KR102101936B1 - 의료용 임플란트 표면 개질용 조성물 및 그에 의해 표면 개질된 의료용 임플란트 - Google Patents

의료용 임플란트 표면 개질용 조성물 및 그에 의해 표면 개질된 의료용 임플란트 Download PDF

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Abstract

의료용 임플란트 표면 개질용 조성물 및 그에 의해 표면 개질된 의료용 임플란트에 관한 것으로, 일 양상에 따른 의료용 임플란트에 의하면, 높은 결합 안정도로 이타콘산을 의료용 임플란트의 표면에 결합시킬 수 있을 뿐만 아니라, 이식 부위에서의 섬유화 억제 및 염증 반응 억제 활성을 갖는 효과가 있다.

Description

의료용 임플란트 표면 개질용 조성물 및 그에 의해 표면 개질된 의료용 임플란트{Composition for suface modification of medical implants and suface modified medical implants using the same}
의료용 임플란트 표면 개질용 조성물 및 그에 의해 표면 개질된 의료용 임플란트에 관한 것이다.
치료 또는 성형의 목적으로, 임플란트, 치과용 임플란트, 스텐트, 나사, 골 대체물 등의 의료용 임플란트를 삽입한다. 하지만, 이 의료용 임플란트는 체내에 삽입 되었을 때, 외부 물질로 체내에 인식되어 출혈과 혈액 손실을 방지하기 위해 응고기전이 활성화되거나 이물 반응이 발생한다. 또한 의료용 이식물은 영구적으로 생체조직과 접촉하게 되므로 표면의 적합성과 생체내 친화성 모두 가져야 한다
따라서 의료용 임플란트의 표면을 개질 시키는 기술과 생체활성물질을 고정화 시키는 유효한 방법이 요구된다.
한편, 최근에 이타콘산이 미생물의 에너지 대사경로의 중요 효소인 이소시트르산 분해효소를 억제하여 대식세포의 항균 활성에 기여한다고 보고된 바 있다.
이에 본 발명자들은, 이타콘산을 이용하여 의료용 임플란트의 이식 부위에의 섬유화 억제 및 염증 반응 억제를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 이타콘산(Itaconic acid)을 함유하는 의료용 임플란트 표면 개질용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 이타콘산으로 표면 개질된 의료용 임플란트를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 의료용 임플란트를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 이타콘산(Itaconic acid)을 함유하는 의료용 임플란트 표면 개질용 조성물을 제공한다.
본 명세서에 있어서, 상기 이타콘산은 아래 화학식 1로 표시되는 것일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112017103236175-pat00001
상기 조성물은 젤라틴을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "젤라틴(gelatin)"은 동물의 뼈, 연골, 가죽 등 결합조직의 주요 단백질 성분인 콜라겐의 부분적인 가수분해에 의해 얻어지는 단백질을 의미할 수 있다. 상기 젤라틴은, 순수 젤라틴 외에, 젤라틴 유도체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 젤라틴 유도체는 프탈화 젤라틴, 에스터화 젤라틴, 아미드화 젤라틴, 또는 포르밀화 젤라틴 중에서 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다. 젤라틴과 관련하여, 그의 종류 (원천)은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 포유류, 어류, 예를 들면, 소 뼈, 소 피부, 돼지 뼈, 돼지 피부 등으로부터 유래된 다양한 젤라틴을 사용할 수 있다. 또한, 상기 젤라틴은 분자량이 10,000 내지 30,000인 것일 수 있다.
상기 젤라틴은 가교된 것일 수 있다. 또한, 상기 젤라틴과 이타콘산은 화학적으로 결합된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 파우더의 형태로 제공될 수 있다.
또 다른 양상은 이타콘산으로 표면 개질된 의료용 임플란트를 제공한다.
구체적으로, 의료용 임플란트로서, 상기 임플란트의 표면의 적어도 일부분에 이타콘산(Itaconic acid)이 결합되어 표면 개질된 것인 의료용 임플란트를 제공하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 "용어 표면 개질"은 입자표면의 화학적 구조와 물리적 구조를 바꾸는 것을 의미할 수 있다.
상기 의료용 임플란트는 젤라틴이 추가적으로 결합된 것일 수 있다. 상기 젤라틴은 가교된 것이고, 이타콘산을 통해 임플란트의 표면에 결합되어 있는 것일 수 있다.
상기 이타콘산 및 젤라틴은 나노입자의 형태이거나, 폴리머의 형태일 수 있다.
상기 의료용 임플란트의 표면의 적어도 일부분은 아미노기가 도입된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 의료용 임플란트의 표면은 이타콘산의 결합을 위해 실란화된 것일 수 있다. 상기 실란화를 위한 아미노실란 화합물은 아미노실란 화합물은 3-아미노프로필트라이에톡시실란 (3-aminopropyltriethoxysilane, APTES), (3-아미노프로필)-테트라에틸오토실리케이트(3-aminopropyl)-tetraethylorthosilicate, [3-(2-아미노에틸아미노)프로필]트리메톡시실란([3-(2-aminoethylamino)propyl]trimethoxysilane), 3-(2-(2-아미노에틸아미노)에틸아미노]프로필트리메톡시실란(3-(2-(2-aminoethylamino)ethylamino)propyltrimethoxysilane), 또는 이들의 조합일 수 있다.
또한, 상기 이타콘산은 임플란트 표면의 고정화 화합물을 통해 임플란트의 표면과 직접적으로 결합된 것일 수 있다. 상기 고정화 화합물의 예는 비오틴, 아비딘, 스트렙트아비딘, 폴리 L-리신, 티올기를 갖는 화합물, 아민기를 갖는 화합물, 알코올기를 갖는 화합물, 카르복실기를 갖는 화합물, 아미노기를 갖는 화합물, 설퍼기를 갖는 화합물, 알데히드기를 갖는 화합물, 카르보닐기를 갖는 화합물, 숙신이미드기를 갖는 화합물, 말레이미드기를 갖는 화합물, 에폭시기를 갖는 화합물, 및 이소티오시아네이트기를 갖는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함할 수 있다. 아미노기를 갖는 화합물의 예에는, 3-아미노프로필트리메톡시실란, N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란 (EDA), 트리메톡시실릴프로필디에틸렌트리아민 (DETA), 3-(2-아미노에틸아미노프로필) 트리메톡시실란, 3-아미노프로필트리에톡시실란가 포함될 수 있고, 알데히드기를 갖는 화합물에는 글루타르알데히드가 포함될 수 있다. 티올기를 갖는 화합물의 예에는 4-메르캅토프로필트리메톡시실란(MPTS)가 포함될 수 있다. 또한, 에폭시기를 갖는 화합물의 예에는, 3-글리시드옥시프로필트리메톡시실란, 이소티오시아네이트기를 갖는 화합물의 예에는, 4-페닐렌디이소티오시아네이트(PDITC), 숙신이미드 및 말레이미드기를 갖는 화합물의 예에는, 디숙신이미딜 카르보네이트 (DSC) 또는 숙신이미딜 4-(말레이미드페닐) 부틸레이트(SMPB)가 포함될 수 있다.
상기 의료용 임플란트는 생체적합성 소재일 수 있다. 상기 생체적합성 ㅅ소재의 예는 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 팔라듐(Pd), 구리(Cu), 강철(steel), 탄탈륨(Ta), 마그네슘(Mg), 니켈(Ni), 크롬(Cr), 철(Fe), 니티놀합금(NiTi), 코발트-크롬 합금(CoCr) 갈륨비소(GaAs), 티타늄(Ti), 폴리락트산, 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤), 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스테르, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드), 폴리테트라플루오르에틸렌 (polytetrafluoroethylene), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리우레탄(polyurethane), 니트로셀룰로스(nitrocellulose), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리에틸렌 텔레프탈레이트(PET), 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리에테르 에테르 케톤(PEEK), 산화규소(SiO2), 산화티타늄(TiO2), 산화알루미늄(Al2O3), 산화니오븀(Nb2O5)을, 실리콘, 실리콘 고무, 및 유리로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 소재를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 의료용 임플란트는 유방 임플란트, 척추 임플란트, 치과 임플란트, 심혈관 임플란트, 심장 임플란트, 스텐트, 인공관절, 인공 골두, 및 세포 배양기구로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 표면 개질된 의료용 임플란트는 물 접촉각이 20 내지 90 °, 25 내지 85 °, 25 내지 80 °, 25 내지 70 °, 30 내지 60 °또는 30 내지 40 °일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 표면 개질된 의료용 임플란트는 표면 개질 전에 비해, 이식 부위 섬유화 억제능 또는 염증반응 억제능이 증가된 것일 수 있다.
또 다른 양상은 의료용 임플란트 표면의 적어도 일부분을 기능화하는 단계; 및 상기 기능화된 의료용 임플란트의 표면에 이타콘산(Itaconic acid)을 결합시키는 단계를 포함하는 의료용 임플란트를 표면 개질하는 방법을 제공한다.
상기 기능화 단계는 이타콘산 및/또는 젤라튼을 임플란트의 표면에 결합시키기 위한 과정일 수 있다. 상기 기능화는 상기한 바와 같이, 아미노기를 도입하는 단계, 또는 고정화 화합물로 기능화하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 이타콘산을 결합시키는 단계는 젤라틴을 추가적으로 결합시키는 것일 수 있다. 상기 단계는 이타콘산 및 젤라틴 복합체를 제조한 후 결합시키거나, 이타콘산을 결합시킨 후 젤라틴을 결합시키거나, 젤라틴을 결합시킨 후 이타콘산을 결합시키는 단계를 포함할 수 있다.
일 양상에 따른 의료용 임플란트 표면 개질용 조성물 및 그에 의해 표면 개질된 의료용 임플란트에 의하면, 높은 결합 안정도로 이타콘산을 의료용 임플란트의 표면에 결합시킬 수 있을 뿐만 아니라, 이식 부위에서의 섬유화 억제 및 염증 반응 억제 활성을 갖는 효과가 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 이타콘산으로 표면 개질된 의료용 임플란트의 제조 과정을 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 2는 일 구체예에 따른 이타콘산 및 젤라틴으로 표면 개질된 의료용 임플란트의 제조 과정을 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 3은 일 구체예에 따른 이타콘산 및/또는 젤라틴 표면 개질된 임플란트의 접촉각을 나타낸 그래프이다.
도 4는 일 구체예에 따른 이타콘산 및/또는 젤라틴 표면 개질된 임플란트의 주사전자현미경 이미지이다.
도 5는 일 구체예에 따른 이타콘산 및/또는 젤라틴 표면 개질된 임플란트의 ATR-FTIR 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 일 구체예에 따른 이타콘산 및/또는 젤라틴 표면 개질된 임플란트의 단백질 흡수 정도를 확인한 그래프이다.
도 7은 일 구체예에 따른 이타콘산 및/또는 젤라틴 표면 개질된 임플란트의 열 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 8은 일 구체예에 따른 이타콘산 및/또는 젤라틴 표면 개질된 임플란트의 세포 배양 결과를 관찰한 광학현미경 사진이다.
도 9는 일 구체예에 따른 이타콘산 및/또는 젤라틴 표면 개질된 임플란트에서의 세포 증식률을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 일 구체예에 따른 이타콘산 및/또는 젤라틴 표면 개질된 임플란트에서의 세포 생존률을 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 11은 일 구체예에 따른 이타콘산 및/또는 젤라틴 표면 개질된 임플란트에서의 세포 부착 패턴을 분석한 현미경 사진이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 이타콘산(Itaconic Acid, IA)으로 표면 개질된 의료용 임플란트의 제조
이타콘산으로 표면 개질된 의료용 임플란트는 도 1에 나타낸 바와 같이 제조하였다.
구체적으로, PDMS(polydimethylsiloxane) 기판(Sylgard® 184 silicone elastomer kit, Dow Corning, USA)을 산소 플라즈마(CUTE-1B, Femto Science, USA)로 1분간 처리하여 PDMS 표면에 하이드록실기(-OH))를 부착시켰다. 이후에, 3-아미노프로필 트리에톡시실란(APTES)를 이용하여 60 ℃에서 2시간 동안 기판의 표면을 실란화 시켰다. 다음으로, 50 mmol, 또는 150 mmol의 이타콘산(IA, analytical grade, assay ≥99%, MW: 130.10 g/mol, density: 1.573 g/mL at 25°C (lit.), Sigma-Aldrich, South Korea)을 1-에틸-3-(3-디메틸아미노)프로필 카르보디이미드 (1-ethyl-3-(3-dimethylamino) propyl carbodiimide, EDC) 및 N-히드록시 숙신이미드 (N-hydroxy succinimide, NHS)(EDC/NHS)의 존재하에서, 60 ℃에서 2시간 동안 반응시켜 이타콘산을 PDMS 기판의 표면에 결합시켰다. 이후에, EDC/NHS 잔여물을 제거한 후 12시간 동안 건조시켜, 이타콘산으로 표면 개질된 의료용 임플란트(이하에서 'IA-PDMS'라 함)를 제작하였다.
실시예 2. 이타콘산 및 젤라틴으로 표면 개질된 의료용 임플란트의 제조
이타콘산 및 젤라틴(IA-GT)으로 표면 개질된 의료용 임플란트는 도 2에 나타낸 바와 같이 제조하였다.
구체적으로, 이타콘산 및 젤라틴 폴리머를 제조하기 위해, 젤라틴 타입 B(소 피부 유래, Bloon 75) 파우더를 DPBS에 혼합한 후, 135 내지 140 ℃에서 16시간 동안 용해시켰다. 이후에, 용해된 젤라틴 타입 B에 50 mmol의 EDC와 50 mmol NHS 용액을 혼합한 후, 100 mmol의 이타콘산을 넣고 2시간 동안 반응시켰다. 추가적으로, 상기 혼합물에 DPBS를 첨가하여 60 ℃에서 30분간 젤라틴과 이타콘산의 반응을 종결시켰다. 최종 혼합액을 셀룰로오스 멤브레인(MWCO 6-8kD)에 투석하여 반응하지 않은 이타콘산, EDC/NHS, 및 염을 제거하였다. 이후에, 48시간 동안 -80℃에서 동결건조하여 IA-GT 파우더를 수득하였다.
상기 수득한 IA-GT 파우더를 상기 실시예 1.과 동일하게 PDMS 기판의 표면 상에 결합시켜, 이타콘산 및 젤라틴으로 표면 개질된 의료용 임플란트(이하에서 'IA-GTpoly-PDMS'라 함)를 제작하였다. 간략하게는 IA-GTpoly-0.25wt% 의 표면 개질된 PDMS를 제작하기 위해서는 DW + EDC 10mmol + NHS 10mmol를 사용하였고, IA-GTpoly-0.50wt%의 표면 개질된 PDMS를 제작하기 위해서는 DW + EDC 20 mmol + NHS 20mmol를 사용하였고, 이것을 제외하고는 상기 실시예 1.과 동일하게 표면 개질된 PDMS를 제조하였다.
실험예 1. 이타콘산 및/또는 젤라틴 표면 개질된 임플란트 특성 분석
1.1. 친수성 분석
상기 실시예 1 및 2에서 제작한 임플란트의 표면에 증류수 4 ul을 떨어뜨린 후, 실온에서 접촉각을 laboratory-made contact angle goniometer with a charge-coupled device camera(IMT 3, IMT Solutions))를 이용하여 측정하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 일 구체예에 따른 이타콘산 및/또는 젤라틴 표면 개질된 임플란트의 접촉각을 나타낸 그래프이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 이타콘산 및/또는 젤라틴로 표면 개질한 PDMS가 기존 PDMS(대조군)와 비교하였을 때 작은 접촉각을 가짐을 알 수 있었다.
1.2. 표면 형태 분석
상기 실시예1 및 2에서 제작한 임플란트의 표면을 주사전자현미경(SEM)(SEM, S-3400N, Hitachi, Tokyo, Japan)으로 관찰하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4는 일 구체예에 따른 이타콘산 및/또는 젤라틴 표면 개질된 임플란트의 접촉각을 나타낸 주사전자현미경 이미지이다.
도 4에 나타낸 바와 같이, PDMS의 표면에 백색의 개질층이 관찰됨을 확인할 수 있었다.
1.3. 표면 화학 결합 분석
임플란트 표면의 화학 결합을 확인하기 위해, ATR(Attenuated total reflection)-FTIR 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1 및 2에서 제작한 임플란트를 FT-IR Spectroscopy (Frontier spectrophotometer equipped with and attenuated total reflection (ATR-FTIR) 모듈 (Nicolet 6700, Thermo Scientific, USA)를 이용하여 각 스펙트럼은 실온에서 4 cm-1의 해상도로 400 cm-1에서 4000 cm-1까지 기록하고 200 회의 스캔을 평균 처리하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5는 일 구체예에 따른 이타콘산 및/또는 젤라틴 표면 개질된 임플란트의 ATR-FTIR 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 카르보닐기의 피크 (1,640 cm-1 for IA-50mmol, 1,648 cm-1 for IA-150mmol, 1,637 cm-1 for IA-GTpoly-0.25wt% & 1,646 cm-1 for IA-GTpoly-0.50 wt%)가 관찰되었으며 이를 통하여 IA가 PDMS에 결합된 것을 확인하였다. 또한, 니트릴기의 피크 (1,542 cm-1 for IA-50mmol, 1,553 cm-1 for IA-150mmol, 1,536 cm-1 for IA-GTpoly-0.25wt% & 1,535 cm-1 for IA-GTpoly-0.50 wt%)의 관찰을 통하여 아마이드 결합을 확인하였다.
1.4. 단백질 흡수능 분석
상기 실시예 1 및 2에서 제작한 임플란트의 표면의 단백질 흡수능을 분석하였다.
구체적으로, BSA (Bovine Serum Albumin)(4.5 mg/mL)를 DPBS에 용해시켰다. 별도로, IA-PDMS 및 IA-GTpoly-PDMS 표면 (크기 : 1 cm2)을 고온 교반 판 (hot stirring plate)에서 단백질 용액 37 ℃, 200 RPM의 조건에서 1 시간 동안 일정하게 저어 주며 배양하였다. 깨끗한 DPBS로 2 회 세척 한 후, BSA 단백질 - 배양된 bare, IA-conjugated 및 IA-GTpoly conjugated PDMS 표면 (3 중의)을 DW 및 작동 시약 혼합물을 함유하는 24 웰 플레이트로 옮겼다. 웰 플레이트를 37 ℃에서 30 분간 배양 한 후 각 샘플의 흡광도를 분석 하였다. 흡착된 단백질의 양은 Micro BCA™ 단백질 분석 키트를 사용하여 제조사의 지시에 따라 정량화하였다. 흡광도는 마이크로 플레이트 분광 광도계 (microplate spectrophotometer)를 사용하여 570 nm의 고정 파장으로 측정 하였다. 모든 값은 평균 ± 표준 편차로 표시하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6은 일 구체예에 따른 이타콘산 및/또는 젤라틴 표면 개질된 임플란트의 단백질 흡수 정도를 확인한 그래프이다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 이타콘산 및/또는 젤라틴 표면 개질된 임플란트는 대조군에 비해 강한 단백질 흡수 억제가 관찰됨을 확인할 수 있었다.
1.5. 결합 안정도 분석
이타콘산 및/또는 젤라틴의 결합 안정도를 분석하기 위해 상기 실시예 1 및 2에서 제작한 임플란트의 표면에 열처리를 수행하였다.
구체적으로, 열처리는 시료로는 2 cm2 크기의 IA-GTpoly-PDMS (IA-GTpoly-0.50wt%)를 사용하였고, 120 ℃에서 1시간 동안 총 3번의 열처리를 수행하였다. 이후에, 상기 실험예 1.1과 동일한 방법으로 접촉각을 측정하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7은 일 구체예에 따른 이타콘산 및/또는 젤라틴 표면 개질된 임플란트의 열 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 3회의 열처리 과정 후, 각각의 접촉각이 조금씩 증가였으나 이타콘산 및/또는 젤라틴의 결합 안정도의 변화는 관찰되지 않았음을 확인할 수 있었다.
실험예 2. 이타콘산 및/또는 젤라틴 표면 개질된 임플란트 활성 분석
2.1. 인 비트로(In vitro) 세포 배양능 분석
2.1.1. 세포 증식률 및 생존률 분석
상기 실시예 1 및 2에서 제작한 임플란트에서의 세포 증식률 및 생존률을 분석하기 위해, NIH3T3 마우스 섬유아세포주를 사용하였다.
구체적으로, 상기 섬유아세포주를 1 cm x 1 cm 크기의 PDMS 표면에 20,000 cell/ml의 세포를 37 ℃에서 배양하였다. 배양 시작 후, 12시간, 24시간 및 48시간에 세포 증식률 및 생존률을 분석하였다. 세포 증식률은 광학 현미경(Euromex IF-Series, Netherlands)으로 관찰하거나 트립신(GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, USA.)을 세포에 처리한 후, 세포 수를 카운팅 하였고, MTT 어세이(Cell Biolabs, INC, USA)를 통해 세포 수를 카운팅 함으로써 측정하였다. 상기 광학 현미경 관찰 결과는 도 8에 나타내었고, 트립신 처리 후 세포 수 카운팅 결과 및 MTT 어세이 결과는 도 9에 나타내었다.
또한, 세포 생존률은 Live/Dead 분석법(L-3224, Invitrogen, LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells (Molecular Probes®))을 통해 관찰하였다. 구체적으로, Live/Dead 분석 용액을 제조하기 위해 15 ml 튜브에 PBS 10ml를 첨가하고, 2 mM EthD-1 및 4 mM 칼세인 AM을 각각 20 ul, 및 5 ul 첨가하였다. 이후에, 알루미늄 호일로 상기 튜브를 감싼 이후에, 파이펫팅으로 잘 혼합한 후 냉장보관하였다. 또한, 배양된 세포를 20분동안 PBS에 넣어 세척하였고, PBS 제거 후, 상기 제조된 Live/Dead 분석 용액을 세포 시료에 첨가하였다. 이후에, 30분동안 인큐베이터에서 배양하였고, 형광 및 공촛점 현미경으로 사진을 촬영하였고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 8은 일 구체예에 따른 이타콘산 및/또는 젤라틴 표면 개질된 임플란트의 세포 배양 결과를 관찰한 광학현미경 사진이다.
도 9는 일 구체예에 따른 이타콘산 및/또는 젤라틴 표면 개질된 임플란트에서의 세포 증식률을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 일 구체예에 따른 이타콘산 및/또는 젤라틴 표면 개질된 임플란트에서의 세포 생존률을 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 이타콘산 및/또는 젤라틴 표면 개질된 임플란트에서 세포 배양이 잘 되고 있음을 알 수 있었다.
또한, 도 9에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 이타콘산 및/또는 젤라틴 표면 개질된 임플란트에서는 대조군과 유사하거나, 증가된 세포 증식율을 나타냄을 알 수 있었다.
또한, 도 10에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 이타콘산 및/또는 젤라틴 표면 개질된 임플란트에서는 표면 개질되지 않은 대조군 PDMS와 비교하여 세포 생존률이 높은 것을 알 수 있었다.
2.1.2. 세포 부착 패턴 분석
세포 부착 패턴을 분석하기 위하여, 세포를 Rhodamin/DAPI 염색(Invitrogen, ThermoFisher Scientific, USA)로 염색하였다. 이를 형광 현미경(CKX-41, OLYMPUS, Japan)으로 관찰하였고, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11은 일 구체예에 따른 이타콘산 및/또는 젤라틴 표면 개질된 임플란트에서의 세포 부착 패턴을 분석한 현미경 사진이다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 이타콘산 및/또는 젤라틴 표면 개질된 임플란트에서 세포가 더 잘 spread 되는 것을 알 수 있었다.
2.2. 인 비보( In vivo ) 활성 분석
2.2.1. 이식 부위 섬유화 분석
상기 실시예 1 및 2에서 제작한 임플란트를 동물 모델에 이식하여 이식 부위에서의 섬유화 여부를 관찰하였다.
우선, 동물 모델은 각 그룹당 4마리의 8주령 Sprague-Daley Rat(Young Bio, KOREA)를 사용하였다. 동물실험은　분당서울대학교병원　동물실험윤리위원회(IACAU)로부터 최종 승인　 후 시행되었다(승인번호: BA1608-206/045-01). 실험 그룹은 아래의 5그룹으로 나누어 실험하였다. 임플란트 이식 시 상처 부위의 염증 및 감염을 방지하기 위해 베타딘을 이용하여 소독을 수행하였다. 소독은 시술 전 및 시술 후 두차례에 걸쳐 진행하였다. 이식을 위해 등 부위에 2cm의 절개 후, 피하 포켓을 제작하였으며, 포켓에 각 그룹의 임플란트를 이식하였다. 이식 후 상처 부위는 Nylon 4/0 (Ethicon)을 이용하여 봉합하였으며, 최종 베타딘을 이용하여 상처부위를 소독하고, 거즈를 이용하여 드레싱을 하였다.
하기 5 그룹의 임플란트를 한 마리의 랫드에 모두 이식하였고, 이식 후 2, 4, 및 8주 후에 랫드를 안락사 시켜, 이식 부위의 조직을 수득하였다.
그룹 1(대조군): 아무처리도 하지 않은 PDMS
그룹 2(IA 50 mmol(low) PDMS): 저농도의 IA로 표면 처리한 PDMS
그룹 3(IA 150 mmol(high) PDMS): 고농도의 IA로 표면 처리한 PDMS
그룹 4(IA-GT 0.25%(low) PDMS): 젤라틴에 IA를 화학적 결합한 것을 저농도로 표면 처리한 PDMS
그룹 5(IA-GT 0.50%(high) PDMS): 젤라틴에 IA를 화학적 결합한 것을 고농도로 표면 처리한 PDMS
섬유화 정도를 평가하기 위해, i) 캡슐 두께 ii) 섬유아세포 수 iii)근섬유아세포 수를 정량화를 정량화하였다.
구체적으로, 헤타톡실린&에오신(Hematoxylin &　Eosin) 염색을 통해 캡슐 두께를 분석하였다. 캡슐의 두께는 피하 근육 하단부로 축적되는 콜라겐 및 조직 층을 측정하였으며 이미지 상 캡슐이 가장 얇게 형성되는 부위를 측정하여 분석을 진행하였고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.
캡슐 두께 결과(단위: ㎛)
주차 Control IA_Low IA_High IA_GT Low IA_GT High
2 813 ± 260.9 514.8 ± 302.3 487.9 ± 45.8 403.3 ± 145 323.2 ± 158.5
4 1060.6 ± 83.7 527.9 ± 110.6 621.7 ± 70 506.6 ± 73.1 544.8 ± 60.5
8 1426.1 ± 250.6 789.1 ± 284.9 786.7 ± 210.5 774 ± 136.9 528.6 ± 183.3
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 2, 4, 및 8 주 모두에서 대조군 그룹과 비교하여 IA-PDMS와 IA-GT-PDMS 그룹 모두에서 캡슐 두께가 감소하는 것을 확인함으로써, IA에 의하여 섬유화가 감소하는 것을 알 수 있었다. 특히, IA-GT-PDMS high에서 가장 얇은 캡슐 두께가 관찰 되었고, 이는 대조군 대비 IA-GT high PDMS의 캡슐 두께가 63% 정도 감소하는 것이다(대조군: 1426μm (100%) 대비 IA-GT high: 528μm(37%)).
조직에서의 섬유아세포의 수를 평가하기 위해 면역 염색을 시행하였으며, 섬유아세포의 특이 인자인 Vimentin에 결합하는 항체(ab92546, Abcam, CA, USA)를 이용하여 섬유아세포만 특이적으로 염색하고 형광을 발현하는 세포만을 선택적으로 평가하여 세포 수를 확인하였다. 구체적으로, 실험의 진행을 위해 정해진 기한 후 조직의 생검을 진행하였으며, 생검된 조직을 Parraffin embedded 기법을 통해 슬라이드로 제작하였다. 슬라이드의 전처리(Deparaffine, Rehydration) 후 섬유아세포 특이 인자에 결합하는 면역인자를 사용하였으며, 각 주차별로 특이 인자의 결합에 의해 발현되는 색상과 세포핵의 염색이 이루어지는 DAPI를 선택적으로 셈하여 분석하였고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
섬유아세포 수 (단위: n)
주차 Control IA_Low IA_High IA_GT Low IA_GT High
2 36.6 ± 13.41 32 ± 4.73 24.17 ± 4.88 28.83 ± 5.81 27.17 ± 6.15
4 27.5 ± 11.48 31.67 ± 10.93 23.67 ± 7.45 29.67 ± 5.16 27.17 ± 5.67
8 39 ± 11.83 30.17 ± 13.38 21 ± 5.52 23.8 ± 7.66 20.75 ± 5.06
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 이식 2주 및 4주까지는 전체 그룹에서 대조군과 비교하여 모두 약간 낮은 수의 섬유아세포를 확인하였으나 이 차이가 유의하지 않았다. 그러나, 이식 8주 후 그룹에서는 IA high와 IA-GT high 그룹에서 대조군과 비교하여 적은 섬유아세포가 관찰되었다 (p<0.05). 이는 대조군 대비 IA-GT high PDMS의 콜라겐 밀도가 50% 정도 감소한 효과이다 ( 대조군: 39 (100%) 대비 IA high: 21(53.8%) / IA-GT high: 20.75(53.2%)).
조직에서의 근섬유아세포의 수를 평가하기 위해 면역 염색을 시행하였으며 근섬유아세포의 특이 인자인 alpha-SMA에 결합하는 항체를 이용하여 근섬유아세포만 특이적으로 염색하고 형광을 발현하는 세포만을 선택적으로 평가하여 세포 수를 확인하였다. 구체적으로, 실험의 진행을 위해 정해진 기한 후 조직의 생검을 진행하였으며, 생검된 조직을 Parraffin embedded 기법을 통해 슬라이드로 제작하였다. 슬라이드의 전처리(Deparaffine, Rehydration) 후 근섬유아세포 특이 인자에 결합하는 면역인자를 사용하였으며, 각 주차별로 특이 인자의 결합에 의해 발현되는 색상과 세포핵의 염색이 이루어지는 DAPI를 선택적으로 셈하여 분석하였고, 그 결과를 표 3에 나타내었다.
근섬유아세포 수 (단위: n)
주차 Control IA_Low IA_High IA_GT Low IA_GT High
2 46 ± 6.03 41.17 ± 4.12 29.5 ± 5.17 39.5 ± 5.68 34.33 ± 7.5
4 62.5 ± 14.03 49.5 ± 12 32 ± 10.53 37.17 ± 8.21 41.17 ± 1.94
8 40 ± 11.73 37.5 ± 7.79 29.83 ± 10 33 ± 6.72 27.67 ± 8.78
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 이식 2주 후 IA high 그룹에서 유의하게 근섬유아세포의 감소가 관찰되었다. 또한, 이식 4주 후에는 IA low 그룹을 제외한 모든 실험군 (IA high, IA-GT low, IA-GT hige)에서 대조군과 비교하여 유의하게 근섬유아세포가 감소되는 것을 확인하였다 (p<0.05). 8주 후 그룹에서는 대조군과 비교하여 IA high 와 IA-GT high 그룹에서 근섬유아세포의 수가 감소하는 것을 확인하였다. 이는 대조군 대비 IA-GT high PDMS의 콜라겐 밀도가 50% 정도 감소한 효과이다(대조군: 39 (100%) 대비 IA high: 21(53.8%) / IA-GT high: 20.75(53.2%)).
2.2.2. 염증 반응 분석
이식 부위의 염증 반응 분석을 위해 생검한 조직을 Hematoxylin &　Eosin 염색을 수행하였다. 이후에, 염색 조직의 캡슐 형성 부위 내 다핵 세포 (염증 매게 세포)만을 선택하여 Image 소프트웨어를 사용하여 정량하였다. 구체적으로, 생검 된 조직에 대해 헤마톡실린 에오신 염색을 진행하였으며, 조직의 염색 후 다핵세포로 판단되는 세포만을 특이적으로 선별하여 계수하였다. 이렇게 계수한 특이 다핵세포들을 기준으로 Score를 구성하여 이 구성 범위에 맞게 각각의 그룹에서의 염증 반응 스코어를 분석하였고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
염증반응 스코어 (단위: score)
주차 Control IA_Low IA_High IA_GT Low IA_GT High
2 2.48 ± 0.44 1.96 ± 0.15 1.82 ± 0.29 1.58 ± 0.38 1.3 ± 0.31
4 1.98 ± 0.43 1.54 ± 0.27 1.38 ± 0.27 1.37 ± 0.53 1.17 ± 0.43
8 1.35 ± 0.14 1.42 ± 0.4 1.03 ± 0.24 1.05 ± 0.33 1 ± 0.3
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 모든 실험군에서 대조군과 비교하여 염증 반응이 유의하게 감소하는 것을 알 수 있었다.
이상의 결과로, 일 구체예에 따른 이타콘산 및/또는 젤라틴 표면 개질된 임플란트는 대조군에 비해 이식 부위에 섬유화 또는 염증 반응을 감소시키는 것을 알 수 있고, 따라서 의료용 임플란트로서 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있음을 알 수 있다.

Claims (14)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 의료용 임플란트로서,
    상기 임플란트의 표면의 적어도 일부분에 단량체 이타콘산(Itaconic acid)이 하나 이상 결합되어 표면 개질된 것인 의료용 임플란트.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 표면의 적어도 일부분은 이타콘산의 결합을 위해 실란화된 것인 임플란트.
  5. 청구항 3에 있어서, 젤라틴이 상기 이타콘산에 추가적으로 결합된 것인 의료용 임플란트.
  6. 청구항 3에 있어서, 상기 이타콘산은 임플란트 표면의 고정화 화합물을 통해 임플란트 표면과 직접적으로 결합된 것인 임플란트.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 고정화 화합물은 비오틴, 아비딘, 스트렙트아비딘, 폴리 L-리신, 티올기를 갖는 화합물, 아민기를 갖는 화합물, 알코올기를 갖는 화합물, 카르복실기를 갖는 화합물, 아미노기를 갖는 화합물, 설퍼기를 갖는 화합물, 알데히드기를 갖는 화합물, 카르보닐기를 갖는 화합물, 숙신이미드기를 갖는 화합물, 말레이미드기를 갖는 화합물, 에폭시기를 갖는 화합물, 및 이소티오시아네이트기를 갖는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것인 임플란트.
  8. 청구항 3에 있어서, 상기 의료용 임플란트는 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 팔라듐(Pd), 구리(Cu), 강철(steel), 탄탈륨(Ta), 마그네슘(Mg), 니켈(Ni), 크롬(Cr), 철(Fe), 니티놀합금(NiTi), 코발트-크롬 합금(CoCr) 갈륨비소(GaAs), 티타늄(Ti), 폴리락트산, 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤), 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스테르, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드), 폴리테트라플루오르에틸렌 (polytetrafluoroethylene), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리우레탄(polyurethane), 니트로셀룰로스(nitrocellulose), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리에틸렌 텔레프탈레이트(PET), 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리에테르 에테르 케톤(PEEK), 산화규소(SiO2), 산화티타늄(TiO2), 산화알루미늄(Al2O3), 산화니오븀(Nb2O5)을, 실리콘, 실리콘 고무, 및 유리로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 소재를 포함하는 것인 임플란트.
  9. 청구항 5에 있어서, 상기 젤라틴은 가교된 것이고, 이타콘산을 통해 임플란트의 표면에 결합되어 있는 것인 임플란트.
  10. 청구항 3에 있어서, 물 접촉각이 20 내지 90 °인 것인 임플란트.
  11. 청구항 3에 있어서, 상기 의료용 임플란트는 유방 임플란트, 척추 임플란트, 치과 임플란트, 심혈관 임플란트, 심장 임플란트, 스텐트, 인공관절, 인공 골두, 및 세포 배양기구로 이루어진 군에서 선택되는 것인 임플란트.
  12. 청구항 3에 있어서, 표면 개질 전에 비해, 이식 부위 섬유화 억제능 또는 염증반응 억제능이 증가된 것인 임플란트.
  13. 의료용 임플란트 표면의 적어도 일부분을 기능화하는 단계; 및
    상기 기능화된 의료용 임플란트의 표면에 단량체 이타콘산(Itaconic acid)을 하나 이상 결합시키는 단계를 포함하는 의료용 임플란트를 표면 개질하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 이타콘산에 젤라틴을 추가적으로 결합시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
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