KR102114647B1

KR102114647B1 - 흑호두나무, 회화나무 및 소나무 추출 혼합물을 유효성분으로 함유하는 항노화 또는 항염용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102114647B1
Application number: KR1020180105141A
Authority: KR
Inventors: 정수경; 경서연; 윤석균; 여현주; 강승현; 박명삼
Original assignee: 코스맥스 주식회사
Priority date: 2018-09-04
Filing date: 2018-09-04
Publication date: 2020-05-25
Also published as: KR20200027171A

Abstract

본 발명은 피부 노화 또는 피부 염증 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 흑호두나무, 회화나무 및 소나무 추출 혼합물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 또는 피부 염증 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 상기 흑호두나무 추출물 또는 그의 추출 혼합물은 세포내 활성산소(ROS)를 억제하는 항산화능을 가지며, 시너지(synergy)적으로 MMP-1과 IL-1β를 억제함으로써 피부 콜라겐 분해 효소 및 염증 유발 인자 발현을 억제하여 결과적으로 노화 개선 및 염증 억제 효과를 나타낼 수 있으므로, 피부 노화 또는 피부 염증 개선용 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

흑호두나무, 회화나무 및 소나무 추출 혼합물을 유효성분으로 함유하는 항노화 또는 항염용 화장료 조성물 {Cosmetic composition for anti-aging and anti-inflammatory activities comprising extracts mixture of Juglans Nigra, Sophora Japonica, and Pinus Densiflora}

본 발명은 피부 노화 또는 피부 염증 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 흑호두나무, 회화나무 및 소나무 추출 혼합물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 또는 피부 염증 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 체온 조절, 장벽 기능 및 여러 가지 생리 기능 등을 가진 보호막으로 인체의 중요 기관 중 하나이다. 피부 노화는 크게 두 가지 과정으로 일어나는데, 특별한 환경적 요인 없이 나이가 들면서 일어나는 내인성 노화와 자외선과 같은 환경요인에 장기간 노출되어 피부에 변화를 일으키는 광노화가 있다. 노화에 따른 피부의 생리적 변화로는 피부 구성 성분인 표피, 진피 및 피하 조직의 두께가 얇아지는 현상, 피부의 수분 함량이 떨어지고 피부가 건조해지는 현상, 색소침착 등 다양한 피부 병이 유발된다. 특히, 과도한 피로 및 스트레스와 증가한 자외선량 등으로 인해 생성되는 활성산소는 콜라겐, 엘라스틴 등의 단백질 분해 효소(MMPs)의 합성을 촉진하여 진피층의 탄력을 감소시킴으로써 피부 주름 및 노화의 주원인으로 작용한다.

한편, 염증은 해로운 주위 환경, 즉 세균과 같은 외부 이물질의 침입과 기계적 손상으로부터 생체를 보호하는 생리적인 반응인데, 과도한 염증 반응 또한 피부 손상의 주요 원인이다. 염증이 발생하면, 여러 종류의 다핵형 백혈구(PMNs)와 면역 물질의 증가를 초래하고, 이들 세포는 염증성 세포 산물인 다양한 종류의 단백질 분해효소(엘라스테이스, 히알루리니데이스 및 리폭시게네이스 등)와 사이토카인(cytokine)을 분비하게 된다. 이후 이들의 작용은 인접해 있는 조직 세포와 비 조직 세포 성분들에게도 해로운 손상을 일으키고, 만성 염증의 심각한 조직 손상을 가져올 수 있다. 또한, 결합 조직의 손상은 피부의 탄력을 감소시켜 주름의 원인이 될 뿐 아니라 나아가 세포의 재생 및 증식에도 나쁜 영향을 미치게 되어 빠른 피부 노화를 초래하게 된다. 또한, 활성 산소와 프리라디칼은 정상적인 세포 조직이나 세포막을 공격하여 세포가 파괴되고 피부는 결국 염증(inflammation)을 일으키게 된다. 염증화된 (inflammated) 조직은 피부에 생리학적 메카니즘에 의해 단백질이나 유전자 물질 등을 파괴하여 주름 등을 형성하는 피부 노화가 일어난다.

이처럼, 과다 염증에 의해 유발되는 단백질 분해 효소들에 의해 세포 및 결합조직이 손상을 입고 결합조직의 손상은 피부의 탄력을 감소시켜 주름의 원인이 될 뿐 아니라 나아가 빠른 피부 노화를 초래하게 된다. 그러므로 활성산소와 프리라디칼을 억제하는 것은 피부 노화 화장료에 중요한 요소이다. 프리라디칼의 생성 원인을 보면 외적으로는 자외선, 공해, 합성세제 등이며, 내부적 요인으로는 염증, 세포 파괴, 심리적 스트레스 등이다. 최근 자외선(UV-B 및 UV-A) 에 의한 피부세포 손상의 주원인은 역시 활성 산소이며, 이는 태양광선 노출시 피부에서 생성되어 피부 단백질의 변성 및 지질의 과산화를 통하며, 피부염 및 광발암 등을 일으킬 수 있다고 보고되어 있다.

이러한 활성 산소종의 중화를 목적으로 토코페롤, 폴리페놀류, Coenzyme Q10, BHT, BHA 등 항 산화제가 폭 넓게 이용되고 있으나 이들은 대부분 합성품으로서 장기간 인간의 피부에 적용할 경우 안전성이 문제화되므로 사용이 제한된다.

따라서, 사람의 피부에 대한 안정성이 보증되는 천연물로서 항산화제를 찾으려는 노력이 진행되었는바, 많은 식물 종에는 식물 보호 효과가 우수한 폴리페놀류가 다양하게 함유되어 있으므로, 녹차, 상백피, 황금 등 수많은 식물 추출물이 항산화제로서 화장품에 폭넓게 사용되고 있다.

타감 작용을 하는 식물들 중에서 높은 항산화능을 보이는 식물들이 있다. 타감 작용이란 성장하면서 어떤 화학물질을 발산해서 다른 식물이 그 주변에 자라지 못하도록 억제하는 작용을 이르며 이를 알렐로파시(Allelopathy)라고 일컫는다. 또한, 식물들간의 화학적 상호작용이라고도 불리는데 타감 작용을 하는 대표 식물로는 소나무, 편백나무, 회화나무, 호두나무, 흑호두나무, 단풍나무 등이 있다.

흑호두나무(Juglans nigra)는 북아메리카가 원산지이며 나무 높이 40m, 나무 둘레 1.2~1.5m이다. 나무껍질은 흑갈색 또는 회색이 도는 검은색이며 줄기는 골이 깊게 패 있다. 길이가 약 30~60㎝인 잎은 매우 짧은 잎자루에 15~20장의 작은 잎이 달려서 깃꼴겹잎을 이룬다. 꽃은 단성화이며 같은 그루에 따로따로 핀다. 열매는 목질의 견과인데 둥글고 2~3개씩 송이로 되어 있다. 열매의 지름은 3.5~5.0㎝이다. 씨는 막 모양의 속껍질에 싸여 있으며 달콤하고 기름기가 많다. 목재는 단단하고 잘 썩지 않아 고급 가구재로 이용하며 열매껍질은 연마재로 쓴다. 일반적으로 식용으로 보편화하여 있는 영국 호두(Juglans regia)에 비해 단일불포화지방산과 폴리페놀 및 토코페롤과 같은 항산화 성분이 더 많이 함유되어 있다고 알려져 있다(International Journal of Food Properties, 2016, 19, 2175-2189). 또한, 흑호두나무는 Juglone 성분을 배출하면서 영국 호두나무에 비해 강한 타감 작용을 한다고 알려져 있다(Journal of Chemical Ecology, 1983, 9, 295-308).

회화나무(Sophora Japonica)는 쌍떡잎식물 장미목 콩과의 낙엽교목으로 꽃봉오리를 괴화 또는 괴미라고 하며 고혈압에 좋고 지혈에 효과가 있다. 나무의 높이가 약 25m까지 자라며 가지가 넓게 퍼진다. 작은 가지는 녹색이며 자르면 냄새가 난다. 잎은 어긋나고 1회 깃꼴겹잎이다. 작은잎은 7∼17개씩이고 달걀 모양 또는 달걀 모양의 타원형이며, 뒷면에는 작은 잎자루와 더불어 누운 털이 있다. 꽃은 8월에 흰색으로 피고 원추꽃차례로 달린다. 꽃이 지고 난 다음 열리는 열매의 형태는 꼬투리 모양인데 둥근 씨앗이 줄줄이 연결된 모양이 독특하다. 길이는 약 5∼8cm이고 종자가 들어 있는 사이가 잘록하게 들어가며 밑으로 처진다. 꽃봉오리를 괴화(槐花) 또는 괴미(槐米)라고 하며 열매를 괴실(槐實) 이라 하는데, 한의학에서 약용으로 사용한다. 열매는 협과로 원기둥 또는 염주 모양이다. 괴화는 동맥경화 및 고혈압에 쓰고 맥주와 종이를 황색으로 만드는 데 쓴다. 괴실은 가지 및 나무껍질과 더불어 치질 치료에 쓴다. 우리나라 산지에서 자라며 정원수나 목재는 가구재로 이용한다. 꽃, 열매, 껍질, 줄기, 뿌리를 다 쓰는데 주로 동맥경화, 장 출혈, 자궁출혈, 잇몸염증, 부스럼, 화상, 고혈압, 뇌일혈, 중풍, 손발의 마비 등 순환기계 질병과 치질, 치루 통에 좋다. 회화나무는 Pterocarpanoid계 Phytoalexin 성분인 Maackiain과 Medicarpin 이성질체를 분비하여 타감작용을 하는 것으로 알려져 있다(Phytochemistry, 1983, 22, 2291-2295).

소나무(Pinus Densiflora)는 상록성 침엽교목으로서 우리나라를 비롯하여 중국이나 일본 등 전 아시아 지역의 임야에서 널리 자생하고, 자유라디칼 또는 활성산소종을 강력하게 제거하는 천연 항산화 물질 특히, 플라보노이드류의 성분이 다량 함유된 것으로 알려져 있으며 저비용으로 손쉽게 솔잎을 얻을 수 있는 장점이 있다. 상기 소나무는 일 예로 적송(Pinus densiflora Sieb & Zucc.), 해송(Pinus thumbergii Parlatore), 금강소나무(Pinus densiflora Sieb & Zucc. For. erecta Uyeki), 구주소나무(Pinus sylvestris L.), 솔잣나무(Pinus pinea Cupressus Sempervirens) 등일 수 있고, 바람직하게는 적송일 수 있다. 소나무에 경우 Gallotanin 및 Phenolid acid 성분 분비를 통해 타감작용을 하여 그 주변에 잡초 성장을 억제하는 것으로 알려져 있다(Journal of Plant Physiology, 2009, 166, 442-446).

위 언급된 것과 같이 흑호두나무는 일반적으로 널리 알려진 영국 호두나무와 그 구성 성분 및 효능이 다르고 소나무와 회화나무는 화장료 조성물로써 그 효능을 평가받아 왔으나 흑호두나무, 소나무, 회화나무 추출 혼합물을 이용함으로써 콜라겐 분해 효소 및 염증 유발 인자를 시너지(synergy)적으로 억제함으로써 피부 노화 및 염증 억제 효과를 가지는 항노화 및 항염증 화장료 조성물을 암시하거나 시사하고 있지 못하다.

이에, 본 발명자들은 효과적 피부 노화 및 염증 억제 화장료 조성물에 대해 연구한 결과, 흑호두나무, 회화나무 및 소나무의 추출물은 각각 항산화능을 지니며 이 혼합물은 시너지(synergy)적으로 MMP-1과 IL-1β를 억제함으로써 결과적으로 피부 노화 및 염증을 개선할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

KR 1020030066565 A KR 1020040055830 A

따라서, 본 발명의 주된 목적은 MMP-1과 IL-1β를 억제함으로써 피부 콜라겐 분해 효소 및 염증 유발 인자 발현을 억제하여 결과적으로 노화 개선 및 염증 억제 효과를 갖는 흑호두나무, 회화나무 및 소나무 추출 혼합물을 유효성분으로 함유하는 항노화 또는 항염증 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 흑호두나무, 회화나무 및 소나무 추출 혼합물을 유효성분으로 함유하는 콜라겐 분해 효소 발현 억제 및 염증 인자 발현 억제 효능을 갖는 피부 노화 또는 피부 염증 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 추출 혼합물은 흑호두나무 : 회화나무 : 소나무의 추출물이 1~6 : 1~6 : 1~6의 중량비, 바람직하게는 1~3 : 1~3 : 1~3의 중량비, 가장 바람직하게는 1 : 1 : 1의 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 추출 혼합물은 각 천연물을 혼합한 후 함께 추출하거나 각각 추출한 후 혼합할 수 도 있다. 본 발명의 실시예에서는 상기 흑호두나무, 회화나무 및 소나무의 단독 추출물을 각각 1~3의 중량비로 혼합한 추출물의 형태로 제조하여 실험하였다.

본 발명의 실험 예에 따르면, 흑호두나무 : 회화나무 : 소나무의 다양한 비율에 따른 MMP-1 및 IL-1β 저해 효과를 확인한 결과, 상기 세 가지를 혼합한 모든 비율에서 단독 추출물보다 우수한 UV 조사에 의해 증가했던 MMP-1 및 IL-1β 발현의 저해 효과를 나타냈다. 이러한 결과로 볼 때, 본 발명의 추출 혼합물은 어떠한 비율에서도 시너지 효과를 나타내어 MMP-1 및 IL-1β를 저해하여 피부 노화 개선 및 항염증 효과를 보임을 확인하였다(도 1 내지 도 3).

본 발명에 있어서, 상기 추출 혼합물은 종래에 사용된 어떠한 용매로도 추출될 수 있으며, 바람직하게는 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매, 더욱 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 4의 저가 알코올, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 부틸렌글리콜 또는 이들의 혼합용매로 추출되는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 화장료 조성물에 유효 성분으로서 함유되는 상기한 추출 혼합물을 얻기 위하여 사용될 수 있는 추출 용매로서는 정제수, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올, 글리세린, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜을 포함하는 용매군 중에서 선택된 하나의 순수 용매 또는 둘 이상이 조합된 혼합용매를 이용할 수 있으나, 이는 본 발명에 있어서 제한적인 것은 아니다. 추출 용매의 첨가량은 혼합 원료의 전체 부피 대비 1 내지 20 배의 부피량이면 바람직하다.

보다 구체적으로는 본 발명의 화장료 조성물에 포함하는 상기의 추출 혼합물은 흑호두나무, 회화나무 및 소나무의 잎을 분쇄 또는 파쇄하여 분말을 만들고, 상기 전술한 추출 용매를 침적하여 24 내지 72 시간 동안 실온에서 추출한다. 이어 얻어진 추출 여액을 여과하고, 감압 건조하여, 농축 혼합 추출액을 얻거나 또는 이를 동결 건조하여 분체를 수득한다. 본 발명의 추출 혼합물은 상기 MMP-1 및 IL-1β 발현을 시너지적으로 저해함으로써 피부 노화 개선 및 항염증 효과가 있다.

본 발명에 있어서, 상기 추출 혼합물은 흑호두나무, 회화나무 및 소나무의 어느 부위를 추출할 수도 있으나, 바람직하게는 그들의 잎, 껍질, 줄기 또는 뿌리를 추출한 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 추출 혼합물의 함량은 화장료 조성물 총 중량에 대해 0.001 ~ 50.0 중량%인 것을 특징으로 하는 피부 노화 또는 피부 염증 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 피부 노화는 자외선에 의한 피부 광노화인 것을 특징으로 하는 피부 노화 또는 피부 염증 개선용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 실험예들에서는 자외선(UV)에 의해 MMP-1 또는 IL-1β의 발현량이 증가되거나 세포내 활성산소(ROS)의 레벨이 증가되는 것을 대조군(control)로 하여 상기 추출 혼합물에 의한 그 저해 효과를 시험하였다. 본 발명에 있어서, 상기 피부 노화의 개선이란 피부 주름 및 피부 탄력이 개선되고 피부세포의 손상이 개선되는 것을 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 추출 혼합물은 세포내 활성산소(ROS)를 억제하는 항산화능을 가지며, 시너지(synergy)적으로 MMP-1과 IL-1β를 억제함으로써 피부 콜라겐 분해 효소 및 염증 유발 인자 발현을 억제하여 결과적으로 피부 노화 및 염증을 개선할 수 있는 것을 특징으로 하는 피부 노화 또는 피부 염증 개선용 화장료 조성물을 제공한다

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 당업계에 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예컨대, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 에센스, 영양 오일, 보습 오일, 영양 크림, 파우더, 팩, 파운데이션, 메이크업 베이스, 클렌징, 젤, 로션 및 연고로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화장료 제형인 것을 특징으로 하는 피부 노화 또는 피부 염증 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 흑호두나무, 회화나무, 소나무 추출 혼합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 MMP-1과 IL-1β 발현을 시너지(synergy)적으로 억제하여 궁극적으로 피부 콜라겐 분해 억제 및 염증 인자 발현을 억제함으로써 우수한 항노화 및 피부 염증 개선 효과를 가진다.

도 1은 흑호두나무, 회화나무, 소나무 단독 추출물 및 추출물 조합 비율을 1 : 1 : 1로 한 혼합물(synergy) 1% 처리 시 MMP-1 저해 효과를 나타내는 도면이다.
도 2는 흑호두나무, 회화나무, 소나무의 조합 비율별 추출 혼합물 처리 시 MMP-1 발현 억제 정도를 나타내는 결과에 대한 그래프이다. 이때, 추출물의 조합 비율이 1 : 1 : 1 일 때 MMP-1 억제능이 가장 높은 것을 확인하였다.
도 3은 흑호두나무, 회화나무, 소나무 단독 추출물 및 그 추출물 조합 비율을 1 : 1 : 1로 한 혼합물(synergy) 1% 처리 시 IL-1β 발현에 미치는 영향을 측정한 그래프이다.
도 4는 흑호두나무, 회화나무, 소나무의 조합 비율별 추출 혼합물 처리 시 IL-1β 발현에 미치는 영향을 측정한 그래프이다. 이때, 추출물의 조합 비율이 1 : 1 : 1 일 때 IL-1β 발현 억제능이 가장 높은 것을 확인하였다.
도 5는 흑호두나무, 회화나무, 소나무의 항산화력을 측정한 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

비교예 1: 흑호두나무, 회화나무 및 소나무의 단독 추출물

흑호두나무 잎, 회화나무 잎 및 소나무 잎을 분말화 한 후 각각 100 g씩 취하여 각각 별개의 용기에 넣고, 추출용매로서 70중량% 에탄올 수용액 1 L에 침적하여 24 시간 동안 실온에 방치하여 추출액을 얻었다. 얻어진 추출액을 여과지를 이용하여 여과를 한 다음 여액을 회전식 증발 건조기로 감압 농축하여 흑호두나무 잎 8.6 g, 회화나무 잎 7.5 g, 소나무 잎 15.0 g의 추출물을 얻었다.

실시예 1: 흑호두나무, 회화나무 및 소나무의 추출 혼합물 제조

상기 비교예 1에서 얻은 흑호두나무, 회화나무 및 소나무 단독 추출물을 하기의 표1에 나타난 바와 같이 혼합하여 추출 혼합물을 얻었다.

	원료명 (중량%)
조합비율	흑호두나무	회화나무	소나무
1 : 1 : 1	33.3	33.3	33.3
2 : 1 : 1	50.0	25.0	25.0
1 : 2 : 1	25.0	50.0	25.0
1 : 1 : 2	25.0	25.0	50.0
3 : 1 : 1	60.0	20.0	20.0
1 : 3 : 1	20.0	60.0	20.0
1 : 1 : 3	20.0	20.0	60.0

실험예 1: MMP-1 저해능 평가

흑호두나무, 회화나무, 소나무 단일 및 표1에 명시한 조합 비율 별 혼합 추출물의 자외선에 의해 증가하는 콜라게나아제(MMP-1)에 대한 저해능을 비교하기 위해 인간 섬유아세포주 Hs68을 이용하여 MMP-1 발현량 측정을 진행하였다. 섬유아세포주 Hs68을 6 well plate에 3x10⁵의 수만큼 분주한 후, 37수만 5% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 DPBS를 넣어준 후 UVB 비조사군을 제외한 나머지 세포군에 12 mJ/cm²의 UVB를 조사한 뒤 상기 추출물을 첨가하여 24시간 동안 추가로 배양하였다. 그 후 각 샘플을 처리한 세포에서 트리졸(RNA iso, DAKARA, 일본)을 이용하여 RNA를 분리한 뒤 nanodrop을 이용하여 260 nm에서 RNA를 정량한 후, 각각 2 ㎍의 RNA를 사용하여 증폭기에서 cDNA를 합성하였다(C1000 Thermal Cycler, Bio-Rad, 미국). 합성된 cDNA에 타겟 단백질인 MMP-1 primer와 시아닌 염료인 사이버그린(SYBR Green supermis, Applied Biosystems, 미국)을 첨가한 혼합물을 이용하여 real-time PCR 기계에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시함으로써 최종적으로 MMP-1 유전자의 발현 정도를 평가하였다. Primer의 서열과 반응 조건은 하기 표 2와 같았으며, 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 UVB 조사군에서 MMP-1 발현량이 급격히 증가한 것에 반해 흑호두나무, 회화나무, 소나무 단일 및 혼합 추출물 처리군에서 그 발현량이 감소하는 모습을 보였다. 도 2와 같이 상기 추출물들의 조합비율 별 MMP-1 발현 억제 효과를 확인하였으며, 특히, 흑호두나무, 회화나무 및 소나무 추출물의 조합비율이 1 : 1 : 1일 때 MMP-1 발현 억제능이 가장 높은 것을 확인하였다.

주형(primer)		서열	반응 조건
MMP-1	F	5'-CGAATTGCCGACAGAGATGA-3'	94℃, 5분 동안 중합 효소 활성화 후, 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초 조건에서 40사이클로 중합반응
	R	5'-GTCCCTGAACAGCCCAGTACTT-3'
IL-1β	F	5'-TGACGTTCCCATTAGACAACTG-3'
	R	5'-CCGTCTTTCATTACACAGGACA-3'
β-actin	F	5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3'
	R	5'-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3'

실험예 2: Pro-inflammatory 저해 효과 평가

흑호두나무, 회화나무, 소나무 단일 및 혼합 추출물의 pro-inflammatory 발현 저해 효과를 평가하기 위해 인간 섬유아세포주 Hs68을 이용하여 IL-1β의 발현량을 측정하였다. 섬유아세포주 Hs68을 6 well plate에 3.5x10⁵의 수만큼 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 DPBS를 넣어준 후 UVB 비조사군을 제외한 나머지 세포군에 12 mJ/cm²의 UVB를 조사한 뒤 상기 추출물을 첨가하여 24시간 동안 추가로 배양하였다. 그 후 각 샘플을 처리한 세포에서 트리졸(RNA iso, DAKARA, 일본)을 이용하여 RNA를 분리한 뒤 nanodrop을 이용하여 260 nm에서 RNA를 정량한 후, 각각 2 ㎍의 RNA를 사용하여 증폭기에서 cDNA를 합성하였다(C1000 Thermal Cycler, Bio-Rad, 미국). 합성된 cDNA에 타겟 primer 및 시아닌 염료인 사이버그린(SYBR Green supermis, Applied Biosystems, 미국)을 첨가한 혼합물을 이용하여 real-time PCR 기계에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시함으로써 최종적으로 IL-1β의 유전자 발현 정도를 평가하였다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 과발현된 IL-1β이 흑호두나무, 회화나무 및 소나무 각각의 1% 처리와 상기 추출 혼합물 1%에 따라 억제되었음을 확인하였다. 또한, 3가지 추출물의 조합 비율별 IL-1β 발현 억제 효과를 도4와 같이 확인 하였으며, 조합비율이 1 : 1 : 1일 때 염증 인자 억제능이 가장 높았다.

실험예 3: 항산화 효능 평가

세포 내에서 발생하는 ROS와 반응하여 형광을 띠는 DCF-DA를 사용하여 ROS 생성량을 확인하여 항산화력을 측정하였다. 섬유아세포주 Hs68을 6 well plate에 3.5x10⁵의 수만큼 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 DPBS를 넣어준 후, UVB 비조사군을 제외한 나머지 세포군에 12 mJ/cm²의 UVB를 조사한 뒤 상기 추출물을 첨가하여 24시간 동안 추가 배양하였다. 이후 빛을 차단한 상태에서 DCF-DA(10μM)를 넣고, 37℃에서 1시간 염색하였다. 그 다음으로 배지를 제거한 후에 DPBS로 2회 washing 한 후, well마다 1ml DPBS를 넣고 cell scrapper로 긁어서 EP tube에 담았다. 이렇게 모은 cell 용액을 200ul씩 96well black plate에 3회 반복하여 넣은 후, Victor 3로 Ex/Em=485/535nm로 하여 plate reading 후, None에 비해 %를 계산하여 intracellular ROS를 측정하였다.

도 5는 DCF-DA assay에 의한 흑호두나무, 회화나무, 소나무 추출물 각각의 세포 내 ROS에 대한 항산화 효능을 비교한 것으로, Ascorbic acid를 양성 대조군으로 사용하고, 각각의 추출물 1%의 농도에서의 항산화력을 검증하였다. 그 결과 각각의 추출물은 1% 농도에서 유의한 항산화 활성을 갖는 것으로 확인되었다.

제형예 1: 화장수 제조

상기 실시예 1에서 얻은 추출 혼합물을 함유하는 화장수를 하기의 표 3에 나타낸 조성 성분 및 조성비에 따라 통상적인 방법으로 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예 1의 추출 혼합물	1.0
글리세린	5.0
에탄올	3.0
폴리옥시에칠렌경화피마자유	0.5
폴리솔페비트80	0.5
부틸렌글라이콜	3.0
카르복실비닐폴리머	0.5
방부제, 향료	적량
정제수	잔량

제형예 2: 영양 에센스의 제조

실시예 1에서 얻은 추출 혼합물을 함유하는 수분 크림을 하기의 표 4에 나타낸 바와 같은 조성 성분 및 조성비에 따라 통상적인 방법으로 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예 1의 추출 혼합물	1.0
글리세린	7.0
부틸렌글라이콜	3.0
글리세릴스테아레이트/피이지-100스에아레이트	1.0
폴리솔베이트60	0.5
소르비탄 스테아레이트	0.5
스쿠알란	3.0
카프릴릭/카프릭 트리그리세라이드	5.0
쉬어버터	2.0
스테아릴 알코올	0.5
수테아린산	0.5
카르복실비닐폴리머	0.2
아르기닌	0.2
방부제, 향료	적량
정제수	잔량

제형예 3: 보습 크림

실시예 1에서 얻은 추출 혼합물을 함유하는 보습 크림을 하기의 표 5에 나타낸 바와 같은 조성 성분 및 조성비에 따라 통상적인 방법으로 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예 1의 추출 혼합물	1.0
글리세린	7.0
부틸렌글라이콜	5.0
글리세릴스테아레이트/피이지-100스에아레이트	2.0
폴리솔베이트60	0.5
소르비탄 스테아레이트	0.5
피토스쿠알란	5.0
호호바 오일	3.0
카프릴릭/카프릭 트리그리세라이드	10.0
알로에버터	3.0
밀납	1.0
스테아릴 알코올	0.5
베헤릴 알코올	0.5
스테아린산	0.5
카르복실비닐폴리머	0.2
잔탄검	0.2
아르기닌	0.3
디메치콘	0.5
베타글루칸	0.2
방부제, 향료	적량
정제수	잔량

Claims

흑호두나무, 회화나무 및 소나무의 추출 혼합물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부 광노화 또는 피부 염증 개선용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매로 추출되는 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부 광노화 또는 피부 염증 개선용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 혼합물은 흑호두나무, 회화나무 및 소나무의 추출물을 1~6:1~6:1~6의 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부 광노화 또는 피부 염증 개선용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출 혼합물의 함량은 화장료 조성물 총 중량에 대해 0.001 ~ 50.0 중량%인 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부 광노화 또는 피부 염증 개선용 화장료 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 추출 혼합물은 세포내 활성산소(ROS)를 억제하는 항산화능을 가지며, 시너지(synergy)적으로 MMP-1과 IL-1β를 억제함으로써 피부 콜라겐 분해 효소 및 염증 유발 인자 발현을 억제하여 결과적으로 피부 노화 및 염증을 개선할 수 있는 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부 광노화 또는 피부 염증 개선용 화장료 조성물
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 에센스, 영양 오일, 보습 오일, 영양 크림, 파우더, 팩, 파운데이션, 메이크업 베이스, 클렌징, 젤, 로션 및 연고로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화장료 제형인 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부 광노화 또는 피부 염증 개선용 화장료 조성물