KR102096557B1

KR102096557B1 - 통증 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR102096557B1
Application number: KR1020180057362A
Authority: KR
Inventors: 민 주오
Original assignee: 포에버 치어 인터내셔널 리미티드
Priority date: 2017-05-20
Filing date: 2018-05-18
Publication date: 2020-04-03
Also published as: JP7332841B2; EP3403674B1; DK3403674T3; TWI729290B; TW201900173A; AU2018203501A1; CA3005375C; ZA201803320B; CA3005375A1; ES2886855T3; AU2018203501B2; EP3403674A1; IL259442A; US11541060B2; JP2019052094A; US20200268766A1; US20180333420A1; CN108743589B; CN108743589A; KR20180127248A

Abstract

본 발명은 오피오이드 유도된 내성 및 중독의 치료시 약제의 제조에 사용하는 약학 조성물의 새로운 용도, 특히 오이오이드 유도된 내성 및 중독의 치료시 약제의 제조에 사용하는 AC1 억제제 NB001 및 AC1&8 혼합 억제제 NB010 및 NB011의 용도를 개시한다.

Description

통증 치료용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR TREATING PAIN}

본 발명은 오피오이드-유도된 내성 및 중독의 치료시 약제를 제조하기 위한 약학 조성물의 새로운 용도에 관한 것으로, 특히 오피오이드-유도된 내성 및 중독의 치료시 약제를 제조하기 위한 AC1 억제제 NB001 및 AC1 & 8 혼합된 억제제 NB010 및 NB011의 용도에 관한 것이다.

"오피에이트(opiate)"라는 용어는 예를 들어, 모르핀, 코데인 및 모르핀의 많은 반합성 동류물(congener)과 같은 아편으로부터 유도된 약학적으로 활성적인 알칼로이드를 나타내기 위해 사용되었다. 모르핀 유사(morphine-like) 작용을 갖는 펩타이드 화합물의 분리 후, 오피오이드(opioid)라는 용어는 일반적으로 모르핀 유사 작용을 갖는 모든 약물을 포괄적으로 지칭하기 위해 도입되었다. 오피오이드 중에는 엔돌핀(endorphins), 엔케팔린(enkephalins) 및 다이노핀(dynorphins)과 같은 모르핀 유사 활성을 나타내는 다양한 펩타이드가 포함된다. 그러나, 일부 공급원은 "오피에이트"라는 용어를 일반적인 의미로 사용하며, 이러한 맥락에서 오피에이트 및 오피오이드는 교체 사용가능하다. 또한, 오피오이드라는 용어는 모르핀 유사 약물의 안타고니스트를 칭하기 위해 사용될뿐만 아니라 이러한 제제와 결합하는 리셉터 또는 바인딩 사이트의 특성을 나타내기 위해 사용되었다.

오피오이드는 일반적으로 진통제로 사용되며, 모르핀은 종종 심각한 고통의 일부를 완화시키는 데 사용되지만, 모르핀의 임상적 사용은 진통제 내성, 신체적 의존성 및 중독의 발달로 제한된다. 모르핀의 장기간 투여가 인간과 동물에서 내성을 유도할 수 있지만 μ-리셉터를 감작시키지 않는 것으로 알려져 있다. 대조적으로, 모르핀의 장기간 사용은 아데닐릴 사이클라아제(AC)의 과민증을 유발할 수 있으며, 이는 오피오이드 내성 및 의존성에 기여한다(Nestler, 1997; 2001a, b; 2002). 중뇌(mid-brain) 내에서 복부 피질 영역(ventral tegmental area, VTA)과 중격핵(nucleus accumbens, NAc) 영역(이들 모두 아편 약제를 강화시키는 데 중요하다)과 같은 여러 뇌 영역에서뿐만 아니라, 청반(locus coeruleus) 및 등핵(dorsal nucleus)(아편 회수에 중요함)에서 아데닐릴 사이클라아제 활성의 장기간 변화가 보고되었다(Nestler and Aghajanian, 1997; Jolas et al., 2000; Williams et al., 2001; Chao and Nestler, 2004).

오피오이드 조절에 있어서 AC의 역할이 제안되었지만, 다양한 AC 동위효소의 역할을 정의하는 특정 억제제가 부족하여 연구가 비교적 느리게 진행되었다. 지금까지 중추 신경계와 말초 감각 신경계에서 서로 다른 발현 양상을 보이는 10개의 AC 유전자가 클로닝되었다(Xia and Storm, 1997). 그 중 AC1 및 AC8은 뇌에서 Ca²⁺/칼모듈린에 의해 독점적으로 자극된다. AC1 및 AC8은 VTA, NAc, 청반 및 등핵을 포함하는 다양한 뇌 영역에 널리 분포되어 있다(Zhuo, 2012).

또한, 많은 연구들이 약물 중독에서 CREB를 포함하였다(Guitart et al., 1992; Hyman, 1996; Maldonado et al., 1996; Walters et al., 2001). 웨스턴 블롯 분석은 모르핀 내성 동물에서 CREB 또는 인산화된 CREB(pCREB)의 증가된 발현을 나타내었다(Li et al., 1999; Gao et al., 2004). CREB 돌연변이 마우스는 모르핀 치료가 중단된 후 덜 심각한 금단 증상을 보였다(Maldonado et al., 1996). 또한, 모르핀의 생리적 효과를 본질적으로 매개하는 G 단백질-결합 리셉터 M 오피오이드 리셉터(MOR)는 CRE 요소를 포함하고, CREB 매개 경로를 통해 활성화되는 것이 입증되었다(Min et al., 1994; Nestler, 1997. Lee et al., 2003). 중추 신경계에서 AC1 및 AC8은 뉴런에서 CREB를 조절하기 위해 상류의 신호 전달 단백질에 작용하는 것으로 알려져 있다(Wei et al., 2002; Zhuo, 2012). AC1 및 AC8 녹아웃(KO) 마우스 및 DKO 마우스의 사용을 통해, AC1 또는 AC8 녹아웃 마우스, 또는 DKO 마우스 및 야생 타입 마우스의 모르핀의 진통 효과는 단기간에 차이가 없는 것으로 보고되어 있다(Li et al., 2006). AC1 & 8 DKO 마우스 및 AC8 녹아웃 마우스는 매일 모르핀(10mg/kg 체중) 주사로 감소된 내성이 계속 유도되었다. 지속적으로 모르핀으로 치료한 DKO 마우스에서, 금단 증상은 유의하게 감소했다(Li et al., 2006). AC1 억제제 ST034037을 사용한 최근의 연구에 따르면, AC1 활성은 MOR의 만성적 활성화에 의해 유도된 AC 민감화를 필요로 하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 AC1 억제가 만성적인 모르핀 유도 내성 및 다른 반응을 극복하는 데 유익할 수 있음을 제시한다(Brust et al., 2017).

오피오이드를 사용하여 통증을 치료하는 동안, 효능의 감소는 종종 약리학적 내성 기전(또는 본래 컨디션의 악화)으로 설명되며, 본래의 효능을 유지하기 위해 투여량이 증가되어야 한다. 최근 연구에 따르면 진통 효과를 생산하는 것 외에도 오피오이드는 또한 손상을 촉진하는 생체 내 메커니즘을 활성화시켜 통증에 대한 증가된 신체 민감성, 즉 오피오이드 유발성 통각 과민증(OIH)을 일으키는 것으로 밝혀졌다. 통증에 대한 민감성의 시작은 오피오이드 철수 반응 초기에 관찰되었다. 최근의 증거에 따르면 통증에 대한 민감성은 오피오이드 치료 중에도 발생할 수 있는 것으로 제시된다. 달리 말하면, 오피오이드의 중단 및 오이오이드의 연속된 투여 모두 통증 민감성의 증가를 가져오고, 이는 분명 상충되는 것이다. 따라서, 오피오이드 진통 효과의 감소는 약리학적 내성의 메커니즘뿐만 아니라 OIH(손상을 촉진하는 메커니즘)의 역할을 하는 것으로 보인다. 그 중에서, 민감화 과정과 탈감작 과정이 모두 발생한다. OIH는 내인성 디놀핀(dynorphin), 글루탐산성 시스템(glutamatergic systems), 및 하향 촉진 메커니즘을 포함하는 이의 고유한 세포성 메커니즘을 가지고 있다. 흥미롭게도, OIH의 기전은 신경병성 통증 및 오피오이드 내성의 메커니즘과 크게 중복된다. 예를 들어, 말초 신경 손상 및 반복적인 오피오이드 투여는 동일한 글루탐산성 세포 경로를 활성화시킬 수 있다.

오피오이드 치료 중에 약물 진통 효과의 감소는 약리학적 내성이거나 기존의 통증 상태의 증가로 간주된다. 그러므로, 약물 투여량의 추가는 약물 효과의 재구성을 위해 승인된 유일한 선택으로 취해진다. 그러나, 오피오이드 유발성 통증에 대한 임상 및 실험실 연구소에 의해 제공된 상충되는 증거에 따르면, 발명자는 이 현상에 대한 설명을 재고해야한다. 한편으로, 오피오이드 효능의 감소가 약물 내성 메커니즘과 관련된다면, 투여량을 증가시키는 것은 분명히 비난을 넘어서는 것이며; 반면에 감소가 OIH로 인한 것이라면, 투여량을 맹목적으로 증가시키는 것은 단지 손상을 촉진하는 생체 내 과정을 증가시켜 통증 및 내성을 증가시킨다.

따라서, 오피오이드의 통증 완화를 연장시키고, 진통제 내성, 신체적 의존성 및 임상 적용에서의 중독성을 극복하기 위해 신약 또는 복합 제제의 연구 및 개발이 매우 중요하다.

미국특허공개 제 US2011/0098295호

Brust et al(2017) Identification of a selective small-molecule inhibitor of type 1 adenylyl cyclase activity with analgesic properties. Science signaling 10.

상기 언급된 오피오이드의 진통제 내성, 신체적 의존성 및 중독의 문제의 견지에서, 본 발명은 오피오이드의 장기간 사용으로 인한 진통제 내성, 신체적 의존성 및 중독의 문제를 감소 또는 개선시키기 위한 새로운 약제 또는 조합 제제의 개발에 관한 것으로, 즉 모르핀 및 다른 오피오이드의 장기간 사용으로 인한 추가 반응을 감소시키기 위한 것이다.

오피오이드는 세포에서 cAMP 생성을 활성화시키는 것으로 알려져 있으며, 오피오이드의 장기간 사용은 아데닐릴 효소의 과민증을 유발한다. 또한 cAMP 의존성 신호 전달 경로는 내성, 의존성 및 다른 인자들을 포함한 오피오이드 관련 장기 효과에 중요한 영향을 미친다(Li et al., 2006; Brust et al., 2017 참조).

상기 발명을 완성하기 위해, 본 발명자들은 놀랍게도, 본 발명의 NB001, NB010 및 NB011의 3가지 화합물을 사용하여 오피오이드의 장기간 사용에 의한 추가 반응을 감소시킬 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 NB001, 즉 5-((2-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)에틸)아미노)펜탄-1-올은 하기 구조를 갖는다:

5-((2-(6-아미노-9 H -퓨린-9-일)에틸)아미노)펜탄-1-올

본 발명의 NB010, 즉 6-아미노-9-(2-p-톨릴옥시-에틸)-9H-퓨린-8-티올은 하기 화학 구조를 갖는다:

6-아미노-9-(2-p-톨릴옥시-에틸)-9H-퓨린-8-티올

본 발명의 NB011, 즉 4-(9H-퓨린-6-일)모르폴린(또한 6-모르폴린-4-일-7H-퓨린으로도 알려짐)은 하기 화학 구조를 갖는다:

6-모르폴린-4-일-7H-퓨린

본 발명에 따르면, 다음의 내용이 제공된다:

(1) 오피오이드, 및

NB001, NB010 또는 NB011로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나

를 포함하는 통증 치료용 약학 조성물로서,

상기 NB001, 즉 5-((2-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)에틸)아미노)펜탄-1-올은 하기 구조를 가지며:

5-((2-(6-아미노-9 H -퓨린-9-일)에틸)아미노)펜탄-1-올

상기 NB010, 즉 6-아미노-9-(2-p-톨릴옥시-에틸)-9H-퓨린-8-티올은 하기 화학 구조를 가지며:

6-아미노-9-(2-p-톨릴옥시-에틸)-9H-퓨린-8-티올

상기 NB011, 즉 4-(9H-퓨린-6-일)모르폴린(6-모르폴린-4-일-7H-퓨린으로도 알려짐)은 하기 화학 구조를 갖는다:

6-모르폴린-4-일-7H-퓨린

(2) (1)에 있어서, 상기 오피오이드는 모르핀인, 약학 조성물.

(3) (1)에 있어서, NB001, NB010 또는 NB011의 3가지 화합물은 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화합물(solvate)을 추가로 포함하는, 약학 조성물.

(4) 통증의 치료시 약제를 제조하기 위한 약학 조성물의 용도로서, 상기 약학 조성물은

오피오이드, 및

를 포함하며,

5-((2-(6-아미노-9 H -퓨린-9-일)에틸)아미노)펜탄-1-올

6-아미노-9-(2-p-톨릴옥시-에틸)-9H-퓨린-8-티올

6-모르폴린-4-일-7H-퓨린

(5) (4)에 있어서, 상기 오피오이드는 모르핀인, 약학 조성물.

(6) (4)에 있어서, NB001, NB010 또는 NB011의 3가지 화합물은 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화합물을 추가로 포함하는, 약학 조성물.

(7) 오피오이드를 NB001, NB010 또는 NB011로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나, 및 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화합물과 함께 적용하는 통증 치료 방법으로서,

5-((2-(6-아미노-9 H -퓨린-9-일)에틸)아미노)펜탄-1-올

6-아미노-9-(2-p-톨릴옥시-에틸)-9H-퓨린-8-티올

6-모르폴린-4-일-7H-퓨린

(8) (1)에 있어서, 상기 오피오이드는 모르핀인, 약학 조성물.

본 발명은 또한 다음을 제공한다.

(9) 신경병성 통증으로 인한 불안, 및 다른 질병과 관련된 불안 및 우울증을 치료하기 위한 약학 조성물로서, 상기 약학 조성물은 NB001, NB010 또는 NB011의 3가지 화합물 중 적어도 하나를 함유하는, 약학 조성물.

(10) (9)에 있어서, NB001, NB010 또는 NB011의 3가지 화합물은 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화합물을 추가로 포함하는, 약학 조성물.

(11) 만성 내장통(chronic visceral pain), 및 관련 불안 및 우울증을 치료하기 위한 약학 조성물로서, 상기 약학 조성물은 NB001, NB010 또는 NB011의 3가지 화합물 중 적어도 하나를 함유하는, 약학 조성물.

(12) 모르핀의 만성적인 사용으로 인한 소양증 반응(itching response)을 치료하기 위한 약학 조성물로서, 상기 약학 조성물은 NB001, NB010 또는 NB011의 3가지 화합물 중 적어도 하나를 함유하는, 약학 조성물.

본 발명에 따르면, NB001은 모르핀 또는 다른 오피에이트 화합물의 만성적 사용의 진통 효과에 대한 향상된 효과를 가지며, 내성을 감소시킬 수 있다. 모르핀과 결합하면 유사한 수준의 통증 완화를 생성하는 데 필요한 모르핀의 투여량을 줄일 수 있다.

본 발명의 치료는 또한 모르핀으로 치료된 환자에서 모르핀 진통 효과를 향상시키고 그리고/또는 모르핀 내성을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 모르핀 내성(모르핀 진통의 소실)은 장기간 모르핀을 사용하는 환자에서 발생할 수 있다. 인간과 동물에서 며칠 또는 몇 주에 걸쳐 모르핀을 반복적으로 사용하면 진통이 감소한다.

본 발명의 또 다른 견지는 AC1 & 8 억제제로서 새로운 화합물 NB010 및 NB011에 관한 것이다. 이는 AC1 및 AC8 활성 모두가 오피오이드 유도된 민감화의 핵심으로 제안되었기 때문에 특히 중요하다. 따라서, AC1 및 AC8 활성의 억제는 아편 유도된 내성, 중독 및 다른 효과를 감소시키는데 이상적인 선택일 수 있다. 본 발명에서는, AC1 및 AC8의 활성이 효과적으로 억제되었지만, AC1 및 AC8을 억제하는 화합물 모두가 본 발명의 효과를 갖는 것은 아니기 때문에, NB001, NB010 및 NB011의 작용 원리를 추정하는 것으로 제안된다.

NB010 및 NB011은 내성을 감소시키도록 모르핀이나 다른 오피에이트 화합물의 만성적 사용에 대한 진통을 증가시키는데 사용될 수 있다. 모르핀과 결합하면 유사한 수준의 통증 완화를 생성하는 데 필요한 모르핀의 투여량을 줄일 수 있다.

또한, 본 발명은 AC1 또는 AC1 & 8 활성을 저해하는 화합물의 유효량을 이를 필요로 하는 인간에게 투여함으로써 모르핀 내성을 치료하는 방법을 제공한다. 일반적으로 이러한 인간은 모르핀을 사용하는 만성 통증의 치료 중에 모르핀 내성이 발달하였다. NB010/NB011은 모르핀과 다른 오피에이트의 장기간 사용으로 인한 부가 반응을 줄이기 위해 사용될 수 있다.

신경병성 통증, 암 통증과 같은 만성 통증에서, 환자는 장시간 동안 통증제를 취할 수 있다. 또한, 모르핀 치료의 부작용은 소양증일 수 있다. NB010/NB011은 만성적인 모르핀 사용으로 인한 소양증 반응을 줄이기 위해 사용될 수 있다.

NB010/NB011은 상해로 인한 정서적 불안/우울증을 줄이기 위해 사용될 수 있습다. NB010과 NB011은 만성적인 오피에이트(모르핀과 같은)의 사용 또는 데미지에 의해 유발될 수 있는 소양증을 줄이기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 일반적으로 항소양증을 위해 NB010 및 NB011의 사용을 포함할 수 있다.

AC1과 AC8은 에탄올 유도된 민감성에 관여하는 것으로 알려져 있으며(Maas et al., 2005), 따라서 NB010과 NB011은 에탄올 관련 중독, 민감성 및 기타 증상을 치료하는 데 사용될 수 있다.

AC1 및 AC8이 코카인 민감화에 관여한다고 보고되었으며(DiRocco et al., 2009), 따라서 본 발명자들은 코카인 등의 만성적 사용과 관련된 중독 행동을 치료하기 위해 NB010 및 NB011을 사용하는 것을 제안한다.

본 발명의 화합물은 또한 약학적으로 허용되는 염의 형태로 존재할 수 있다. 의약에서의 사용을 위해, 본 발명의 화합물의 염은 비독성 "약학적으로 허용되는 염(pharmaceutically acceptable salts)"(Ref International J. Pharm., 1986, 33, 201-217; J. Pharm.Sci., 1997(Jan), 66, 1, 1)을 칭한다. 그러나, 당업자에게 공지된 다른 염이 본 발명에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 제조에 유용할 수 있다. 대표적인 유기 또는 무기산으로는 이에 한정하는 것은 아니나, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 과염소산, 황산, 질산, 인산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 락트산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 만델산, 메탄설폰산, 하이드록시에탄설폰산, 벤젠 설폰산, 옥살산, 팔모익산, 2-나프탈렌설폰산, p-톨루엔설폰산, 시클로헥산설폰산, 살리실산, 사카린산 또는 트리플루오로 아세트산을 포함한다. 대표적인 유기 또는 무기 염기는 이에 한정하는 것은 아니나, 벤자틴, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 메글루민, 프로카인, 알루미늄, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 포타슘, 소듐 및 아연과 같은 염기성(basic) 또는 양이온성 염을 포함한다.

본 발명은 본 발명의 화합물의 프로드럭을 그 범위 내에 포함한다. 일반적으로, 이러한 프로드럭은 생체 내에서 요구되는 화합물로 쉽게 전환될 수 있는 화합물의 기능적 유도체일 것이다. 따라서, 본 발명의 치료 방법에서, 용어 "투여(administering)"는 구체적으로 개시된 화합물 또는 구체적으로 개시되지 않을 수도 있으나, 생체 내에서 환자에게 투여한 후 명시된 화합물로 전환되는 화합물을 이용하여, 기재된 다양한 질환을 치료하는 것을 포함한다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 비경구, 경구, 직장, 대체 또는 경피 투여에 사용되는 형태로 존재할 수 있다.

따라서, 이들은 극성 용제에 경피 투여용으로, 또는 고정된 사용을 위해, 통상적인 또는 코팅된 정제, 당의정(dragees), 웨이퍼 캡슐, 겔 캡슐, 필(pills), 카세제(cachets), 분말, 좌약 또는 직장 캡슐의 형태로 주사 가능한 용액 또는 현탁액 또는 다중 투여 바이얼의 형태로 제공될 것이다.

이 적용에 적합한 부형제는 셀룰로오스 또는 미정질 셀룰로오스 유도체, 알칼리 토금속 카보네이트, 마그네슘 포스페이트, 전분, 변성 전분 및 고체 형태의 락토스이다.

직장용으로, 코코아 버터 또는 폴리에틸렌 글리콜 스테아레이트가 바람직한 부형제이다.

비경구용으로, 물, 수용액, 생리 식염수 및 등장액이 사용하기에 가장 적합한 운반체이다.

본 발명의 활성 화합물 또는 이의 약학 조성물에 대한 치료적 유효량이 목적하는 효과에 따라 달라질 것이라는 것은 또한 당업자에게 명백하다. 따라서, 투여될 최적 용량은 쉽게 결정될 수 있으며, 사용된 특정 화합물, 투여 방식, 제제의 강도 및 질병 상태의 진행에 따라 달라질 것이다. 또한, 대상자 연령, 체중, 식이 및 투여 시간을 포함하여 치료되는 특정 대상자와 관련된 인자는 적절한 치료 수준으로 투여량을 조정할 필요가 있을 것이다. 따라서, 상기 투여량은 평균적인 경우의 예시이다. 물론, 보다 높거나 낮은 투여량 범위가 유리한 개별적인 경우가 있을 수 있으며, 이는 본 발명의 범위 내에 있다.

본 발명의 화합물은 진통제로서의 본 발명의 화합물의 사용이 이를 필요로 하는 대상자에게 요구될 때마다, 상기 조성물 및 투여 요법 중 어느 것으로 또는 상기 조성물 및 당업계에 확립된 투여 요법에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 약학 및 수의학적 조성물의 성분 중 하나 이상으로 채워지는 하나 이상의 용기를 포함하는 약학 또는 수의학적 팩 또는 키트를 제공한다. 선택적으로, 이러한 용기(들)과 관련된 것은 의약품이나 생물학적 제제의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관이 정한 형태의 주의가 있을 수 있으며, 이러한 주의는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매에 대한 기관의 승인을 반영한다.

본 발명의 화합물은 진통 효과가 있는 투여량의 투여에 의해 인간과 같은 온혈 동물에서 경미한 통증 내지 심한 통증을 치료하는 데 사용될 수 있다. 투여량 범위는 평균(70kg) 인간에 대해 하루에 약 1 내지 4회 요법으로 약 0.1 mg 내지 약 15,000 mg, 특히 약 50 mg 내지 약 3500 mg, 또는 보다 특히 약 100 mg 내지 약 1000 mg의 활성 성분일 것이며; 그럼에도 불구하고, 본 발명의 활성 화합물에 대한 치료 유효량은 치료되는 통증의 타입에 따라 다양할 것이라는 것은 당업자에게 명백하다.

경구 투여용으로, 치료되는 대상자에게 증상에 따라 투여량을 조절하도록 0.01, 10.0, 50.0, 100, 150, 200, 250 및 500 밀리그램의 활성 성분을 함유하는 정제의 형태로 약학 조성물을 제공하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 언급되는 통증의 예는 이에 한정하는 것은 아니나, 염증성 통증, 중추 매개 통증, 말초 매개 통증, 내장통, 구조적 또는 연조직 손상 관련 통증, 진행성 질환 관련 통증, 신경병성 통증, 및 급성 손상, 트라우마 또는 수술로 인한 것과 같은 급성 통증, 및 두통 및 신경병 컨디션, 뇌졸증 후 컨디션, 암 및 편두통으로 인한 것과 같은 만성 통증을 포함한다.

또한, 본 발명의 화합물은 면역 억제제, 항염증제, 예를 들어, 우울증 및 파킨슨 병과 같은 신경학적 및 정신의학적 컨디션의 치료 및 예방을 위한 제제, 예를 들어, 요실금 및 조루와 같은 비뇨생식기 컨디션의 치료를 위한 제제, 약물 및 알코올 남용용 약제, 위염 및 설사 치료용 제제, 심혈관 제제 및 심장보호 제제 및 호흡기 질환의 치료용 제제로서 유용하다.

본 발명의 화합물은 또한 골관절염, 류마티스성 관절염, 섬유 근육통, 편두통, 두통, 치통, 화상, 일광 화상, 뱀 물림(특히 독사), 거미 물림, 곤충 물림, 신경성 방광, 양성전립선비대, 간질성 방광염, 비염, 접촉 피부염/과민증, 가려움, 습진, 인두염, 점막염, 장염, 셀룰라이트, 작열통(causalgia), 좌골 신경염, 하악 관절 신경통(mandibular joint neuralgia), 말초 신경염, 다발성 신경염, 절단 통증, 의사 수족증 통증(phantom limb pain), 수술후장폐색증(post-operative ileus), 담낭염, 유방절제술후 통증 증후군, 구강 신경병 통증, 샤르코 통증(Charcot's pain), 반사교감신경이상증, 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 대퇴감각이상증(meralgia paresthetica), 구강작열감증후군(burning-mouth syndrome), 대상포진후신경통(post-herpetic neuralgia), 삼차 신경통(trigeminal neuralgia), 군발성 두통, 편두통, 말초 신경병증, 말초 신경병증, 양측 말초 신경병증, 당뇨병성 신경병증, 대상포진후신경통(postherpetic neuralgia), 삼차 신경통(trigeminal neuralgia), 시신경염, 과열후신경염(postfebrile neuritis), 이동신경염(migrating neuritis), 분절 신경염(segmental neuritis), 곰바울트 신경염(Gombault's neuritis), 신경세포염, 목팔 신경통(cervicobrachial neuralgia), 뇌신경통, 슬상신경통(geniculate neuralgia), 설인 신경통(glossopharyngial neuralgia), 편두통성 신경통, 특발성 신경통(idiopathic neuralgia), 늑간 신경통, 유방 신경통, 모튼 신경통(Morton's neuralgia), 코섬모체 신경통(nasociliary neuralgia), 후두 신경통, 홍통증(red neuralgia), 슬러더 신경통(Sluder's neuralgia), 나비입천장 신경통(splenopalatine neuralgia), 안와상 신경통(supraorbital neuralgia), 날개관 신경통(vidian neuralgia), 염증성 장 질환, 과민성 장 증후군, 부비동 두통, 긴장성 두통, 노동, 출산, 생리통 및 암에 의해 유발되는 통증을 치료하는 데 유용하다.

도 1. AC1 & 8 억제제 NB010을 이용한 ACC에서 프리-LTP 및 포스트-LTP의 억제.
도 2. ACC에서 프리-LTP에 미치는 상이한 제제들에 의한 AC1/8 억제의 효과.
도 3. 모르핀(10mg/kg)의 반복된 주사에 의해 유도된 모르핀 내성이 AC1 억제제 NB001(5mg/kg)을 이용하여 감소되었다.
도 4. NB010 및 NB011은 모르핀 내성 역전에서 현저한 효과를 생성하였다.
도 5. 조건화된 장소 선호도 실험(the conditioned place preference experiment)의 결과.
도 6. 신경 손상으로 인한 불안증에 대한 상이한 제제들의 효과.
도 7. 소양증 반응 시험의 결과.

NB001, 5-((2-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)에틸)아미노)펜탄-1-올은 분자식 C₁₂H₂₀N₆O 및 분자량 264.33을 갖는다. Sigma 686301-48-4에서 구입가능하다.

NB010, 6-아미노-9-(2-p-톨릴옥시-에틸)-9H-퓨린-8-티올은 하기 화학 구조를 갖는다:

Asinex LTD의 BAS03384로 구입가능한 제품이다.

NB01 1,4-(9H-퓨린-6-일)모르폴린(6-모르폴린-4-일-7H-퓨린으로도 알려짐)은하기 화학 구조를 갖는다:

Maybridge사로부터 JFD02793로 구입가능한 제품이다.

표시된 화학식을 갖는 화합물의 약학적으로 허용되는 염은 본 발명의 범위 내에서 화합물 A 및 화합물 B의 정의에 해당된다.

실시예 1. AC1 & 8 혼합된 억제제 스크리닝

잠재적인 AC1 및 AC8 보조-억제제(또는 AC1 & 8 억제제라고 불림)를 찾기 위해 한 세트의 생화학적 스크리닝 실험을 수행했다. AC1 또는 AC8 발현 세포주에 대해 cAMP 에세이(assays), 유전자 활성화 (pCREB) 에세이 및 통합 생리학적 실험으로, AC1 및 AC8에 작용하는 잠재적인 화합물 A 및 B를 스크리닝했다. NB010 및 NB011 모두 100μM에서 AC1뿐만 아니라 AC8 활성을 유의하게 억제한다는 것을 발견했다(표 1 참조). 실험방법에 대해서는 Wang, H.S., et al., Identification of an Adenylyl Cyclase Inhibitor for Treating Neuropathic and Inflammatory Pain. Science Translational Medicine, 2011. 3(65)를 참조하였다.

표 1	NB010 및 NB011이 아데닐릴 사이클라아제 서브타입(adenylyl cyclase subtype ) 8 및 1에 미치는 효과
		억제 퍼센트
		AC8	AC1
NB010 (100 μM)		88 ± 2 % 억제	96 ± 4 %
NB011 (100 μM)		86 ± 2	91 ± 3 %

실시예 2. 불안-관련 피질 LTP에 대한 NB010 및 NB011 평가

이전의 연구들은 AC1 및 AC8의 활성이 반복적인 자극에 의해 유도된 시냅스 LTP(synaptic LTP)에 필요하다는 것을 시사하였다(Zhuo, 2016). 뉴런에서 AC1 및 AC8 활성에 대한 NB010 및 NB011의 효과를 평가하기 위해, 성체 마우스의 ACC 피질 슬라이스에서 두 가지 형태의 LTP가 기록되었다.

위에서 언급한 바와 같이, θ 버스트 자극(θ burst stimulation)은 적어도 40분 동안 시냅스 반응의 상승작용(potentiation)을 유도했다(도 1A, n=8 슬라이스). ACC LTP의 유도는 NB010(25μM)으로 사전처리 함으로써 차단될 수 있다(도 1A, n=5 슬라이스). 유사한 결과가 NB011에서 발견되었다(도 2, n=6 슬라이스). 대조적으로, 동일한 용량의 비-선택적 AC 억제제 SQ22356는 프리-LTP(pre-LTP)의 유의한 감소를 야기하지 않았다. 대조적으로, 프리-LTP는 GABApention(25μM)을 사용해도 차단되지 않았다(n = 5).

ACC에 대한 최근 보고(Chen et al., 2014)는 또한 GABApention이 ACC LTP에 영향을 미치치 않는다는 것을 발견했다. 흥미롭게도, 포스콜린(forskolin)(10μM)은 프리-LTP의 약간의 증가를 가져 왔으며(도 2), 이는 AC 활성이 프리-LTP에 중요하다는 것을 나타낸다. 이러한 발견은 NB010 및 NB011 모두가 성체 마우스 뉴런에서 AC1 및 AC8 활성을 억제할 수 있음을 나타낸다. 이는 NB010 및 NB011이 부상으로 인한 불안을 치료하는데 사용될 수 있음을 증명한다.

최근 연구는 부상으로 인한 불안이 프리-LTP와 관련이 있음을 시사하고(Koga et al., 2015; Zhuo, 2016), 그러므로 본 발명의 발명자들은 NB010 및 NB011이 프리-LTP에 미치는 효과를 실험하기로 결정했다. 그리고 두 화합물은 모두 프리-LTP를 억제하는 것을 나타냈다(도 1). 자세한 실험 과정은 Koga, K., et al., Coexistence of Two Forms of LTP in ACC Provides a Synaptic Mechanism for the Interactions between Anxiety and Chronic Pain. Neuron, 2015. 85(2): p. 377-389를 참조하였다.

도 1은 AC1 & 8 억제제 NB010을 이용한 ACC에서의 프리-LTP 및 포스트-LTP 억제를 나타내며, 이때 (A) 포스트-LTP는 NB010 (25μM) 용액(n=5)의 적용에 의해 차단되는 반면, 포스트-LTP는 컨트롤 슬라이스(채워진 원; n = 8)에서 유도되었고; (B) 프리-LTP는 NB010(25μM) 용액(n=5)의 적용에 의해 차단되는 반면, 프리-LTP는 컨트롤 슬라이스(채워진 원; n = 8)에서 유도되었다.

도 2 는 ACC에서 프리-LTP상의 상이한 시약에 의한 AC1/8의 억제 효과를 보여준다. 여기서, 데이터는 45분 중 마지막 5분에서 프리-LTP의 유도가 향상되었음을 보여준다. *컨트롤 군과 비교하여 유의한 차이가 있음을 나타낸다(포스콜린(forskolin)은 증가한 반면 NB010 및 NB011은 감소함).

실시예 3. 모르핀 내성에서 AC1 및 AC1 & 8 억제제의 행동 효과(behavioral effects).

먼저, 본 발명의 발명자들은 AC1 녹아웃(knockout) 마우스가 모르핀의 반복 주입에 의해 야기된 모르핀 내성에 영향을 주는지 검사하고자 하였다. 본 발명자들의 이전 보고에 따라, 모르핀을 7일 동안 매일 (10mg/kg, s.c) 주사하여 모르핀-유도 내성을 측정하였다. AC1 녹아웃 마우스에서, 모르핀은 식염수-처리된 야생형 마우스(saline-treated wild-type mice)와 비교하여 유의한 큰 진통 효과를 나타냄을 발견하였다(n=5 내지 8 마우스: 7 일째: 컨트롤 마우스, MPE 18±6%, AC1 KO, 40±8%; P<0.05). 이러한 결과는 AC1 활성을 억제하는 것이 모르핀 내성을 감소시키는데 유익할 수 있음을 나타낸다. 다음으로, 선택적인 AC1 억제제 NB001(5mg/kg, i.p.)을 이용하여 야생형 마우스를 모르핀으로 처리하였다. 통각수용성 열판(nociceptive hotplate) 및 테일-플릭 반응 잠복기(tail-flick response latency)를 모두 기록하였다. NB001 공-적용(co-application)은 만성적인 모르핀 치료 후 반응 잠복기에 유의한 효과를 제공함을 발견했다(p<0.005)(도 3).

AC1 및 AC8 이중 녹아웃(double knockout) 마우스의 이전 연구는 모르핀 내성이 유의하게 감소한다는 것을 발견했다(Li et al., 2006). 본 발명자들은 AC1 & 8 억제제가 또한 모르핀 내성을 감소시키는데 유익한 효과를 제공할 것으로 예상했다. 유사하게, NB010 또는 NB011(5mg/kg, i.p.)로 사전처리한 경우 모두 모르핀 주사 후 7일 째 유의한 더 큰 진통효과를 제공했다(n=5 내지 8 마우스, 각 경우의 컨트롤 처리와 비교하여 p<0.05). 자세한 실험 방법은 Li, S., Lee, ML, Bruchas, MR, Chan, GC, Storm, DR 및 Chavkin, C. (2006) Calmodulin-stimulated adenylyl cyclase gene deletion effects morphine responses. Mol Pharmacol 70, 1742 -1749를 참조한다.

도 3은 AC1 억제제 NB001(5mg/kg) 사용에 의해 모르핀(10mg/kg)의 반복 주입에 의해 유도된 모르핀 내성이 감소되었음을 보여준다.

따라서, 본 발명자들은 AC1 억제제 NB001 및 AC1 & 8 억제제 NB010 및 NB011 모두가 모르핀 진통 효과를 향상시키는데 유용하고, 이로써 모르핀의 반복적인 사용이 가능할 것이라고 기대했다.

도 4에 보여지는 바와 같이, NB010 및 NB011은 모르핀 주입(10mg/kg) 7일 후 모르핀 내성을 역전 시키는데 유의한 효과를 제공했다(n=5 내지 7 마우스). 대조적으로, 100mg/kg의 GABApentin은 유의한 효과를 제공하지 못했다(n=6 마우스). 나아가, 비-선택적 AC 억제제 SQ022356의 효과 또한 실험되었고 동일한 용량에서 유의한 효과는 발견되지 않았으며, 이는 AC1/AC8의 선택적 억제제가 중요함을 알려준다.

모르핀 내성에 대한 AC1/AC8의 역할을 추가로 실험하기 위해, AC 활성제 포스콜린이 적용되었고 모르핀 반복 주사 3일 후에 모르핀이 마우스(n=3 마우스)에서 더 빨리 내성을 발생시키는 것을 발견했다.

AC1 억제제 NB001(5mg/kg) 및 AC1/AC8 억제제 NB010 또는 NB011(5mg/kg)에 대해, 반복적인 모르핀 주사 7일 후 반복적인 모르핀 주사(10mg/kg)에 의해 유도된 모르핀 내성이 감소했다. GABApentin(100mg/kg) 또는 SQ22356(5mg/kg)은 어떠한 유의한 효과를 제공하지 않았다.

가능한 용량-관련 효과를 실험하기 위해, NB 화합물을 1mg/kg의 낮은 용량으로 적용하였고; NB001/NB010/NB011에서 유의한 효과가 발견되지 않았으며, 이는 효과가 용량과 관련되어 있음을 나타낸다.

실시예 4. 모르핀의 조건 장소 선호도(Conditioned Place Preference, CPP)

조건 장소 선호도(CPP)는 모르핀의 유익한 효과에 대한 CREB 돌연변이 마우스의 반응 감소를 확인하기 위해 사용되었다(Walters와 Blendy, 2001). 식염수-처리된 및 억제제 처리된 마우스에 후속적으로 모르핀 CPP가 유도되었다. NB001 (5mg/kg, ip) 처리된 마우스는 식염수-처리된 마우스보다 챔버의 모르핀-짝지어짐 사이드(morphine-paired side)를 탐험하는데 유의하게 적은 시간을 소비한다는 것을 발견했고, 이는 AC1이 모르핀의 향상된 특성에 기여한다는 것을 나타낸다(p<0.05). 챔버의 어느 사이드에서도 초기 선호도는 유의한 차이가 없었다. 자세한 실험 방법은 Walters CL, Blendy JA (2001) Different requirements for cAMP response element binding protein in positive and negative reinforcing properties of drugs of abuse. J Neurosci 21:9438-9444를 참조하였다.

모르핀의 조건 장소 선호도 실험에서, 본 발명자들은 NB001이 모르핀-유도된 선호도에서 유의한 감소를 야기한다는 것을 발견했다. NB010 및 NB011(5mg/kg)은 모두 NB001과 유사하다(도 5). 대조적으로, 동일 용량의 비-선택적 AC 억제제 SQ022356은 어떠한 억제도 제공하지 않았다(도 5). 이는 AC1/AC8 억제가 선택적임을 나타낸다. 100mg/kg의 GABApention 효과 또한 실험되었다. 도 5에 보여지는 결과와 같이, 모르핀(10mg/kg)은 9일 후 장소 선호 행동을 유도하기 위해 반복적으로 사용되었고, AC1 억제제 NB001, AC1/8 억제제 NB010 또는 NB011(5mg/kg)을 적용했을 때의 효과는 유의하였다. GABApentin(100mg/kg) 또는 SQ22356(5mg/kg)은 어떠한 유의한 효과를 나타내지 않았다.

나아가, 상기 실험 결과는 또한 NB001 / NB010 / NB011의 용량을 1mg/kg로 감소하였을 때, 기대한 효과가 제공되지 않았음을 보여주며(도면에는 나타나지 않음), 따라서 NB001 / NB010 / NB011의 효과는 용량-의존적이다(n=3 내지 5 마우스).

포스콜린(5mg/kg)는 어떠한 억제 효과를 제공하지 못했고, 그 결과는 또한 선택시간이 약간 증가했음을 보여준다(n=3 마우스).

실시예 5. 불안 행동 실험

앞서 언급한 바와 같이, 본 발명자들은 EPM 실험에서 신경 부상이 불안 행동을 야기한다는 것을 발견했다(Koga et al., 2015; 도 6 참조). 따라서 본 발명자들은 두 억제제가 불안-관련 프리-LTP를 예방하기 때문에 NB010 또는 NB011가 불안 및 다른 행동을 감소시킬 수 있는지 검사하였다. 예상한대로, NB010 또는 NB011(5mg/kg)은 신경 상해로 인한 불안 반응을 유의한 감소를 제공하였다(각각의 경우 P<0.05, 각 제제에 대해 n=6 마우스)(도 6 참조).

저용량(1mg/kg)에서, NB010(도 6 참조)은 유의하게 감소하지 않았다. 비슷한 결과가 1mg/kg의 NB011에서 얻어졌다. GABApentin(100mg/kg, i.p.) 이나 SQ22356(5mg/kg)도 행동 불안을 유의하게 감소시키지 못했다(도 3). 포스콜린 (5mg/kg)의 사용은 불안을 더 증가시키지 않았는데, 이는 포화 효과의 생성으로 인한 것일 수 있다(도 6).

자세한 실험 방법은 Koga, K., et al., Coexistence of Two Forms of LTP in ACC Provides a Synaptic Mechanism for the Interactions between Anxiety and Chronic Pain. Neuron, 2015. 85(2): p. 377-389를 참조하였다.

도 6은 신경 부상으로 야기된 불안에 대한 상이한 제제의 효과를 나타낸다. AC1 & 8 억제제 NB010/NB011 (5mg/kg, i.p.)의 사용은 신경 부상으로 야기된 불안을 감소시켰다(부상 후 7 일). 1mg/kg의 낮은 용량에서, NB010이나 NB011 모두 불안에 영향을 미치지 않았다. GABApentin(100mg/kg) 또는 SQ22356(5mg/kg)의 사용은 유의한 효과가 없었다. 이 실시예에서 불안 상태를 평가하기 위해 EPM 실험을 사용했다.

소양증(가려움증) 반응

소양증은 종종 오피오이드(opioids)의 만성적인 사용을 포함하는 다양한 질병에 의해 야기된는 것으로 잘 알려져 있다. AC1 및 AC8의 억제가 소양증 반응을 감소시킬 수 있는지 평가하기 위해, 본 발명자들은 화합물 A의 주사에 의한 행동 소양증 반응에서 NB010 및 NB011의 효과를 평가하였다. 구체적인 실험 방법은 미국 특허 공개 공보 US20110098295 A1을 참조하며, 결과적으로 화합물 48/80(100㎍/50㎕)의 진피내 주사에 의해 유도된 전체 긁는 반응(total scratching responses)은 야생형 마우스(n=7)와 비교하여 NB010 또는 NB011 사전처리(n=6 마우스)의 주사를 받은 마우스에서 유의하게 감소됨을 발견했다(도 7). GABApention(100mg/kg)의 적용은 소양증 반응의 유의한 감소를 야기하지 않았다(도 7). SQ22356은 또한 실험된 용량(5mg/kg, ip)에서 유의한 감소를 나타내지 않았다. 대조적으로, 포스콜린(5mg/kg)의 적용은 행동 소양증 반응을 유의하게 향상시켰다(도 7).

도 7은 마우스에서 행동 소양증 반응에 대해 cAMP 경로에 영향을 미치는 상이한 제제의 효과를 보여준다. NB010 또는 NB011의 적용은 성체 마우스에서 히스타민 방출 화합물 40/80에 의해 유도된 소양증 반응을 유의하게 감소시켰다. 대조적으로, GABApentin이나 SQ22356 중 어느 것도 유의한 효과를 제공하지 않았다. 포스콜린은 소양증 반응을 유의하게 향상시키는 AC 활성제이다. * 컨트롤에 비해 P<0.05.

실험 동물

AC1 및 AC8 KO 마우스는, Wei F, Qui CS, Kim SJ, et al. Genetic elimination of behavioral sensitization in mice lacking calmodulin-stimulated adenylyl cyclase. Neuron. 2002; 36(4): 713-726 참조하였고, C57B1/6 백그라운드(background)에서 여러 세대(F8-F12) 동안 육종되었다. 컨트롤 야생형(WT) 마우스는 찰스 리버(Charles River)의 성체 수컷(8 내지 12주 령) C57B1/6 마우스였다. 실험의 끝에서, 동물은 마취제(할로센, halothane)의 과도한 흡입으로 처리되었다. 동물은 12시간 : 12시간의 명 : 암 사이클로 보관하고 음식과 물은 자유롭게 사용할 수 있도록 하였다.

AC1 및 AC8에 대한 신규 억제제의 생화학적 스크리닝 실험.

AC8 발현 벡터 pcDNA3-AC1 트렌스펙션(transfection)을 위해, HEK293 세포를 플레이트 당 1x10⁶의 밀도로 60mm 직경 페트리 접시에 플레이팅하고, 밤새 성장시키고, Lipofectamine 2000(Invitrogen)에 의해 pcDNA3-AC1 (플레이트 당 0.8㎍ DNA)을 트렌스펙션시켰다. 안정한 트렌스펙션 클론을 선택하고 0.8mg/ml G418 (Invitrogen, CA)을 함유하는 배지에서 유지시켰다. HEK293 세포에서 다른 AC 아이소폼(isoforms)의 일시적인 발현을 위해, HEK293 세포를 96-웰(well) 조직 배양 접시에 씨딩(seeded)하고 AC5 플라스미드로 각각 트렌스펙션시키고, 트렌스펙션 48 시간 후 실험하였다.

ACs를 발현하는 HEK293 세포를 수확하고 상이한 처리 후에 0.1M HCl에서 용해(lysed)시켰다. 직접적인 cAMP 측정은 직접적인 cAMP 효소면역분석 키트(Assay Designs, MI)를 사용하여 수행하였고 광학 밀도 값은 마이크로플레이트 판독기로 405 nm에서 측정하였다. 포스포디에스테라제(Phosphodiesterase)는 배지에 1mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴(3-isobutyl-1-methylxanthine)(Sigma, MO)을 첨가하여 억제되었다.

CRE 루시퍼라제 리포터 유전자 에세이(CRE luciferase reporter gene assay)

HEK293 세포를 항생제가 없는 96-웰 플레이트로 계대배양시키고, 밤새 성장시키고 Lipofectamine 2000 시약에 의해 pGL3-CRE 반딧불 루시퍼라제 및 pGL3-CMV-아드레날린성 루시퍼라제 컨스트럭트(웰 당 0.25㎍ DNA)를 트렌스펙션시켰다. 트렌스펙션된 세포를 밤새 배양하고 배지를 10% 태아 카프 혈청(fetal calf serum)을 함유하는 DMEM으로 교체 하였다. 48 시간 후, 세포를 10μM 포스콜린, 10μM A23187 및 2mM CaCl2로 처리하거나, 10μM 포스콜린, 10μM A23187 및 2mM CaCl2의 조합으로 처리하여, 100 μM의 농도에서 각각의 화학물질의 존재 또는 부재하에서 실험하였다. 6시간이 지날 무렵, 배양된 세포를 수확하고 듀얼 루시퍼라제 리포터 에세이 시스템(Dual Luciferase Reporter Assay System)(Promega)에 의해 루시퍼라제 활성을 분석하였다. 상대적인 광 유닛은 시리우스 광도계(SIRIUS luminometer)를 사용하여 측정하였다.

전체 세포 패치 클램프(patch clamp) 기록

ACC 수준에서 관상 뇌 섹션(300 μm)을 표준 방법을 사용하여 준비했다(Wu et al., 2005). 상기 섹션은 산소(95% O₂ 및 5% CO₂), 인공 뇌척수액(artificial cerebrospinal fluid, ACSF)(mM으로 포함: 124 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgSO₄, 25 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄, 10 포도당)을 포함하는 담금 회복 챔버로 옮겨져 실온에서 적어도 1 시간 두었다. 실험은 시각화를 위해 적외선 DIC 광학이 장착된 BX51W1 현미경의 스테이지의 기록 챔버에서 수행되었다. 　Axon 200B 증폭기(Axon Instruments, CA)로 II/III 층 뉴런에서 흥분성 시냅스 후 전류(excitatory postsynaptic currents, EPSCs)를 기록하고, 자극은 ACC의 V층에 위치한 바이폴라 텅스텐 자극 전극(bipolar tungsten stimulating electrode)에 의해 전달되었다. 알파-아미노-3-하이드록시-5-메틸이속사졸-4-프로피온산(Alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole -4-propionic acid, AMPA) 수용체-매개 EPSCs는 0.05Hz의 반복 자극에 의해 유도되었고 뉴런은 AP5(50μM)의 존재하에 -70mV에서 전압 클램핑(voltage clamped)되었다. 기록용 파이펫(3-5 MΩ은: 145 K-gluconate, 5 NaCl, 1 MgCl₂, 0.2 EGTA, 10 HEPES, 2 Mg-ATP, 0.1 Na3-GTP 및 10 포스포크레아틴 디소듐(phosphocreatine disodium) (단위는 mM)이 포함된 용액으로 채워지고, KOH로 pH 7.2로 조정하였다. 140 세슘 메탄설포네이트(cesium methanesulfonate), 5 NaCl, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 2 MgATP, 0.1 Na3GTP, 0.1 스페르민(spermine), 2 QX-314 브롬화물 및 10 포스포크레아틴 디소듐(phosphocreatine disodium) (단위는mM) (CsOH로 pH 7.2로 조정함)인 내부 용액은 AMPA 수용체-매개 전달 실험의 정류(rectification)에 사용되었다. 미니어처 EPSC(mEPSC) 기록을 위해, 0.5μM TTX가 관류 용액에 첨가되었다. 모든 실험에서 Picrotoxin (100μM)은 항상 GABAA 수용체-매개 억제성 시냅스 전류를 차단하기 위해 존재했다. 액세스 저항(Access resistance)은 15 내지 30MΩ이었고 실험 전반에 걸쳐 모니터링되었다. 실험 도중 액세스 저항이 15% 이상 변하면 데이터는 버려졌다. 데이터를 1kHz에서 필터링하고 10kHz에서 디지털화 하였다.

조건 장소 선호도 실험

두 개의 구별된 맥락적(contextual) 환경(다른 벽, 바닥 및 냄새)이 있는 챔버가 사용되었다(MED-associates, St. Albans, VT). 실험 첫날에, 동물들은 자유롭게 30분간 챔버의 양 사이드를 탐험할 수 있었고 데이터는 동물을 거의 동일한 성향(equal bias)의 그룹으로 나누기 위해 사용되었다. 다음 8일 동안, 각각의 동물은 챔버의 다른 사이드에서 10mg/kg의 모르핀이나 동일한 부피의 식염수를 격일로 받았다. 동물은 30분 동안 특정 사이드에 갇혔다. 조건화 후, 모든 동물은 식염수를 주사받고 30분 동안 챔버의 양 사이드를 자유롭게 탐험할 수 있게 하였다. 장소 선호도는 이전과 비교하여 조건화 후 모르핀-짝지어짐 사이드(morphine-paired side)에서 시간 소비 증가로 정의되었다.

신경병증 통증 모델

신경병증 통증 모델은 이전에 기술된 것처럼 총비골신경(common peroneal nerve,CPN)을 연결함으로써 유도되었다(Li et al., 2010). 간단히 말하면, 케타민(ketamaine)(0.16mg/kg; Bimeda-MTC)과 자일라진(xylazine)(0.01mg/kg; Bayer)의 혼합 식염수를 복강 내 주사하여 마우스를 마취시켰다. CPN은 거의 횡 방향으로 움직이는 근육의 앞쪽과 뒤쪽 그룹 사이에서 볼수있다. 만성적인 CPN은 발의 배굴근의 수축이 발가락의 경련으로 보일 때까지 크로믹 거트 봉합사 5-0(chromic gut suture 5-0)(Ethicon)로 천천히 연결되었다. 기계적 이질통 실험(Mechanical allodynia test)는 수술 후 3, 7, 14일에 수행되었다. 실험은 블라인드 되었으며, 수술 및 마우스의 기계적인 민감도 측정은 상이한 개체에 달려있다.

기계적 이질통(Mechanical allodynia) 실험

마우스를 원형 용기에 넣고 실험 전 30분 간 적응시켰다. 기계적 이질통은 본 프레이 필라멘트(von Frey filaments)(Stoelting)를 굽힘 점(bending point)에 적용한 경우 뒷 발의 반응성을 기초로 평가되었다. 긍정적인 반응으로는 핥기, 물기, 뒷 발의 갑작스런 회수가 포함된다. 임계 자극을 특징화하기 위한 실험이 수행되었다. 1.65 필라멘트의 기계적 압력(힘, 0.008g)은 순수한 마우스에서는 무해한 것으로 나타났다. 이 필라멘트는 그 후 기계적 이질통 실험에 사용되었다.

Claims

오피오이드인 모르핀, 및
NB001, NB010 또는 NB011로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나
를 포함하며,
상기 NB001인 5-((2-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)에틸)아미노)펜탄-1-올은 하기 구조를 가지며:
[화학식 1]

5-((2-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)에틸)아미노)펜탄-1-올
상기 NB010인 6-아미노-9-(2-p-톨릴옥시-에틸)-9H-퓨린-8-티올은 하기 화학 구조를 가지며:
[화학식 2]

6-아미노-9-(2-p-톨릴옥시-에틸)-9H-퓨린-8-티올
상기 NB011인 4-(9H-퓨린-6-일)모르폴린(6-모르폴린-4-일-7H-퓨린으로도 알려짐)은 하기 화학 구조를 갖는,
[화학식 3]

6-모르폴린-4-일-7H-퓨린
통증 치료용 약학 조성물.
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제1항에 있어서,
NB001, NB010 또는 NB011의 3가지 화합물은 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화합물(solvate)을 추가로 포함하는, 약학 조성물.
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