KR102094082B1 - 난면역성 항원에 대한 항체를 스크리닝하는 방법 및 난면역성 항원의 검출 센서 - Google Patents

Abstract

본 발명은 난면역성 항원에 대한 항체를 스크리닝하는 방법 및 난면역성 항원의 검출 센서에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 난면역성 항원에 대한 항체를 스크리닝 하는 방법은 혈청 및 제 1 난면역성 항원을 포함하는 제 1 병원체를 혼합하여 제 1 항체-항원 반응 물질을 형성하는 단계; 상기 제 1 항체-항원 반응 물질을 산처리함으로써, 상기 제 1 난면역성 항원에 대한 타겟 항체를 포함하는 제 1 항체를 획득하는 단계; 상기 제 1 병원체에 비하여 상기 제 1 난면역성 항원이 포함되지 아니한 제 2 병원체를 혼합하여 제 2 항체-항원 반응 물질을 형성하는 단계; 및 상기 제 2 항체-항원 반응 물질로부터 상기 제 2 병원체와 반응하지 아니한 상기 타겟 항체를 수득하는 단계를 포함한다.

Description

난면역성 항원에 대한 항체를 스크리닝하는 방법 및 난면역성 항원의 검출 센서{A screening method of antibody for retardant immune antibody and a detection sensor for retardant immune antibody}

본 발명은 항체 스크리닝 기술에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 난면역성 항원에 대한 항체를 스크리닝하는 방법 및 난면역성 항원의 검출 센서에 관한 것이다.

항체는 일반적으로 동물의 면역계를 이용하여 생산이 가능하며, 동물의 면역계중 체액성 면역계는 B세포를 이용하여 항체를 생산할 수 있다. 예를 들면, 인간의 체액성 면역계를 구성하는 B세포는 10⁹ 내지 10¹¹개의 클론을 가지며, 각각의 B세포가 한 가지의 항체를 생산하므로 필요시 같은 수의 항체를 생산할 수 있다. 또한, 특이항원의 항체를 생산하기 위해서 해당 항원을 동물에 주사하여 체액성 면역계를 활성화함으로써 해당항원에 대한 B세포의 증식과 항체 생산을 촉진시킨다. 따라서, 항원이 동물의 면역계의 활성화를 방해하는 물질이거나 기타 동물의 생리활성에 영향을 끼치는 물질인 난면역성 항원인 경우, 일반적인 동물에 항원을 주사하는 방법으로 항체를 생산하는 것은 매우 어려울 수 있다.

Lipopolysaccharide(LPS)는 그람음성균의 외막에 존재하는 당사슬의 일종으로 포유류에 감염시 발열작용을 하는 항원 물질이다. LPS는 인간의 혈액계에 감염시 수 ng와 같은 적은 양의 존재만으로도 40 ℃ 이상의 발열을 일으키는 것으로 알려져 있다. 따라서, LPS에 대한 항체의 생산을 위해 동물에 주사하는 경우 급성적인 면역계의 활성화와 발열 등의 부작용이 발생할 수 있다. 그러므로, LPS에 대한 항체를 얻기 위하여 동물 주사법이 아닌 혈청으로부터 LPS에 대한 항체를 분리하는 방법이 시도되고 있으며, 주로 해당 항원을 고정한 친화도 크로마토그래피를 이용하는 방법이 사용되고 있으나 수율이 낮은 단점이 있다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는, 동물 주사법이 아닌 혈청으로부터 안전하게 난면역성 항원에 대한 항체를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 이루고자 하는 다른 기술적 과제는, 혈청으로부터 병원체 별로 특이결합성을 갖는 항체를 다량 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 이루고자 하는 또 다른 기술적 과제는, 전술한 이점을 갖는 난면역성 항원의 검출 센서를 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따르면, 혈청 및 제 1 난면역성 항원을 포함하는 제 1 병원체를 혼합하여 제 1 항체-항원 반응 물질을 형성하는 단계; 상기 제 1 항체-항원 반응 물질을 산처리함으로써, 상기 제 1 난면역성 항원에 대한 타겟 항체를 포함하는 제 1 항체를 획득하는 단계; 상기 제 1 병원체에 비하여 상기 제 1 난면역성 항원이 포함되지 아니한 제 2 병원체를 혼합하여 제 2 항체-항원 반응 물질을 형성하는 단계; 및 상기 제 2 항체-항원 반응 물질로부터 상기 제 2 병원체와 반응하지 아니한 상기 타겟 항체를 수득하는 단계를 포함하는 난면역성 항원에 대한 항체를 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있다.

일 실시예에서, 상기 제 1 난면역성 항원은 LPS(Lipopolysaccharide), 당사슬, 지방산(fatty acid), 알러지유발 항원, 농약, 및 살충제를 포함할 수 있으며, 상기 제 1 병원체는 E.Coli BL21, E.Coli DH5a, E.Coli HB101, E.Coli JM110, 및 B.subtills 중 어느 하나 일 수 있다.

또한, 일 실시예에서, 상기 제 2 항체-항원 반응 물질은 항원-항체 반응을 하지 아니하는 상기 타겟 항체, 및 상기 제 1 항체 중 상기 타겟 항체를 제외한 항체 물질들과 상기 제 2 병원체와의 항체-항원 반응 물질을 포함할 수 있고, 상기 타겟 항체를 수득하는 단계는, 상기 제 2 항체-항원 반응 물질을 원심분리함으로써 상기 제 1 항체 중 상기 타겟 항체를 제외한 항체 물질들과 상기 제 2 병원체와의 항체-항원 반응 물질을 포함하는 침전물을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 상기 제 1 항체-항원 반응 물질은 폴리클로날 항체를 포함할 수 있으며, 상기 언급한 스크리닝 방법은 모두 인비트로(in vitro)에서 수행되는 것일 수 있다.

상기 다른 기술적 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 난면역성 항원의 검출 센서는, 기판; 및 상기 기판 상에 형성되며, 난면역성의 타겟 항원에 대한 타겟 항체를 포함하는 항체층을 포함하고, 상기 타겟 항체는 혈청 및 제 1 난면역성 항원을 포함하는 제 1 병원체를 혼합하여 제 1 항체-항원 반응 물질을 형성하고, 상기 제 1 항체-항원 반응 물질을 산처리함으로써, 상기 제 1 난면역성 항원에 대한 타겟 항체를 포함하는 제 1 항체를 획득하며, 상기 제 1 병원체에 비하여 상기 제 1 난면역성 항원이 포함되지 아니한 제 2 병원체를 혼합하여 제 2 항체-항원 반응 물질을 형성하고, 상기 제 2 항체-항원 반응 물질로부터 상기 제 2 병원체와 반응하지 아니한 상기 타겟 항체를 수득하여 획득할 수 있다.

일 실시예에서, 상기 제 1 난면역성 항원은 박테리아의 LPS(Lipopolysaccharide), 당사슬, 지방산(fatty acid), 알러지유발 항원, 농약, 및 살충제를 포함할 수 있으며, 상기 제 1 병원체는 E.Coli BL21, E.Coli DH5a, E.Coli HB101, E.Coli JM110, 및 B.subtills 중 어느 하나일 수 있다.

또한, 일 실시예에서, 상기 제 1 항체-항원 반응 물질은 폴리클로날 항체를 포함할 수 있다. 상기 제 2 항체-항원 반응 물질은 항원-항체 반응을 하지 아니하는 상기 타겟 항체, 및 상기 제 1 항체 중 상기 타겟 항체를 제외한 항체 물질들과 상기 제 2 병원체와의 항체-항원 반응 물질을 포함하는 것인 난면역성 항원의 검출 센서.

일 실시예에서, 상기 제 2 항체-항원 반응 물질을 원심분리함으로써 상기 제 1 항체 중 상기 타겟 항체를 제외한 항체 물질들과 상기 제 2 병원체와의 항체-항원 반응 물질을 포함하는 침전물을 제거함으로써 상기 타겟 항체를 수득할 수 있으며, 상기 타겟 항체는 인비트로(in vitro)에서 수득될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 제 1 난면역성 항원을 포함하는 제 1 병원체를 혼합하여 상기 제 1 난면역성 항원에 대한 타겟 항체를 포함하는 제 1 항체를 획득하고, 상기 제 1 난면역성 항원이 포함되지 아니한 제 2 병원체를 혼합하여 상기 제 2 병원체와 항체-항원 반응을 일으킨 항체들을 제거함으로써 동물 주사법이 아닌 혈청으로부터 안전하게 난면역성 항원에 대한 항체를 스크리닝하는 방법이 제공될 수 있다.

또한, 혈청 내에서 병원체의 타겟 항원에 대한 항체 분리를 위하여 해당 병원체를 직접 사용하고, 상기 타겟 항원이 없는 돌연변이종을 이용하여 비특이적 결합을 일으키는 항체들을 제거하여 효과적으로 병원체별로 특이결합성을 갖는 항체를 스크리닝하는 방법이 제공될 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 전술한 이점을 갖는 난면역성 항원의 검출 센서가 제공될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 난면역성 항원에 대한 항체를 스크리닝하는 방법을 설명하는 순서도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 항체의 분리 과정을 설명하는 개략도이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 항체 스크리닝 과정 중 혈청과 제 1 병원체의 혼합 후 항체의 결합여부를 확인하기 위한 FACS 실험 이미지이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 항체 스크리닝 과정 중 제 1 항원-항체 반응 물질에 산처리하여 항체 물질들을 분리한 결과이다.
도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따른 항체 스크리닝 과정 중 산처리하여 제 1 항원-항체 반응 물질에서 분리된 항체에 제 2 병원체를 혼합하여 결합된 정도를 확인한 FACS 이미지이다.
도 3d는 본 발명의 일 실시예에 따른 항체 스크리닝 과정 중 제 2 병원체와 결합된 항체들을 분리한 결과이다.
도 3e는 본 발명의 일 실시예에 따른 항체 스크리닝 각 과정에서 수득된 단백질들은 분석한 SDS-PAGE 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 스크리닝된 타겟 항체를 제 1 병원체 및 제 2 병원체에 각각 결합시킨 후 결합 정도를 형광으로 분석한 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 스크리닝된 타겟 항체를 제 1 병원체, 제 2 병원체, 및 다양한 종류의 그람음성균 및 그람양성균과 결합시킨 후 결합 정도를 나타내는 FACS 결과이다.
도 6은 본 발명의 다른 실시예에 따른 난면역성 항원의 검출 센서를 나타내는 개략도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 항체 스크리닝 방법으로 분리된 타겟 항체를 플라스틱 기판상에 고정시킨 후 다른 농도의 제 1 병원체 및 제 2 병원체를 각각 처리한 후 결합된 양을 분석한 형광 사진이다.
도 8a 및 도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따른 항체 스크리닝 방법으로 분리된 타겟 항체를 금전극상에 고정시킨 후 각각 제 1 병원체 및 제 2 병원체를 처리하고 결합에 따른 Rct 값의 변화를 측정하기 위한 임피던스 스펙트로스코피 분석 결과이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 실시예들은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위하여 제공되는 것이며, 하기 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 오히려, 이들 실시예는 본 개시를 더욱 충실하고 완전하게 하고, 당업자에게 본 발명의 사상을 완전하게 전달하기 위하여 제공되는 것이다.

도면에서 동일 부호는 동일한 요소를 지칭한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "및/또는"은 해당 열거된 항목 중 어느 하나 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어는 실시예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다. 또한, 본 명세서에서 단수로 기재되어 있다 하더라도, 문맥상 단수를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprise)" 및/또는 "포함하는(comprising)"이란 용어는 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다.

본 명세서에서 기판 또는 다른 층 "상에(on)" 형성된 층에 대한 언급은 상기 기판 또는 다른 층의 바로 위에 형성된 층을 지칭하거나, 상기 기판 또는 다른 층 상에 형성된 중간 층 또는 중간 층들 상에 형성된 층을 지칭할 수도 있다. 또한, 당해 기술 분야에서 숙련된 자들에게 있어서, 다른 형상에 "인접하여(adjacent)" 배치된 구조 또는 형상은 상기 인접하는 형상에 중첩되거나 하부에 배치되는 부분을 가질 수도 있다.

본 명세서에서, "아래로(below)", "위로(above)", "상부의(upper)", "하부의(lower)", "수평의(horizontal)" 또는 "수직의(vertical)"와 같은 상대적 용어들은, 도면들 상에 도시된 바와 같이, 일 구성 부재, 층 또는 영역들이 다른 구성 부재, 층 또는 영역과 갖는 관계를 기술하기 위하여 사용될 수 있다. 이들 용어들은 도면들에 표시된 방향뿐만 아니라 소자의 다른 방향들도 포괄하는 것임을 이해하여야 한다.

이하에서, 본 발명의 실시예들은 본 발명의 이상적인 실시예들(및 중간 구조들)을 개략적으로 도시하는 단면도들을 참조하여 설명될 것이다. 이들 도면들에 있어서, 예를 들면, 부재들의 크기와 형상은 설명의 편의와 명확성을 위하여 과장될 수 있으며, 실제 구현시, 도시된 형상의 변형들이 예상될 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시예는 본 명세서에 도시된 영역의 특정 형상에 제한된 것으로 해석되어서는 아니 된다. 또한, 도면의 부재들의 참조 부호는 도면 전체에 걸쳐 동일한 부재를 지칭한다.

본 발명에서는 포유류가 박테리아에 감염되어 온 결과 선천적인 면역을 가지고 있다는 점에 착안하여, 박테리아 외막 구성요소에 해당하는 항체를 동물 혈청으로부터 직접 분리하는 방법을 제공하고자 한다. 예를 들면, 인간의 경우 오랜 기간 박테리아에 감염되어 왔으며 이로 인하여 박테리아의 외막 단백질 등에 대한 면역을 가지고 있다. 즉, 인간에는 존재하지 않는 해당 박테리아의 외막 구성요소에 대한 항체를 생산하는 B세포를 선천적으로 보유하고 있으며 혈청내에 존재하는 항체(임뮤노글로브린, 혈청내 10 mg/ml이상)중에 해당 항원에 대한 항체를 혈청에 일부 포함하고 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 난면역성 항원에 대한 항체를 스크리닝하는 방법을 설명하는 순서도이고, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 항체의 분리 과정을 설명하는 개략도이다.

도 1 및 도 2를 함께 참조하면, 먼저 난면역성 항원에 특이결합성을 갖는 항체를 스크리닝하기 위하여 시험관 내에서 난면역성 항원인 제 1 항원을 포함하는 제 1 병원체(20)와 혈청(10)을 혼합할 수 있다(S10). 상기 난면역성 항원은 인체 내에서 급성적인 면역계의 활성화 또는 발열과 같은 부작용을 일으켜 동물 주입법으로 항체를 수득하기 어려운 항원을 지칭한다. 상기 난면역성 항원은 박테리아의 LPS(Lipopolysaccharide)와 같은 당사슬, 박테리아의 표면 단백질 및 세포막을 구성하는 지방산(fatty acid), 알러지유발 항원, 농약, 살충제 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 또한, 상기 제 1 병원체는 E.Coli BL21, E.Coli DH5a, E.Coli HB101, E.Coli JM110, 및 B.subtills 중 어느 하나일 수 있다.

예를 들면, 도 2에서 나타낸 바와 같이, 상기 난면역성 항원의 일종인 LPS를 외막에 갖는 제 1 병원체(20)인 박테리아 BL21를 인간의 혈청과 혼합하여 인큐베이팅할 수 있다. 상세하게는, LPS를 외막에 가지고 있는 박테리아인 BL21(농도 107 cells/mL, 부피 1 mL)과 인간혈청(부피 1 mL)를 혼합한 후 1 시간동안 25 ℃ 에 인큐베이션 하였다.

이러한 과정을 통하여 제 1 항체-항원 반응 물질(30)이 형성될 수 있다. 제 1 항체-항원 반응 물질은 상기 난면역성 항원에 대한 항체 물질인 타겟 항체 뿐만 아니라, 제 1 병원체(20)는 다양한 항원을 포함할 수 있으므로 다양한 종류의 항체 물질들을 포함하는 폴리클로날 항체일 수 있다. 또한, 제 1 항체-항원 반응 물질(30)은 반응을 일으키지 아니한 일부의 제 1 병원체(20) 및 잔여 반응물을 포함할 수 있다.

이후, 제 1 항체-항원 반응 물질(30)에 산처리를 함으로써, 상기 난면역성 항원에 대한 타겟 항체(41)를 포함하는 제 1 항체(40)를 획득할 수 있다(S20). 일 실시예에서, 제 1 항체-항원 반응 물질(30)을 11,000 rpm 으로 원심분리한 후, 침전된 제 1 병원체(20)를 분리할 수 있다. 제 1 병원체(20)와 결합된 항체 물질들을 분리하기 위하여 제 1 병원체(20)를 포함하는 용액에 산용액을 처리할 수 있다.

예를 들면, 분리된 제 1 병원체(20)를 포함하는 용액에 Glycine-HCl buffer pH 2.7, 0.1 M 의 산용액을 약 10초간 처리할 수 있다. 산처리된 반응액을 원심분리하여 용액 부분을 분리하면 제 1 병원체(20)와 결합하였던 제 1 항체(40)들을 분리하여 획득할 수 있다. 제 1 항체(40)는 앞서 설명한 바와 같이, 타겟 항체(41) 뿐만 아니라, 제 1 병원체(20)가 갖는 다양한 종류의 항원에 대한 항체 물질들을 포함하고 있다. 제 1 항체(40)로부터 난면역성 항원에 대한 타겟 항체(41)인 모노클로날 항체를 스크리닝하기 위하여 다음과 같은 과정을 진행한다.

타겟 항체를 분리하기 위하여, 제 1 병원체와 동일한 구조를 갖지만 타겟 항체(41)에 대한 난면역성 항원인 제 1 항원만을 포함하지 아니하는 제 2 병원체(50)를 이용할 수 있다. 예를 들면, 제 1 병원체의 일예인 박테리아 BL21의 돌연변이종인 LPS가 외막에 없는 클리어콜리를 분리된 제 1 항체(40) 용액과 혼합한 후 약 1 시간동안 15 내지 30 ℃ 에서 인큐베이션 할 수 있다(S30). 인큐베이션을 통하여, 제 1 항체(40)와 제 2 병원체(50)간의 제 2 항체-항원 반응 물질(60)이 형성될 수 있다. 이러한 반응 산물들은 원심분리를 실시하여 침전은 버리고 용액 부분만을 분리할 수 있다. 일 실시예에서는, 분리된 용액 부분과 제 2 병원체(50)와의 반응을 재실시할 수 있다.

제 2 항체-항원 반응 물질(60)은 타겟 항체(41)를 제외한 항체 물질들과 결합한 제 2 병원체, 항원-항체 결합이 진행되지 아니한 타겟 항체(41), 및 잔여 반응물을 포함할 수 있다. 이러한 제 2 항체-항원 반응 물질(60)로부터 제 2 병원체와 항원-항체 결합하는 항체 물질들 및 잔여 반응물을 제거함으로써 타겟 항체(41)를 획득할 수 있다(S40 및 S50). 일 실시예에서, 단백질 A-크로마토그래피를 실시함으로써 상기 타겟 항체(41)만을 분리할 수 있다. 또한, 타겟 항체(41)에 대하여 BCA키트를 이용하여 단백질의 정량을 실시할 수 있다.

이와 같이, 혈청에 존재하는 타겟 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 분리하기 위하여 해당 항원이 없는 돌연변이종을 이용하여 비특이적 결합을 일으키는 항체를 제거함으로써 효과적으로 타겟 항체를 스크리닝할 수 있다. 이러한 방법은 박테리아 종별로 특이결합성을 갖는 항체를 스크리닝할 수도 있다. 또한, 이러한 항체 스크리닝 방법은 인비트로(in vitro)에서 수행될 수 있으므로, 부작용 때문에 동물 주사법을 이용하여 항체를 생성할 수 없는 난면역성 항원에 대한 항체를 안전하게 획득할 수 있도록 한다.

도 3a는 본 발명의 실시예에 따른 항체 스크리닝 과정 중 혈청과 제 1 병원체의 혼합 후 항체의 결합여부를 확인하기 위한 FACS 실험 이미지이다.

도 3a를 도 1 및 도 2와 함께 참조하면, S10 단계와 같이 제 1 항원을 포함하는 제 1 병원체인 LPS를 외막에 가지고 있는 박테리아 BL21와 인간의 혈청를 혼합하면 제 1 병원체의 외막에 제 1 항체가 결합됨을 확인할 수 있다. 인간 혈청 처리 전후 LPS를 외막에 가지고 있는 박테리아인 BL21를 형광이 레이블된 anti-hIgG로 처리후 FACS로 분석한 결과를 보면, 혈청처리 전의 경우는 형광이 거의 나타나지 않았고 혈청처리 후의 경우 형광이 관찰됨을 알 수 있다. 따라서, 제 1 병원체와 혈청의 혼합시 제 1 병원체의 외막에 항체 물질들이 결합되었음을 나타낸다.

도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 항체 스크리닝 과정 중 제 1 항원-항체 반응 물질에 산처리하여 항체 물질들을 분리한 결과이다.

도 3b를 참조하면, LPS를 외막에 가지고 있는 박테리아인 BL21와 인간 혈청를 혼합한 후, 결합된 항체를 각각 다른 산처리 시간으로 박테리아에서 분리하여 확인한 결과, 항체의 헤비 체인(heavy chain)은 55 kDa의 분자량을 가짐을 확인할 수 있다. 또한, 10초, 1분, 및 3분간의 산처리에 따른 단백질 수득량을 비교해 보면, 산처리 시간이 길수록 단백질의 수득량이 증가함을 알 수 있다.

도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따른 항체 스크리닝 과정 중 산처리하여 제 1 항원-항체 반응 물질에서 분리된 항체에 제 2 병원체를 혼합하여 결합된 정도를 확인한 FACS 이미지이다.

제 1 병원체 및 혈청을 혼합하여 제 1 항체가 형성된 후, 산용액으로 분리시 각각 다른 시간동안 분리를 진행시킨 제 1 항체를 다시 박테리아에 결합시켜 결합된 정도를 FACS로 측정하였다. 상세하게는, 10초, 1분, 및 3분 간의 산처리에 따라 얻어진 항체를 박테리아에 다시 결합시키고 형광이 레이블된 anti-hIgG로 처리후 FACS로 분석하였다. 도 3c에서 나타난 바와 같이, 가장 짧은 산처리시간 (10초)의 경우 가장 높은 형광이 관찰되어 이때 사용된 항체가 가장 높은 박테리아 결합활성을 나타내는 것을 알 수 있다. 이상의 결과를 토대로 본 발명의 실시예에서는 산처리시간을 10초로 선택하였다.

도 3d는 본 발명의 일 실시예에 따른 항체 스크리닝 과정 중 제 2 병원체와 결합된 항체들을 분리한 결과이다.

일 실시예에서, 도 1의 S30 단계를 이용하여 분리된 제 1 항체에 난면역성 항원을 제외한 항원들을 갖는 제 2 병원체를 혼합할 수 있다. 예를 들면, 제 2 병원체는 외막에 LPS만을 가지지 아니하는 박테리아 BL21의 돌연변이종인 클리어콜리일 수 있다. 따라서, 이러한 제 2 병원체를 혼합하는 경우, 제 1 항체 중 외막에 존재하는 LPS에 결합하는 항체인 타겟 항체는 결합하지 않지만, 외막에 존재하는 타 단백질 등의 요소에 결합하는 항체는 클리어콜리에 결합할 것으로 판단된다.

도 3d에서 나타난 바와 같이, 박테리아 BL21에 결합하여 분리된 항체를 클리어콜리에 결합시키고 형광이 레이블된 anti-hIgG로 처리후 FACS로 분석한 결과 처음 처리한 경우 많은 항체가 결합된 것으로 확인되었다. 그러나, 두 번, 세 번 반복시에는 거의 결합된 항체가 없는 것으로 보아 한번의 클리어콜리 처리를 통해 타겟 항체 이외의 박테리아 BL21 외막에 존재하는 타 요소에 결합하는 항체는 거의 제거된 것으로 판단된다.

도 3e는 본 발명의 일 실시예에 따른 항체 스크리닝 각 과정에서 수득된 단백질들을 분석한 SDS-PAGE 결과이다.

도 3e를 참조하면, 도 1의 S10 단계 이후 분리된 단백질들은 제 1 항체의 긴 체인 (70 kDa)과 짧은 체인 (26 kDa)인 것으로 판단된다. 또한, 각 과정의 단계가 진행될수록 약 70 kDa 보다 조금 작은 분자량을 갖는 긴 체인을 갖는 제 1 항체가 더 수득됨을 알 수 있다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 스크리닝된 타겟 항체를 제 1 병원체 및 제 2 병원체에 각각 결합시킨 후 결합 정도를 형광으로 분석한 것이다.

도 4에서 사용되는 제 1 병원체(박테리아 BL21)와 제 2 병원체(클리오콜리)는 각각 녹색형광단백질(GFP)를 세포내에 발현하도록 유전자조작을 진행하였다. 도 4를 참조하면, 488mn의 필터를 통과하여 촬영한 형광이미지에서는 박테리아 BL21과 클리어콜리에서 각각 녹색형광이 관찰되었다. 이후, 형광 물질이 레이블된 타겟 항체를 제 1 병원체 및 제 2 병원체와 결합시킨 후, 530nm의 필터를 통과하여 형광이미지를 촬영하였다.

이와 같이 촬영된 형광이미지에서는 제 1 병원체만이 붉은 형광을 띄었다. 이는 본 발명의 일 실시예에 따른 항체 스크리닝 방법으로 분리된 항체를 제 1 병원체(박테리아 BL21)과 제 2 병원체(클리어콜리)에 각각 결합시킨 경우 분리한 항체는 박테리아인 BL21에만 특이하게 결합하는 것을 보여준다. 다시 말해, 제 1 병원체 및 제 2 병원체에서의 결합 차이로 볼 때, 본 발명의 일 실시예에 따른 타겟 항체는 난면역성 항원인 박테리아 BL21의 외막에 존재하는 LPS에 선택적으로 결합하는 것을 보여준다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 스크리닝된 타겟 항체를 제 1 병원체, 제 2 병원체, 및 다양한 종류의 그람음성균 및 그람양성균과 결합시킨 후 결합 정도를 나타내는 FACS 결과이다.

일 실시예에서, 제 1 병원체는 박테리아 BL21, 제 2 병원체는 클리어콜리일 수 있고, 그람 음성균은 DH5알파, HP101, 및 JM110 이며, 그람 양성균인 B.subtilis 일 수 있다. 상기 방법으로 획득한 타겟 항체를 각각의 박테리아에 처리후 형광이 레이블된 anti-hIgG로 처리하고 FACS로 형광을 관찰하였다. 도 5를 참조하면, 타겟 항체는 제 1 병원체에 선택적으로 결합됨을 보여주며 나머지 박테리아의 경우 유사한 정도의 형광치를 보여주었다. 이는 LPS를 갖는 그람 음성균의 경우에도 선택적인 결과를 보여주므로 분리된 항체가 박테리아 BL21의 LPS에만 결합함을 알 수 있으며, 실시예의 방법으로 항체를 분리할 경우 박테리아의 종에 따른 LPS에 대한 항체를 얻을 수 있음을 보여준다.

도 6은 본 발명의 다른 실시예에 따른 난면역성 항원의 검출 센서를 나타내는 개략도이다.

도 6을 참조하면, 난면역성 항원의 검출 센서(1000)는 기판(100) 및 항체층(200)을 포함할 수 있다. 기판(100)은 고분자 재료 또는 금속 재료일 수 있다. 상기 고분자 재료는 폴리카프로락톤 [poly(ε-caprolactone)], 폴리디옥사논 (polydioxanone), 폴리락틱산 [poly(lactic acid)], 폴리글리콜산 [poly(glycolicacid)], 폴리락틱산-글리콜산 공중합체 [poly(lactic acid-co-glycolic acid)], 폴리하이드로시부티레이트 ([poly(β-hydroxybutyrate)]와 폴리하이드록시부티릭산-하이드록시발러릭산 공중합체 (polyhydroxybutyric acid-cohydroxyvalericacid), 폴리(γ-에틸 글루타메이트) [poly(γ-ethyl glutamate)], 폴리안하이드라이드 공중합체 (polyanhydrides), 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱산 공중합체 (polyethylene oxide-polylactic acid), 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱글리콜산 공중합체 (polyethyleneoxidepolylactic-co-glycolic acid) 공중합체, 및 폴리에틸렌옥사이드-폴리카프로락톤 공중합체 (polyethylene oxide-polycaprolactone) 중 어느 하나 이상일 수 있다. 또한, 상기 금속 재료는 탄탈륨(Ta), 주석(Sn), 텅스텐(W), 아연(Zn), 바나듐(V), 루테늄(Ru), 이리듐(Ir), 철(Fe, 스테인레스 스틸) 또는 이들의 합금을 포함할 수 있다.

항체층(200)은 기판(100) 상에 형성되며, 타겟 항원에 대한 타겟 항체(41)을 포함할 수 있다. 항체층(200)은 기판(100) 상에 생물학적 결합 또는 화학적 결합 방법으로 고정될 수 있으며, 이러한 고정 방법은 한정되지 아니한다. 항체층(200)에 포함되는 타겟 항체(41)는 도 1 내지 도 5를 참조하여 설명된 항체 스크리닝 방법을 이용하여 획득된 항체이며, 이로 인하여 타겟 항체(41)와 결합하는 난면역성 항원을 포함하는 병원체만을 검출할 수 있다.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 항체 스크리닝 방법으로 분리된 타겟 항체를 플라스틱 기판상에 고정시킨 후 다른 농도의 제 1 병원체 및 제 2 병원체를 각각 처리한 후 결합된 양을 분석한 형광 사진이다.

도 7을 참조하면, 사용된 박테리아 BL21과 클리오콜리는 각각 녹색형광단백질(GFP)를 세포내에 발현하도록 유전자조작을 진행하였다. 사진에서 보이는 바와 같이 모재상에 같은 농도의 분리된 항체를 고정한 후 박테리아 BL21과 클리어콜리를 처리한 결과 박테리아 BL21의 경우에만 결합된 것으로 관찰되었다. 또한, 처리한 박테리아 BL21의 농도에 따라 그에 비례하는 숫자의 박테리아가 항체가 고정된 모재에 결합된 것으로 확인 되었다. 이상의 결과는 모재에 분리된 항체를 결합하는 경우 특이결합을 일으키는 박테리아 BL21의 선택적인 검출이 가능함을 보여준다.

도 8a 및 도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따른 항체 스크리닝 방법으로 분리된 타겟 항체를 금전극상에 고정시킨 후 각각 제 1 병원체 및 제 2 병원체를 처리하고 결합에 따른 Rct 값의 변화를 측정하기 위한 임피던스 스펙트로스코피 분석 결과이다. Rct값은 전극으로 이온이 전달될 때의 저항값으로 임피던스 커브의 x축 교차점으로 측정된다.

도 8a에서 나타난 바와 같이 항체고정, BSA단백질 고정 등의 과정시 전극표면에 단백질 결합에 따라 Rct값이 증가하는 것으로 관찰된다. 박테리아 BL21을 처리하는 경우 Rct값이 증가하는 것으로 관찰되며, 이러한 결과는 박테리아가 전극표면에 결합되었음을 나타낸다.

도 8b를 참조하면, 항체고정, BSA단백질 고정 등의 과정시 전극표면에 단백질 결합에 따라 Rct값이 증가하는 것으로 도 8a과 유사하게 관찰된다. 그러나, 박테리아 BL21을 처리하는 경우와 달리 같은 농도의 클리어콜리를 처리하는 경우 Rct값이 증가하지 않는 것으로 관찰되며, 이는 클리어콜리가 박테리아가 전극표면에 결합되지 않는 것으로 판단된다. 즉, 도 8a와 도 8b의 결과는 전극의 표면에 분리된 LPS에 대한 항체를 고정하는 경우 박테리아 BL21이 전극의 표면에 선택적으로 결합됨을 보여준다. 따라서, 전극에 분리된 항체를 고정하는 경우 박테리아 BL21을 선택적으로 탐지할 수 있는 센서의 개발이 가능함을 보여준다.

전술한 것과 같이, 본 발명의 다양한 실시예들에 따른 혈청내 항체의 분리방법과 분리된 항체를 이용하는 방법을 상세하게 설명하였다. 본 발명의 항원은 LPS에 대한 실시예와 같이 박테리아의 외막에 존재하는 요소들에 대한 분리를 가능하게 하는 방법을 제공한다. 뿐만 아니라 동물의 생리활성을 방해하여 항체생산이 어려운 다양한 항원에 대한 항체생산 방법을 제공한다. 또한, 분리된 항체는 실시예에 보인 박테리아 BL21 뿐아니라 다양한 박테리아에 사용이 가능하다.

하지만, 본 발명이 속한 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 범위 내에서 상기 구성에 대한 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 범위는 오직 하기의 특허청구범위에 의해서만 한정된다.

Claims (14)

1. 동물에서 분리된 혈청 및 LPS(Lipopolysaccharide)를 포함하는 제 1 박테리아를 혼합하여 제 1 항체-항원 반응 물질을 형성하는 단계;
   상기 제 1 항체-항원 반응 물질을 산처리함으로써, 상기 LPS에 대한 타겟 항체를 포함하는 제 1 항체를 획득하는 단계;
   상기 제 1 박테리아에 비하여 상기 LPS이 포함되지 아니한 제 2 박테리아를 혼합하여 제 2 항체-항원 반응 물질을 형성하는 단계; 및
   상기 제 2 항체-항원 반응 물질로부터 상기 제 2 박테리아와 반응하지 아니한 상기 타겟 항체를 수득하는 단계를 포함하는 LPS에 대한 항체를 스크리닝하는 방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 제 1 항체-항원 반응 물질은 폴리클로날 항체를 포함하는 LPS에 대한 항체를 스크리닝하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 제 2 항체-항원 반응 물질은 항원-항체 반응을 하지 아니하는 상기 타겟 항체, 및 상기 제 1 항체 중 상기 타겟 항체를 제외한 항체 물질들과 상기 제 2 박테리아와의 항체-항원 반응 물질을 포함하는 것인 LPS에 대한 항체를 스크리닝하는 방법.
6. 제 5 항에 있어서,
   상기 타겟 항체를 수득하는 단계는,
   상기 제 2 항체-항원 반응 물질을 원심분리함으로써 상기 제 1 항체 중 상기 타겟 항체를 제외한 항체 물질들과 상기 제 2 박테리아와의 항체-항원 반응 물질을 포함하는 침전물을 제거하는 단계를 더 포함하는 LPS에 대한 항체를 스크리닝하는 방법.
7. 제 1 항의 스크리닝 방법은 인비트로(in vitro)에서 수행되는 것인 LPS에 대한 항체를 스크리닝하는 방법.
8. 기판; 및
   상기 기판 상에 형성되며, LPS(Lipopolysaccharide)에 대한 타겟 항체를 포함하는 항체층을 포함하고,
   상기 타겟 항체는 동물로부터 분리된 혈청 및 상기 LPS을 포함하는 제 1 박테리아를 혼합하여 제 1 항체-항원 반응 물질을 형성하고, 상기 제 1 항체-항원 반응 물질을 산처리함으로써, 상기 LPS에 대한 타겟 항체를 포함하는 제 1 항체를 획득하며, 상기 제 1 박테리아에 비하여 상기 LPS이 포함되지 아니한 제 2 박테리아를 혼합하여 제 2 항체-항원 반응 물질을 형성하고, 상기 제 2 항체-항원 반응 물질로부터 상기 제 2 박테리아와 반응하지 아니한 상기 타겟 항체를 수득하여 획득하는 LPS의 검출 센서.
9. 삭제
10. 삭제
11. 제 8 항에 있어서,
    상기 제 1 항체-항원 반응 물질은 폴리클로날 항체를 포함하는 LPS의 검출 센서.
12. 제 8 항에 있어서,
    상기 제 2 항체-항원 반응 물질은 항원-항체 반응을 하지 아니하는 상기 타겟 항체, 및 상기 제 1 항체 중 상기 타겟 항체를 제외한 항체 물질들과 상기 제 2 박테리아와의 항체-항원 반응 물질을 포함하는 것인 LPS의 검출 센서.
13. 제 12 항에 있어서,
    상기 제 2 항체-항원 반응 물질을 원심분리함으로써 상기 제 1 항체 중 상기 타겟 항체를 제외한 항체 물질들과 상기 제 2 박테리아와의 항체-항원 반응 물질을 포함하는 침전물을 제거함으로써 상기 타겟 항체를 수득하는 LPS의 검출 센서.
14. 제 8 항에 있어서,
    상기 타겟 항체는 인비트로(in vitro)에서 수득되는 것인 LPS의 검출 센서.

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