KR102091792B1 - 5-HT2c receptor 길항 물질의 탐색 방법 - Google Patents

5-HT2c receptor 길항 물질의 탐색 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102091792B1
KR102091792B1 KR1020180072610A KR20180072610A KR102091792B1 KR 102091792 B1 KR102091792 B1 KR 102091792B1 KR 1020180072610 A KR1020180072610 A KR 1020180072610A KR 20180072610 A KR20180072610 A KR 20180072610A KR 102091792 B1 KR102091792 B1 KR 102091792B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ht2c receptor
tryptamine
receptor
ht2c
sleep
Prior art date
Application number
KR1020180072610A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20200000597A (ko
Inventor
강인철
Original Assignee
주식회사 이노파마스크린
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 이노파마스크린 filed Critical 주식회사 이노파마스크린
Priority to KR1020180072610A priority Critical patent/KR102091792B1/ko
Publication of KR20200000597A publication Critical patent/KR20200000597A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102091792B1 publication Critical patent/KR102091792B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

본 발명은 단백질 칩을 이용하여 식용식물 추출물로부터 5-HT2c receptor 에 대한 길항 작용을 가지는 식용식물 추출물을 초고속 대량으로 탐색하는 방법에 관한 발명이다. 상기 본 발명에 따라 탐색되는 5-HT2c receptor 에 길항 활성을 가지는 식용식물 추출물은 5-HT2c receptor - 길항 물질로서 수면의 질을 향상시키는데 좋은 효과를 가질 수 있다.

Description

5-HT2c receptor 길항 물질의 탐색 방법{Screening Method for 5-HT2c receptor antagonists}
본 발명은 단백질 칩을 이용하여 5-HT2c receptor 의 길항물질을 초고속 탐색하는 방법에 관한 발명이다.
포유동물에서 수면은 REM 수면과 NREM 수면의 두 가지 중요 단계로 구성된다. REM 수면은 NREM 수면 사건 이후 일어나는 독특한 수면 단계이다. 쥐에서 자발적으로 일어나는 NREM-REM 수면 순환은 12분에서20분 걸린다(Vivaldi E.A., Wyneken U., Roncagliolo M., Ocampo A., Zapata A.M., Sleep. 1994;17:208-19., Gottesmann C., Neurosci.Bibobehav.Rev. 1996;20:367-87., Datta S., Hobson J.A., Behav.Neurosci. 2000;114:1239-44., Alam M.N., McGinty D., Szymusiak R., Am.J.Physiol. 1995;269:R1240-9., Thakkar M.M., Strecker R.E., McCarley R.W., J.Neurosci. 1998;18:5490-7.).
그것들은 NREM 수면에는 4 단계가 있으며 더 많은 단계가 진행됨에 따라 깊은 수면이 된다(Chae KY., Korean Journal of Pediatrics. 2007;50(8):711-7.). NREM 수면은 수면의 질과 관련이 있다. 5HT2c receptors가 결핍된 쥐는 WT쥐 보다 NREM 수면이 적었고 더 늦게 일어났으며, 특히 24시간의 어두운 시기에 보여졌다(Frank MG, Stryker MP, Tecott LH., Neuropsychopharmacology 2002;27(5):869-73.).
Serotonin(5-HT) 2 receptors는 3가지 subtype(5-HT2a, 5-HT2b, 그리고 5-HT2c receptors)으로 분류되며 수면에 중요한 역할을 한다(PPA Humphrey, P Hartig, D Hoyer, Trends Pharmacol Sci. 1993;14:233-6).
인간 뇌에 5-HT2b의 결합 부위가 존재하는지 여부가 명확하게 밝혀지지는 않았지만, 5-HT2a는 고전적인 5-HT2 수용체와 동일할 수 있다. 그러나 느린 파장 수면을 조절하는 것은 5-HT2a receptors 보다 5-HT2c receptors 가 더 중요하다(Sharpley AL, Elliott JM, Attenburrow M-J, Cowen PJ, Neuropharmacology. 1994;33:467-71).
5-HT2c receptors의 역할은 rapid eye movement(REM) sleep 과 non rapid eye mevement(NREM) 수면 둘 다 조절하는데 중요하다(Reidun Ursin., Sleep Medicine Reviews. 2002;6(1):57-69.).
[선행특허 문헌]
대한민국 특허공개번호 제1020110134654호
본 발명은 상기의 필요성을 해결하기 위하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 5-HT2c receptor 에 대해 뛰어난 길항 작용을 가지는 식용식물을 식용식물 추출물로부터 초고속 대량으로 탐색하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 superepoxy2 가 코팅된 표면을 가지는 단백질 칩 상에 5-HT2c 수용체(receptor)를 부착하는 단계; 상기 5-HT2c 수용체가 부착된 단백질 칩에 형광 물질이 부착된 리간드 물질 및 다수의 식용식물 추출물을 반응시키는 단계; 상기 반응이 완료된 단백질 칩을 완충용액으로 세척하는 단계; 및 상기 세척된 단백질 칩 상에서, 상기 다수의 식용식물 추출물이 각각 반응한 스팟들의 형광 발현 강도를 비교하여, 상대적으로 형광 강도가 낮은 스팟에 반응한 식용식물 추출물을 5-HT2c receptor 에 대한 길항물질로 판별하는 단계를 포함하는 5-HT2c receptor 길항물질의 탐색방법을 제공한다.
또한 본 발명은 길경 에탄올 추출물, 고삼 에탄올추출물, 및 대두 에탄올 추출물 중 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는 5-HT2c 수용체 길항용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 전술한 방법에 의해 탐색된 5-HT2c receptor 에 길항 작용을 갖는 식용식물 추출물을 특징으로 하는 수면장애 치료 및 예방용 약학적 또는 수면증진 기능성 식품의 조성물을 제공한다. 기타 실시 예들의 구체적인 사항들은 발명의 실시를 위한 구체적인 내용 및 도면들에 포함되어 있다.
상기한 본 발명에 의하는 경우, 식용식물 추출물로부터 5-HT2c receptor 길항 활성을 가지는 식용식물 추출물을 초고속 대량 탐색할 수 있다. 상기 본 발명에 따라 탐색된 5-HT2c receptor 에 길항 활성을 가지는 식용식물 추출물은 우수한 5-HT2c receptor 길항 물질로서, 수면장애 치료 및 예방용 약학적 의약(medicines) 또는 수면 질 향상을 위한 기능성 식품에서 유효성을 더욱 높일 수 있다.
도 1은 5-HT receptor 2c - Cy5-트립타민의 상호작용을 나타내는 형과스캔 사진이며,
도 2는 5-HT receptor 2c - Cy5-트립타민의 상호작용을 나타내는 도1의 결과를 도표로 나타내는 그래프이며,
도 3은 5-HT receptor 2c - Cy5-트립타민의 상호작용을 식용작물 추출물에 의해 농도별 억제됨을 나타내는 실험결과와 그 형광스캔 사진이며,
도 4는 5-HT receptor 2c - Cy5-트립타민의 상호작용을 식용작물 추출물에 의해 농도별 억제됨을 나타내는 실험결과와 그 그래프이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 예를 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 단백질 칩으로는 SuperEpoxy2 슬라이드 (Arrayit® Corporation, CA, USA) 가 이용될 수 있다. 상기 SuperEpoxy2 슬라이드에 5-HT2c receptor를 부착시켜 수용체 단일 층을 구성한 후, 형광물질로 표시된 리간드 물질과 식용작물 추출물을 혼합하여 리간드 결합을 방해하는 최적의 식용작물 추출물을 초고속 대량 탐색할 수 있는지를 실험하였다.
실시예 1: 단백질 칩 상에 5- HT2c receptor 의 고정화
단백질 칩으로 SuperEpoxy2 슬라이드 (Arrayit® Corporation, CA, USA)를 사용하였으며, SuperEpoxy2 슬라이드 상에 접착식 시트지를 이용하여 well-chip을 준비 후, 5-HT2c receptor 단백질 (perkinelmer inc., MA, USA)을 스팟팅하여 5-HT2c receptor 마이크로어레이(5-HT2c receptor 부착 단백질 칩)를 구성하였다. 여기에서, 5-HT2c receptor 는 30% 글리세롤 용액을 함유하는 인산-완충 생리식염수(phosphate-buffered saline; PBS)로 50㎍/㎖까지 희석한 다음 사용하였다. 상기 희석된 5-HT2c receptor 를 스팟팅하고 4℃에서 밤새 반응시킨 다음, 결합하고 남은 5-HT2c receptor 를 0.1% 트윈-20을 함유한 인산-완충 생리식염수(0.1% PBST)로 세척하였다. 제조된 5-HT2c receptor 마이크로어레이를 사용시까지 4℃에서 보관하였다.
실시예 2: 5 - HT2c receptor 마이크로어레이를 이용하여 식용작물 추출물로부터 5-HT2c receptor 길항 식용작물 추출물 초고속 대량 탐색
2-1) 형광표지 부착 트립타민(Tryptamine)과 식용작물 추출물 라이브러리 혼합 용액의 제조
수용체-리간드 결합 반응 실험을 위해 형광물질(Cy-5; Amersham Parmacia
Biotech, Uppsala Sweden)로 표지한 리간드 물질(Tryptamine)을 펩트론에서 합성하여 구매하였고, 식용작물 추출물 (1000 ~ 0㎍/㎖)과 Cy5-트립타민(1mM)을 혼합하여 각각의 혼합 용액을 제조하였다. 상기 리간드 물질과 식용작물 추출물 라이브러리들은 10mM MgCl2, 1mM EDTA, 0.1% BSA를 함유하는 50mM Tris-Hcl, pH 7.4 완충용액으로 희석시켜 사용하였다.
2-2) 5-HT2c receptor 와 Cy5-트립타민의 상호작용
5-HT2c receptor 와 Cy5-트립타민의 상호작용을 알아보기 위하여, 실시예 1에서 제조한 5-HT2c receptor 마이크로어레이를 1시간 동안 3% BSA로 블로킹하고 0.1% PBST 용액으로 두 번 세척하였다. 그런 다음, 상기 5-HT2c receptor 마이크로어레이에 0mM 에서 1mM 범위 농도의 Cy5로 형광 표지된 트립타민을 스팟팅하여 반응시켰다. 도면1은 5-HT2c receptor - Cy5-트립타민의 상호작용을 나타내는 형광 스캔 사진이다. 도면2는 5-HT2c receptor - Cy5-트립타민의 용량-반응 곡선을 나타내는 그래프이다.
상기 도면 1 및 도면 2에서, 5-HT2c receptor 는 Cy5로 표지된 트립타민과 잘 작용하는 것으로 나타났다. 이 중에서도 약 1mM의 농도에서 트립타민은 포화 반응을 나타내었다. 이로 인해 상기 5-HT2c receptor 마이크로어레이는 상기 5-HT2c receptor 를 위한 길항 물질의 탐색을 위해 유효하고 적절한 것을 알 수 있다.
2-3) 5-HT2c receptor 길항 식용작물 추출물 초고속 대량 탐색
실시예 1에서 제조한 5-HT2c receptor 마이크로어레이를 1시간 동안 3% BSA로 블로킹하고 0.1% PBST로 두 번 세척하였다. 그런 다음, 상기 제조한 각각의 추출물과 Cy5-트립타민을 함유하는 혼합 용액을 칩 표면에 고정된 5-HT2c receptor 위에 스팟팅한 후, 30℃, 습도 70%인 조건에서 한 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 0.1% PBST 용액으로 세척한 다음, 형광 레이저 스캐너를 이용하여 리간드 결합 정도를 상대적 형광 세기로 분석함으로써 추출물의 경쟁적 길항 능력을 측정하였다. 그 결과, 추출물 중에서 농도의존적인 형광 세기를 나타내는 것으로 나타나, 이 식용식물 추출물이 5-HT2c receptor - Cy5-트립타민 결합 반응을 효과적으로 억제하는 것임을 증명하였다(도 3).
도 3, 및 도 4는 식용작물 추출물이 5-HT2c receptor 와 Cy5-트립타민의 상호작용을 억제하는지를 알아보기 위해 실험한 결과이다.
상기 실험에서, 양성(positive) 대조군은 형광 물질로 표지된 트립타민만 반응시킨 것을 사용하여 실험한 것이고, 음성(negative) 대조군은 향부자를 처리한 것을 사용하여 실험하였다.
도 1에서 형광의 강도는 무지개 색깔로 표현된다. 원래는 Cy5 형광다이의 색상은 보통 빨강색인 하나의 색상으로 결과가 나오나 이 경우 형광 강도를 쉽게 보기가 어려워 기기의 분석 소프트웨어를 이용하여 형광 강도에 따라 색깔의 변화를 주게 되어 있다.
보통 형광 강도가 가장 강한 경우 흰색부터 빨강, 주황, 노랑, 초록, 파랑의 순으로 형광 강도를 표현하게 된다. 도 3의 결과에서 양성대조군을 보면, 낮은 농도의 추출물과 Cy5-트립타민 그리고 Cy5-트립타민만 처리하여 반응시킨 것의 경우 색깔이 흰색 또는 빨간색으로 5-HT2c receptor 와 Cy5-트립타민이 상호작용을 하는 것을 알 수 있다. 그러나, 높은 농도의 추출물과 Cy5-트립타민을 처리한 실험에서는 5-HT2c receptor 와 Cy5-트립타민의 상호작용이 감소하여 5-HT2c receptor에 Cy5-트립타민이 결합하지 않아 형광이 낮은 녹색 또는 파란색으로 나타나고 있다.
따라서 3종의 식용작물 추출물(길경 에탄올 추출물, 고삼 에탄올추출물, 대두 에탄올 추출물)이 5-HT2c receptor 에 대한 결합력을 가지는 물질이며 길항능력을 가진 물질임을 증명하는 것이다(도 3, 도 4).

Claims (2)

  1. 삭제
  2. 길경 에탄올 추출물, 또는 고삼 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 5-HT2c 수용체와 이의 형광 리간드의 결합을 경쟁적으로 억제하는 조성물.
KR1020180072610A 2018-06-25 2018-06-25 5-HT2c receptor 길항 물질의 탐색 방법 KR102091792B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180072610A KR102091792B1 (ko) 2018-06-25 2018-06-25 5-HT2c receptor 길항 물질의 탐색 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180072610A KR102091792B1 (ko) 2018-06-25 2018-06-25 5-HT2c receptor 길항 물질의 탐색 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200000597A KR20200000597A (ko) 2020-01-03
KR102091792B1 true KR102091792B1 (ko) 2020-03-20

Family

ID=69155421

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180072610A KR102091792B1 (ko) 2018-06-25 2018-06-25 5-HT2c receptor 길항 물질의 탐색 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102091792B1 (ko)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101861784B1 (ko) * 2016-09-02 2018-05-28 대전대학교 산학협력단 한약재 추출물（ｃｊｓ０３）을 함유하는 불면증 개선, 예방 또는 치료용 조성물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CDI Laboratories, 'HuProt™ Human Proteome Microarray v3.1', User Quide, 2014. 1부.*
한민규 et al., 'Protein Chip의 개발 현황과 응용', 한국바이오칩학회, 2007, pp 3-8. 1부.*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200000597A (ko) 2020-01-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rabindran et al. Antitumor activity of HKI-272, an orally active, irreversible inhibitor of the HER-2 tyrosine kinase
Levitzki Tyrphostins: tyrosine kinase blockers as novel antiproliferative agents and dissectors of signal transduction
CN101678029B (zh) 基于嘌呤的cdk抑制剂与酪氨酸激酶抑制剂的组合及其在治疗增生性疾病中的用途
Ottolini et al. Calcium signals that determine vascular resistance
Wedge et al. AZD2171: a highly potent, orally bioavailable, vascular endothelial growth factor receptor-2 tyrosine kinase inhibitor for the treatment of cancer
JP2022009090A (ja) 癌を治療するためのｋｒａｓ阻害剤の投与
RU2569749C2 (ru) Производные пурина, предназначенные для применения для лечения заболеваний, связанных с баф (белок-активатор фибробластов)
CN1832939B (zh) 用于治疗癌症或病毒病的三杂环化合物、组合物和方法
Liu et al. Effects of the tyrosine protein kinase inhibitor genistein on the proliferation, activation of cultured rat hepatic stellate cells
KR102584344B1 (ko) 병용 의약
CN102348708A (zh) 激酶抑制剂的前药形式及其在治疗中的用途
US20090082406A1 (en) Cancer Therapy
CN106456635A (zh) Mdm2抑制剂的间歇给药
AU2017220611A1 (en) TAF1 inhibitors for the therapy of cancer
Negi et al. Recent advancements in small molecule inhibitors of insulin–like growth factor-1 receptor (IGF-1R) tyrosine kinase as anticancer agents
Fadri-Moskwik et al. Aurora B is regulated by acetylation/deacetylation during mitosis in prostate cancer cells
KR102091792B1 (ko) 5-HT2c receptor 길항 물질의 탐색 방법
Das et al. Irreversible kinase inhibitors targeting cysteine residues and their applications in cancer therapy
CN102724962A (zh) 包衣药物球状体及其用于消除或减少病症比如呕吐和腹泻的用途
WO1997034920A1 (en) Assays for kdr/flk-1 receptor tyrosine kinase inhibitors
Prothero et al. Inhibition by inorganic ions of a sustained calcium signal evoked by activation of mGlu5 receptors in rat cortical neurons and glia
CN1511036B (zh) 包含信号转导抑制剂和埃坡霉素衍生物的联合形式
Takaoka et al. Effect of combining epidermal growth factor receptor inhibitors and cisplatin on proliferation and apoptosis of oral squamous cell carcinoma cells
KR20230163362A (ko) 유방암 치료용 약제학적 조성물 및 이의 사용 방법
KR20140032916A (ko) 에틸（２―메틸―３―｛（Ｅ）―［（나프타［２，１―ｂ］퓨란―２―일카보닐）하이드라조노］메틸｝―1Ｈ―인돌―1―일）아세테이트, 이의 유사체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant