KR102123903B1 - 분화인자가 함유된 엑소좀 나노 캐리어 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 분화인자가 함유된 엑소좀 나노 캐리어 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 연골재생용 엑소좀 나노 캐리어 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 연골 재생과 골관절염 치료를 위해 필러나 치료용으로 인체의 관절 부위에 직접 주입하여 사용 가능하고 조직 공학적으로 생체에 적합한 바, 엑소좀 나노캐리어 안에 들어있는 물질을 효과적으로 관절부위에 전달함으로써, 해당 부위의 연골 손상에 대하여 재생 효과를 발현함은 물론 골관절염의 발생을 억제하고 치료할 수 있어서 연골 재생 및 골관절염 치료 및 예방에 탁월한 효과가 있다.

Description

분화인자가 함유된 엑소좀 나노 캐리어 조성물 및 이의 제조방법{Composition of exosome nano carriers containing differentiation factors and methods of thereof}

본 발명은 분화인자가 함유된 엑소좀-나노 캐리어 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 분화인자가 함유된 엑소좀-나노캐리어를 제조하고, 이를 이용하여 BMSCs의 연골화를 통해, 골관절염과 같이 손상된 연골을 재생하는 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

연골손상 질환을 치료하기 위해서는 자가골 이식술, 미세 천공술 등과 같은 수술적 방법과 조직 공학적 방법인 연골 세포를 포함한 하이드로겔을 이용한 비침습적인 치료 연구가 이루어지고 있다. 그러나, 이러한 연구들 역시 치료 효율이 떨어지는 단점이 있어 새로운 치료방법에 대한 개발이 요구되고 있는 실정이다.

생체나노물질인 엑소좀(Exosome)은 세포로부터 분리된 10 ~ 200nm의 크기를 가진 다소포체로 세포의 증식, 분화 매트릭스 합성, 세포 사멸 방지 등의 우수한 특성을 가지며, 높은 생체적합성을 보인다. 뿐만 아니라 엑소좀은 세포에 직접 영향을 끼치는 특성 외에도 엑소좀 속에 있는 물질들을 면역반응 등의 여러 작용으로부터 내재적 성질을 보호하고 상처부위에 표적화 시킬 수 있는 것으로 알려져 있어서, 연골 재생 연구에 적합하다(Farooqi, A. A.; Desai, N. N.; Qureshi, M. Z.; Librelotto, D. R. N.; Gasparri, M. L.; Bishayee A.; Nabav, S. M.; Curti, V.; Daglia, M. Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds, Biotechnology Advances, 36(1), 328-334 (2018)).

또한, miRNA는 연골 손상 치료에 이용된다고 알려져 있다. 특히 miRNA 140은 연골에서 특이적으로 발현되고, 연골세포 분화, ECM 분해 및 세포내 분화에 관여하는 것을 알려져 있다.

상기와 같은 miRAN를 넣어 상처부위의 연골 결손 miRNA를 억제하여 연골 치료를 치료하는 시도와 엑소좀 안에 자체적으로 들어있는 miRNA를 통하여 분화시키는 시도는 있다. 상기와 같이 miRAN를 넣오 상처부위의 연골 결손 miRNA를 억제하여 연골 치료를 치료하는 시도와 엑소좀 안에 자체적으로 들어있는 miRNA를 통하여 분화시키는 시도는 있지만 엑소좀-나노캐리어를 통해 약물 및 물질을 전달과정에서, 약물을 엑소좀에 로딩시킬때 물질의 변성, 오염 등 문제점으로 원하는 효율을 얻어내지 못하는 문제점이 있다.

한편 등록특허 제10-1864234호는 음경해면체 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 발기부전 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로 엑소좀을 포함하는 것은 본 발명과 유사하나 상기 조성물은 발기부전 예방, 개선, 치료용이어서 본 발명의 연골 재생용과는 용도가 상이하며, 상기 발명은 엑소좀 자체에 의해 특정 용도에의 효과가 발생되는 것으로 본 발명과 기술적 특징이 상이하다.

등록특허 제10-1864234호

Farooqi, A. A.; Desai, N. N.; Qureshi, M. Z.; Librelotto, D. R. N.; Gasparri, M. L.; Bishayee A.; Nabav, S. M.; Curti, V.; Daglia, M. Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds, Biotechnology Advances, 36(1), 328-334 (2018).

상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 본 발명의 목적은 연골 결함과 관절염 치료를 위해 연골 분화인자인 miRNA 140이 함유된 엑소좀-나노캐리어를 통하여 연골로의 분화 및 재생에 필요한 조성물을 제공하는데 있다.

또한 상기 조성물을 이용하여 연골재생용 주사제 형태로 개인 맞춤형 의료용 키트로 제공하고자 한다.

또한, 상기의 조성물을 제공하기 위해 동결-해동 방식을 사용한 상기의 엑소좀-나노캐리어의 조성물의 제조방법을 제공하고자 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 엑소좀을 주성분으로 하고, 여기에 보조성분으로 분화 인자인 miRNA 140를 포함한 분화인자가 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 엑소좀 나노캐리어 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은

(a) 엑소좀을 분리하는 단계;

(b) 분화인자를 엑소좀 수용액에 트랜스펙션하는 단계;

(c) 트랜스 펙션된 분화인자와 엑소좀을 융합시키는 단계

를 포함하는 분화인자를 포함하는 엑소좀-나노캐리어 조성물의 제조방법.

을 제공한다.

본 발명은 바람직한 조성으로서, 엑소좀을 주성분으로 하고 여기에 분화인자가 보조성분으로 혼합된 구성으로 이루어질 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 주성분으로 사용되는 엑소좀은 세포 증식, 분화 등 좋은 세포 치료제로써의 기능과 면역반응 등으로부터 물질의 내재적 성질보호 등 캐리어로써의 장점을 가지고 있다. 엑소좀-나노캐리어는 엑소좀 자체를 치료 물질로 사용가능 하고, 또한 생체 적합 고분자, 성장인자 등과 융합하여 엑소좀-나노캐리어를 제조하면, 더욱 효과적으로 전달 가능하여, 다양한 상처부위를 치료할 수 있으며, 지지체, 주사제 등 다양한 방법을 적용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 분화인자는 miRNA, 덱사메타손(dexamethasone), TGF-beta(Transforming Growth Factor-beta1)을 포함한 연골 분화 인자일 수 있으며, 상기 miRNA는 miRNA-27a, miRNA-27B, miRNA-140, miRNA-146 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기의 분화 인자는 줄기 세포를 연골 세포로 분화시킬 수 있는 등의 효과를 가지며, 그 중 miRNA 140는 연골 조직의 항상성에 관여하여, BMSCs에서 연골 세포로 분화를 시켜, 연골 재생 과정에서 중요한 역할을 한다.

상기의 (a) 엑소좀을 분리하는 단계는 다음과 같다;

엑소좀은 토끼에서 피를 채취한 뒤, 원심분리 (1500rpm, 10min)를 이용하여 혈청과 혈장을 분리한 후 다시 원심분리(16500xg, 20min)를 이용하여 세포 파편과 단백질을 분리합니다. 이후 0.2um 필터를 이용하여 엑소좀과 마이크로비지클(microvesicles)을 분리한 뒤 초원심 분리(26500rpm, 10min)를 이용하여, 최종적으로 엑소좀을 분리하여, 추출한다. 분리한 엑소좀은 1% PS(penicillin-streptomycin) 용액과 Free Water에 희석시켜 사용 전까지 동결시켜 놓는다.

상기의 엑소좀을 추출하기 위해 사용되는 혈액은 제한은 없으나, 바람직하게는 포유동물의 혈액, 더욱 바람직하게는 토끼의 혈액을 사용할 수 있다.

상기의 (b) 분화인자를 엑소좀 수용액에 트랜스펙션하는 단계는 다음과 같다;

분화인자인 miRNA 140을 엑소좀 수용액에 트랜스펙션하는 단계에서는 여러 과정을 통해 추출된 엑소좀을 세포 배양을 위해 페니실린 용액에 용해시켜서 용액상으로 제조 한 이후 Dulbecco’s modified eagle (DMEM/F-12, Gibco, USA) 배양액에 분화인자를 트랜스펙션 함으로써 엑소좀 수용액으로 제조한 후 인큐베이팅 처리를 한다. 이때 제조된 엑소좀 용액은 밀봉된 채로 낮은 온도에서 동결시켜 보관함으로써 변질 또는 오염이 없도록 한다.

상기의 (c) 트랜스펙션된 분화인자와 엑소좀을 융합시키는 단계는 다음과 같다;

트랜스펙션된 분화인자와 엑소좀을 융합시키는 단계를 거친다. 바람직하게는 엑소좀 수용액을 상온으로 해동 시켜 융합을 시키고, 다시 2시간 -80℃의 온도로 동결하는 과정을 10번 반복하여 엑소좀-나노캐리어 수용액을 제조할 수 있다.

상기의 조성물을 제공하기 위해 동결-해동 방식을 사용하는 이유는 초저온에서 입자들이 동결되면서 분자구조가 깨진 사이로 물질들이 함유되어 물질의 변성 등의 문제가 생기지 않으며, 방법이 훨씬 간단하기 때문이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 엑소좀 나노캐리어 용액은 사용 직전에 용량에 맞게 배양액에 혼합시켜 세포 배양에 사용한다.

본 발명에 따르면 상기와 같은 공정을 거치게 되면 본 발명에서 목적하는 분화인자가 함유된 엑소좀-나노캐리어를 제조할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 새로운 엑소좀 나노캐리어는 첨가제로서, 예컨대 성장인자인 TGF-β1, BMPs 등 중에서 하나 이상의 성분을 첨가할 수 있으며. 이러한 첨가제를 사용하는 경우 분화인자의 효과 외에도 연골재생 회복속도의 개선을 기대할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기와 같은 본 발명의 연골재생 및 골관절염 치료 및 예방용 조성물은 인체에 직접 주입하여 사용할 수 있으며, 예컨대 일회용 주사기에 충전된 키트 형태로 제조될 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 분화인자를 포함하는 엑소좀 나노캐리어는 기존의 다른 캐리어 물질보다 생체 적합성이 좋고 물질의 내재적 성질을 보호되며 증식, 분화 등 여러 효과를 가지고 있기 때문에 우수한 효능을 보이는 장점을 가진다.

본 발명은 상기와 같은 새로운 생체 적합한 엑소좀-나노캐리어 조성물을 구성하여, 엑소좀 나노캐리어 안에 들어있는 물질을 효과적으로 관절부위에 전달함으로써, 해당 부위의 연골 손상에 대하여 재생 효과를 발현함은 물론 골관절염의 발생을 억제하고 치료할 수 있어서 연골 재생 및 골관절염 치료 및 예방에 탁월한 효과가 있다.

또한, 본 발명은 분화인자 뿐만 아니라 다른 물질들을 넣을 수 있는 방법을 제시함으로써 엑소좀 나노캐리어를 이용해 다른 물질로 다양한 치료를 유도하거나 다른 손상 부위에 사용 가능할 수 있는 우수한 효과가 있다.

도 1은 엑소좀에 miRNA를 트렌스펙션시키는 방법을 이해하기 쉽게 하기 나타낸 것이다.
도 2는 (a) 분리된 엑소좀과 (b) 분화인자가 함유된 엑소좀-나노캐리어의 모폴로지를 TEM을 통하여 관찰한 사진이다.
도 3은 엑소좀 내의 miRNA 140 분화인자 여부 및 양을 측정하기 위해, 분리된 엑소좀 (control group)과 본 발명에 따라 제조된 분화인자가 포함된 엑소좀-나노캐리어를 qRT-PCR를 통하여 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따라 제조된 분화인자가 포함된 엑소좀-나노캐리어 조성물의 크기 및 분포도를 DLS를 통하여 측정한 그래프이다.
도 5는 BMSC 세포 (BMSC), 연골세포 (Chon), BMSC에 miRNA 140이 포함된군 (miR), 엑소좀 (Orignal exosome), 및 miRNA 140이 트렌스펙션된 엑소좀-나노 캐리어 (GD-C)군을 1, 2, 3일 동안 배양 후 Live and dead 염색을 하여 세포 증식, 모폴로지, 세포 생존 및 사멸 등을 관찰한 사진이다.
도 6은 도5에 나타낸 5개의 군을 1, 2, 3일동안 배양 후 SEM을 사용하여 세포 증식, 모폴로지 등을 관찰한 사진이다.
도 7은 BMSC, miR 및 GD-C군에서 배양된 세포의 증식을 MTT assays를 이용하여 관찰한 그래프이다.
도 8은 1, 2, 3일 동안 엑소좀 (Orignal exosome)을 제외한 4개의 군에서 배양된 세포의 연골 발현과 형태 등을 확인하기 위하여, (a) Safranin-O, (b) Alcian Blue를 염색한 결과이다.
도 9는 1, 2, 3일 동안 4개의 군에서 배양된 세포의 연골 발현과 형태 등을 확인하기 위하여, COL2와 DAPI를 형광염색하여, 세포 증식, 모폴로지, 분화 등을 관찰한 사진이다.
도 10은 1, 2, 3일 동안 4개의 군에서 배양된 세포의 연골 유전자 발현을 관찰하기위해 (a) 전기영동과 (b) RT-PCR을 통해 나타낸 유전자 발현을 정량화하여 나타낸 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 엑소좀 추출 및 엑소좀-나노캐리어 제조

엑소좀을 추출하기 위하여, 30ml 토끼 혈액을 원심분리(1200rpm, 10분간) 하여, 상층액인 혈청 serum)을 분리한다. 분리된 혈청은 원심분리(16500xg)로 다시 세포 파편을 제거한다. 이후 0.2μm 필터 (filter)에 투과시켜서 200nm 이상 마이크로 낭포 (microvesicle) 들을 제거한다. 이후 1X 인산염 버퍼 용액(Phosphate buffer solution, PBS) 을 첨가하여, 초원심분리기를 이용하여, 26500xg 조건에서, 70분간 엑소좀을 분리한다. 이 과정을 세 번 반복하여, 엑소좀을 제외한 다른 물질들을 PBS로 세척한다. 분리된 엑소좀은 1% 페니실린 수용액에 융해시켜, 처리 전까지 -80 ℃에 밀봉된 채로 보관한다. 27 μl의 miRNA 140을 750 μl DMEM/F-12 배양액에 첨가 하고, 81 μl Lipofectamine를 혼합한 후 인큐베이팅 처리를 5분간 처리한다. 이후 엑소좀 수용액에 첨가하여 처리 전까지 -80 ℃에 밀봉된 채로 보관한다. 위의 트랜스펙션 양은 24 well 플레이트 기준 50ml에 분주한 배양액에 첨가도록 맞춰진 양이다. 2시간 동안 완전히 동결시킨 후, 상온에서 15 분간 해동처리를 하고, 다시 2 시간 동안 다시 동결시키는 과정을 10번 반복하여 분화인자를 엑소좀 속에 함유시킨다. 이후 PBS 용액을 첨가하고, 초원심분리를 (26500xg, 70분간) 통하여, 세척한 후 엑소좀-나노캐리어를 제외한 배양액, 함유되지 않은 분화인자 등의 다른 물질들을 세척 후 -80 ℃에 보관하다가 사용 직전에 배양액에 혼합시켜 사용한다.

실시예 2: 무릎 연골세포 및 BMSCs 세포의 채취 및 배양

무릎 연골세포 및 BMSCs는 6주령 White New Zealand 토끼에서 채취한 연골과 뼈에서 분리하였다. 무릎연골은 채취한 후, 1 ㎟ 이하의 크기로 잘게 썰고, BMSCs 세포는 뼈 절개 하여 추출한다. 세포들은 PBS에 넣은 후 연골세포는 1200 rpm, BMSCs는 1500 rpm 에서 3분간 원심분리시킨다. 잘게 썬 연골을 10 mg/ml collagenase A (Roche Diagnostics GmbH), 1 mg/ml hyaluronidase (Roche Diagnostics GmbH), 0.7 mg/ml DNase (Roche Diagnostics GmbH)을 섞은 용액에 넣어 37 ℃, 5 % CO₂에서 3시간 분해시킨다. BMSCs 세포는 3일 후 PBS 세척을 통하여 막을 벗겨낸다.

분리된 세포들은 분해시킨 용액을 다시 재 원심분리 시킨 후, 셀컬쳐 디쉬에서 10 % fetal bovine serum (Hyclone technologies)과 1 % penicillin/ascorbic acid 가 포함된 DMEM/F-12 배양액에서 배양하였다.

실험예 1 : 엑소좀-나노캐리어 함유도 및 특성평가

엑소좀과 분화인자가 포함된 엑소좀 나노캐리어의 모폴로지를 Transmission Electron Microscopy(TEM)를 통해 측정하였고, 결과는 도 2에 나타내었다.

엑소좀 내의 miRNA 140 분화인자 여부 및 양을 측정하기 위해, qRT-PCR를 통하여, 엑소좀과 분화인자가 포함된 엑소좀 나노캐리어의 miRNA 140의 양을 비교하였고, 도 3에 나타내었다.

또한 엑소좀 나노캐리어를 Free Water에 희석시켜 Dynamic Lighting System (DLS)를 시행하여 크기 및 분포도를 측정하였다. 그 결과 엑소좀은 30~150nm의 직경을 보여주었으며, 엑소좀-나노캐리어는 77.6nm의 직경을 갖는 것을 확인하였고, 결과는 도 4에 나타내었다.

실험예 2 : 세포의 생존, 세포 사멸, 증식 및 모폴로지 확인

BMSC 세포 (BMSC), 연골세포 (Chon), BMSC에 miRNA 140이 포함된 군 (miR), 엑소좀 (Orignal exosome) 및 miRNA 140이 트렌스펙션된 엑소좀 나노 캐리어(GD-C)군을 Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM), Scanning Electron Microscopy (SEM), MTT assays 을 이용해 세포의 생존, 사멸 방지, 모폴로지, 증식 등을 관찰하였다(도 5 내지 도 7).

토끼 BMSCs 세포와 무릎 연골세포를 채취한 후 플레이트에 배종한 후 실험에 맞게 각각 처리하여 3일 동안 배양하였다. Live and dead 형광염색을 통해 세포들을 염색한 후 CLSM을 통해 세포의 생존, 세포 사멸 등을 관찰하였다. 그 결과 Orignal exosome과 GD-C군에서는 세포 사멸이 거의 보이지 않아 다른 군보다 세포가 많이 생존하였고 증식이 잘되었다. 특히, GD-C군에 miR군과 비교했을 때 더 잘 분화가 된 것을 알 수 있다.

세포 증식 및 모폴로지를 측정하기 위해 2.5% 글루타 알데하이드를 이용해 고정한 후 SEM을 이용하여 확인하였다. Orignal exosome과 GD-C군에서 세포 증식이 더 잘되었고, miR보다 GD-C군에서 세포 증식이 더 잘된 것을 확인할 수 있었다. 또한 세포의 증식률을 확인하기 위한 MTT assays 결과, GD-C군이 BMSC군과 miR군보다 훨씬 증식이 잘되는 것을 볼 수 있다.

실험예 3 : 조직학적 염색 및 분화 평가

BMSC, Chon, miR, Orignal exosome, 및 GD-C군에서 3일 동안 세포들을 배양한 후, Safranin-O, Alcian Blue 염색과 COL2, DAPI 형광염색을 이용해 조직학적으로 관찰하였다(도 8 및 도 9). Safranin-O 염색에서는 연골에서 많이 발현되는 세포외기질의 수분을 함유하는 글라이코스아미노글리칸의 발현정도를 확인하였으며, Alcian Blue 염색에서 pH 2.5와 병행하여, 황산화산성 mucin(sulfate acid mucopolyssacaride: chondroitin sulfate A.B.C. and heparin)을 감별하였다. 또한 COL2, DAPI 형광염색을 통하여 BMSCs 세포로부터 무릎 연골세포로의 분화를 확인하였다. GD-C군이 다른 군보다 훨씬 연골로의 분화가 잘된 것을 확인 할 수 있었다.

실험예 4 : 유전자 발현 분석

엑소좀-나노캐리어에서 분화인자의 함유 여부 및 분화도를 알아보고자 Quantitative Real Time - Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) 실험을 하였다. BMSC, Chon, miR, 및 GD-C군을 비교한 결과, 연골 유전자 표현형이 전기영동에서 모두 발현이 잘 된 것을 확인하였다. 연골 특정 유전자를 GAPDH로 정량화 한 결과, GD-C군에서 어그리칸과 제 II형 콜라겐 연골 유전자 발현이 더 잘된 것을 확인하였다(도 10). 이는 GD-C군이 BMSC의 연골화가 일어났으며, 이는 연골 세포가 증식하기 위한 더 적합한 미세 환경을 제공할 수 있을 것으로 사료된다.

Claims (10)

1. 토끼 혈액에서 분리된 엑소좀을 주성분으로 포함하고 보조성분으로써 분화인자 miRNA 140을 함유하는 것을 특징으로 하는 연골 재생용 엑소좀 나노캐리어 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀과 분화인자는 세척 후에도 엑소좀 내에 분화인자가 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 연골 재생용 엑소좀 나노캐리어 조성물.
3. 삭제
4. (a) 채취된 토끼의 혈액을 원심분리, 초원심분리를 이용하여 엑소좀을 분리하는 단계;
   (b) 분화인자 miRNA 140을 배양액에 혼합 후 인큐베이팅을 통해 엑소좀 수용액에 트랜스펙션하는 단계;
   (c) 트랜스펙션된 분화인자와 엑소좀이 들어있는 수용액에 동결 해동 방법을 통해 상온에서 15분 해동 후 -80℃로 동결을 규칙적으로 10번 반복하여 융합시키는 단계;
   를 포함하는 연골 재생용 엑소좀 나노캐리어 조성물의 제조방법.
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제

Images