KR102147951B1 - 솔잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 그람양성 또는 그람음성 세균에 대한 항균용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 솔잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 그람양성 또는 그람음성 세균에 대한 항균용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명에서는 솔잎 에탄올 추출물이 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus) 및 프레보텔라 인터메디아(Prevotella intermedia)에 대한 우수한 항균 활성을 확인하였으므로, 천연물을 이용한 항균제로서 친환경적이고 부작용이 거의 없는 안전한 항균제로 사용될 수 있다.

Description

솔잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 그람양성 또는 그람음성 세균에 대한 항균용 조성물{Antimicrobial composition against gram positive or gram negative bacteria containing extract of pine needle as effective component}

본 발명은 솔잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 그람양성 또는 그람음성 세균에 대한 항균용 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 병원성 미생물에 의한 직접 혹은 간접적인 피해는 경제, 환경 및 의학적으로 많은 문제를 일으키고 있다. 특히, 식품 산업에서의 식품 유통 과정 중의 부패로 인한 손실과 농업에서의 농작물에 대한 과량의 화학 살충제의 사용으로 인한 인체의 유해성 및 환경오염, 항생제의 오남용으로 인한 항생제 내성 균주의 출현 등은 이미 사회 전반에서 고질적인 문제가 되고 있다. 이런 현실에서 식물 등에서 분리된 천연 생리 활성 물질들은 병원성 세균, 진균 등의 넓은 범위에서 항생 활성을 나타내지만, 환경 친화적으로 사용할 수 있다는 점에서 새로운 대체 물질로서의 개발이 시급한 실정이다.

현재 사용되고 있는 대부분의 항생제는 화학적인 합성을 통해 제조된 것으로서 고비용이 소요되며, 상기와 같은 오염 및 부작용을 유발하는 등의 많은 한계를 가지고 있다. 따라서, 최근에는 천연물로부터 새로운 항균물질을 분리하고자 하는 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 항생제의 기능을 대체할 수 있는 환경친화적인 물질의 개발이 중요한 과제이다. 천연물로부터 새로운 항균물질을 분리하기 위해서는 항균 스펙트럼이 광범위하고 장기간 투여하여도 부작용 없이 안전하여야 한다는 점 등을 고려해야 한다.

적송(Pinus densiflora Sieb. et Zucc.)은 상록성 침엽교목으로 국내를 비롯하여 만주, 일본 등지에 널리 분포하고 있어 예로부터 솔잎, 송진, 꽃가루, 솔방울, 껍질 등은 구황식품으로 널리 식용되어 왔고, 현재도 한방과 식품분야에서 여러 가지 형태로 이용되고 있다. 특히 솔잎은 생체조직의 산화 환원 촉진작용 및 지혈작용 등이 있다고 하며, 동맥경화증의 민간약으로도 사용되어 왔다. 솔잎에는 엽록소, 비타민 A 및 비타민 K가 함유되어 있고 그 외에도 단백질, 지방, 인, 철, 효소, 정유(식물성 휘발류, 테르펜 계열), 미네랄 및 비타민 C가 함유되어 있으며 체내의 노폐물을 배출시키고 신진대사를 활발하게 하는 것으로 알려져 있다.

한편, 한국공개특허 제2011-0032038호는 '솔잎 추출물을 함유한 스프레이용 조성물, 그 제조방법, 상기 스프레이용 조성물이 충진된 스프레이 장치, 스프레이식 손 소독 세정제 및 스프레이식 구강청정제'를 개시하고 있으며, 한국공개특허 제2011-0000216호는 '솔잎 추출물, 쑥 추출물, 녹차잎 추출물을 함유하는 방향제용 조성물 및 그 제조방법'을 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 솔잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 그람양성 또는 그람음성 세균에 대한 항균용 조성물에 대해 아직까지 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 적송(Pinus densiflora)의 솔잎을 대상으로 에탄올 추출하여 제조한 솔잎 에탄올 추출물이 인간신장 세포주인 HEK293 세포에 대해 세포 독성이 없으며, 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus) 및 프레보텔라 인터메디아(Prevotella intermedia)에 각각 처리하였을 때, 이들의 생육을 효과적으로 저해하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 솔잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 그람양성 또는 그람음성 세균에 대한 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 솔잎 에탄올 추출물이 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus) 및 프레보텔라 인터메디아(Prevotella intermedia)에 대한 우수한 항균 활성을 확인하였으므로, 천연물을 이용한 항균제로서 친환경적이고 부작용이 거의 없는 안전한 항균제로 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 구현 예에 따른 솔잎 에탄올 추출물을 농도별로 인간신장 세포주(HEK293)에 처리하였을 때, 세포 생존율을 측정하여 솔잎 에탄올 추출물의 세포 독성을 확인한 결과이다. Normal은 아무것도 처리하지 않은 대조군이다.
도 2는 본 발명의 일 구현 예에 따른 솔잎 에탄올 추출물을 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus)에 처리하였을 때, 최소저해농도(MIC, Minimum Inhibitory Concentratio)를 측정한 결과이다. Normal은 아무것도 처리하지 않은 대조군이며, Positive control은 카베니실린(carbenicillin, 10㎍/㎖)을 처리한 양성 대조군이다.
도 3은 본 발명의 일 구현 예에 따른 솔잎 에탄올 추출물을 프레보텔라 인터메디아(Prevotella intermedia)에 처리하였을 때, 최소저해농도(MIC, Minimum Inhibitory Concentratio)를 측정한 결과이다. Normal은 아무것도 처리하지 않은 대조군이며, Positive control은 카베니실린(carbenicillin, 10㎍/㎖)을 처리한 양성 대조군이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 솔잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 그람양성 또는 그람음성 세균에 대한 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 "항균(antimicrobial)"의 의미는 어떤 농도에서 미생물의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제, 또는 제거하는 능력을 의미한다.

본 발명의 "항균용 조성물"은 세균과 같은 미생물의 생육을 저해하는 활성을 가진 조성물로서, 항미생물제를 총칭하는 의미인 항생제와 같은 의미일 수 있고, 항균 효과가 요구되는 다양한 분야에 사용되는 모든 형태가 포함될 수 있으며, 예를 들어, 의약품, 의약외품, 식품 첨가제 또는 사료 첨가제 등의 형태일 수 있다.

본 발명의 "함유하는(comprising)" 용어는 포함하는 것에 한정되지 않으며, 일예로 다른 첨가제, 성분, 지수 또는 단계와 같은 것을 제외하지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 병원성 세균에 대한 항균용 조성물에서, 상기 솔잎 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매를 이용하여 추출한 것일 수 있으며, 바람직하게는 에탄올을 이용하여 추출한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 솔잎은 적송(Pinus densiflora)의 솔잎일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 그람양성 세균은 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus)이고, 상기 그람음성 세균은 프레보텔라 인터메디아(Prevotella intermedia)인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

재료 및 방법

1. 솔잎 추출물 제조

솔잎은 전라남도 곡성지역(해발 350m 이상)에서 자란 건강한 적송(Pinus densiflora)을 선택하여 영양상태가 좋은 가지 부분을 채취한 후, 싱싱하고 푸른 잎만 선별하여 사용하였다. 선별한 솔잎은 여러 번 세척하여 탈수기에서 표면의 수분을 완전히 제거한 후 사용하였다. 세척이 완료된 솔잎 대비 10배 가량의 70%(v/v) 주정용 에탄올을 첨가하여 60℃의 조건에서 3시간 동안 추출하였다. 추출이 완료된 솔잎 에탄올 추출물은 감압 농축기를 이용하여 잔여 용매를 모두 제거한 후, 하기 실시예에 사용하였으며, 양성 대조군으로 카베니실린(carbenicillin)을 사용하였다.

2. 세균 배양

본 발명에 사용한 균주는 스트렙토코커스 소브리누스 KCOM 1157(Streptococcus sobrinus KCOM 1157) 및 프레보텔라 인터메디아 KCOM 1107(Prevotella intermedia KCOM 1107)를 사용하였다. 스트렙토코커스 소브리누스 KCOM 1157 균주는 BHI(Brain Heart Infusion) 배지를 이용하여 37℃에서 호기성 조건으로 배양하였으며, 프레보텔라 인터메디아 KCOM 1107 균주는 0.5% 효모 추출물, 0.05% 시스테인 HCl-H₂O, 0.5㎎/ml 헤민 및 2㎍/ml 비타민 K₁가 포함된 TSB(Tryptic Soy broth) 배지를 이용하여 37℃의 혐기성 배양기(조건: 10% H₂, 5% CO₂ 및 85% N₂)에서 배양하였다.

3. 세포 독성

인간신장 세포주인 HEK293 세포는 10% FBS(Fetal Bovine Serum), 100unit/mL의 페니실린(penicilin) 및 100ng/mL의 스트렙토마이신(streptomycine)을 포함한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, WELGENE, Korea) 배지에서 37℃ 및 5% CO₂ 조건으로 배양하였다. 솔잎 에탄올 추출물의 세포 독성을 확인하기 위해, 상기 배양된 HEK293 세포에 솔잎 에탄올 추출물을 농도별로 처리하고 24시간 동안 배양한 후, 이를 대상으로 MTT(3-(4,5-디메틸디아졸-2-일)-2,5-데펜테르라졸리움 프로미드) 분석을 통해 세포 독성을 측정하였다.

4. 최소저해농도( MIC ) 및 최소살균농도(MBC) 측정

MIC(Minimum Inhibitory Concentration)는 액체 배지상에서 최소저해농도이며, 이는 특정 미생물의 증식을 완전히 저해하는 데 요구되는 최소 농도의 항생물질 양을 측정하는 시험법으로, 액체 배지에서 균주를 솔잎 추출물과 함께 24시간 배양한 후 미생물의 생장 정도를 확인하였다. 이때 생장 정도는 UV 분광 광도계를 이용하여 O.D 600에서 흡광도를 측정하였다.

MBC(minimal bactericidal concentration)는 최소살균농도이며, 즉, MBC는 균이 다시 성장할 수 없도록 살균시키는 최소 농도 단위를 나타낸다. MIC 측정결과를 평가한 후, 이를 토대로 고체 배지에 도말하였을 때, 콜로니가 형성되지 않는 최소 농도를 산출하였다.

실시예 1. 솔잎 에탄올 추출물의 세포 독성 확인

본 실시예 1에서는 본 발명의 솔잎 에탄올 추출물의 세포 독성을 확인하기 위해, 인간 신장세포주인 HEK293 세포에 솔잎 에탄올 추출물을 농도별(10, 20, 40, 60, 80, 100, 200 및 300㎍/㎖)로 처리한 후, MTT 분석을 통해 세포 독성을 측정한 결과, 도 1에 개시한 바와 같이 솔잎 에탄올 추출물을 300㎍/㎖의 농도까지 처리하여도 아무것도 처리하지 않은 대조군(Normal)의 세포 생존율과 유사하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 토대로 하기 실시예 2의 MIC 및 MBC 시험 농도로 설정하였다.

실시예 2. 솔잎 에탄올 추출물 처리에 따른 스트렙토코커스 소브리누 스( Streptococcus sobrinus ) 및 프레보텔라 인터메디아 ( Prevotella intermedia )에 대한 MIC 및 MBC 확인

본 실시예 2에서는 본 발명의 솔잎 에탄올 추출물 처리에 따른 그람양성 세균인 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus)와 그람음성 세균인 프레보텔라 인터메디아(Prevotella intermedia)에 대해 최소저해농도(MIC) 및 최소살균농도(MBC)를 측정하였다. 그 결과, 하기 표 1에 개시한 바와 같이 스트렙토코커스 소브리누스의 경우 300㎍/㎖의 솔잎 에탄올 추출물을 처리하였을 때, 세균의 생장이 저해되거나 콜로니가 형성되지 않는 것을 확인하였으며(도 2), 프레보텔라 인터메디아의 경우 100㎍/㎖의 솔잎 에탄올 추출물을 처리하였을 때, 세균의 생장이 저해되었으며, 150㎍/㎖의 솔잎 에탄올 추출물을 처리하였을 때, 콜로니가 형성되지 않는 것을 확인하였다(도 3).

스트렙토코커스 소브리누스 및 프레보텔라 인터메디아에 대한 솔잎 에탄올 추출물의 MIC 및 MBC 측정 결과

세균	MIC(㎍/㎖)	MBC(㎍/㎖)
스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus)	300	300
프레보텔라 인터메디아(Prevotella intermedia)	100	150

Claims (4)

1. 적송(Pinus densiflora)의 솔잎 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 프레보텔라 인터메디아(Prevotella intermedia)에 대한 항균용 조성물.
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