KR102117350B1 - 조절 t 세포들의 저해를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 환자의 질병 또는 질병 항원들의 면역 내성을 억제하는 방법에 관한 것이다. 방법은 또한 작동 T 림프구들의 활성을 촉진한다. 본 발명은 환자의 Th1 환경을 촉진하는 치료 조성물을 투여하는 단계와 동시에 질병 항원 내성 및 환자에 의한 질병 항원들의 면역회피에 이르게 할 수 있는 Treg 세포들의 면역억제 활성을 감소시키는 단계를 포함한다. 치료 조성물은 동종 emTh-1 세포들을 포함한다. 치료 조성물은 또한 질병 항원의 샤페론 풍부 세포 용해물과 같은 질병 항원들을 포함할 수 있다.
Description
본 발명은 환자에 있어서 질병 항원의 면역 내성을 억제하거나 및/또는 암 면역억제 메커니즘을 무력화하기 위한 방법에 관한 것이다.
암 면역치료의 주요 목적은 내재(innate) 및 적응 면역 반응의 활성을 통하여 종양 제거를 촉진하는 것이며 면역 내성의 메커니즘을 극복하는 동안에 종양 특이 림프구를 유도하는 이중 역량에 부여된 백신요법 전략의 개발에 의존한다. 암 면역치료의 사용은 잠재적으로 종양 제거 및 적절히 디자인된 암 백신으로의 지속적인 차도를 야기할 수 있다. 악성 세포들을 표적으로 하고 정상 세포들을 회피하는 면역치료에서의 특이성이 또한 최소 독성에 이르게 할 수 있다.
면역 반응들은 일반적으로 두 개의 양극화된 반응, 헬퍼 T1(Th1, 이하 Th1으로 표기), Th2 반응으로 설명된다. Th1 반응은 세포 면역을 매개하고 면역 매개 종양 제거에 매우 중요하며 Th2 반응은 체액성 면역을 매개한다. Th2 반응은 일부 감염성 질병에 대하여 보호할 수 있으나 항-종양 반응을 위하여 바람직하지는 않다. Th1 및 Th2 반응은 증가된 Th1 반응이 Th2 반응을 하향 조절하고 반대의 경우도 마찬가지인, 역조절성(counter-regulatory)이다.
Th1 면역은 종양 제거에 필수적이나, 일부 환자들에 있어서 종양이 Th1 환경의 존재하에서 지속적으로 성장할 수 있다. 따라서, 종양들은 보호를 위한 Th1 반응을 성공적으로 억제하고 회피할 수 있다. 성공적인 면역치료는 Th1 환경을 촉진하여야만 하고 또한 종양 회피 메커니즘 및 정상 조직들의 면역 파괴를 방지하는 역 자연적 내성 회로를 무력하게 하여야 한다.
항-종양 면역을 방해하는 많은 메커니즘은 CD4+CD25+FoxP3+ 조절 T(T regulatory, Treg, 이하 Treg로 표기) 세포들의 활성의 결과이다. 이러한 Treg 세포들은 종양-유래 내성의 발생 및 지속에 중요하게 기여하고 초기 종양 진행에서의 중요한 면역 탈출 메커니즘이다. 종양 진행 동안에 관찰되는 Treg 확장(expansion)은 자연적으로 발생하는 Treg(nTreg, 이하 nTreg로 표기)로부터 또는 CD4+CD25-FoxP3- T 세포들의 CD4+CD25+FoxP3+ Treg로의 전환(iTreg, 이하 iTreg로 표기)으로부터 야기될 수 있다. Treg는 효과기(effector) CD4+, CD8+, 및 자연 살해(NK) 세포들의 기능을 억제하고 수지상 세포 활성을 저해함으로써 면역 반응을 약화시킨다. Treg 세포들이 면역 세포들에 의한 종양의 제거를 위한 주요한 장벽 중 하나이기 때문에, 약물 또는 항체들을 사용하는 그것들의 치료상 소모 또는 기능적 불활성은 암 면역치료에 대한 반응을 향상시킨다. 그러나, Treg 세포들의 선택적 제거 또는 불활성이 중요한 도전에 직면하는데 그 이유는 이러한 세포들은 활성화된 종래의 비억제 T 세포들과 같이, 동일한 표면 마커(marker)들을 공유하기 때문이다. 항체 기반 접근들은 예를 들면, Treg 세포들 및 활성화된 작동 T 림프구(effector T lymphocytes) 모두를 구분없이 표적으로 한다.
샤페론 풍부 세포 용해물(Chaperone Rich Cell Lysate, CRCL)을 포함하는 항암 백신의 사용은 면역자극 효과를 제공하는 것으로 알려졌다. 샤페론 풍부 세포 용해물은 등전위 초점화(isoelectric focusing) 기법에 의해 종양 세포 용해물로부터 발생된다. 샤페론 풍부 세포 용해물 처리 수지상 세포들 및 대식세포(macrophage)들은 Treg 저해에 저항하고 호-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인의 생산 및 면역자극 가능성을 유지한다. 그러나, Treg 상의 샤페론 풍부 세포 용해물의 직접적인 효과는 개연성이 낮아 보이는데 그 이유는 Treg, FoxP3 발현의 생존 및 면역억제 기능이 샤페론 풍부 세포 용해물에의 노출 다음에 유지되기 때문이다.
일부 화학치료제(즉, 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 글리벡(Imatinib mesylate))이 암 백신 효과를 더 향상시키는 Treg 기능의 음성 조절제로서 설명되어 왔다. 동종(allogeneic) T 세포들의 적응성 전달은 또한 숙주 면역 세포들에 보조의 "위험한" 신호를 제공함으로써 종양 면역치료의 효과를 증가시킬 수 있다. 이러한 효과는 부분적으로 활성화된 T 림프구들의 사이토카인 생산에 기인하는데, 이는 보호형 1 면역 반응의 발생을 조성한다. 그러나 Treg 상의 인터페론-감마(IFN-γ)를 포함하는 1형 사이토카인의 효과는 모순적이었다. 모든 세포 매개 면역을 위한 본질적인 작동 사이토카인으로서, 외인성(exogenous) 또는 자가분비(autocrine) 인터페론-감마가 Treg 발생을 음성적으로(negatively) 조절할 수 있다. 이러한 개념과 평행하게, 다른 연구들이 인터페론-감마가 활성-유래 세포 사멸을 향상시키고 이러한 사이토카인은 내인성 및 외인성 경로-의존 세포사멸(apoptosis)을 향상시킴으로써 작동 T 세포들의 확장 및 지속을 조절할 수 있다는 것을 발견하였다.
본 발명은 환자에 있어서 질병 항원의 면역 내성을 억제하거나 및/또는 암 면역억제 메커니즘을 무력화하기 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
일 양상에서, 본 발명은 환자의 질병의 면역 내성을 억제하는 방법에 관한 것이다. 방법은 동종 Th1 세포들을 포함하는 치료 조성물을 환자에 투여함으로써 Treg 세포들의 면역억제 활성의 감소를 포함하는데 Treg 세포들의 활성의 감소 및/또는 저해는 환자의 질병 항원의 면역 내성을 감소시킨다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 환자의 치료 면역 효과를 자극하기 위한 방법에 관한 것이다. 방법은 동종 Th1 세포들을 포함하는 치료 조성물을 환자에 투여함으로써 Treg 세포들의 면역억제 활성의 감소를 포함하는데 Treg 세포들의 활성의 감소 및/또는 저해는 환자의 질병에 대한 치료 효과를 유도한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 환자의 면역억제 기능을 손상시키는 방법에 관한 것이다. 방법은 동종 Th1 세포들을 포함하는 치료 조성물을 환자에 투여함으로써 Treg 세포들의 면역억제 활성의 감소를 포함하는데 Treg 세포들의 활성의 감소 및/또는 저해는 환자의 면역억제 기능을 감소시킨다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 활성화된 Th1 세포들 및 질병 항원의 소스(source)의 투여하는 단계를 포함하는, 면역 내성을 억제하고 질병을 갖는 환자의 치료 효과를 촉진하는 방법에 관한 것으로서 Th1 세포들 및 질병 항원들이 동일한 위치에 투여된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 질병 항원의 소스 및 면역보강제(adjuvant)를 포함하는 조성물에 관한 것으로서 질병 항원들은 샤페론 단백질 내에 포함되며 면역보강제는 활성화된 동종 Th1 세포들을 포함한다.
본 발명의 치료 조성물 또는 치료 방법은 환자의 다양한 질병을 치료하도록 사용될 수 있다. 질병은 암성(cancerous), 또는 비암성일 수 있다. 암성 질병은 혈액 종양과 같이 종양을 생산하지 않는 암들뿐만 아니라 종양들을 발생하는 암들을 포함할 수 있다. 비암성 질병들은 예를 들면, 병원체에 기인하는 질병 또는 병원균을 포함할 수 있다. 종양들은 유방, 폐, 간, 위, 피부, 췌장 등을 포함하는 환자 내의 다양한 위치에 존재할 수 있다. 환자들은 인간 또는 비인간일 수 있다.
도 1a는 미접촉(naive) T 세포들이 서로 다른 종양 세포 라인들에 침전되고 활성화된 emTh-1 세포들로 치료될 때 FoxP3 발현 상의 효과를 도시한 점도표이다.
도 1b는 미접촉 T 세포들이 서로 다른 종양 세포 라인들에 침전되고 활성화된 emTh-1 세포들로 치료될 때 FoxP3 발현 상의 효과를 도시한 막대 그래프이다.
도 2a는 emTh-1 상청액(supernatant)의 존재 하에서 또는 emTh-1 상청액 없이, 미접촉 T 세포들이 형질전환성인자-베타1(TGF-β1)이 있거나 또는 없는 T 세포 익스팬더 비드(expander bead)와 함께 배양될 때 FoxP3 발현 상의 효과를 도시한 점도표이다.
도 2b는 emTh-1 상청액의 존재 하에서 또는 emTh-1 상청액 없이, 미접촉 T 세포들이 형질전환성인자-베타 1이 있거나 또는 없는 T 세포 익스팬더 비드와 함께 배양될 때 FoxP3 발현 상의 효과를 도시한 히스토그램이다.
도 2c는 전체 CD4+ 림프구에서 CD4+CD25-FoxP3- 활성화 T 세포들의 퍼센트를 도시한 막대 그래프이다.
도 2d는 도 2a에 설명된 것과 같이 배양된 세포들에서 전사 인자 FoxP3, Tbet, 및 GATA-3의 발현을 도시한 점도표이다.
도 2e는 emTh-1 상청액의 표시된 농도와 함께 도 2a에 설명된 것과 같이 배양된 세포들에서 전사 인자 FoxP3, Tbet, 및 GATA-3의 발현을 도시한 막대 그래프이다.
도 2f는 emTh-1 상청액의 존재하에서 발생되는 잔류 FoxP3-발현 세포들의 면역억제 활성의 막대 그래프이다.
도 2g는 전환된 iTreg 세포들의 면역억제 활성을 저해하는 emTh-1 상청액을 도시한 막대 그래프이다.
도 3a는 마우스 인터페론-감마에 대한 차단 항체들이 있거나 또는 없는 emTh-1 상청액 존재하에서 또는 emTh-1 상청액 없이 형질전환성인자-베타1이 있거나 또는 없는 T 세포 익스팬더 비드를 갖는 미접촉 T 세포들을 도시한 막대 그래프이다.
도 3b는 마우스 종양괴사인자-알파에 대한 차단 항체들이 있거나 또는 없는 emTh-1 상청액이 존재 하에서 또는 emTh-1 상청액 없이 형질전환성인자-베타 1이 있거나 또는 없는 T 세포 익스팬더 비드를 갖는 미접촉 T 세포들을 도시한 막대 그래프이다.
도 3c는 인터페론-감마R-/- 마우스 비장으로부터 분리되고 도 3a에서 설명된 것과 같이 배양된 미접촉 T 림프구에서의 FoxP3 발현의 점도표이다.
도 3d는 인터페론-감마R-/- 마우스 비장으로부터 분리되고 도 3a에서 설명된 것과 같이 배양된 PoxP3 발현 세포들의 퍼센트를 도시한 막대 그래프이다.
도 4a는 emTh-1에 의해 저해된 nTreg (CD4+CD25+Treg) 면역억제 기능을 도시한 점도표이다.
도 4b는 emTh-1에 의해 저해된 nTreg (CD4+CD25+Treg) 면역억제 기능을 도시한 막대 그래프이다.
도 4c는 emTh-1에 의해 저해된 nTreg (CD4+CD25+Treg) 면역억제 기능을 도시한 막대 그래프이다.
도 4d는 도 4a를 위하여 설명된 세포 내 인터페론-감마 농도를 도시한 막대 그래프이다.
도 4e는 인간 emTh-1 상청액이 인간 Treg 억제 기능을 감소시키고 Treg 매개저해에 대한 작동 T 세포 저항을 촉진하는 것을 나타내는 점도표이다.
도 4f는 인간 emTh-1 상청액이 인간 Treg 억제 기능을 감소시키고 Treg 매개저해에 대한 작동 T 세포 저항을 촉진하는 것을 나타내는 점도표이다.
도 5a는 12B1 세포들로 주입되고 샤페론 풍부 세포 용해물, emTh-1 또는 두 샤페론 풍부 세포 용해물 및 emTh-1의 조합이 투여된 미접촉 Balb/c 마우스 상의 백신 효과를 도시한 그래프이다.
도 5b는 12B1 세포들로 주입되고 샤페론 풍부 세포 용해물, emTh-1 또는 두 샤페론 풍부 세포 용해물 및 emTh-1의 조합이 투여된 미접촉 Balb/c 마우스 상의 백신 효과를 도시한 그래프이다.
도 5c는 12B1 세포들로 주입되고 두 샤페론 풍부 세포 용해물 및 emTh-1의 조합 또는 샤페론 풍부 세포 용해물, emTh-1 및 항-아시알로 GM1 항체들이 투여된 미접촉 Balb/c 마우스 상의 백신 효과를 도시한 그래프이다.
도 5d는 B16 세포들로 주입되고 emTh-1 및 B16 샤페론 풍부 세포 용해물의 조합이 투여된 C57BL/6 마우스 상의 백신 효과를 도시한 그래프이다.
도 6a-6d는 마우스 내의 종양 면적을 도시하고 emTh-1 및 B16 샤페론 풍부 세포 용해물에 의해 유도되는 종양 특이 면역을 표시한 점도표이다.
도 7a는 항종양 T 림프구상의 emTh-1 및 B16 샤페론 풍부 세포 용해물 면역치료의 효과를 도시한 막대 그래프이다.
도 7b는 emTh-1 세포들이 생체 내 Treg보다 CD4+CD25+FoxP3- 작동 T 세포들을 향하여 미접촉 T 림프구의 분화를 스큐잉하는 것을 도시한 점도표이다.
도 7c는 emTh-1 세포들이 생체 내 Treg 억제 기능을 악화시키는 것을 도시한 바 그래프이다.
도 1b는 미접촉 T 세포들이 서로 다른 종양 세포 라인들에 침전되고 활성화된 emTh-1 세포들로 치료될 때 FoxP3 발현 상의 효과를 도시한 막대 그래프이다.
도 2a는 emTh-1 상청액(supernatant)의 존재 하에서 또는 emTh-1 상청액 없이, 미접촉 T 세포들이 형질전환성인자-베타1(TGF-β1)이 있거나 또는 없는 T 세포 익스팬더 비드(expander bead)와 함께 배양될 때 FoxP3 발현 상의 효과를 도시한 점도표이다.
도 2b는 emTh-1 상청액의 존재 하에서 또는 emTh-1 상청액 없이, 미접촉 T 세포들이 형질전환성인자-베타 1이 있거나 또는 없는 T 세포 익스팬더 비드와 함께 배양될 때 FoxP3 발현 상의 효과를 도시한 히스토그램이다.
도 2c는 전체 CD4+ 림프구에서 CD4+CD25-FoxP3- 활성화 T 세포들의 퍼센트를 도시한 막대 그래프이다.
도 2d는 도 2a에 설명된 것과 같이 배양된 세포들에서 전사 인자 FoxP3, Tbet, 및 GATA-3의 발현을 도시한 점도표이다.
도 2e는 emTh-1 상청액의 표시된 농도와 함께 도 2a에 설명된 것과 같이 배양된 세포들에서 전사 인자 FoxP3, Tbet, 및 GATA-3의 발현을 도시한 막대 그래프이다.
도 2f는 emTh-1 상청액의 존재하에서 발생되는 잔류 FoxP3-발현 세포들의 면역억제 활성의 막대 그래프이다.
도 2g는 전환된 iTreg 세포들의 면역억제 활성을 저해하는 emTh-1 상청액을 도시한 막대 그래프이다.
도 3a는 마우스 인터페론-감마에 대한 차단 항체들이 있거나 또는 없는 emTh-1 상청액 존재하에서 또는 emTh-1 상청액 없이 형질전환성인자-베타1이 있거나 또는 없는 T 세포 익스팬더 비드를 갖는 미접촉 T 세포들을 도시한 막대 그래프이다.
도 3b는 마우스 종양괴사인자-알파에 대한 차단 항체들이 있거나 또는 없는 emTh-1 상청액이 존재 하에서 또는 emTh-1 상청액 없이 형질전환성인자-베타 1이 있거나 또는 없는 T 세포 익스팬더 비드를 갖는 미접촉 T 세포들을 도시한 막대 그래프이다.
도 3c는 인터페론-감마R-/- 마우스 비장으로부터 분리되고 도 3a에서 설명된 것과 같이 배양된 미접촉 T 림프구에서의 FoxP3 발현의 점도표이다.
도 3d는 인터페론-감마R-/- 마우스 비장으로부터 분리되고 도 3a에서 설명된 것과 같이 배양된 PoxP3 발현 세포들의 퍼센트를 도시한 막대 그래프이다.
도 4a는 emTh-1에 의해 저해된 nTreg (CD4+CD25+Treg) 면역억제 기능을 도시한 점도표이다.
도 4b는 emTh-1에 의해 저해된 nTreg (CD4+CD25+Treg) 면역억제 기능을 도시한 막대 그래프이다.
도 4c는 emTh-1에 의해 저해된 nTreg (CD4+CD25+Treg) 면역억제 기능을 도시한 막대 그래프이다.
도 4d는 도 4a를 위하여 설명된 세포 내 인터페론-감마 농도를 도시한 막대 그래프이다.
도 4e는 인간 emTh-1 상청액이 인간 Treg 억제 기능을 감소시키고 Treg 매개저해에 대한 작동 T 세포 저항을 촉진하는 것을 나타내는 점도표이다.
도 4f는 인간 emTh-1 상청액이 인간 Treg 억제 기능을 감소시키고 Treg 매개저해에 대한 작동 T 세포 저항을 촉진하는 것을 나타내는 점도표이다.
도 5a는 12B1 세포들로 주입되고 샤페론 풍부 세포 용해물, emTh-1 또는 두 샤페론 풍부 세포 용해물 및 emTh-1의 조합이 투여된 미접촉 Balb/c 마우스 상의 백신 효과를 도시한 그래프이다.
도 5b는 12B1 세포들로 주입되고 샤페론 풍부 세포 용해물, emTh-1 또는 두 샤페론 풍부 세포 용해물 및 emTh-1의 조합이 투여된 미접촉 Balb/c 마우스 상의 백신 효과를 도시한 그래프이다.
도 5c는 12B1 세포들로 주입되고 두 샤페론 풍부 세포 용해물 및 emTh-1의 조합 또는 샤페론 풍부 세포 용해물, emTh-1 및 항-아시알로 GM1 항체들이 투여된 미접촉 Balb/c 마우스 상의 백신 효과를 도시한 그래프이다.
도 5d는 B16 세포들로 주입되고 emTh-1 및 B16 샤페론 풍부 세포 용해물의 조합이 투여된 C57BL/6 마우스 상의 백신 효과를 도시한 그래프이다.
도 6a-6d는 마우스 내의 종양 면적을 도시하고 emTh-1 및 B16 샤페론 풍부 세포 용해물에 의해 유도되는 종양 특이 면역을 표시한 점도표이다.
도 7a는 항종양 T 림프구상의 emTh-1 및 B16 샤페론 풍부 세포 용해물 면역치료의 효과를 도시한 막대 그래프이다.
도 7b는 emTh-1 세포들이 생체 내 Treg보다 CD4+CD25+FoxP3- 작동 T 세포들을 향하여 미접촉 T 림프구의 분화를 스큐잉하는 것을 도시한 점도표이다.
도 7c는 emTh-1 세포들이 생체 내 Treg 억제 기능을 악화시키는 것을 도시한 바 그래프이다.
본 발명은 환자에 있어서 질병 항원의 면역 내성을 억제하거나 및/또는 암 면역억제 메커니즘을 무력화하기 위한 방법을 포함한다. 방법은 또한 질병 항원에 대항하는 면역, 특히, Th1 면역을 자극하는 단계를 포함한다. 면역 내성의 억제 및 항-질병 항원 면역의 자극 모두 질병 항원의 소스 및 동종 Th1 세포들, 바람직하게는 면역보강제와 같은 동종의, 활성화된 Th1 세포들을 포함하는 치료 조성물의 투여에 의해 발생될 수 있다. 일반적으로, 동종 Th1 세포들은 활성화된, 작동(effector)/기억(memory) Th1 세포들(emTh-1, 이하 emTh-1로 표기)이다. 치료 조성물은 또한 질병 관련 항원들 및/또는 질병 관련 항원들을 포함하는 용해물, 바람직하게는 샤페론 풍부 세포 용해물과 같은, 질병 조직으로부터 분리된 샤페론 단백질의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 면역 내성이 억제를 위한 방법은 Treg 세포들의 억제 활성을 손상시키는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 여기서는 iTreg로서 언급된, 미접촉 T 세포들(CD4+CD25-FoxP3-)의 Treg 세포들(Cd4+CD25+FoxP3+)로의 전환을 저해할 수 있다. nTreg) 세포들 및 iTreg 세포들 모두의 면역억제 활성은 감소되거나 제거될 수 있다. 본 발명의 방법들은 바람직하게는 Treg 세포의 면역억제 활성을 저해하고 동시에 환자 내의 종래의 작동 T 림프구들의 기능을 촉진한다. Treg 상의 치료 조성물의 저해 활성은 인터페론-감마에 의존하는데, 이는 바람직한 조성물에서 em-Th1 세포들에 의해 생산되며 차례로 숙주 내재 및 적응 면역 세포들로부터 인터페론-감마의 생산을 증가시킨다.
여기에 언급된 것과 같은 "면역 내성의 억제"는 환자의 면역 시스템에 의한 종양 회피의 모든 자연적 내성 및/또는 억제를 포함하는 질병 항원들의 존재를 견디기 위하여 환자의 면역 시스템의 능력을 억제하는 것에 관한 것이다.
여기에 설명된 방법들은 환자의 다양한 질병을 치료하도록 사용될 수 있다. 질병은 암성(cancerous), 또는 비-암성일 수 있다. 암성 질병은 혈액 종양과 같이 종양을 생산하지 않는 암들뿐만 아니라 종양들을 발생하는 암들을 포함할 수 있다. 비암성 질병들은 예를 들면, 병원체에 기인하는 질병 또는 병원균을 포함할 수 있다. 종양들은 유방, 폐, 간, 위, 피부, 췌장 등을 포함하는 환자 내의 다양한 위치에 존재할 수 있다. 환자들은 인간 또는 비인간일 수 있다.
본 발명의 방법들은 치료 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함할 수 있는데 조성물의 투여는 질병의 내성 및/또는 환자의 면역 시스템에 의한 질병 항원들을 억제할 수 있다. 환자로의 치료 조성물의 투여는 환자 내의 종양 회피 메커니즘을 손상시킬 수 있으며 더 나은 종양 박멸에 이르게 한다. 바람직하게는, 치료 조성물의 투여는 CD4+CD25+FoxP3+인, Treg 세포들의 활성을 억제할 수 있다. 여기에 언급된 것과 같이 "Treg" 세포들은 CD4+CD25+FoxP3+인 Treg 세포들에 관한 것이며 nTreg 및 iTreg 모두를 포함한다. 여기에 언급된 것과 같이 미접촉 T 세포들은 CD4+CD25-FoxP3-인 T 세포들이다.
본 발명의 방법들은 다양한 방법으로 Treg 세포들의 활성을 억제하는 단계를 포함한다. Treg 세포들의 활성의 억제는 예를 들면, 미접촉 T 세포들의 iTreg 세포들로의 전환의 저해에 의한 것일 수 있다. 방법은 예를 들면, FoxP3의 활성을 조절함으로써, 미접촉 세포들의 Treg 세포들로의 전환을 방해하는, 여기에 설명된 치료 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. FoxP3+는 면역 억제 활성을 야기할 수 있는 세포들을 위한 마커인 전사 인자이다. 세포 내 FoxP3의 또는 전환(reversal)은 세포가 억제 기능을 실행하지 않는다는 표시이다.
본 발명의 방법은 또한 면역 내성의 억제를 향상시키기 위하여 환자의 nTreg 세포들을 음성으로(negatively) 조절할 수 있다. 환자는 자극에 반응하는 미접촉 T 세포들로부터 유래하는 iTreg 세포들에 더하여 nTreg 세포들을 가질 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 치료 조성물은 또한 환자 내의 nTreg 및/또는 iTreg 세포들의 활성을 억제할 수 있다.
방법들은 또한 Treg 세포들의 활성 및/또는 CD40L의 함유(inclusion)를 억제하기 위하여 인터페론-감마를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 인터페론-감마 및/또는 CD40L은 치료 조성물의 일부일 수 있다. 치료 조성물에서의 인터페론-감마 및/또는 CD40L의 사용은 작동 T 림프구의 활성을 저해하지 않고 Treg의 면역억제 활성을 차단할 수 있다. 바람직하게는, 인터페론-감마는 활성화된 Th1 세포들로부터 자연적으로 생산되는데 이에 의해 이러한 세포들은 또한 증가된 숙주(host) 인터페론-감마 생산에 이르게 하는 숙주 면역 세포들 내의 IL-12(interleukin-12)의 발현을 상향 조절할(upregulation) 수 있는 표면상에 CD40L을 발현한다.
본 발명의 방법들은 또한 미접촉 T 세포들의 CD4+CD25+Tbet+GATA3- 표현형(Tbet+ 세포들)으로의 분화를 스큐잉하는(skewing) 단계를 포함할 수 있다. 치료 조성물이 투여는 환자 내의 Th1 면역 환경을 나타내는 미접촉 T 세포들의 Tbet+ 세포들로의 전환을 스큐잉할 수 있다. Tbet+의 존재는 Th1 환경의 촉진 및 Treg 세포들의 생산으로부터 벗어난 촉진에 기인하는 면역 내성 활성의 억제에 이르게 할 수 있다.
본 발명은 위의 방법들에서 설명된 것과 같이 Treg 세포들의 활성을 억제하는 치료 조성물의 투여를 포함한다. 치료 조성물은 생(living) 면역 세포들을 포함할 수 있는데, 이들 중 적어도 일부는 T 세포들이다. T 세포들은 바람직하게는 Th1 표현형(인터페론-감마를 생산하고 IL-4를 생산하지 않는 CD4+ T 세포들)의 작동/기억 T 세포들(CD45RO+, CD62LLo)이다. 작동/기억 Th1 세포들은 제조 및 도입 시간에 환자에 활성화되고 여기서는 emTh-1 세포들로 언급된다. 바람직한 활성화 방법은 T 세포 상에 CD3 및 CD28 표면 분자들의 교차결합(cross-linking)에 의한 것이다. 다른 활성화 방법들이 또한 본 발명의 범위 내에 존재한다. emTh-1 세포들은 바람직하게는 활성화된 상태에서 CD40L을 발현하며 많은 양의 염증성 사이토카인(인터페론-감마, GM-CSF, 및 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)와 같은)을 생산한다. 이러한 emTh-1 세포들은 바람직하게는 환자에 동종이다. emTh-1의 활성은 예를 들면, Har-noy의 미국특허 제7,435,592에 설명된 것과 같이 실행될 수 있으며 Har-noy의 미국특허 제7,402,431에 설명된 것과 같이 버퍼 내에 투여를 위하여 만들어질 수 있다. 이러한 특허 모두 여기에 참조로서 통합된다. 활성화된 emTh-1 세포들은 여기에 설명된 치료 조성물에 사용될 수 있다. 그러한 활성화된 emTh-1 세포들은 이스라엘의 Immunovative Therapies사의 ALLOSTIM 상표 하에서 이용가능하다. 그러한 세포들과 유사한 기능적 특성들을 나타내는 다른 활성화된 T 세포들도 또한 본 발명의 범위 내에 존재한다. 본 발명의 치료 조성물이 활성화된 emTh-1 세포들을 포함하는 맥락에서 설명될 것이나 다른 방법들이나 유사한 기능적 특성을 갖는 방법들을 사용하여 준비된 세포들을 포함하는 치료 조성물도 모두 본 발명이 범위 내에 존재한다. 또한 인터페론-감마 및 CD45L 분자들과 같이, emTh-1 세포들의 무생(non-living) 조성물들이 본 발명이 범위 내에 존재한다.
emTh-1 세포들에 더하여, 치료 조성물은 환자 내의 Th1 환경의 유지를 향상시키거나 및/또는 환자에 의한 질병 항원들의 면역 내성을 억제하는 다른 조성물들을 포함할 수 있다. 일부 실시 예들에서, 치료 조성물은 또한 질병과 관련된 항원들을 포함할 수 있다. 만일 하나 이상의 항원이 조성물 내에 포함되면, 항원들은 동일한 항원 소스 또는 서로 다른 항원 소스로부터 존재할 수 있다. 모든 항원이 제제에 사용될 수 있는데 예를 들면, 이러한 항원들은 생 세포 또는 생물체로부터 기원될 수 있으며, 소스 물질은 그것들로부터 전체 세포들 또는 생물체 또는 용해물로서 사용되는, 조사 불활성화된(irradiation inactivated), 동결/융해 용해물일 수 있다. 일부 바람직한 실시 예들에서, 종양 세포들 또는 종양 세포 용해물들은 항원들을 위한 소스 물질로서의 역할을 한다. 세포 소스 물질은 자가(autologous) 또는 동종 세포 소스 혹은 셀 라인으로부터 유래할 수 있다. 항원들은 또한 항원들을 위하여 인코딩되는, 순수(naked) DNA 또는 RNA로부터 유래한다. 핵 물질이 단독으로 사용될 수 있거나 또는 바이러스 벡터와 통합될 수 있다. 항원 소스의 또 다른 예는 항원들을 모방한 항-이디오형(anti-idiotypic) 항체 또는 그것들의 부들, 혹은 항원의 구조를 모방한 다른 방법들이다. 항원-펄스화(antigen-pulsed) 또는 감염된 수지상 세포들이 또한 조성물 내의 항원 소스일 수 있다. 수지상 세포는 펩티드 또는 전체 단백질, 재조합 단백질, 또는 항원(들)을 위하여 인코딩하는 mRNA 또는 DNA로 펄스화될 수 있거나, 또는 수지상 세포는 항원들을 포함하는 세포들과 융합될 수 있거나, 또는 수지상 세포는 항원들을 포함하는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스과 같은 바이러스 벡터에 감염될 수 있거나, 또는 이러한 항원 소스 조성물들은 수지상 세포 없이 단독으로 사용될 수 있다.
하나 또는 그 이상의 종양 관련 항원들이 또한 치료 조성물에 사용될 수 있는데, 종양 관련 항원들의 예는 다음을 포함한다: MART-1, gp100, 티로시나아제(tyrosinase), Melan A, TRP-1, CDL4, 베타-카테닌, MUM-1과 같은 종양-특이 돌연변이 유전자 산물, p53 및 ras(K- 및 H-ras)와 같은 종양유전자, MAGE, GAGE 및 NY-ESO1과 같은 암 테스트 항원, MUC1, 사이클린 B1, Her2-neu, CEA, WT, p53, SART1, PRAME, p15와 같은 과발현 자가 항원들, 및 HPV E7, EBV-유래 항원들과 같은 같은 바이러스 항원들 및 텔로머라제(telomerase).
바람직한 실시 예에서, 항원 성분은 사멸된 감염 조직 또는 종양들로부터 분리된 하나 또는 그 이상의 샤페론 단백질(또한 열 충격 단백질(heat shock protein)로서 알려진)을 포함할 수 있다. 열 충격 단백질은 박테리아, 균류(fungi) 및 기생성 병원체로의 면역 반응의 주요한 표적들 중 하나이다. 종양 유래 열 충격 단백질(hsp)-펩티드 복합체들(특히, hsp70 및 gp94/gp96)이 동물 및 인간 내의 항-종양 면역 반응을 생산하는, 효과적인 백신으로서의 역할을 하는 것으로 입증되어 왔다. 이러한 접근은 수많은 세포 과정에서 분자 샤페론으로서 그것들의 기능에 책임이 있는 스트레스 단백질의 펩티드 결합 특성을 이용한다.
세포외 환경에서의 특정 샤페론들은 또한 샤페론 폴리펩티드에 대한 능력 및 숙주 면역 시스템의 상호작용에 의한 미접촉 및 적응 면역을 조절할 수 있다. 종양으로부터 열 충격 단백질로의 백신주입은 항-종양 반응을 끌어낼 수 있으며, 면역 억제 메커니즘을 하향 조절한다. 열 충격 단백질들의 면역원성(immunogenicity)은 그것들과 관련되는 항원의 펩티드로부터 유래할 수 있다.
항원 소스로서의 사용을 위하여 샤페론 단백질의 분리를 위한 바람직한 방법은 Katsantis의 미국특허 제6,875,849에서 설명된다. 추가적인 방법들이 Srivastava에 의해 미국특허 제6,797,480; 6,187,312; 6,162,436; 6,139,841; 6,136,315; 및 5,837,251에서 설명된다. 열 충격 단백질은 또한 펩티드, 전체 세포 또는 세포 용해물을 포함하는, 항원들로 펄스화될 수 있다.
일 실시 예에서, 종양-유래 샤페론 풍부 세포 용해물이 항원 소스로서 사용되고 아래의 실시 예들에서 설명되는 것과 같이 자유 용액-등전위 초점화 기법을 사용하여 종양 용해물로부터 주요 샤페론 단백질의 농축에 의해 획득된다. 이러한 기법은 5배 내지 20배까지의 더 많은 항원 물질을 획득하기 위한 빠르고 효율적인 과정이며 종래의 기법과 비교하여 시간이 덜 든다. 다수의 샤페론 복합체 농축의 자유 용액-등전위 초점화 기법은 잠재적으로 한정된 종양 소스로부터 높은 생산과 관련된 임상 관점으로부터 바람직할 수 있으며 종양 채취부터 환자의 치료까지 빠른 반환 시간을 갖는다.
게다가, 전체 미생물 또는 생 약독의(attenuated) 전체 미생물과 같은 미생물 일부, 불성화된 미생물, 재조합 폴리펩티드 및 단백질, 당단백질, 당지질, 리포펩티드, 합성 펩티드를 포함하는, 종래에 백신에 사용되는 항원들이 또한 본 발명의 약학 조성물 내에 사용될 수 있거나, 또는 파열된 미생물, 단독으로 사용되거나 캐리어 단백질과 같은 캐리어 성분과 접합하여 사용되는 다당류들이 또한 사용될 수 있다.
일반적으로, 질병의 치료 및 예방을 위하여 사용될 수 있는 모든 항원 또는 항원의 조합들이 치료 조성물에 사용될 수 있다. 항원들로부터 유래할 수 있는 질병의 예들은 다음과 같다: 디프테리아(diphteria), 파상풍(tetanus), 소아마비(polio), 광견병(rabies), 백일해(whooping cough), A, B 및 C형 간염, 앱스타인-바 바이러스(EBV), 거대세포 바이러스(CMV), 헤르페스(herpes) 1 및 2, 황열병(yellow fever), 장티푸스(typhoid fever), 수두(chicken pox), 천연두(variola), 홍역(measles), 유행성 이하선염(mumps), 풍진(German measles), 일본 뇌염(Japanese encephalitis), 뇌막염(meningitis), 인플루엔자, 폐렴연쇄상구균성 전염병(pneumococcal infections), 로타바이러스 감염(rotavirus infections), 후천성 면역 결핍증(AIDS), 암, 인간 T 세포 림프종 바이러스(HTLV) 1 및 2, 매독(syphilis), 인체 유두종 바이러스(HPV), 결핵(tuberculosis), 라임 병(Lyme disease), 로우스 육종 바이러스 감염(RSV infections), 트리파노소마증(trypanosomiasis), 뎅기 열(Dengue fever), 말라리아(malaria), 탄저병(anthrax), 에볼라 바이러스(ebola virus), 야토병(tularemia), 예르시니아(Yersinia), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus), 클라미디아(Chlamia)에 의해 야기되는 박테리아성 질병, 임질균(Neisseria gonorrhoeae), 폐렴구균(streptococcus pneumoniae), 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 또는 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) B형, 말라리아(malaria), 레슈마니아증(leishmaniasis), 리스테리아증(listeriosis) 등.
바람직한 일 실시 예에서, 치료 조성물은 emTh-1 세포들 및 또한 샤페론 풍부 세포 용해물을 포함한다. emTh-1 세포들 및 샤페론 풍부 세포 용해물은 개별적으로 Th1 면역을 촉진하나 emTh-1 세포들의 추가는 Th1 면역의 발생을 증가시키고 또한 Treg 활성의 억제를 촉진하기 위하여 면역보강제를 제공한다. 게다가, 조합이 하나만의 성분보다 더 효과적인 것과 같이 이러한 두 개의 성분이 치료 조성물에 결합될 때 상승 반응이 나타날 수 있다.
치료 조성물은 또한 Treg 세포들의 면역 내성 활성의 감소 또는 저해를 방해할 수 있는 다른 성분 또는 인자들을 포함할 수 있다. 일 실시 예에서, 치료 조성물은 외인성 인터페론-감마를 포함할 수 있다. 인터페론-감마는 정제될 수 있거나 또는 재조합 인터페론-감마일 수 있다. 치료 조성물은 또한 형질전환성인자-베타 항체들을 포함할 수 있다. 형질전환성인자-베타는 일반적으로 Treg 세포 활성을 증가시킨다. 치료 조성물 내의 항-형질전환성인자-베타 항체의 포함은 Treg 세포들의 활성을 감소시킨다.
치료 조성물은 비경구(parenteral), 피내(intradermal), 근육내, 피하(subcutaneous) 또는 점막(mucosal) 경로를 포함하는 종래에 사용되는 모든 경로를 거쳐 투여될 수 있다. 특정 실시 예들에서, 조성물은 또한 절내(intranodal)로 또는 종양내로 투여될 수 있다. 동종 emTh-1 세포들은 바람직하게는 인체 백혈구 항원(HLA)-불일치 도너(donor)로부터 유래한다. 치료조성물의 바람직한 투여량은 피내 경로에 대하여 적어도 약 1×107 cells이며 더 바람직하게는 정맥 내 경로에 대하여 5×107 내지 1×109 cells 사이이다. 주로 원하는 면역 반응을 발생시킬 수 있는 이러한 범위를 벗어나는 투여량 또한 본 발명이 범위 내에 존재한다.
치료 조성물은 한번 또는 여러 번 그리고 각각의 투여에서 서로 다른 경로에 의해 투여될 수 있다. 만일 한번 이상 투여되면, 조성물이 두 번째 투여는 첫 번째 투여량의 투여 후에 적어도 3일째, 바람직하게는 적어도 7-14일째에 투여될 수 있다. 치료 조성물의 추가적인 투여량은 필요한 만큼 투여될 수 있다. 바람직한 일 실시 예에서, emTh-1 세포들은 우선 피내로 투여되고 그리고 나서 샤페론 풍부 세포 용해물이 동일한 위치에 피내로 투여된다. 이러한 피내 주입은 약 3-6회 반복되고 약 3-10일의 차이를 갖는다. 그리고 나서 이러한 백신 스케줄에 의해 발생되는 기억 세포들을 활성화하기 위하여, emTh-1 세포 단독의 정맥 내 주입이 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 동종 Th1 세포들을 포함하는 치료 조성물을 환자에 투여함으로써 Treg 세포들의 면역억제 활성의 감소를 포함하는 환자의 치료 면역 효과를 자극하기 위한 방법을 포함하는데 Treg 세포들의 활성의 감소 및/또는 저해는 환자의 질병에 대한 치료 효과를 유도한다. 본 발명은 또한 동종 Th1 세포들을 포함하는 치료 조성물을 환자에 투여함으로써 Treg 세포들의 면역억제 활성의 감소를 포함하는 환자의 면역억제 기능을 손상시키는 방법을 포함하는데 Treg 세포들의 활성의 감소 및/또는 저해는 환자의 면역억제 기능을 감소시킨다.
실시 예들
재료 및 방법
마우스 - 마우스들이 특정 무균 조건하에서 제공되고 애리조나 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 가이드라인에 따라 관리되었다. 국립 암 연구소로부터 암컷 BALB/c (H2d), C57Bl6 (H2b), 중증 복합형 면역결핍 SCID(H2d) 및 누드(H2d) 마우스들이 획득되었다. 인터페론-감마-수용체-/- (H2d) 마우스들을 Jackson Immunoresearch Laboratories사(새크라멘토, 캘리포니아)로부터 구매하였다. 내인성 프로모터의 조절 하에서 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP) 및 FoxP3를 공동 발현하는 FoxP3-EGFP (H2d) 마우스들을 Jackson Immunoresearch Laboratories사로부터 획득하였다. 녹색 형광 단백질 발현은 FoxP3+ Treg의 정확한 동정 및 분리를 허용한다. 유사유전자형(congenic) Thy1.1 마우스들(Chy.PL(B6)-Thy1a/ScrJ)이 Jackson Immunoresearch Laboratories사로부터 획득하였다. 이러한 동물들은 T 림프구-특이 Thy1.1 대립 유전자를 지닌다. Thy1.2 마우스들로부터의 도너 T 세포들은 항-Thy1.2 항체들을 사용하여 수혜(recipient) Thy1.1 마우스 T 세포들과 구분될 수 있다. 마우스들은 6-8주 연령에서 사용되었다.
동종의, 활성화된 emTh -1 세포들의 제작 - emTh-1 세포들이 Har-Noy 등의 Leukemia Research(2009) 33;525-538 및 Har-Noy 등의 Leukemia Research(2008) 32;1903-1913에서 설명된 것과 같이 체외에서(in vitro) 발생되고 활성화되었다. C57BL/6 마우스들로부터 비장 세포들이 수확되었고 적혈구 세포들의 용해를 위하여 암모늄-클로라이드 포타슘(ACK) 버퍼로 처리되었다. 각각의 단편의 순도를 평가하기 위하여 양성으로 그리고 음성으로 선택된 세포들이 유세포 분석기(flow cytometry)에 의해 규칙적으로 분석되었다. 이러한 CD4+ 림프구들은 3:1의 초기 비드:CD4+ 비율에서, 항-CD3 및 항CD28이 코팅된 상자성(paramagnetic) 비드(CD3/CD28 T 세포 익스팬더 비드, Dynal/Invitrogen)와 함께, 그리고 20IU/㎖ 재조합 마우스(rm) IL-2, 20ng/㎖ 재조합 마우스 IL-7, 10ng/㎖ 재조합 마우스 IL-12(Peprotech, 뉴저지) 및 10㎍/㎖ 항-마우스 IL-4 mAB(Becton Dikerson)의 존재 하에서, 10% 열-불활성(heat-inactivated) 소태아 혈청(Gemini Bio-products, 우드랜드, 캘리포니아)이 보강된 RPMI 배지(Gibco/BRL, 게이더스버그, 메릴랜드) 내에서 확장되었다. 일정한 세포 밀도(0.5-1×106 cells/㎖)를 유지하기 위하여 재조합 마우스 IL-2, 재조합 마우스 IL-7, 항-IL-4 mAB 및 12(CD3/CD28 비드를 포함하는 추가의 완전 배지가 3일부터 6일까지 매일 배양액에 더해졌다. 세포들이 확장함에 따라 1:1의 비드:세포 비율을 유지하기 위하여 더해진 비드의 양이 계산되었다. 배양 6일 후에, CD4+ 세포들의 확장은 0일째에 이식된 세포들이 초기 수의 대략 60 내지 100배로 확장되었다. 6일째에 세포들이 수확되었고 물리적 분열 및 자석의 통과에 의해 비드를 제거하였다. 이러한 세포들은 새로 사용되거나 또는 다음의 사용을 위하여 액체 질소에 저장된다. C57BL/6 마우스들로부터 emTh-1 세포들을 발생시키기 위하여 유사한 프로토콜을 따랐다.
인간 emTh-1 세포들은 림프구 분리 배지(1,077; Eurobio)로 밀도 원심분리에 의해 분리된 건강한 도너 말초 혈액 림프구로부터 발생되었다. 그리고 나서 CD4 T 세포들이 인간 CD4 마이크로비드(Miltenyi Biotech)를 사용하여 분리되었고 20IU/㎖ 재조합 인간 IL-2(rhIL-2), 20ng/㎖ 재조합 인간 IL-7, 10ng/㎖ 재조합 인간 IL-12(Peprotech), 및 10g/㎖ 항-인간 IL-4 mAB(BD Bio-sciences)의 존재 하에서, 인간 T 세포 익스팬더 비드(Dynabeads, Invitrogen)과 함께 배양되었다. 인간 CD4+ T 세포 배양은 마우스 세포들을 위하여 이전 단락에서 설명된 것과 같이 유지되었다. 인간 연구는 헬싱키 선언에 입각한 동의하에, 임상시험심사위원회(Institutional Review Board, IRB00005448; FWA00004218)에 의해 승인되었다.
자기 세포 분리(magnetic cell sorting) - BALB/c 또는 C57BL6 마우스들로부터 분리된 비장들이 수확되었고 절개하였다. CD4+CD62L+, CD4+CD25+ 및 CD4+CD25- T 림프구들이 제조사의 설명에 따라 마우스 CD4+CD62L+ 미접촉 T 세포 또는 Treg 세포 분리 키트 및 autoMACSTM 분리기(Miltenyi Biotec, 오번, 캘리포니아)를 사용하여 자기 세포 분리에 의해 정제되었다. 이러한 기법에 의해 분리된 CD4+CD25+ 림프구들은 높은 레벨의 전사 인자 FoxP3를 발현하고 면역억제 특성들이 부여된다.
CD4+ CD62L + T 세포들의 CD4+CD25+ FoxP3 + Treg 세포들로의 전환 - 위에서 설명된 것과 같이 CD4+CD25-CD62L+ 미접촉 T 세포들이 Balb/c 마우스 비장세포들로부터 분리되었으며, 96-웰 플레이트(웰 당 100 세포) 내의 완전 배지에서 배양되었으며 37℃에서 72시간 동안 형질전환성인자-베타(5ng/㎖)의 존재 하에서 항-CD3/항-CD28 T 세포 익스팬더 비드(Dynabeads, Invitrogen)와 함께 활성화되었다. 일부 웰은 동종의 활성화된 CD4+ emTh-1 세포들의 상청액과 함께 처리되었다. 유세포 분석기 분석에 의해 CD4+CD25+FoxP3+ 및 CD4+CD25+FoxP3- 세포들의 퍼센트 비율이 결정되었다.
유세포 분석기 분석 및 항체 - 세포들(∼106)이 인산완충식염수(PBS, phosphate buffered saline, 이하 PBS로 표기) 함유 3% 열-불활성 소태아 혈청 및 0.09% 아지드화 나트륨(sodium azide, Sigma Chemical)에 세척되었고 Fc 수용체-차단 Ab (BD Biosciences Pharmingen, 샌 디에고, 캘리포니아)로 5분 동안 우선 배양되었으며, 그리고 나서 40분 동안 형광색소(Fluorochrome)-결합 항체의 적절한 조합의 포화 양으로 배양되었다. 그리고 나서 세포들을 세척하였고 형광 활성화 세포 선별장치(FACS calubur, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, 산 호세, 캘리포니아)를 사용하여 분석하였다. 각각의 샘플을 위하여 최소 10,000 이벤트가 수집되었고, 셀퀘스트 프로(CellQuest Pro) 소프트웨어(Becton Dickinson Immunocytometry Systems)로 데이터 분석이 실행되었다. FoxP3 검출을 위하여, 제공자의 설명(Clone FJK-16, eBiosciences, 샌 디에고, 캘리포니아)에 따라 알로피코시아닌(Allophycocyanin, APC) 항-마우스 FoxP3 염색 세트를 사용하여 자기 세포 선별 또는 체내에 발생된 전환된 CD4+CD25+ Treg에 의해 정제된 CD4+CD25+ 또는 CD4+CD25- T 세포들이 고정되고, 침투되었으며 염색되었다. CD4+CD25+ Treg의 모니터링을 위하여, 세포들은 우선 플루오레세인 이소티오시안산염(fluorescein isothiocyanate, FITC)-결합 항-CD4(쥐 IgG2b; BD Biosciences Pharmingen) 및 피코에리스린(phycoerithrine, PE)-결합 항-CD25(쥐 IgG1; BD Biosciences Pharmingen)로 염색되었다. 그리고 나서, 위에서 설명된 것과 같이 eBioscience사 FoxP3 염색 세트를 사용하여 세포들이 염색되었다. 전사 인자 Tbet 및 GATA-3의 발현(각각 Th-1 및 Th-2 세포들로 발현된)은 항-마우스 Tbet-피코에리스린 및 항-마우스 Gata-피코에리스린 단일클론 항체들(BD Biosciences Pharmingen)을 사용하여 세포내 염색에 의해 평가되었다. BD Biosciences Pharmingen사(PE_결합 쥐 IgG1, FITC-결합 쥐 IgG2a) 또는 eBioscience사(ARC-결합 쥐 IgG1)로부터 아이소타입(isotype) 제어 항체들을 구매하였다.
T 세포 증식 및 억제 분석법 - CD4+CD25+ 및 CD4+CD25- T 세포들이 MilTenyi 분리 키트를 사용하여 비장세포들 및 림프절로부터 정제되었다. 세포들은 완전 배지에서 또는 인간 emTh-1 상청액과 함께 37℃에서 96-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양되었고, 플레이트-경계 항-CD3(5ng/㎖), 가용성 항-CD28(5ng/㎖), 및 IL-2(20 IU/㎖)와 함께 활성화되었다. 다른 실험에서, 미처리된, 활성 emTh-1 세포 상청액 및 전처리되거나 또는 새로 분리된 CD4+CD25- T 세포들(1×105)이 처리되거나 또는 미처리된 CD4+CD25+ T 세포들(1×105)과 함께 96-웰 플레이트에서 48시간 동안 공생 배양되었다. 항-CD3/CD28 T 세포 익스팬더 비드들(Dynabeads)이 모든 공생 배양에 추가되었다(세퍼/비드=1/1), 그리고 나서 추가로 12시간 동안 브로모데옥시우리딘(BrdU, Millipore Corporation of Massachusetts)이 더해졌다. 그리고 나서 세포들이 고정되었고 제조사의 설명(Millipore Corporation of Massachusetts)에 따라 효소 결합 면역흡착 검사(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)를 사용하여 브로모데옥시우리딘 혼합이 검출되었다. 배양은 6회 반복 실시되었다.
유사한 실험들이 1.077 림프구 분리 배지와 함께 밀도 원심분리에 의해 분리된 인간 말초 혈액 림프구를 사용하여 실행되었다. 인간 Treg 세포 분리 키트(Miltenyi Biotec)를 사용하여 전체 말초 혈액 단핵 세포들로부터 CD4+CD25+ 및 CD4+CD25- T 세포들을 정제하였다. 세포들은 완전 배지에서 또는 인간 emTh-1 상청액과 함께 37℃에서 96-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양되었고, 플레이트-경계 항-CD3(5ng/㎖), 가용성 항-CD28(5ng/㎖), 및 IL-2(20 IU/㎖)와 함께 활성화되었다. 그리고 나서 CD4+CD25- 반응 T 세포들은 제조사의 설명(Invitrogen)에 따라 CellTrace Violet 세포 증식 키트를 사용하여 염색되었다. 라벨링된 세포들은 인간 항-CD3/CD28 T 세포 익스팬더 비드(세포:비드 비율 1:1)를 갖는 CD4+CD25+ T 세포들(1×105)과 함께 공생 배양되었고 제조사에 의해 표시된 것과 같이, 72시간 후에 유세포 분석기에 의해 세포 분열이 분석되었다.
효소결합면역흡착검사에 의한 사이토카인 생산의 검출 - 제조사의 절차(eBioscience)에 따라 효소 결합 면역흡착 검사를 사용하여 세포 배양 상청액 내의 인터페론-감마 및 종양 괴사 인자-알파의 농도가 결정되었다.
12B1 백혈병 세포들 및 종양 발생 - BALB/c 골수 세포들의 인간 bcr-abl(b3a2) 융합 유전자로의 레트로바이러스의 형질전환에 의해 쥐류(murine) 백혈병 세포 라인 12B1이 획득된다. 이러한 세포들은 p210 bcr-abl 단백질을 발현한다. 이는 꼬리 정맥 주사 후 100 세포가 존재하는 100% 치사량(LD100)의, 공격성 백혈병이다. 세포들은 10% 열-불활성(heat-inactivated) 소태아 혈청(Gemini Bio-products, 우드랜드, 캘리포니아)이 보강된 RPMI 배지(Gibco/BRL, 게이더스버그, 메릴랜드) 내에 배양된다(37℃, 5% CO2). 12B1 세포들은 Wei Chen 박사(Cleveland Clinic, 클리블랜드, 오하이오)로부터 획득되었고, 규칙적으로 검사하여 마이코플라스마(Mycoplasma) 오염이 없는 것으로 확인되었다.
종양 발생을 위하여, 12B1 세포들은 우선 PBS (Gibco/BRL) 내에서 3회 세척되었고, 그리고 나서 계산하여 5×104 cells/㎖의 농도로 조절하였다. 암컷 BALB/c 마우스들에 0.1㎖ (5×103 cells) 오른쪽 서혜부(right groin) 내에 피하로 주사되었고 종양 발생을 위하여 모니터링되었다.
샤페론 풍부 세포 용해물 제작 - 12B1 종양 유래 샤페론 풍부 세포 용해물들이 제조된다. 간단히 설명하면, 종양 조직들이 균질화되었고 획득된 고속 상청액들은 15W의 일정한 전압에서 로토포(Rotofor) 장치(Bio-Rad) 내에서 FS-IEF를 받았다. 샤페론 단백질 함량을 위하여 단편들이 수확되고 분석되었다. 흥미로운 단편들을 모으고 투석, 세정제 제거, 및 원심 농축에 의해 백신으로서 제작되었다. 제조사의 설명에 따라 리뮐루스 변형세포 용해물(LAL) 분석 키트(Cambrex Bio Science, 워커스빌, 메릴랜드)를 사용하여 샤페론 풍부 세포 용해물 내에 포함된 내독소 레벨이 결정되었다. 샤페론 풍부 세포 용해물 내 내독소의 레벨은 대조군 배양액 내보다 낮았다(＜0.01 EU/㎍). 12B1 샤페론 풍부 세포 용해물은 생체 내 백신 접종을 위하여 사용되었다.
생체 내 종양 성장 및 병용 면역치료 - 0일째에 오른쪽 서혜부 내에 BALB/c 마우스들에 5×103 생 12B1 세포들이 주사되었다. 3일, 7일, 14일째에 동종의(C57BL6) 활성화된 CD4+ 세포들(103 cells/마우스) 또는 12B1 유래 CRCL 백신(25㎍/마우스) 또는 세포들+샤페론 풍부 세포 용해물들이 투여되었다. 100㎕의 전체 용량으로 오른쪽 족척(footpad) 내에 처리되었다. 매 이틀마다 종양 성장이 모니터링되었고 종양 면적이 4000 ㎜3에 도달할 때 마우스들을 안락사하였다. 서로 다른 처리 그룹 사이에서 무종양(tumor-free) 생존을 비교하였다.
생체 내 면역 세포들의 고갈 - -1일, +3일 및 +5일째에 항-아시알로 GM1 항체들(25㎕/마우스, PBS로 1/8 희석; Wako Chemicals사, 오사카, 일본)의 복강내(intraperitoneal) 주사에 의해 자연 살해 세포들이 고갈되었다.
통계 - 카플란-마이어 곡선이 발생되고 생존 비율 및 처리 그룹들 사이의 차이를 결정하기 위하여 로그-순위 통계법에 의해 분석되었다. 다른 실험들에서, 그룹들 사이의 유의차(significant difference, p＜XXXX)를 결정하기 위하여 스튜던트의 t 검정이 사용되었다.
자기 활성 세포 분리법을 사용하여 마우스 비장들로부터 CD4+CD25-CD62L+ 미접촉 T 세포들을 분리하였다. 세포들은 T-세포 익스팬더 비드들(세포:비드 비율 1:1)을 사용하여 활성화되었고, 서로 다른 종양 세포 라인(12B1, B16, 4T1)으로부터 배양 배지 내에 재침전되었으며 emTh-1 세포들의 상청액으로 처리되었다. 도 1a에서, 처리된 세포들은 72시간 동안 37℃에서 96-웰 플레이트 내에 배양되었고 유세포 분석기 분석을 사용하여 FoxP3 발현이 결정되었다. 도 1b는 세 가지 독립된 실험으로부터의 집단 데이터를 도시한다. 도시된 데이터 다이어그램을 분석하기 위하여 스튜던트의 t 검정이 사용되었다.
도 1a 및 1b에 도시된 것과 같이, Th-1 세포 상청액은 종양 세포들 또는 체외 형질전환성인자-베타에 의해 유도되는 미접촉 CD4+CD25-FoxP3- T 세포들로부터 CD4+CD25+FoxP3+ Treg의 분화를 손상시켰다. Treg 확장은 CD4+CD25-FoxP3- 세포들의 CD4+CD25+FoxP3+로의 전환으로부터 또는 자연적으로 발생하는 Treg의 증식으로부터 야기할 수 있다. Treg 억제 기능의 유도를 위하여 전사 인자 FoxP3를 필요로 하고 비조절 세포들에서의 발현은 그리고 나서 면역억제 세포들로 전환한다. emTh-1 세포들에 의해 생산되는 가용성 인자들의 역할이 조사되었다. 특히, 형질전환성인자-베타가 체내에서 서로 다른 형질전환성인자-베타 분비 종양들에 의해 유도되는 미접촉 T 세포들로부터 Treg의 생산을 음성적으로 조절할 수 있는지를 알아보기 위하여 연구가 수행되었다. 12B1, B16 흑색종 및 4T1 세포들은 배양 내에서 형질전환성인자-베타를 분비할 수 있는 것으로 알려졌다. 이러한 3가지 종양 라인 중 하나를 갖는 미접촉 CD4+CD62L+ T 세포들의 배양은 FoxP3+ T 세포들 내로의 그것들의 분화를 트리거링하였다(도 1a). 그러나 종양 유도 FoxP3 발현은 배양 동안에 활성화된 emTh-1 세포들의 상청액의 존재에 의해 상당히 약화되었다(도 1a, b).
CD4+CD25-CD62L+ 미접촉 T 세포들이 emTh-1 상청액의 존재하에서 또는 상기 상청액 없이 형질전환성인자-베타(5ng/㎖)와 함께 또는 상기 형질전환성인자-베타 없이 T 세포 익스팬더 비드((세포:비드 비율 1:1)와 함께 72시간 동안 배양되었다. 그리고 나서 유세포 분석기에 의해 세포들이 분석되었다. 도 2a 및 도 2b는 10가지 독립된 실험의 점도표 또는 히스토그램을 나타낸다. 도 2c는 emTh-1 상청액 없이 배양된 세포들과 비교하여 유의차가 P＞.01인, 전체 CD4+ T 림프구들에서 CD4+CD25+FoxP3- 활성화된 T 세포들의 퍼센트 비율이다. 도 2d는 전사 인자들인 FoxP3, Tbet, 및 GATA-3가 형질전환성인자-베타(5ng/㎖)와 함께 또는 상기 형질전환성인자-베타 없이 혹은 emTh-1 상청액 없이 T 세포 익스팬더 비드와 함께 72시간 동안 배양된 CD4+CD25-CD62L+ T 세포들 내에서 결정된 것을 나타낸다. 3가지 실험의 대표적인 결과가 도 2d에 도시된다.
도 2a-2g의 데이터는 emTh-1 상청액들이 형질전환성인자-베타 유래의 미첩촉 세포들의 FoxP3+ T 림프구 내로의 전환을 상당히 저해하는 것을 나타낸다(도 2a 및 2b). 게다가, 활성화된 작동(CD25+FoxP3) 세포들의 수는 동종 emTh-1 상청액에 의해 증가되었다(도 2c). 효과는 용량 의존 방식으로 도시되었다(도 2e). emTh-1 상청액의 존재하에서 또는 상기 emTh-1 상청액 없이 FoxP3EGFP-유전자이식된 마우스들로부터 분리된 미접촉 CD4+CD25-FoxP3 T의 형질전환성인자-베타 유래의 전환이 실행되었다. 그리고 나서 GFP-음성(즉, FoxP3-발현) 세포들이 분류되고 그것들의 억제 활성을 평가하였다. 결과들은 이러한 잔류 FoxP3-발현 iTreg들이 손상된 것을 입증하였다(도 2f). 게다가, 이전에 전환된 FoxP3+ iTreg들에 더해진 emTh-1 상청액은 그것들의 면역억제 기능을 상당히 손상시켰다(도 2g).
염증유발 세포 계통(pro-inflammatory cell leanage)을 향하여 형질전환성인자-베타 유래 FoxP3+ T 세포 분화를 스큐잉할 수 있는지를 알아보기 위하여 emTh-1 상청액들이 평가되었다. 전사 인자들인 T-bet 및 GATA-3는 각각 Th1 또는 Th2에 의해 두드러지게 발현되었다. 유세포 분석기 분석은 형질전환성인자-베타와 Th-1 상청액의 존재하에서 72시간 배양 후 획득된 대부분의 CD4+ T 세포들이 낮은 레벨의 GATA-3 및 FoxP3를 발현하였다는 것을 나타낸다. 획득된 세포들 대부분은 Th-1 극성화와 일치하는 Tbet-음성 표현형을 나타내었다(도 2d). 따라서 이러한 결과들은 emTh-1 세포들이 FoxP3+부터 염증유발 Th-1 계통까지 미접촉 T 세포들의 형질전환성인자-베타-의존 극성화를 스위칭할 수 있는 수용성 인자들을 생산한다는 것을 나타내었다.
CD4+CD25-CD62L+ 미접촉 T 세포들이 마우스 인터페론-감마에 대한 차단 항체와 함께 또는 상기 마우스 인터페론-감마(도 3a)에 대한 차단 항체 없이 혹은 형질전환성인자-베타에 대한 차단항체(도 3b)와 함께 또는 없이, emTh-1 상청액의 존재하에서 또는 상기 상청액 없이 형질전환성인자-베타1과 함께 또는 상기 형질전환성인자-베타1 없이 T 세포 익스팬더 비드와 함께 72시간 동안 배양되었다. 도 3c 및 3d에서, CD4+CD25-CD62L+ 미접촉 T 세포들이 인터페론-감마R-/- 마우스 비장으로부터 분리되었고 형질전환성인자-베타1과 함께 또는 상기 형질전환성인자-베타1 없이 혹은 형질전환성인자-베타1로 처리된 emTh-1 상청액의 존재 하에서 또는 상기 상청액 없이 그리고 emTh-1 상청액의 존재하에서 또는 상기 상청액 없이 T 세포 익스팬더 비드와 함께 72시간 동안 배양되었다. FoxP3 발현 세포들의 퍼센트 비율이 유세포 분석기에 의해 결정되었다.
Th-1 세포들에 의해 생산되는 주요 사이토카인들의 관련성이 조사되었다. Th-1 세포 배양으로부터의 상청액 내에 높은 레벨의 인터페론-감마 및 종양괴사인자-알파가 검출되었다. 차단 항체들을 사용하여, 종양괴사인자-알파가 아닌, 인터페론-감마의 중화는 emTh-1 상청액의 효과를 제거하였는데, 미접촉 세포들의 FoxP3 발현 T 세포들로의 형질전환성인자-베타가 유도된 전환을 회복하였다. 이러한 데이터는 종양괴사인자-알파가 아닌, 재조합 인터페론-감마가 FoxP3+ T 세포들의 형질전환성인자-베타가 유래된 발생의 음성 조절을 손상시켰다는 것을 나타내었다(도 3a 및 3c). 이러한 결과들은 인터페론-감마R-/- 마우스들을 사용하여 확인되었다. 도 3c 및 3d에 도시된 데이터는 인터페론-감마R-/- 마우스들로부터 분리된 CD4+ 미접촉 T 세포들의 FoxP3+ T 세포들로의 전환은 Th-1 세포 상청액에 의해 변경되지 않았다는 것을 나타낸다(도 3c 및 3d). 따라서 인터페론-감마는 FoxP3+ T 림프구 발생의 Th-1 매개 저해에 원인이 되는 주요한 메커니즘을 대표하였다.
도 4a에서, CD4+CD25+ nTreg들이 BALB/c 마우스 림프 조직들로부터 분리되었고 emTh-1 상청액과 함께 또는 상기 상청액 없이 플레이트-경계(plate-bound) 항-CD3(5ng/㎖), 가용성 항-CD28(5ng/㎖), 및 IL-2(20 IU/㎖)와 함께 표시된 시간 기간 동안 배양되었다. 그리고 나서 유세포 분석기를 사용하여 FoxP3 발현이 결정되었다. 도 4b에서, CD4+CD25+ nTreg들이 emTh-1 상청액과 함께 또는 상기 상청액 없이 플레이트-경계 항-CD3(5ng/㎖), 가용성 항-CD28(5ng/㎖), 및 IL-2(20 IU/㎖)와 함께 표시된 시간 동안 배양되었다. 그리고 나서 세포들이 완전 배지와 함께 광범위하게 세척되었다. 반응 CD4+CD25- T 림프구들은 미처리된 nTreg들이 없거나(CD25) 또는 상기 nTreg들의 존재 하에서(CD25- + 미처리된 nTreg) 혹은 emTh-1 상청액이 처리된 nTreg들의 존재 하에서(CD25- [nTreg]emth -1 sup) 항-CD3/항-CD28 T 세포 익스팬더 비드로 자극되었다. 브로모데옥시우리딘 통합 분석법을 사용하여 반응 CD25- T 세포들의 증식이 결정되었다. 유의미하지 않은(NS, nonsignificant); P＜.001인, 유의차가 미처리된 Treg들과 함께 배양된 반응 CD25- T 세포들과 비교되었다. 도 4c에서, emTh-1 상청액과 함께 48시간 동안 CD4+CD25- T 림프구들이 우선 처리되었거나([CD25-]emTh-1 sup) 또는 처리되지 않았으며(미처리된 CD25-), 완전 배지와 함께 광범위하게 세척되었으며, 새로 분리된 CD4+CD25+ nTreg들(+nTreg)과 함께 공생 배양되었다. 그리고 나서 브로모데옥시우리딘 통합 분석법을 사용하여 반응 CD25- T 세포들의 증식이 결정되었다. P＜.001이다. 도 4d에서, 인터페론-감마 농도가 도 4c를 위하여 설명된 공생 배양 내에서 평가되었다.
도 4e에서, CD4+CD25+ Treg들이 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC)로부터 분리되었고 인간 emTh-1 세포 상청액에 24시간 동안 노출되었다. 그리고 나서 세포 추적 바이올렛(Cell Trace Violet)이 라벨링된 CD25- 반응 T 세포들이 미처리된 Treg (Cd25- + 미처리된 Treg) 또는 emTh-1이 전처리된 Treg (CD25- + [Treg]emTh -1 sup)에 더해진다. 도 4f에서, CD4+CD25- T 림프구들이 emTh-1과 함께 먼저 처리되거나([CD25-]emTh-1 sup) 또는 emTh-1 없이(미처리된 CD25) 처리되고, 그리고 나서 Cell Trace violet으로 라벨링되고 새로 분리된 CD4+CD25+ Treg (+Treg)와 공생 배양된다. 반응 CD25- T 세포 증식이 재료 및 방법에 설명된 것과 같이 유세포 분석기 분석에 의해 결정된다.
도 4a에서의 결과는 nTreg들 내의 FoxP3 발현이 emTh-1 상청액에 의해 손상되지 않았음을 입증하였다. 마우스 림프 조직들로부터 분리된 nTreg들은 항-CD3와 항-CD28 항체 및 IL-2로 활성화된다. 세포들은 48시간 동안 완전 배지 또는 emTh-1 상청액 내에서 배양되었고 그리고 나서 추가의 48시간 동안 새로 분리된 CD4+CD25- 세포들과 공생 배양되기 전에 세척되었다. CD4+CD25- 세포들의 증식을 저해하기 위하여 nTreg로 처리되거나 또는 미처리된 emTh-1 상청액의 능력이 브로모데옥시우리딘 통합 분석법을 사용하여 분석되었다. 데이터는 emTh-1 상청액(도 4b) 또는 인터페론-감마가 CD4+CD25+ Treg들을 억제하기 위하여 Treg들의 능력을 상당히 저해한 것으로 나타났다. 말초 혈액 림프구들로부터 분리된 인간 CD4+CD25+ Treg 및 CD4+CD25- 반응 T 세포들을 사용하여 유사한 결과들이 획득되었다.
T 세포들이 emTh-1 상청액과 함께 48시간 동안 배양되었고 그리고 나서 새로 분리된 CD4+CD25+FoxP3+ nTreg들과 공생 배양되었다. emTh-1 상청액으로 전처리된 CD4+CD25- T 세포들의 인터페론-감마의 어떠한 증식(도 4c)과 생산(도 4d)도 Treg들에 의해 억제되지 않았다. emTh-1 상청액으로 전처리된 인간 CD4+CD25+ 반응 T 세포들이 인간 CD4+CD25+ Treg들에 노출되었을 때 유사한 결과들이 획득되었다(도 4f). 이러한 데이터는 emTh-1 세포들이 Treg들이 저해 기능을 손상시킬 뿐만 아니라, Treg 매개 저해에 대한 작동 T 세포들의 저항을 유도한다는 것을 나타낸다.
미접촉 Balb/c 마우스들에 오른쪽 서혜부 내에 5×103 생존 12B1 세포들이 주사되었다. 도 5a에서, 3일, 7일 및 14일째에 백신주입이 실행되었다. "재료 및 방법"에 설명된 것과 같이 오른쪽 footpad 내에 처리되었다. 마우스의 생존이 모니터링되었고 카플란-마이어 점도표에 의해 표시되었다. 도 5b에서, 0일째에 중증 복합형 면역결핍 마우스들에 5×103 생존 12B1 세포들이 오른쪽 서혜부 내에 주사되었고 3일, 7일 및 14일째에 족척 주사에 의해 PBS, 활성화된 emTh-1 또는 활성화된 emTh-1과 CRCR의 조합으로 처리되었다. 도 5c에서, 면역능력이 있는 Balb/c 마우스들에 종양 세포들이 주사되었고 3일, 7일 및 14일째에 족척 주사에 의해 PBS, 활성화된 emTh-1 또는 활성화된 emTh-1과 샤페론 풍부 세포 용해물의 조합으로 처리되었다. 일부 마우스 그룹에서, 자연 살해 세포들은 "재료 및 방법"에서 설명된 것과 같이 -1일, 3일 및 5일째에 항-아시알로 GM1 항체들의 복강내 주사를 사용하여 감소되었다. 모든 실험에서 마우스들의 생존이 모니터링되었고 카플란-마이어 플롯에 표시되었다. 도 5d에서, 0일째에 C57BL/6 마우스들에 5×105 12B1 세포들이 주사되었다. 종양 면적이 재료 및 방법에서 설명된 것과 같이 이틀마다 모니터링되었다. 동물 생존은 카플란-마이어 분석을 사용하여 도시하였다.
종양 특이 면역을 유도하기 위하여, 그것들이 동일한 형태의 종양으로부터 유래하는 샤페론 풍부 세포 용해물과 같은 개인화 백신과 결합될 수 있는가를 알아보기 위하여 동종의 emTh-1 세포 기반 면역치료가 평가되었다. 도 5의 결과에 도시된 것과 같이, 동종 emTh-1 세포들은 12B1 백혈병을 갖는 마우스들을 처리하기 위하여 체내에서 안전하게 배달되고 종양 유래 샤페론 풍부 세포 용해물과 효과적으로 결합되었다. 미접촉 Balb/c 마우스들 내에 자리 잡은 12B1 종양들이 사용되었고 동종 emTh-1 세포 기반 면역치료가 처리된 동물들의 상당한 종양이 없는 생존을 야기하는 CRCL 백신 전략과 효과적으로 결합될 수 있는지를 확인하였다(도 5a). Balb/c 마우스들로부터 발생되는 emTh-1 세포들로 처리된 B16 종양이 있는 C57BL/6 마우스들을 포함하는 B16 흑색종(melanoma) 모델로 유사한 결과들이 획득되었다(도 5d 참조).
샤페론 풍부 세포 용해물 및 활성화된 emTh-1에 의해 유도된 항-종양 반응들에서 T 세포들의 역할은 복합형 면역결핍 및 누드 마우스의 사용에 의해 정의된다. 12B1 종양이 있는 복합형 면역결핍 마우스들은 위에서 설명된 것과 같이 종양 세포 접종 후 3, 7 및 14일째에 샤페론 풍부 세포 용해물과 활성화된 emTh-1로 처리된다. 샤페론 풍부 세포 용해물과 활성화된 emTh-1 면역치료는 12B1 종양이 있는 복합형 면역결핍 마우스들의 생존을 개선하지 못하였다(도 5b). 유사한 결과들이 누드 마우스들을 사용하여 획득되었다. 이러한 데이터는 12B1 종양들에 대한 동종 Th-1과 샤페론 풍부 세포 용해물 병영 면역치료가 T 세포 매개 면역 반응에 의존한다는 것을 나타내었다. 이러한 데이터와 일치하게, 항-아시알로(asialo)-GM1 항체들을 사용하는 면역적격(immunocompetent) 마우스들에서의 자연 살해 세포들의 체내 고갈은 동종 Th-1과 샤페론 풍부 세포 용해물 처리의 치료 효과를 상당히 손상시키지는 않았으며, 이는 자연 살해 세포들이 병영 치료(도 5c)에 의해 유도되는 항종양 면역 반응에서 중요한 역할을 하지 않는다는 것을 나타내었다. 따라서, 샤페론 풍부 세포 용해물 백신과 결합하여 동종의 활성화된 emTh-1 세포들을 기초로 한 면역치료의 종양 보호 효과는 T 림프구들에 의존한다.
미접촉 BALB/c 마우스들이 0일째에 5×103 12B1 세포들이 주사되었고(오른쪽 서혜부에 피하로) 도 5에 설명된 것과 같이 백신주입되었다. 그리고 나서 생존한 종양이 없는 마우스들은 45일째에 오른쪽 서혜부에 주어진 피하로 5×103 12B1 세포들로 그리고 왼쪽 서혜부에 주어진 피하로 1×106 A20 세포들로 재도전되었다. 이틀마다 종양 면적이 결정되었다. 도 6a에서, 대조군 마우스들에서 A20 종양 면적이 모니터링되었다. 도 6b에서, 샤페론 풍부 세포 용해물과 동종의 활성화된 emTh-1 세포들로 처리된 마우스들에서 A20 종양 면적이 모니터링되었다. 도 3c에서, 대조군 그룹에서 12B1 종양 면적이 모니터링되었다. 도 3d에서, emTh-1과 샤페론 풍부 세포 용해물로 처리된 마우스들에서 12B1 종양 면적이 모니터링되었다. 결과들은 2개의 독립된 실험을 대표한다.
샤페론 풍부 세포 용해물과 동종의 활성화된 emTh-1 세포들로 처리된 생존 마우스들이 오른쪽 서혜부에 모의(parental) 12B1 종양 세포들로 그리고 반대편 서혜부에 미처리 B 세포 백혈병(A20, H-20)으로 재도전되었다. A20 종양들이 처리 그룹 및 대조군 그룹 모두 모든 8마리 마우스에서 발생되었다(도 6a 및 6b). 8마리 마우스 중 5마리는 샤페론 풍부 세포 용해물과 동종의 활성화된 emTh-1 세포 그룹 내의 12B1 종양 재도전에 대하여 보호되었고 2마리는 종양 성장의 지연을 나타내었으며, 반면에 모든 대조군 마우스들은 12B1 종양들을 발생하였다(도 6c 및 6d). 따라서 이러한 결과들은 샤페론 풍부 세포 용해물과 동종의 활성화된 emTh-1 세포들을 포함하는 병영 면역치료는 처리된 동물 대부분에서 지속적 종양 특이 면역을 유도한다는 것을 나타낸다.
도 7a에서, emTh-1과 샤페론 풍부 세포 용해물의 면역치료는 종양 특이 살해 T 림프구를 유도한다. B16 종양이 있는 마우스들이 PBS 대조군에 주사하였으며 또한 재료 및 방법에 나타낸 것과 같이 B16 유래 샤페론 풍부 세포 용해물 및 동종 emTh-1으로 처리하였다. 최종 백신주입 후 7일째에, 비장세포들이 수확되었으며 3일 동안 샤페론 풍부 세포 용해물(25 ㎍/㎖) 및 50 U/㎖ IL-2과 함께 배양하였다. 그리고 나서 T 림프구들이 나일론 울 컬럼(nylon wool column) 상에서 정제되었으며 36시간 동안 나타낸 것과 같이 B16 종양 세포들 또는 무관한 4T1 유방암 세포 표적들 중 하나와 함께 배양되었다(작동 T 세포 대 표적 종양 세포의 비는 20:1). 세포독성이 결정되었다: 대조군 T, PBS로 주사된 마우스들로부터의 T 림프구들과 함께 배양된 종양 세포들; +T[emTh-1], 샤페론 풍부 세포 용해물과 emTh-1으로 처리된 마우스들로부터의 T 림프구들과 함께 배양된 종양 세포들. 도 7b에서, emTh-1 세포들은 체내 Treg들보다 오히려 CD4+CD25+FoxP3- 작동 T 세포들을 향하는 CD4+CD25-FoxP3- 미접촉 T 림프구들의 분화를 스큐잉하였다. Thy1.2 FoxP3EGFP 형질전환 BALB/c 마우스로부터 분리된 CD4+CD25-FoxP3- 미접촉 림프구들(107 cells)이 12B1 종양이 있는 유사유전자 Thy1.1 BALB/c 마우스들로 전달되었다. 동물들은 emTh-1 세포들(+emTh-1 cells) 또는 PBS 대조군(No emTh-1 cells)으로 처리되었다. 수혜 Thy1.1 마우스들의 내인성 T 세포들은 Thy1.1을 발현하나 Thy1.1 마우스들 내의 Thy1.2 T 림프구들의 특정 트래킹(traching) 및 동정을 허용하는, Thy1.2 항원을 발현하지 않는다. 비장들이 수확되고 절개되었으며, 유세포 분석기를 사용하여 CD4+ T 세포 개체군을 얻은 후에 Thy1.2 GFP+ 세포들의 빈도를 평가함으로써 전달된 미접촉 Thy1.2CD4+CD25-FoxP3- T 세포들의 체내 GFP+(FoxP3-expressing) 내로의 전환이 결정되었다. 도 7c에서, emTh-1 세포들은 체내에서 Treg 억제 기능을 손상시켰다. 반응 CD4+CD25- T 림프구들은 미처리된 종양이 있는 마우스들(CD25-+[Treg]untreated) 또는 emTh-1 (CD25-+[Treg]emTh-1)으로 처리된 종양이 있는 마우스들의 배수 림프절(draining lymph node)로부터 분리된 Treg들이 없을 때 또는 존재하에 항-CD3/항-CD28 T 세포 익스팬더 비드와 함께 자극되었다. 브로모데옥시우리딘 통합 분석법을 사용하여 48시간 후에 반응 CD4+CD25- T 림프구 증식이 결정되었다.
샤페론 풍부 세포 용해물과 emTh-1 세포로 처리된 마우스들로부터 분리된 T 세포들의 항종양 기능이 분석되었다. 병영 치료를 받는 동물들의 비장으로부터 정제된 림프구들은 분명히 모의 종양 세포들을 살해할 수 있었으나 무관한 표적 암 세포들은 살해할 수 없었다(도 7a). EmTh-1 세포들은 Thy1.2 CD4+CD25+FoxP3+ Treg들보다 오히려 Thy1.2 CD4+CD25+FoxP3+ 작동 T 세포들을 향하여 12B1 종양이 있는 유사유전자형 Thy1.2 마우스들로 전달되는 미접촉 Thy1.2 CD4+CD25-FocP3- T 림프구의 분화를 스큐잉할 수 있었다(도 7b). 게다가, Treg들의 억제 기능은 상당히 감소되었다(도 7c). 이는 체외에서 관찰된 Treg들 상의 emTh-1 세포들의 효과가 또한 체내에서 발생한다는 것을 확인시켰으며 또한 emTh-1 세포들이 샤페론 풍부 세포 용해물 백신주입의 효과를 증가시키는 메커니즘이 종양 유래 Treg들의 저해에 관련된다는 것을 입증하였다.
비록 본 발명이 바람직한 실시 예들을 참조하여 설명되었으나, 통상의 지식을 가진 자들은 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 형태 및 세부내용에서의 변경이 만들어질 수 있다는 것을 인정할 것이다.
Claims (7)
- 환자의 Treg 세포의 면역억제 활성을 감소시키는데 사용되는 동종(allogeneic) Th-1 세포를 포함하는, 암 또는 감염성 질병 치료용 조성물에 있어서,
상기 치료용 조성물은 항 형질전환성인자-베타(TGF-β) 항체를 더 포함하고,
상기 치료용 조성물은 질병 항원의 샤페론 풍부 세포 용해물을 더 포함하며,
상기 치료용 조성물은 인터페론-감마 또는 CD40L을 더 포함하고,
상기 동종 Th-1 세포는 동종 em(effector/memory)Th1 세포이고,
인터페론-감마(IFN-γ)에 의해 중개되는 상기 Treg 세포 활성의 감소 및 저해의 적어도 하나는 i) 환자의 질병 항원들의 면역 내성을 감소시키거나, ii)환자의 질병에 대한 치료 효과를 유도하거나, iii) 환자의 면역억제 기능을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 Treg 세포들의 억제 활성은 미접촉 T 세포들(CD4+CD25-FoxP3-)의 iTreg 세포들로의 전환을 감소시킴으로써 저해되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 Treg 세포들의 억제 활성은 nTreg 세포들의 저해에 의한 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 Treg 세포들은 CD4+CD25+FoxP3+인 것을 특징으로 하는 조성물.
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Journal of Immunotoxicology, 2009.11.16.(온라인 공개), 제7권, 제1호, 페이지 15-26* |
| Leukemia Research, 2009, 제33권, 제4호, 페이지 525-538 |
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