 약 30% 내외의 세포독성을 보였으며, <실시예 2> 및 <실시예 5>의 제조방법 간에 차이가 없음을 확인하였다(도 14b).

상기 결과들은 대량생산을 위하여 보다 단순화시킨 제조방법에 의해 제조된 화물치환 나노입자가 앞서 동맥경화증 치료 효과를 확인한 화물치환 나노입자와 유사한 수준의 효과를 나타낼 것임을 제시한다.

Claims

메틸-β-사이클로덱스트린(methyl-β-cyclodextrin) 및 심바스타틴(simvastatin) 복합체(complex)가 인지질(phospholipid)로 코팅된 나노입자를 유효성분으로 함유하는 동맥경화증 예방 또는 치료용 약학적 조성물이며,
상기 인지질은 DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 및 DSPE-PEG (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]) 혼합물이고,
상기 나노입자의 유체역학적 크기(hydrodynamic size)는 70 내지 130 nm이며,
상기 복합체는 콜레스테롤 결정을 분해하고, 상기 콜레스테롤 결정의 분해는 상기 복합체의 심바스타틴 및 동맥경화반(atherosclerotic plaque) 내 콜레스테롤 결정(cholesterol crystal)에 존재하는 콜레스테롤을 상호 치환함으로써 이루어지며, 상기 복합체는 대식세포(macrophage) 또는 포말세포(foam cell)의 사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는,
동맥경화증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
1) 메틸-β-사이클로덱스트린(methyl-β-cyclodextrin) 및 심바스타틴(simvastatin)을 각각 용매에 용해시킨 후 혼합하는 단계;
2) 상기 혼합액을 진공 하에서 건조시킨 후, 다시 수화시켜 복합체를 형성하는 단계; 및
3) 상기 복합체를 DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 및 DSPE-PEG (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]) 혼합물인 인지질로 코팅하는 단계를 포함하는 화물치환 나노입자의 제조방법에서,
상기 제조되는 나노입자의 유체역학적 크기(hydrodynamic size)는 70 내지 130 nm이고,

상기 인지질로 코팅하는 단계는,
DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 및 DSPE-PEG (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000])로 구성된 지질 필름을,
상기 수화시켜 복합체를 형성하는 단계에서 제조되는 용액으로 수화시켜 수행되는 것을 특징으로 하는,
화물치환 나노입자의 제조방법.
삭제
삭제
제 9항에 있어서, 상기 단계 1)의 용매는 에탄올인, 화물치환 나노입자의 제조방법.
제 9항에 있어서, 상기 단계 1)의 메틸-β-사이클로덱스트린, 및 심바스타틴은 0.5 내지 15 : 1의 몰농도 비로 혼합하는, 화물치환 나노입자의 제조방법.
삭제
제 9항에 있어서, 상기 단계 3)의 인지질은 복합체 내의 메틸-β-사이클로덱스트린에 대하여 0.5 내지 15 : 1의 몰농도 비로 사용하는, 화물치환 나노입자의 제조방법.
1) 메틸-β-사이클로덱스트린(methyl-β-cyclodextrin); 심바스타틴(simvastatin); 및 DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 및 DSPE-PEG (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]) 혼합물인 인지질을 각각 용매에 용해시킨 후 혼합하는 단계;
2) 상기 혼합액을 진공 하에서 건조시키는 단계; 및
3) 상기 건조물을 다시 수화시키는 단계를 포함하는 화물치환 나노입자의 대량 제조방법에서,
상기 제조되는 나노입자의 유체역학적 크기(hydrodynamic size)는 70 내지 130 nm인 것을 특징으로 하는,
화물치환 나노입자의 대량 제조방법.
삭제
삭제
제 16항에 있어서, 상기 단계 1)의 용매는 에탄올 또는 클로로포름인, 화물치환 나노입자의 대량 제조방법.
삭제