KR102091528B1 - 인삼 농축액을 포함하는 간질환 개선용 조성물 - Google Patents

인삼 농축액을 포함하는 간질환 개선용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR102091528B1
KR102091528B1 KR1020180167612A KR20180167612A KR102091528B1 KR 102091528 B1 KR102091528 B1 KR 102091528B1 KR 1020180167612 A KR1020180167612 A KR 1020180167612A KR 20180167612 A KR20180167612 A KR 20180167612A KR 102091528 B1 KR102091528 B1 KR 102091528B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
malonyl
ginsenosides
ginsenoside
ethanol
total
Prior art date
Application number
KR1020180167612A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190000863A (ko
Inventor
표미경
오명환
이환
정종태
조윤호
Original Assignee
재단법인 금산국제인삼약초연구소
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 재단법인 금산국제인삼약초연구소 filed Critical 재단법인 금산국제인삼약초연구소
Priority to KR1020180167612A priority Critical patent/KR102091528B1/ko
Publication of KR20190000863A publication Critical patent/KR20190000863A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102091528B1 publication Critical patent/KR102091528B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/03—Organic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/20—Natural extracts
    • A23V2250/21—Plant extracts
    • A23V2250/2124—Ginseng

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 말로닐 진세노사이드를 유효성분으로 하는 간질환 치료, 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것으로 간 효소인 ALT(Alanine transaminase) 및 AST(Aspartate transaminase)의 농도 감소, 염증 감소, 일산화질소의 생성 억제을 억제하여 간질환을 개선, 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

인삼 농축액을 포함하는 간질환 개선용 조성물{Composition for treating liver diseases contain ginseng extracts}
본 발명은 인삼 농축액을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 질병 개선 또는 치료에 관한 발명이다.
인삼에는 사포닌계 성분인 진세노사이드가 다량 포함되어 있다.
일반적으로 잘 알려진 진세노사이드(ginsenoside)의 종류로 Ra, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg1, Rg1, Rh, Rs, Rf, Re, Ro, F, K 등이 있다. 진세노사이드는 성분에 따라 각각 적합한 질병의 치료, 완화 및 예방을 위한 약학 성분이나 건강식품으로 사용되고 있다. 예를 들어, Rb1은 대표적인 진세노사이드로 진통, 해열, 지방분해, 최면 및 체내 다양한 단백질의 합성 효율을 증가시키고, 진세노사이드 Rb2는 호르몬 촉진 및 항당뇨 효과가 있으며, 진세노사이드 Rg1은 흥분, 피로회복 및 기억 개선 등의 효과가 있다는 것이 밝혀졌다. 이외에도 대한민국 공개특허 제2016-0112094호, 제2016-0107420호 등 여러 특허뿐만 아니라 논문에서도 진세노사이드 성분별 질병 치료 용도를 개시하고 있다.
반면, 인삼에 포함된 진세노사이드 중 말로닐 산의 카복실 그룹이 에스터 결합 되어 있는 말로닐 진세노사이드(malonyl ginsenoside)는 온도에 민감하여 분해되기 쉽고 산성을 띠고 있으며 분리 정제가 매우 까다로워 이들에 대한 분석이나 이용에 대한 연구는 활발하지 않은 것으로 알려져있다.
대한민국 공개특허 제2016-0112094호 대한민국 공개특허 제2016-0107420호
본 발명은 말로닐 진세노사이드를 유효성분으로 하는 조성물을 이용하여 질병을 치료, 완화 및 예방할 수 있는 의약, 기능성 건강 식품 및 가공 식품 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 말로닐 진세노사이드를 유효성분으로 하는 간질환 치료 또는 건강식품 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 유효성분인 말로닐 진세노사이드는 말로닐-Rb1, 말로닐-Rc, 말로닐-Rb2 및 말로닐-Rd인 간질환 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 유효성분인 말로닐 진세노사이드는 말로닐-Rb1, 말로닐-Rc, 말로닐-Rb2 및 말로닐-Rd인 간질환 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 말로닐 진세노사이드 함량이 증가된 간질환 개선용 기능성 건강 식품의 제조방법은 a) 백삼, 백미삼 또는 이들의 혼합물에 에탄올을 가하는 단계; b) 저온에서 진공 또는 초음파 추출하는 단계; 및 c) 추출 후 강하막증발식 또는 진공농축 방법으로 농축액을 얻는 단계;를 포함한다.
본 발명의 일 양태에 따른 말로닐 진세노사이드 함량이 증가된 간질환 개선용 기능성 건강 식품의 제조방법에서, 상기 a) 단계에서 에탄올의 농도는 30 내지 90%(v/v)일 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따른 말로닐 진세노사이드 함량이 증가된 간질환 개선용 기능성 건강 식품의 제조방법에서, 상기 b) 단계에서 온도는 30 내지 70℃일 수 있다.
본 발명의 질병 치료 조성물 및 건강식품 조성물은 간 효소인 ALT(Alanine transaminase) 및 AST(Aspartate transaminase)의 농도를 감소시키고, 염증을 감소시키며, 일산화질소의 생성을 억제하여 다양한 간질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 말로닐 진세노사이드 Rb1의 1H-NMR 결과이다.
도 2는 말로닐 진세노사이드 Rb1의 13C-NMR 결과이다.
도 3은 말로닐 진세노사이드 Rb1의 HR-ESI-MS 결과이다.
도 4는 말로닐 진세노사이드 Rb2의 1H-NMR 결과이다.
도 5는 말로닐 진세노사이드 Rb2의 13C-NMR 결과이다.
도 6은 말로닐 진세노사이드 Rb2의 HR-ESI-MS 결과이다.
도 7은 말로닐 진세노사이드 Rc의 1H-NMR 결과이다.
도 8은 말로닐 진세노사이드 Rc의 13C-NMR 결과이다.
도 9는 말로닐 진세노사이드 Rc의 HR-ESI-MS 결과이다.
도 10은 말로닐 진세노사이드 Rd의 1H-NMR 결과이다.
도 11은 말로닐 진세노사이드 Rd의 13C-NMR 결과이다.
도 12는 말로닐 진세노사이드 Rd의 HR-ESI-MS 결과이다.
도 13은 인삼 농축액에 포함된 말로닐 진세노사이드의 정량 분석을 위한 HPLC 결과 중 하나로 기존의 분석법과 본 발명에서 이용한 신규 분석법을 나타낸다.
도 14는 실시예 2에 따라 추가 농축 단계를 더 수행한 백삼 농축액의 HPLC 결과이다.
도 15는 용매의 농도 변화에 따른 백삼 농축액의 HPLC 결과이다.
도 16은 시간 변화에 따른 백삼 농축액의 HPLC 결과이다.
도 17은 온도 변화에 따른 백삼 농축액의 HPLC 결과이다.
도 18은 70℃에서 용매의 농도 변화에 따른 백삼 농축액의 HPLC 결과이다.
도 19는 70℃에서 시간 변화에 따른 백삼 농축액의 HPLC 결과이다.
도 20은 백삼 농축액의 간세포 독성 확인 결과이다.
도 21은 TNF-α처리에 의한 ALT((B)) 및 AST((A)) 활성 변화를 나타낸다.
도 22는 백삼 농축액의 처리에 의한 ALT((A)) 및 AST((B))의 활성 변화를 나타낸다.
도 23는 간염 유발 흰쥐에 백삼 농축액(GS-KG9)을 처리한 후 AST(Aspartate transaminase)의 측정 결과를 나타낸다(Nor=정상군, Con=D-갈락토사민 처리군(간염군), sily=실리마린 처리군).
도 24는 백삼 농축액(GS-KG9)을 처리한 간염 유발 흰쥐에서 ALT(Alanine transaminase)의 측정 결과를 나타낸다(Nor=정상군, Con=D-갈락토사민 처리군(간염군), sily=실리마린 처리군).
도 25는 백삼 농축액(GS-KG9)을 처리한 간염 유발 흰쥐에서 SOD(Superoxide dismutase)의 측정 결과를 나타낸다(Nor=정상군, Con=D-갈락토사민 처리군(간염군), sily=실리마린 처리군).
도 26은 백삼 농축액(GS-KG9)을 처리한 간염 유발 흰쥐에서 GPx(Glutathione peroxidase)의 측정 결과를 나타낸다(Nor=정상군, Con=D-갈락토사민 처리군(간염군), sily=실리마린 처리군).
도 27은 백삼 농축액(GS-KG9)을 처리한 간염 유발 흰쥐에서 나타나는 간섬유화를 보여준다.
이하에서 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다. 본 명세서에서 사용하는 용어는 따로 정의하지 않는 경우 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 내용으로 해석되어야 할 것이다. 본 명세서의 도면 및 실시예는 통상의 기술자가 본 발명을 쉽게 이해하고 실시하기 위한 것으로 도면 및 실시예에서 발명의 요지를 흐릴 수 있는 내용은 생략될 수 있으며, 본 발명이 도면 및 실시예로 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 인삼에 포함되어 있는 여러 진세노사이드(ginsenoside) 중에서 말로닐 진세노사이드(malonyl ginsenoside)를 유효성분으로 하는 질병 치료 약학 조성물 및 기능성 건강식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 인삼 농축액을 포함하는 조성물은 특히 간질환 치료용일 수 있다.
본 발명에서 간질환은 간경화, 간경변, 비알콜성 지방간, 알코올성 지방간, 비알콜성 간염 및 알코올성 간염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 간질환일 수 있다. 본 발명의 조성물은 간경화, 간경변, 지방간 및 간염과 관계된 간손상의 주요 지표인, 간 효소 ALT(Alanine transaminase) 및 AST(Aspartate transaminase)의 농도를 정상 수치까지 감소시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 손상된 간 세포에 본 발명의 인삼 농축액 처리시 대조군 대비 40% 이상의 ALT 및 AST의 농도를 감소시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 간세포의 염증을 억제할 수 있어 간염, 지속된 염증에 의해 발생하는 간경화, 간경변, 지방간 등의 간질환을 효과적으로 치료, 예방 및 개선시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 염증을 유발시킨 간 세포에 본 발명의 인삼 농축액 처리시 세포 독성이 나타나지 않고, NO(nitric oxide)의 생성을 억제시킬 수 있으며, 대표적인 염증 인자인 PGE2, TNF-a 및 IL-6를 현저히 억제시킬 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함된 유효성분인 말로닐 진세노사이드는 말로닐-Rb1(m-Rb1), 말로닐-Rc(m-Rc), 말로닐-Rb2(m-Rb2) 및 말로닐-Rd(m-Rd)로, 중성 진세노사이드인 Rb1, Rc, Rb2 및 Rd로 각각 전환되거나 이들 중성진세노사이드로부터 각각 전환될 수 있다.
말로닐 진세노사이드는 중성 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc및 Rd에 말로닐 산(malonic acid)의 카복실 그룹(carboxyl group)이 에스터(ester) 결합되어 있는 산성의 형태로, m-Rb1, m-Rb2, m-Rc 및 m-Rd로 나타낼 수 있다. 말로닐 진세노사이드는 중성 진세노사이드에 비해 온도에 매우 민감하여 고온 농축과정에서 대부분 분해되어 그 함량이 매우 적고, 산성을 띠고 있어 말로닐 진세노사이드 성분만을 분리하거나 정제하기가 매우 힘들다. 그리고, 인삼 농축액이나 인삼 추출물을 제조할 때 대부분의 m-Rb1, m-Rb2, m-Rc 및 m-Rd 말로닐 진세노사이드는 각각 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd인 중성 진세노사이드로 전환되기 때문에 말로닐 진세노사이드의 함량이 높은 인삼 농축액이나 추출물의 제조는 어려운 것으로 알려져 있다. 또한, 말로닐 진세노사이드는 다른 중성 진세노사이드 등과 달리 분석이 쉽지 않아 말로닐 젠세노사이드를 다량 포함하는 인삼 농축액을 제조하는데 어려움이 있다.
본 발명의 인삼 농축액 제조에 사용하는 인삼 중 고려인삼의 수삼이나 백삼에 포함된 대표적인 말로닐 진세노사이드는 아래 [화학식 1]과 같은 화합물로써 m-Rb1, m-Rb2, m-Rc 및 m-Rd가 있고, 일반적으로 총 진세노사이드 대비 30 내지 60% 정도가 포함되어 있으나, 고온 농축 과정에서 중성 진세노사이드로 전환되기 때문에 일반적인 고온 인삼 농축액에는 극히 미량의 말로닐 진세노사이드가 존재한다.
[화학식 1]
Figure 112018129257458-pat00001
말로닐 진세노사이드는 말리지 않은 인삼인 수삼이나, 건조시킨 백삼 등에 많이 포함되어 있으나, 이들은 대부분 인삼을 홍삼화와 같이 고온 가공하는 과정에서 아래 [화학식 2]과 같은 화합물인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd로 전환되어 함량이 급격히 감소하게 된다.
[화학식 2]
Figure 112018129257458-pat00002
본 발명의 조성물에 포함된 인삼 농축액에는 말로닐 진세노사이드의 함량이 적어도 중성 진세노사이드 대비 20%(mg/g) 이상 포함되어 있다(말로닐 진세노사이드/중성 진세노사이드 ≥ 0.2). 구체적으로, 말로닐 진세노사이드인 m-Rb1, m-Rb2, m-Rc 및 m-Rd 각각의 함량은 모두 중성 진세노사이드인 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd 각각의 적어도 20%(mg/g) 이상 포함되어 있거나 더 높아 말로닐 진세노사이드를 유효성분으로 하는 치료 조성물 및 건강 식품 조성물로 이용할 수 있다(0.2Rb1≤m-Rb1, 0.2Rc≤ m-Rc, 0.2Rb2≤ m-Rb2 및 0.2Rd ≤ m-Rd).
일반적인 고온 추출 방법에 따라 인삼 농축액을 제조하면 인삼 농축액에 포함된 말로닐 진세노사이드는 대부분 중성 진세노사이드로 전환되거나 분해되기 때문에 모든 말로닐 진세노사이드는 전환 가능한 중성 진세노사이드 대비 20중량%에 한참 미치지 못하는 함량으로 포함되어 있다. 예를 들어, m-Rb1, m-Rc, m-Rb2 및 m-Rd의 경우 이들 중 적어도 어느 하나 이상은 전환가능한 중성 진세노사이드인 Rb1, Rc, Rb2 및 Rd 각각에 대비하여 20%에 미치지 못하는 함량으로 고온 추출한(일반적으로 최소 70℃ 이상에서 하루 이상 증류 또는 환류) 인삼 농축액에 포함되어 있다. 이렇게 적은 말로닐 진세노사이드의 함량을 포함하는 인삼 농축액은 본 발명에서 목적하는 질병의 치료나 개선 효과가 나타나는데 충분하지 않다. 또한, 총 중성 진세노사이드 대비 말로닐 진세노사이드가 20중량% 이상 포함되어 있더라도, 말로닐 진세노사이드의 함량이 적어도 전환 가능한 중성 진세노사이드의 각각의 20중량% 이상에 미치지 않으면 기존의 치료제들 대비 충분한 질병의 치료나 개선 효과를 얻기 어려울 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함된 인삼 농축액에서 말로닐 진세노사이드와 중성 진세노사이드의 중량비는 말로닐 진세노사이드가 적어도 중성 진세노사이드의 20중량% 이상은 포함되어 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 총 말로닐 진세노사이드(m-Rb1, m-Rc, m-Rb2, m-Rd) : 총 중성 진세노사이드(말로닐 진세노사이드가 전환될 수 있는 총 중성 진세노사이드, Rb1, Rc, Rb2, Rd) = 0.2:1 내지 2:1, 총 말로닐 진세노사이드 : 총 중성 진세노사이드 = 0.3:1 내지 2:1, 총 말로닐 진세노사이드 : 총 중성 진세노사이드 = 0.4:1 내지 2:1, 총 말로닐 진세노사이드 : 총 중성 진세노사이드 = 0.5:1 내지 2:1, 총 말로닐 진세노사이드 : 총 중성 진세노사이드 = 0.6:1 내지 2:1, 총 말로닐 진세노사이드 : 총 중성 진세노사이드 = 0.7:1 내지 2:1, 총 말로닐 진세노사이드 : 총 중성 진세노사이드 = 0.8:1 내지 2:1, 총 말로닐 진세노사이드 : 총 중성 진세노사이드 = 0.9:1 내지 2:1, 총 말로닐 진세노사이드 : 총 중성 진세노사이드 = 1:1 내지 2:1, 총 말로닐 진세노사이드 : 총 중성 진세노사이드 = 1.1:1 내지 2:1, 총 말로닐 진세노사이드 : 총 중성 진세노사이드 = 1.2:1 내지 2:1, 총 말로닐 진세노사이드 : 총 중성 진세노사이드 = 1.3:1 내지 2:1, 총 말로닐 진세노사이드 : 총 중성 진세노사이드 = 1.4:1 내지 2:1, 총 말로닐 진세노사이드 : 총 중성 진세노사이드 = 1.5:1 내지 2:1, 총 말로닐 진세노사이드 : 총 중성 진세노사이드 = 1.6:1 내지 2:1, 총 말로닐 진세노사이드 : 총 중성 진세노사이드 = 1.7:1 내지 2:1, 총 말로닐 진세노사이드 : 총 중성 진세노사이드 = 1.8:1 내지 2:1 또는 총 말로닐 진세노사이드 : 총 중성 진세노사이드 = 1.9:1 내지 2:1일 수 있다. 그러나, 이러한 중량비에 제한되는 것은 아니며, 본 발명에 따른 추가 농축과정을 더 거쳐 총 말로닐 진세노사이드 : 총 중성 진세노사이드 = 0.2:1 내지 15:1, 총 말로닐 진세노사이드 : 총 중성 진세노사이드 = 0.2:1 내지 14:1, 총 말로닐 진세노사이드 : 총 중성 진세노사이드 = 0.2:1 내지 13:1, 총 말로닐 진세노사이드 : 총 중성 진세노사이드 = 0.2:1 내지 12:1, 총 말로닐 진세노사이드 : 총 중성 진세노사이드 = 0.2:1 내지 11:1 또는 총 말로닐 진세노사이드 : 총 중성 진세노사이드 = 0.2:1 내지 10:1까지 이를 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함된 인삼 농축액에서 말로닐 진세노사이드 및 중성 진세노사이드 각각의 중량비는 사용되는 인삼의 상태나 제조 과정의 조건에 따라 조금씩 달라질 수 있다. 그러나, 말로닐 진세노사이드 모든 성분은 이들이 전환될 수 있는 중성 진세노사이드 성분 대비 최소 20중량%가 포함되어 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 말로닐 진세노사이드 각각의 성분과 중성 진세노사이드 각각의 성분의 중량비(mg/g)는 다음과 같을 수 있다. m-Rb1:Rb1=0.2:1 내지 2:1, m-Rb1:Rb1=0.2:1 내지 1.9:1, m-Rb1:Rb1=0.2:1 내지 1.8:1, m-Rb1:Rb1=0.2:1 내지 1.7:1, m-Rb1:Rb1=0.2:1 내지 1.6:1, m-Rb1:Rb1=0.2:1 내지 1.5:1, m-Rb1:Rb1=0.2:1 내지 1.4:1, m-Rb1:Rb1=0.2:1 내지 1.3:1, m-Rb1:Rb1=0.2:1 내지 1.2:1, m-Rb1:Rb1=0.2:1 내지 1.1:1, m-Rb1:Rb1=0.2:1 내지 1.0:1, m-Rb1:Rb1=0.2:1 내지 0.9:1, m-Rb1:Rb1=0.2:1 내지 0.8:1, m-Rb1:Rb1=0.2:1 내지 0.7:1, m-Rb1:Rb1=0.2:1 내지 0.6:1, m-Rb1:Rb1=0.2:1 내지 0.5:1, m-Rb1:Rb1=0.2:1 내지 0.4:1, m-Rb1:Rb1=0.2:1 내지 0.3:1 일 수 있다. m-Rc:Rc=0.2:1 내지 2:1, m-Rc:Rc=0.2:1 내지 1.9:1, m-Rc:Rc=0.2:1 내지 1.8:1, m-Rc:Rc=0.2:1 내지 1.7:1, m-Rc:Rc=0.2:1 내지 1.6:1, m-Rc:Rc=0.2:1 내지 1.5:1, m-Rc:Rc=0.2:1 내지 1.4:1, m-Rc:Rc=0.2:1 내지 1.3:1, m-Rc:Rc=0.2:1 내지 1.2:1, m-Rc:Rc=0.2:1 내지 1.1:1, m-Rc:Rc=0.2:1 내지 1.0:1, m-Rc:Rc=0.2:1 내지 0.9:1, m-Rc:Rc=0.2:1 내지 0.8:1, m-Rc:Rc=0.2:1 내지 0.7:1, m-Rc:Rc=0.2:1 내지 0.6:1, m-Rc:Rc=0.2:1 내지 0.5:1, m-Rc:Rc=0.2:1 내지 0.4:1, m-Rc:Rc=0.2:1 내지 0.3:1일 수 있다. m-Rb2:Rb2=0.2:1 내지 2:1, m-Rb2:Rb2=0.2:1 내지 1.9:1, m-Rb2:Rb2=0.2:1 내지 1.8:1, m-Rb2:Rb2=0.2:1 내지 1.7:1, m-Rb2:Rb2=0.2:1 내지 1.6:1, m-Rb2:Rb2=0.2:1 내지 1.5:1, m-Rb2:Rb2=0.2:1 내지 1.4:1, m-Rb2:Rb2=0.2:1 내지 1.3:1, m-Rb2:Rb2=0.2:1 내지 1.2:1, m-Rb2:Rb2=0.2:1 내지 1.1:1, m-Rb2:Rb2=0.2:1 내지 1.0:1, m-Rb2:Rb2=0.2:1 내지 0.9:1, m-Rb2:Rb2=0.2:1 내지 0.8:1, m-Rb2:Rb2=0.2:1 내지 0.7:1, m-Rb2:Rb2=0.2:1 내지 0.6:1, m-Rb2:Rb2=0.2:1 내지 0.5:1, m-Rb2:Rb2=0.2:1 내지 0.4:1, m-Rb2:Rb2=0.2:1 내지 0.3:1일 수 있다. m-Rd:Rd=0.2:1 내지 2:1, m-Rd:Rd=0.2:1 내지 1.9:1, m-Rd:Rd=0.2:1 내지 1.8:1, m-Rd:Rd=0.2:1 내지 1.7:1, m-Rd:Rd=0.2:1 내지 1.6:1, m-Rd:Rd=0.2:1 내지 1.5:1, m-Rd:Rd=0.2:1 내지 1.4:1, m-Rd:Rd=0.2:1 내지 1.3:1, m-Rd:Rd=0.2:1 내지 1.2:1, m-Rd:Rd=0.2:1 내지 1.1:1, m-Rd:Rd=0.2:1 내지 1.0:1, m-Rd:Rd=0.2:1 내지 0.9:1, m-Rd:Rd=0.2:1 내지 0.8:1, m-Rd:Rd=0.2:1 내지 0.7:1, m-Rd:Rd=0.2:1 내지 0.6:1, m-Rd:Rd=0.2:1 내지 0.5:1, m-Rd:Rd=0.2:1 내지 0.4:1, m-Rd:Rd=0.2:1 내지 0.3:1일 수 있다. 그러나, 이러한 중량비에 제한되는 것은 아니며, 본 발명에 따른 추가 농축과정을 더 거쳐 m-Rb1:Rb1=0.2:1 내지 20:1, m-Rb1:Rb1=0.2:1 내지 19:1, m-Rb1:Rb1=0.2:1 내지 18:1, m-Rb1:Rb1=0.2:1 내지 17:1, m-Rb1:Rb1=0.2:1 내지 16:1, m-Rb1:Rb1=0.2:1 내지 15:1까지 이를 수 있고, m-Rc:Rc=0.2:1 내지 25:1, m-Rc:Rc=0.2:1 내지 24:1, m-Rc:Rc=0.2:1 내지 23:1, m-Rc:Rc=0.2:1 내지 22:1, m-Rc:Rc=21:1 내지 1.6:1, m-Rc:Rc=0.2:1 내지 20:1까지 이를 수 있고, m-Rb2:Rb2=0.2:1 내지 10:1, m-Rb2:Rb2=0.2:1 내지 9:1, m-Rb2:Rb2=0.2:1 내지 8:1, m-Rb2:Rb2=0.2:1 내지 7:1, m-Rb2:Rb2=0.2:1 내지 6:1, m-Rb2:Rb2=0.2:1 내지 5:1까지 이를 수 있으며, m-Rd:Rd=0.2:1 내지 5:1, m-Rd:Rd=0.2:1 내지 4:1, m-Rd:Rd=0.2:1 내지 3:1, m-Rd:Rd=0.2:1 내지 2:1까지 이를 수도 있다.
본 발명의 조성물에 포함된 인삼 농축액의 제조방법은 a) 백삼, 백미삼 또는 이들의 혼합물에 에탄올을 가하는 단계, b) 저온에서 진공 또는 초음파 추출하는 단계 및, c) 추출 후 강하막증발식 또는 진공농축 방법으로 농축액을 얻는 단계를 포함하는 인삼 농축액 제조방법으로, 말로닐 진세노사이드 함량이 높은 인삼 농축액을 제공할 수 있다.
본 발명의 제조방법 a) 단계에서 에탄올의 농도는 30 내지 90%(v/v), 50 내지 90%(v/v), 50 내지 80%(v/v), 60 내지 80%(v/v), 바람직하게는 60 내지 75%(v/v)이다. 에탄올의 농도가 높을수록 농축액에 포함된 말로닐 진세노사이드인 m-Rb1, m-Rb2, m-Rc 및 m-Rd와 이들이 전환된 형태인 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd의 총합 자체는 높아지나, 에탄올의 농도가 일정 %를 넘어가게 되면 진세노사이드의 추출 수율이 현저히 감소하게 된다. 또한, 에탄올의 농도가 지나치게 높을 경우, 진세노사이드의 총합은 높아지는 반면 말로닐 진세노사이드의 함량도 급격히 감소하게 된다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 물과 30~70%(v/v) 에탄올에서 추출 수율은 유사하나, 말로닐 진세노사이드 함량과 총 진세노사이드 함량은 70%(v/v) 에탄올을 사용할 때 가장 우수할 수 있다. 그러나, 100%(v/v) 에탄올에서 추출 수율은 급격히 감소할 수 있고, 특히 중성 진세노사이드 보다 극성이 높은 말로닐 진세노사이드 추출 수율이 낮아질 수 있다.
본 발명의 제조방법 b) 단계에서 온도는 30 내지 70℃, 40 내지 70℃에서 수행될 수 있으며, 바람직하게는 저온으로 30 내지 50℃, 보다 바람직하게는 35 내지 45℃이다. 온도에 따른 인삼 농축액 수득 수율은 크게 차이나지 않으나, 온도가 높을수록 농축액에 포함되어 있는 총 진세노사이드의 함량이 감소하게 되고, 말로닐 진세노사이드가 중성 진세노사이드 등으로 전환되는 비율이 급격히 높아질 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 온도를 40℃로 유지하였을 때 말로닐 진세노사이드 함량이 가장 높고, 온도를 상승시켜 70℃ 이상에 이르게되면 말로닐 진세노사이드가 중성 진세노사이드로 전환되는 비율도 높아지고, 총 진세노사이드의 함량도 감소할 수 있다.
본 발명의 제조방법에서 c) 단계 후, 크로마토그래피로 진세노사이드를 분획하고, HPLC로 말로닐 진세노사이드를 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다. 크로마토그래피는 농축액에 포함된 진세노사이드를 분획할 수 있는 것이라면 제한되지 않으나 이온크로마토그래피가 바람직하다. 진세노사이드의 분획 후 진세노사이드의 농축액에 포함된 진세노사이드의 종류를 확인할 수 있다. 진세노사이드를 분리후 1H-NMR 및 13C-NMR과 함께 HR-ESI-MS(High resolution-Electrospray ionization-mass spectrometry) 분석으로 진세노사이드의 구조를 확인할 수 있고, 구조가 확인된 말로닐 진세노사이드를 표준품으로 HPLC 분석을 통하여 말로닐진세노사이드 함량을 분석할 수 있다.
본 발명의 제조방법에서 c) 단계 후, 물 및 아세토나이트릴(acetonitrile)을 용매로하는 농도기울기법을 이용한 말로닐 진세노사이드 분석 단계를 더 포함할 수 있다. 1H-NMR,13C-NMR 및 HR-ESI-MS로 농축액에 포함되어 있는 말로닐 진세노사이드 구조 분석은 가능하나, 정량 분석은 어려울 수 있다. 농축액에 포함된 말로닐 진세노사이드의 정량 분석을 위해서, 물과 아세토나이트릴 두 용매계를 이동상으로 사용한 농도기울기법을 통해 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 분석을 하여 말로닐 진세노사이드의 정량을 확인할 수 있다. HPLC 분석에서 이동상 중 트리플루오로아세트산(trifloroacetic acid, TFA)가 함유된 아세토나이트릴의 비율을 0% 에서 100%(v/v) 까지 순차적으로 가한 후, 다시 100%에서 0%(v/v)까지 순차적으로 가하여 실시하여 말로닐 진세노사이드의 정량을 분석할 수 있다. 이러한 정량 분석은, 기존에 진세노사이드를 분석하던 공지의 방법들과 달리 농축액에 포함된 말로닐 진세노사이드의 정량을 확인할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, a)~c) 단계에 따른 제조방법으로 제조한 농축액에 포함된 진세노사이드의 함량은 20mg/g 이상일 수 있다.
본 발명의 제조방법 b) 단계에서 저온 진공 또는 초음파 추출 시간은 2 내지 24 시간, 바람직하게는 2 내지 12시간으로 2~3회 반복하여 추출할 수 있다. 추출 온도에 따라 시간을 조절할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 추출 온도를 70℃로 하였을 때 추출 시간 길어질수록 수율은 높아지나, 2시간 추출할 때 말로닐 진세노사이드를 가장 많이 포함한 농축액을 제조할 수 있고, 12시간을 초과하게 되면 진세노사이드의 분해로 인해 총진세노사이드 함량이 낮아질 수 있다. 추출 온도를 40℃로 하였을 때는 마찬가지로 2시간 추출할 때 말로닐 진세노사이드의 함량이 가장 높고 12시간을 초과했을 경우도 유지하였으나, 고온에서 12시간을 초과했을 경우는 말로닐 진세노사이드가 중성 진세노사이드로 전환될 수 있기 때문에 추출온도는 상대적으로 저온인 40℃ 내외가 바람직할 수 있다.
본 발명은 인삼 추출액에 포함된 말로닐 진세노사이드 함량을 보다 향상시키기 위해, 추가의 분획 및 농축 과정을 더 포함할 수 있다.
추가의 분획 및 농축 과정을 더 포함하는 인삼 농축액 제조방법은, a) 백삼, 백미삼 또는 이들의 혼합물에 에탄올을 가하는 단계, b) 저온에서 진공 또는 초음파 추출하는 단계, c) 추출 후 강하막증발식 또는 진공농축 방법으로 농축액을 얻는 단계, d) c)단계의 농축액을 이온교환크로마토그래피 컬럼에 로딩하고, 에탄올을 0% 에서 100%(v/v)까지 순차적으로 가하는 단계 및, e) d)단계의 이온교환크로마토그래피로 얻은 에탄올 층을 물과 부탄올로 분획한 후, 물층을 회수하여 수분을 제거하는 단계를 더 포함하는 인삼 농축액 제조방법을 제공할 수 있다.
이온교환크로토그래피의 컬럼은 특별히 제한되지 않으나, 분자량이 1,000(MW)인 분자의 흡착에 적합한 다공성 컬럼이 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 분자량 1,000이상의 분자 흡착에 적합한, 스티렌과 다이비닐벤젠의 공중합체의 다공성 흡착제를 컬럼으로 사용할 수 있다.
본 발명의 제조방법에서 d) 단계의 이온교환크로마토그래피에서 농도별로 서로 다른 에탄올을 가해준다. 우선 물을 가하여 극성이 가장 높은 성분을 제거하고, 에탄올의 농도를 점점 높이면서 가해준다. 에탄올의 농도를 점점 높이면서(1~100%) 가해주고, 가해주는 에탄올의 농도에 따라 크로마토그래피로 얻은 에탄올층을 각각 분리한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 순서대로 에탄올의 농도를 달리하여 얻은 각각의 에탄올층에 포함되어 있는 진세노사이드의 함량 중 40 내지 60%, 바람직하게는 45 내지 55% 농도의 에탄올을 가하여서 얻은 에탄올층에 말로닐 진세노사이드의 함량이 가장 높을 수 있다.
본 발명의 제조방법에서 c) 단계 후, 분취용 크로마토그래피로 진세노사이드를 분획하고, 분석용 HPLC로 말로닐 진세노사이드를 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, c) 단계 후, 물 및 아세토나이트릴(acetonitrile)을 용매로하는 농도기울기법을 이용한 말로닐 진세노사이드 분석 단계도 더 포함할 수 있다.
본 발명의 a)~e) 단계로 제조한 인삼 농축액의 말로닐 진세노사이드 함량은 a)~c) 단계로 제조한 인삼 농축액의 말로닐 진세노이드 함량보다 현저히 높다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, a)~e) 단계로 제조한 인삼 농축액의 말로닐 진세노사이드 함량은 500mg/g 이상일 수 있다. 또한, 진세노사이드 중 진세노사이드 Rf, Rg2, Rb3와 같이 말로닐 진세노사이드나 중성 진세노사이드가 아닌 성분이 거의 없어 의약품, 건강식품의 제조에도 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명에서, a)~c) 단계로 제조한 인삼 농축액과 a)~e) 단계로 제조한 인삼 농축액은 모두 백삼, 백미삼, 수삼 또는 홍삼 등에 비하여 말로닐 진세노사이드 함량이 매우 높다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, a)~c) 단계로 제조한 인삼 농축액과 a)~e) 단계로 제조한 인삼 농축액은 제조방법에 따라 제조한 인삼 농축액은 말로닐 진세노사이드를 고함량으로 포함하고 있어 간질환 치료, 예방 및 개선에 현저한 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 조성물을 용이하게 투여하기 위해, 인삼 농축액 외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 그리고, 공지의 방법에 따라, 과립제, 정제, 캡슐제, 에멀젼, 시럽, 산제 등의 경구용 제형으로 제조하거나 외용제, 비경구 투여를 위한 주사용 용액 등으로도 제형화하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 건강(기능)식품으로 제조할 수 있고, 건강 식품으로 제조시 식품첨가물을 더 포함할 수 있다. 식품첨가물은 본 발명이 속하는 분야에 일반적으로 사용되는 식품첨가물을 사용할 수 있고, 식품의약품안정청 등에 의해 승인된 첨가물을 이용하는 것이 바람직하다.
이하에서 본 발명을 실시하기 위해 보다 구체적인 실시예에 대하여 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 실시하기 위한 바람직한 실시예로서 본 발명이 이에 제한되어 해석되는 것은 아니다.
인삼 농축액에 포함된 말로닐 진세노사이드의 검출 및 분석
본 발명의 실시예에서 얻은 백삼 농축액에 포함된 m-Rb1, m-Rb2, m-Rc, m-Rd는 1H-NMR, 13C-NMR, HR-ESI-MS(High resolution - Electrospray ionization - mass spectrometry)를 활용하여 구조를 확인하였다(도 1~12). 각각의 m-Rb1, m-Rb2, m-Rc, m-Rd의 13C-NMR는 [표 1]과 같다.

C
m-Rb1
m-Rb2
m-Rc
m-Rd

1
39.24
39.23
39.21
39.23

2
26.83
26.68
36.93
26.78

3
89.25
89.15
89.16
89.14

4
39.71
39.72
39.71
39.72

5
56.49
56.48
56.47
56.47

6
18.47
18.46
18.46
18.47

7
35.18
35.17
36.15
35.18

8
40.07
40.06
40.05
40.07

9
50.25
50.24
50.21
50.23

10
36.94
36.94
36.93
36.94

11
30.74
30.80
30.79
30.93

12
70.24
70.23
70.28
70.22

13
49.52
49.49
49.45
49.51

14
51.42
51.44
51.44
51.46

15
30.82
30.01
30.73
30.80

16
26.66
26.68
26.66
26.68

17
51.65
51.69
51.67
51.66

18
16.06
16.05
16.03
16.03

19
16.53
16.32
16.54
16.34

20
83.50
83.65
83.37
83.56

21
22.42
22.35
22.37
22.40

22
36.20
36.18
35.15
36.15

23
23.23
23.24
23.19
23.40

24
126.00
125.98
126.05
125.99

25
131.08
131.12
131.04
130.93

26
25.84
25.82
25.82
25.80

27
17.99
17.91
17.90
17.79

28
28.07
28.09
28.08
28.09

29
16.63
16.55
16.32
16.55

30
17.46
17.43
17.41
17.42

3-O-glucopyranosyl

1′
104.89
104.78
104.90
104.79

2′
84.07
83.53
83.37
83.34

3′
78.42
78.07
78.19
78.20

4′
71.02
71.83
72.12
71.65

5′
78.37
77.44
78.05
78.06

6′
62.83
62.74
62.71
62.88

2’-O-glucopyranosyl

1″
106.09
105.80
105.75
105.74

2″
76.62
76.75
77.18
77.38

3″
79.28
79.22
79.25
79.30

4″
71.72
71.39
71.68
71.38

5″
75.28
75.31
75.06
75.17

6″
65.12
64.73
64.65
64.68

20-O-glucopyranosyl

1″′
98.11
98.16
98.13
98.31

2″′
74.89
74.93
75.26
75.30

3″′
77.68
78.25
78.30
78.33

4″′
71.44
71.05
71.36
71.09

5″′
77.09
76.56
76.57
78.20

6″′
70.20
69.24
68.51
62.71

6″′-O-glucopyranosyl
6″′-O-Arabinopyranosyl
6″′-O-
Arabinofuranosyl

1″″
105.50
104.68
110.16

2″″
75.28
72.16
83.43

3″″
78.08
74.15
78.85

4″″
71.59
68.61
86.04

5″″
78.30
65.63
62.66

6″″
62.83

Malonyl

M1
169.78
167.93
170.74
170.79

M2
44.08
45.13
45.33
45.51

M3
170.09
170.50
172.74
172.82
백삼 농축액에 포함된 말로닐 진세노사이드의 정량 분석
백삼 농축액에 포함된 말로닐 진세노사이드의 정량 분석을 위해 물과 아세토나이트릴(acetonitrile)의 두 가지 용매계로서 농도기울기법을 사용하였다. 이동상은 0.03% TFA in water(A)와 0.03% TFA in CH3CN(B)을 사용하여 용매 A 대비 용매 B의 비율을 18%(0분)에서 25%(30분), 32%(40분), 40%(79분), 80%(90분), 100%(95분)으로 순차적으로 변화 시켜주고 다시 18%(120분)로 조절하였다. 컬럼 온도는 40℃, 유속은 분당 1.0㎖, 시료 주입량은 20㎕, 검출조건은 PDA 검출기(PDA Detector)에서 203nm 조건하에 분석을 진행하였다(도 13).
[실시예 1]
말로닐 진세노사이드를 포함하는 인삼 농축액 제조방법의 조건은 아래와 같은 실험을 통해 확립하였다. 이하 실시예에서 다른 언급이 없으면, 진공 조건은 -70~-80cmHg이다. 그리고, 추출 후 농축까지 과정은 추출물을 여과한 후, 40℃, 0~50hPa 진공 조건에서 진공 농축 또는 100~150℃, 진공압 5~20 hPa 조건에서 강하막증발식(falling film evaporation) 방법에 따른다.
실시예 1-1. 추출용매에 따른 진세노사이드 함량
백삼시료 5g에 물, 30%, 50%, 70%, 100%(v/v) 에탄올을 각각 50 mL씩을 가하여 저온 진공추출(40℃)에서 4시간 동안 2회 반복 추출하여 농축 후, 수율과 진세노사이드(ginsenoside)를 분석하였다. 수율은 50% 에탄올 추출물에서 30.8%로 가장 높았고, 그 다음으로 70% 에탄올 농축액이 29.8%로 높았다([표 2]). 진세노사이드 함량은 Rg1, Re, Rf, Rb1, m-Rb1, Rc, m-Rc, Rb2, Rb3, m-Rb2, Rd, m-Rd의 총합이 에탄올의 비율이 높을수록 높게 나타나 100%에탄올 추출물에서 164.4 mg/g으로 높게 나타났고, 그 다음으로 70% 에탄올 농축액이 134.5 mg/g으로 높게 났다. 따라서 수율과 진세노사이드 총함량을 모두 고려 했을 때 추출법은 70% 에탄올 추출법이 가장 우수하게 나탔다([표 3] 및 도 15).
추출용매 물 30% 에탄올 50% 에탄올 70% 에탄올 100% 에탄올
수율(%) 28.6 27.9 30.8 29.8 4.28

추출
용매
물
30% 에탄올
50% 에탄올
70% 에탄올
100% 에탄올

Rg1
5.553±0.421
5.464±0.653
5.379±0.522
5.323±0.081
11.220±0.408

Re
16.906±0.697
15.577±0.344
17.622±0.753
19.126±0.219
41.974±0.770

Rf
2.338±0.140
2.188±0.230
4.226±0.068
4.567±0.135
6.335±0.228

Rb1
19.376±0.427
19.371±0.401
22.342±0.473
23.495±0.806
37.802±0.171

m-Rb1
20.821±0.154
21.611±0.444
23.303±0.293
24.809±0.187
11.004±0.038

Rc
8.561±0.195
8.508±0.029
9.887±0.194
10.375±0.151
15.342±0.092

m-Rc
10.551±0.357
11.297±0.556
12.009±0.530
13.416±0.508
11.168±0.179

Rb2
3.858±0.357
4.337±0.110
4.981±0.265
5.337±0.155
7.420±0.111

Rb3
2.177±0.161
2.563±0.096
2.865±0.376
3.170±0.029
2.413±0.068

m-Rb2
7.939±0.111
8.446±0.217
9.622±0.307
10.150±0.095
4.789±0.341

Rd
2.091±0.216
2.236±0.059
2.520±0.162
2.636±0.035
4.202±0.050

m-Rd
10.875±0.473
10.566±0.357
11.488±0.384
12.047±0.062
10.719±0.291

총합
111.044
±1.783
112.163
±1.976
126.245
±1.413
134.450
±1.784
164.387
±0.766
실시예 1-2. 추출시간에 따른 진세노사이드 함량
저온(40℃) 진공에서 70% 에탄올로 추출시간에 따른 추출 수율은 시간이 증가할수록 높아졌다([표 4]). 농축액 내의 진세노사이드 함량은 추출시간별로 실험오차 범위 내에서 변동이 있을 뿐 큰 차이는 없었으나 시간이 길수록 말로닐 진세노사이드 함량은 서서히 함량이 줄어들고 중성 진세노사이드 함량이 증가하는 경향을 보였다([표 5], 도 16).
추출시간 2시간 4시간 6시간 12시간 24시간
수율(%) 24.5 28.6 30.8 31.4 33.5

추출
시간
2시간
4시간
6시간
12시간
24시간

Rg1
5.334±0.146
5.650±0.331
5.360±0.200
5.226±0.095
5.496±0.123

Re
19.492±0.440
19.677±0.965
17.420±0.475
17.596±0.108
17.805±0.353

Rf
4.595±0.132
4.781±0.134
4.499±0.216
4.256±0.106
4.385±0.059

Rb1
22.409±1.017
23.168±0.822
23.190±0.729
23.212±0.186
25.261±0.411

m-Rb1
24.172±0.588
23.891±1.317
22.900±0.607
21.311±0.438
20.008±0.402

Rc
10.145±0.211
9.935±0.623
9.382±0.333
10.466±0.168
11.345±0.324

m-Rc
12.443±0.342
12.531±0.424
10.750±0.383
10.879±0.333
10.535±0.101

Rb2
4.729±0.167
5.055±0.102
4.463±0.195
4.823±0.275
5.492±0.037

Rb3
2.138±0.280
2.362±0.522
1.918±0.409
1.964±0.506
1.920±0.650

m-Rb2
12.528±0.641
12.498±0.800
10.479±0.419
10.937±0.275
10.348±0.205

Rd
2.614±0.166
2.548±0.222
2.336±0.084
2.702±0.184
2.554±0.188

m-Rd
6.036±0.199
6.069±0.272
5.270±0.184
5.420±0.285
5.132±0.333

총합
126.635
±1.719
128.165
±4.923
117.967
±2.954
118.792
±1.344
120.281
±2.017
실시예 1-3. 온도변화에 따른 진세노사이드 함량
저온 진공에서 70% 에탄올로 실온, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃에서 각각 4시간씩 2회 추출한 추출수율은 28.28%, 29.28%, 29.12%, 30.20%, 29.88%로 크게 다르지 않았다([표 6]). 농축액내의 진세노사이드 함량은 40℃에서 총 진세노사이드 함량이 146.967mg/g으로 가장 높게 나타났고, 온도가 높을수록 점차 감소하여 70℃에서는 127.813 mg/g으로 낮아졌다. 특히 말로닐 진세노사이드 함량은 40℃에서 가장 높게 나타났으며 온도가 높을수록 이에 상응하는 중성 진세노사이드가 높게 나타나 말로닐진세노사이드는 추출 온도가 높아질수록 중성진세노사이드로 전환되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 추출 수율 및 진세노사이드 함량을 고려했을 때 추출온도는 40℃가 가장 적합한 것으로 판단되었다([표 7], 도 17).
추출온도 실온 40℃ 50℃ 60℃ 70℃
수율(%) 28.28 29.28 29.12 30.20 29.88

추출
온도
실온
40℃
50℃
60℃
70℃

Rg1
5.124
5.643
5.735
5.660
5.065

Re
14.352
20.928
19.432
17.582
17.475

Rf
3.820
4.763
3.077
4.926
4.434

Rb1
18.089
22.289
21.920
24.115
25.042

m-Rb1
21.919
28.535
27.129
22.103
19.119

Rc
7.961
10.889
11.187
12.160
12.828

m-Rc
11.768
15.260
20.526
16.741
14.952

Rb2
4.230
5.613
5.743
5.877
6.247

m-Rb2
9.023
13.362
12.147
9.246
7.961

Rd
2.253
3.088
1.881
2.115
2.621

m-Rd
9.684
13.692
12.428
11.194
9.035

총합
110.176
146.967
144.662
135.249
127.813
실시예 1-4. 70℃에서 용매 농도에 따른 진세노사이드 함량
70℃ 환류추출 조건에서 추출용매별 추출수율 및 진세노사이드 함량비교를 위하여 70℃에서 물. 30%, 50%, 70%, 100% 에탄올로 각각 4시간씩 2회 추출한 추출수율은 34.96%, 22.08%, 26.98%, 28.62%, 10.90%로 물에서의 추출수율이 가장 높게 나타났고, 다음으로는 70% 에탄올, 50% 에탄올, 30% 에탄올, 100% 에탄올 순으로 높게 나타났다([표 8]). 농축액 내의 총 진세노사이드 함량은 100% 에탄올에서 208.593mg/g으로 가장 높았고, 70% 에탄올 추출에서 130.716mg/g으로 그 다음으로 높았으며, 에탄올의 함량이 낮아질수록 농축액내 진세노사이드 함량은 현저하게 줄어들어 물추출시 60.059mg/g으로 낮아졌다. 말로닐 진세노사이드 함량은 50% 에탄올과 70% 에탄올 추출시 비슷하게 높게 나타났으나 중성 진세노사이드 함량은 에탄올의 함량이 높을수록 높게 나타나 추출수율 및 총 진세노사이드 함량, 말로닐 진세노사이드 함량 등을 고려할 때 가장 적합한 추출용매는 70% 에탄올 추출이라는 것을 확인할 수 있었다([표 9], 도 18).
추출용매 물 30% 에탄올 50% 에탄올 70% 에탄올 100% 에탄올
수율(%) 37.96 22.08 26.98 28.62 10.90

추출
용매
물
30% 에탄올
50% 에탄올
70% 에탄올
100% 에탄올
Rg1 2.845±0.140 5.074±0.198 5.526±0.173 6.463±0.077 11.342±0.527

Re
10.339±1.107
16.179±0.337
18.255±0.761
20.725±0.917
44.173±4.832

Rf
1.547±0.585
4.173±0.106
4.306±0.570
4.264±1.199
6.282±0.391

Rb1
13.165±0.235
27.502±0.836
28.651±0.525
33.397±0.809
56.722±2.758

m-Rb1
8.509±0.367
13.575±0.216
15.250±0.859
15.108±0.595
13.700±0.756

Rc
6.809±0.455
13.408±0.111
14.175±0.574
16.547±0.590
30.040±2.016

m-Rc
4.462±0.182
7.070±0.097
7.883±0.374
7.808±0.299
10.015±0.481

Rb2
3.210±0.128
6.321±0.111
6.481±0.459
7.866±0.271
13.519±0.877

Rb3
0.817±0.118
1.343±0.075
1.266±0.321
1.485±0.063
1.119±0.082

m-Rb2
5.087±0.330
8.124±0.285
9.223±0.709
9.229±0.599
9.166±1.097

Rd
1.379±0.047
2.843±0.035
3.191±0.155
3.810±0.239
7.062±0.697

m-Rd
1.890±0.068
3.392±0.160
4.169±0.135
4.014±0.314
5.453±0.302

총합
60.059
±2.026
109.005
±1.625
118.376
±3.988
130.716
±3.518
208.593
±13.647
실시예 1-5. 70℃, 70% 에탄올에서 추출시간에 따른 진세노사이드 함량
70℃ 환류추출 및 70% 에탄올 추출조건에서 시간별 추출수율은 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간씩 2회 반복 추출하였을 경우 시간이 증가할수록 추출수율이 증가하여 24시간에서 33.94%로 가장 높게 나타났다([표 10]). 반면에 농축액에서의 총 진세노사이드 함량은 2시간일 때 가장 높게 나타났고, 다음으로 12시간으로 나타났으며, 24시간에는 다소 줄어 12시간 이후에는 진세노사이드 이외의 다른 화합물이 추출되는 것으로 추측되었다. 말로닐 진세노사이는 추출 2시간에 가장 높게 나타났고, 시간이 증가할수록 점차 감소하여 24시간에는 약 25%로 줄어 들었으나 이에 상응하는 중성 진세노사이드의 함량은 시간이 지날수록 증가했으나 말로닐 진세노사이드가 감소하는 량만큼의 증가로 이어지지 않아 이들 중성 진세노사이드가 Rg3 등의 다른 진세노사이드로 전환되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 말로닐 진세노사이드를 포함한 백삼고유 성분 추출은 70℃ 고온 추출보다는 40℃ 저온진공 추출 또는 저온초음파 추출이 더 적합할 것으로 판단되었다([표 11], 도 19).
추출시간 2시간 4시간 6시간 12시간 24시간
수율(%) 23.48 29.76 28.26 29.46 33.94

추출
시간
2시간
4시간
6시간
12시간
24시간

Rg1
6.764±0.198
5.232±0.104
5.432±0.113
6.465±0.127
6.022±0.139

Re
23.561±1.623
18.362±1.622
18.339±0.300
20.844±0.232
17.312±0.176

Rf
4.728±1.441
4.329±0.075
4.459±0.194
5.210±0.041
4.202±0.115

Rb1
32.867±0.355
27.858±0.938
31.136±0.085
37.528±0.938
36.113±0.383

m-Rb1
19.984±0.426
14.586±0.369
12.677±0.164
11.512±0.210
6.344±0.218

Rc
16.706±0.304
14.134±0.397
15.606±0.322
19.126±0.248
18.044±0.231

m-Rc
10.346±0.254
7.457±0.082
6.747±0.048
6.017±0.116
3.327±0.139

Rb2
8.073±0.152
6.659±0.067
7.529±0.046
9.070±0.151
8.543±0.251

Rb3
1.541±0.096
1.258±0.056
1.425±0.019
1.738±0.069
1.438±0.242

m-Rb2
10.526±0.361
7.452±0.308
6.734±0.159
6.204±0.157
2.861±0.603

Rd
3.888±0.277
3.140±0.117
3.495±0.214
4.280±0.167
4.086±0.116

m-Rd
5.189±0.219
3.679±0.065
3.362±0.023
3.140±0.118
1.847±0.109
총합 144.173
±2.145		 114.148
±3.929		 116.941
±1.428		 131.134
±1.791		 110.138
±1.842
실시예 1-6. 70℃, 70% 에탄올에서 24시간 동안 고온 추출한 인삼 농축액의 진세노사이드 함량
인삼 농축액을 제조하는 일반적인 방법인 고온 추출방법에 따라 인삼 농축액을 제조하였다. 70% 에탄올을 추출용매로 하고, 70℃에서 24시간 동안 고온 추출한 백삼 농축액을 얻었다. 4개의 무작위 시료를 채취하여 진세노사이드 함량을 분석하였다([표 12]). 말로닐 진세노사이드가 대부분 중성 진세노사이드로 전환되거나 분해되어 함량이 매우 적은 것을 확인할 수 있었다.
진세노사이드(mg/g) 시료 1 시료 2 시료 3 시료 4
평균
Rg1 10.93 10.82 11.05 6.02 9.70
Re 12.67 12.84 12.91 17.31 13.93
Rf 3.29 3.43 3.31 4.20 3.56
Rb1 21.81 21.75 21.98 36.11 25.41
m-Rb1 6.24 6.08 6.33 6.34 6.25
Rc 21.47 21.26 21.74 18.04 20.63
m-Rc 4.27 4.14 4.24 3.33 3.99
Rb2 13.04 13.24 13.26 8.54 12.02
Rb3 2.50 2.60 2.73 1.44 2.31
m-Rb2 3.35 3.33 3.48 2.86 3.26
Rd 4.92 6.07 5.79 4.09 5.22
m-Rd 1.64 2.11 1.81 1.85 1.85

총합		 106.12 107.67 108.63 110.14 108.14
이상의 실험 결과 말로닐 진세노사이드를 고함량 포함하는 인삼 농축액 제조방법의 조건은 70% 에탄올을 추출용매로 하고, 40℃에서 4시간 2회 반복하는 추출 저온 진공 추출 및/또는 초음파 추출이 가장 적합한 것으로 확립하였다.
[실시예 2]
백삼과 백미삼 혼합 시료로부터 초음파 추출을 통해 말로닐 진세노사이드를 포함하는 인삼 농축액을 제조하였다. 백삼:백미삼(6:4) 시료 5 g에 70% 에탄올 50 mL을 넣고, 40℃에서 4시간씩 주파수 30~40KHz 초음파에서 2회 반복추출하였다. 이후, 5~50 hPa의 진공압을 유지하면서 40℃에서 진공 농축하여 인삼 농축액을 얻어 GS-KG9으로 나타냈다. 동일한 과정으로 세 가지 인삼 농축액을 얻었고(GS-KG9_1, GS-KG9_2, GS-KG9_3) 각각의 인삼 농축액의 진세노사이드 성분을 분석하였다(아래 [표 13]). 평균 추출 수율은 36.3%였으며, 진세노사이드 함량은 Rg1이 7.696, Re가 18.752, Rf가 3.277, Rb1이 13.934, m-Rb1이 24.243, Rc가 8.853, m-Rc가 20.139, Rb2가 6.136, Rb3가 1.382 m-Rb2가 13.934, Rd가 2.262, m-Rd 5.502 mg/g 이었다.

구분
GS-KG9_1
GS-KG9_2
GS-KG9_3
GS-KG9 평균값

Rg1
7.754
7.666
7.667
7.696±0.050

Re
18.790
18.666
18.800
18.752±0.075

Rf
3.256
3.254
3.319
3.277±0.037

Rb1
13.867
13.946
13.988
13.934±0.062

m-Rb1
24.224
24.151
24.355
24.243±0.103

Rc
8.686
8.922
8.951
8.853±0.146

m-Rc
20.098
20.116
20.201
20.139±0.055

Rb2
5.847
6.314
6.247
6.136±0.252

Rb3
1.339
1.348
1.459
1.382±0.066

m-Rb2
13.890
14.056
13.858
13.934±0.107

Rd
2.247
2.244
2.295
2.262±0.029

m-Rd
5.409
5.452
5.644
5.502±0.125

총 함량
125.406
126.136
126.785
126.109±0.690

말로닐
총함량
63.621
63.776
64.057
63.818±0.221
[실시예 3]
백삼시료 500g을 사용하여 실시예 2와 동일한 방법으로 백삼 농축액(GS-KG9)을 제조하였다. 제조한 백삼 농축액(GS-KG9)에 포함된 말로닐 진세노사이드 함량을 높이기 위해 추가의 크로마토그래피 단계를 더 진행하였다.
백삼 농축액 150~200g을 소량의 물에 녹인 후, Diaion HP-20 수지에 로딩하여 0, 30, 40, 50, 60, 80, 100%(v/v) 에탄올(EtOH)로 각각 분획하였다. 각각의 분획물을 HPLC 분석을 통하여 말로닐 진세노사이드가 함유된 50% 에탄올 분획을 물과 부탄올로 분획하였다. 말로닐 진세노사이드가 함유된 물층을 실리카 겔(Silica gel)를 이용하여 클로로포름:메탄올:물(Chloroform:methanol:water), 에탄올:에틸아세테이트:물(Ethanol:Ethyl acetate: water) 용매조건으로 용매계의 극성을 순차적으로 증가시켜 각각의 말로닐 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd 세부 분획을 얻었다. 최종정제를 위해 C18 컬럼이 장착된 분취용 LC(PreP-LC)를 사용하여 m-Rb1, m-Rb2, m-Rc, m-Rd를 각각 순수하게 정제하였다.
50% 에탄올 분획 백삼 농축액에 포함된 말로닐 진세노사이드의 정량 분석을 위해 물과 아세토나이트릴(acetonitrile)의 두 가지 용매계로서 농도기울기법을 사용하였다. 이동상은 0.03% TFA in water(A)와 0.03% TFA in CH3CN(B)을 사용하여 용매 B의 비율을 18%(0분)에서 25%(30분), 32%(40분), 40%(79분), 80%(90분), 100%(95분)으로 순차적으로 변화 시켜주고 다시 18%(120분)로 조절하였다. 컬럼 온도는 40℃, 유속은 분당 1.0㎖, 시료 주입량은 20㎕, 검출조건은 PDA 검출기(PDA Detector)에서 203nm 조건하에 분석을 진행하였다. 분석 결과, 중성의 진세노사이드 Rg1이 6.017 mg/g, Re가 44.512 mg/g, Rb1이 17.750 mg/g, Rc가 10.271 mg/g, Rb2가 10.679 mg/g, Rd가 9.314 mg/g이었으며, 산성의 말로닐 진세노사이드인 m-Rb1은 264.308 mg/g, m-Rc는 221.532 mg/g, m-Rb2는 82.108 mg/g, m-Rd는 23.165 mg/g으로 총진세노사이드는 689.657 mg/g이었으며, 이중 산성의 말로닐 진세노사이드인 m-Rb1, m-Rc, m-Rb2 및 m-Rd의 합인 말로닐 진세노사이드 합은 591.133 mg/g으로 총 진세노사이드의 85.7%를 차지했고, 백삼 농축액의 59.1%를 차지하는 고함량의 말로닐 진세노사이드 분획이었다(도 14). 동일한 방법으로 0, 30, 40, 60, 70, 100% 에탄올 분획 백삼 농축액에 포함된 진세노사이드 함량을 분석하였고 그 결과는 [표 14]과 같다.

에탄올 농도별 진세노사이드 함량(mg/g)
성분 0% 30% 40% 50% 60% 70% 100%
Rg1 N/D N/D 3.2 6.0 2.3 1.1 N/D
Re N/D N/D 28.1 44.5 19.6 6.2 N/D
Rf N/D N/D N/D N/D N/D 5.7 0.2
Rb1 N/D N/D 16.4 17.6 55.4 125.1 0.9
Rg2(r) N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D
m-Rb1 N/D N/D 120.1 264.3 83.5 3.0 N/D
Rc N/D N/D 5.6 10.3 70.8 110.3 0.5
m-Rc N/D N/D 100.7 221.5 96.7 2.5 N/D
Rb2 N/D N/D 6.6 10.7 42.7 78.2 0.4
Rb3 N/D N/D N/D N/D N/D 8.2 N/D
m-Rb2 N/D N/D 20.6 82.1 37.0 1.1 N/D
Rd N/D N/D 30.1 9.3 25.6 49.1 1.3
m-Rd N/D N/D 9.5 23.2 19.3 15.6 N/D
총 함량 0 0 340.9 689.5 452.9 406.1 3.3
총 함량 (말로닐진세노사이드) 0 0 250.9 591.1 236.5 22.2 0
[실시예 4]
실시예 2의 백삼 농축액(GS-KG9)을 이용하여 간질환 효과를 확인하였다.
실시예 4-1. 간세포 배양 및 세포독성 확인
Human 간암세포주인 HepG2 cell은 한국세포주은행(KCLB)으로부터 분양 받았으며, 세포배양을 위해 10% FBS과 1% 항생제(penicillin- streptomycin)을 포함하는 DMEM 배지를 사용하였다. 세포는 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양하였다. 배양 후 백삼 농축액(GS-KG9) 시료를 62.5㎍/㎖ ~ 500㎍/㎖로 처리하고 24시간 배양 후 세포 생존율을 MTT(Carmichael J, DeGraff WG, Gazdar AF, Minna JD, Mitchell JB. 1987. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Res 47: 936-942.)방법으로 평가하였다. 백삼 농축액 처리군은 아무것도 처리하지 않은 정상(Normal)군 대비 세포생존에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다(도 20).
실시예 4-2. 간손상 지표의 분석
실시예 2의 백삼 농축액(GS-KG9)을 이용하여 간질환에 대한 치료 효과를 확인하였다. 간경화, 간경변, 지방간 및 간염과 같이 간손상을 나타내는 주요 지표인 간 효소인 ALT(Alanine transaminase) 및 AST(Aspartate transaminase)의 농도 및 활성 정도를 평가하였다.
HepG2 세포에 TNF-α를 처리하여 ALT 및 AST의 농도 및 활성을 상승시킨 후(도 21), 백삼 농축액(GS-KG9)을 100㎍/㎖, 200㎍/㎖ 각각 처리하였다. 백삼 농축액의 처리결과 100㎍/㎖ 및 200㎍/㎖의 농도에서 모두 ALT 및 AST 양이 대조군(Control)군에 비해 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 22).
[실시예 5]
실시예 2의 백삼 농축액(GS-KG9)을 이용하여 간질환에 대한 효과를 확인하였다.
실험 동물로 생후 5주령 수컷 SD(Sprague-Dawley)계 수컷 흰쥐를 BMS (Seoul, Korea)에서 구입하여 동물사육실에서 식이 및 일정조건 (23±2℃, 습도 50±5%, 명암 12시간)으로 1주일간 순화시켰다.
실시예 5-1. 간 손상 모델의 제작 및 투여
급성 간염을 일으키는 D-갈락토사민(D-galactosamine)을 이용하여 간 손상 모델을 준비하였다. D-갈락토사민은 대사장애를 통한 UTP(uridine triphosphate), UDP(uridine diphosphate) 및 UMP(uridine monophophate) 등의 농도를 감소시킴으로 mRNA의 합성과 단백질 합성을 억제하는 역할을 한다. 또한 세포막을 구성하는 성분 중 탄수화물의 조성과 세포 내 Ca2+농도를 변화시켜 간 손상을 일으키는 것으로 알려져 있다. 그리고, D-갈락토사민의 투여는 범소엽성 간세포 괴사(panlobular focal hepatocyte necrosis), 염증세포의 침윤, 마크로파지(macrophage)의 증가 등을 나타낸다고 보고되고 있고, 급성 중독 시에는 간괴사, 만성 중독시에는 간경변과 세포성 종양을 일으키는 것으로 보고되고 있다.
실험 군은 정상군(Nor), D-갈락토사민 처리군(대조군(감염군), Con), 실리마린(Silymarin)+D-갈락토사민 처리군(Sily), 백삼 농축액(GS-KG9)(100, 300, 500 mg/kg)+D-갈락토사민 처리군으로, 6두 씩 총 9군으로 나누어 일정한 시간에 각 추출물을 1일 1회 총 2주간 경구 투여 하였다. 생리식염수에 희석한 D-갈락토사민을 각 추출물 마지막 투여 2시간 후 650mg/kg의 농도로 복강 투여하였고 72시간 염증유발 시킨 뒤 희생하였다. 양성 대조물질 실리마린(silymarin)의 용량은 25 mg/kg으로 경구투여 하였다. 본 연구에 실리마린은 대조군으로 사용된 약물로 엉겅퀴의 일종인 실리붐 마리아눔(Silybum marianum)의 씨앗에서 추출한 천연 약물로 독성 간질환이나 간세포 보호, 만성 간염, 간 경변 등의 간 질환에 주로 사용되는 약물이다.
실험 모델의 체중은 부검 전까지 2일 간격으로 측정하였다. 간 중량은 부검 시 복부대동맥으로부터 채혈 후 간을 적출하여 생리식염수로 세척 후 필터 페이퍼(filter paper)를 이용하여 수분을 제거한 후 무게를 측정하였다.
실험 모델의 간 기능 지표의 생화학적 검사는 혈청을 이용하였다. 생화학적 검사를 실시하기 위해 부검 시 복부대동맥으로부터 채취한 혈액 샘플을 원심분리용 튜브(BD Vacutainer, UK)에 넣고 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 생화학적 검사는 자동 생화학 분석기 (DRI-CHEM 3000s, Fujifilm, Japan)를 이용하여 ALT(Alanine aminotransferase), AST(Aspartic aminotransferase), 총 빌리루빈(Total bilirubin), 직접 빌리루빈(Direct bilirubin, D. bili), 알부민(Albumin), 총 단백질(Total protein, TP), 총 콜레스테롤(Total cholesterol, TC), 총 글리세라이드(Total glyceride, TG), 칼슘(Calcium), LDH(Lactate dehydrogenase), CPK(Creatine phosphokinase), GGT(Glucose, Gamma-glutamyl transferase), ALP(Alkaline phosphatase)를 측정하였다.
항산화 효능의 방어기작으로 CAT(catalase), SOD(superoxide dismutase), GPx(glutathione peroxidase)를 측정하였다. 우선, CAT(catalase)은 혈청을 이용해 측정하였다. 구체적으로, 부검 시 복부대동맥으로부터 채취한 혈액 샘플을 항응고제가 첨가된 원심분리용 튜브(BD Vacutain, erUK)에 넣고 2500g에서 15분간 원심분리하여 혈청을 분리하여 -70℃ 냉동고에 보관하여 실험에 사용하였다. CAT 측정은 다이서로스(Deisseroth) 등의 방법에 의해서 카탈라아제 키트(catalase kit)(Oxford biomedical research 제조)의 사용자 매뉴얼에 따라 520nm의 흡광도에서 활성도의 변화를 측정하였다. 다음으로 SOD(superoxide dismutase)는 간 조직을 이용하여 측정하였다. 구체적으로, 간은 4엽을 전부 적출하여 0.1g을 떼어 수크로즈 버퍼(0.25 M sucrose, 10 Mm Tris, 1 Mm EDTA, Ph 7.4)에 넣고 4℃ 냉장고에 보관하여 실험에 이용하였다. 간을 균질기로 균질화하고 -4℃, 10,000 g에서 60분동안 원심 분리하여 상등액만 수거하였다. 간 균질액의 단백질 정량은 로우리(Lowry) 등의 방법에 의해서 650nm에서 흡광도를 측정하고 표준 단백 시료는 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)을 사용하여 정량하였다. SOD 어세이 키트(SOD assay kit)(Dojindo 제조)의 사용자 매뉴얼에 따라 450nm의 흡광도에서 5분간 흡광도 감소를 측정하였다. 마지막으로 GPx(glutathione peroxidase)는 간 조직을 이용하여 측정하였다. 구체적으로, 0.1 g의 간을 10 mM 인산칼륨 버퍼(potasisumphosphate buffer), pH 7.4에 넣고 4℃ 냉장고에 보관하여 실험에 이용하였다. 간을 균질화하여 글루타티온과산화효소 키트(Glutathione peroxidase kit)(Oxford biomedical research 제조)의 사용자 메뉴얼에 따라 340nm의 흡광도에서 흡광도의 감소를 측정하였다.
5-2. 체중, 간 중량 및 간 지수의 측정
백삼 농축액(GS-KG9) 시료를 2주간 투여 후 간염을 유발한 흰쥐의 간지수(※간지수(%)=[(간무게/체중)*100],%)를 측정하였다. 측정결과, 정상군 12.13±1.11%, 간염군 10.88±1.25%로 체중 당 간 무게가 감소되었으며, 백삼 농축액(GS-KG9) 시료 투여시 간염의 간 지수 감소가 억제됨을 확인할 수 있었다([표 15]).
실험군 정상군 간염군 간염+
시판약물 		간염 + GS-KG9(mg/kg)
100 300 500
증가된
체중(g) 		85.33
±5.19		 78.50
±7.05		 82.58
±10.77		 79.17
±7.59		 79.00
±9.50		 75.08
±9.52
간지수(%) 12.13±1.11 10.88±1.25 11.54
±0.92		 13.23
±0.28		 12.67
±2.30		 13.14
±0.78
*간염군(D-갈락토사민 처리군), 시판약물(실리마린)
5-3. 간손상 지표의 분석
백삼 농축액(GS-KG9) 시료를 2주간 투여 후 간염 유발한 흰쥐의 혈액을 분석하였다. 정상군보다 간염군에서 간염염증지표인 AST와 ALT 값이 76.0, 42.7 U/L의 정상군 수치보다 113.0±14.1, 69.4±9.9 U/L로 현저하게 증가하였다. 백삼 농축액(GS-KG9) 투여군에서는 간염증지표 수치의 상승이 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였고, 특히 백삼 농축액(GS-KG9) 500 mg/kg 투여군에서 정상에 가까운 수치로 간 염증을 억제하는 것으로 확인하였다([표 16], 도 23, 도 24). 도 23 등에서 막대그래프 위에 있는 a, b, c, d, e, f는 통분 분석을 나타내는 것으로 문자가 다르다는 것은 군간의 차이가 있다는 것을 의미한다.
실험군 정상군 간염군 간염+
시판약물 		간염 + GS-KG9(mg/kg)
100 300 500
AST
(U/L) 		76.0
±4.7		 113.0
±14.1		 83.0
±5.2		 101.5
±11.6		 77.8
±10.7		 72.8
±12.0
ALT
(U/L) 		42.7
±4.0		 69.4
±9.9		 57.3
±12.5		 65.7
±10.3		 54.5
±14.4		 42.4
±3.6
*간염군(D-갈락토사민 처리군), 시판약물(실리마린)
5-4. 간 조직에서 SOD(Superoxide dismutase) 측정
간 조직의 항산화 효소 SOD 활성을 측정한 결과 정상군의 SOD 활성은 98.39(억제%), 간염군은 40.63(억제%)로 감소하였음을 확인하였다. 백삼 농축액(GS-KG9) 시료 투여 시 SOD 활성 감소가 농도 의존적으로 억제되어, SOD 활성이 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해 간세포 조직에서 백삼 농축액(GS-KG9)에 의한 항산화 활성을 알 수 있었다([표 17], 도 25).
실험군 정상군 간염군 간염+
시판약물 		간염 + GS-KG9(mg/kg)
100 300 500
SOD activity (inhibition rate%) 98.39
±0.23		 40.63
±0.17		 83.52
±0.15		 66.18
±0.09		 72.93
±0.15		 74.95
±0.17
*간염군(D-갈락토사민 처리군), 시판약물(실리마린)
5-5. 간 조직에서 GPx(Glutathione peroxidase) 측정
간 조직에서 GPx의 양을 측정한 결과 정상군에서는 81. 62 mU/mL, 간염군에서 42.25 mU/mL로 감소하였음을 확인하였다. 백삼 농축액(GS-KG9) 시료 투여 시 GPx 감소가 농도 의존적으로 억제되어, GPx 활성이 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해 간세포 조직에서 백삼 농축액(GS-KG9)에 의한 항산화 활성을 알 수 있었다([표 18], 도 26)
실험군 정상군 간염군 간염+
시판약물 		간염 + GS-KG9(mg/kg)
100 300 500
GPx
(mU/mL) 		81.62
±0.93		 42.25
±9.62		 77.45
±3.92		 66.54
±2.52		 68.48
±0.89		 69.44
±1.15
*간염군(D-갈락토사민 처리군), 시판약물(실리마린)
5-6. 간 조직 검사
정상군(A)과 비교하여 간염군(B)은 간섬유화(fibrosis)가 진행되어 콜라겐침착(검은색 화살표, 파란색 염색)을 확인할 수 있었다. 백삼 농축액(GS-KG9) 500mg/kg 투여군(F)을 제외한 모든 실험군(B, C, D, E)에서 간 섬유화가 관찰되었으나, 백삼 농축액(GS-KG9) 500mg/kg 투여군(F)은 정상군(A)과 동일한 형태적 특징을 보여 간섬유화가 억제됨을 확인할 수 있었다(도 27).

Claims (4)

  1. a) 백삼, 백미삼 또는 이들의 혼합물에 에탄올을 가하는 단계;
    b) 40 내지 50 ℃에서 진공 또는 초음파 추출하는 단계; 및
    c) 추출 후 강하막증발식 또는 진공농축 방법으로 농축액을 얻는 단계;
    를 포함하는, 말로닐 진세노사이드 함량이 증가된 간섬유화 개선용 기능성 건강 식품의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 a) 단계에서 에탄올의 농도는 30 내지 90%(v/v)인 간섬유화 개선용 기능성 건강 식품의 제조방법.
  3. 삭제
  4. 제1항 또는 제2항의 제조방법에 의해 제조된, 말로닐 진세노사이드 함량이 증가된 간섬유화 개선용 기능성 건강 식품.
KR1020180167612A 2018-12-21 2018-12-21 인삼 농축액을 포함하는 간질환 개선용 조성물 KR102091528B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180167612A KR102091528B1 (ko) 2018-12-21 2018-12-21 인삼 농축액을 포함하는 간질환 개선용 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180167612A KR102091528B1 (ko) 2018-12-21 2018-12-21 인삼 농축액을 포함하는 간질환 개선용 조성물

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170022777A Division KR20180096274A (ko) 2017-02-21 2017-02-21 인삼 농축액을 포함하는 간질환 개선용 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190000863A KR20190000863A (ko) 2019-01-03
KR102091528B1 true KR102091528B1 (ko) 2020-03-24

Family

ID=65021898

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180167612A KR102091528B1 (ko) 2018-12-21 2018-12-21 인삼 농축액을 포함하는 간질환 개선용 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102091528B1 (ko)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130043767A (ko) * 2011-10-21 2013-05-02 주식회사 진생사이언스 가공된 파낙스속 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 간보호 및 간질환의 치료 또는 예방용 조성물
KR101695848B1 (ko) 2015-03-03 2017-01-13 한국과학기술원 진세노사이드 f2를 포함하는 비알코올성 간 질환 또는 인슐린 저항성의 예방 또는 치료용 조성물
KR101738232B1 (ko) 2015-03-17 2017-05-22 경희대학교 산학협력단 진세노사이드 화합물 k 및 글리콜 키토산의 결합체 및 이의 항암 용도

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal ofEthnopharmacology, 2013, Vol.145, pp.233-240. 1부.*
Kor. J. Pharmacogn. 2016, Vol.47, No.1, pp.84-91. 1부.*
Phytotherapy Research. Vol. 23, 2009년, 1426-1430

Also Published As

Publication number Publication date
KR20190000863A (ko) 2019-01-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5352655B2 (ja) 草本植物である、ハマウツボ科の全寄生植物［ｃｉｓｔａｎｃｈｅｔｕｂｕｌｏｓａ（ｓｃｈｅｎｋ．）ｗｉｇｈｔ］から抽出されるフェニルエタノイド配糖体を含む医薬調製物、これの製造方法およびこれの使用
KR101074158B1 (ko) 간 보호 또는 간 질환의 예방 및 치료용 인삼다당체 조성물
CN101863871B (zh) 蔷薇红景天总苷及其医药用途和制备方法
KR101817552B1 (ko) 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 함유하는 간염의 예방 또는 치료용 조성물
KR101326256B1 (ko) 라말린을 함유하는 간섬유화 및 간경화의 예방 또는 치료용 약학 조성물
CN107349244B (zh) 丙二酰基人参皂苷的提取方法
JP2009120518A (ja) 田七人参抽出物
KR100988877B1 (ko) 작약 추출물을 유효성분으로 하는 ｂ형 간염 치료제 조성물
KR102091528B1 (ko) 인삼 농축액을 포함하는 간질환 개선용 조성물
KR100827938B1 (ko) 단삼 정제 추출물, 이의 제조 방법 및 이를 유효성분으로함유하는 간 보호 및 간섬유화 또는 간경화증 예방 및치료용 조성물
KR102254572B1 (ko) 향유 추출물을 이용한 만성폐쇄성폐질환 개선용 조성물
KR20110078525A (ko) 인삼 열매 추출물을 함유하는 간기능 개선용 조성물
JP2011037800A (ja) アピオス花を用いた血糖値上昇抑制物質および糖尿病予防用食品素材
JP5415108B2 (ja) Ｌｄｌレセプター合成促進剤
KR20180096274A (ko) 인삼 농축액을 포함하는 간질환 개선용 조성물
KR20150046427A (ko) 인삼 유래의 진세노사이드 Ｒｂ１의 함량이 증강된 추출 분획물을 유효성분으로 함유하는 비알코올성 지방간증의 예방 및 치료용 약제학적 조성물
EP1498131B1 (en) Medicinal preparation containing phenylethanoid glycosides extracted from Cistanche tubulosa
US10064908B2 (en) Method for preventing, improving or treating liver disease
KR20150011576A (ko) 가시오가피 뿌리를 유효성분으로 함유한 면역증진용 약학적 조성물 및 기능성 식품 조성물
Yanai et al. Utilization study of stems and leaves of Tienchi Ginseng. I. Anti-hypertensive effect of stems and leaves of Tienchi Ginseng on stroke-prone spontaneously hypertensive rat (SHRSP)
KR20100062094A (ko) 인삼열매, 인삼화 및 인삼줄기 추출물을 포함하는 알레르기예방 및 치료용 조성물
CN108250258B (zh) 一种利用发酵与超声波提取技术制备的新黄酮糖苷
CN106344601A (zh) Naucleamide G在制备抗炎药物中的应用
CN113577130A (zh) 一种修复肝脏损伤的组氨酸二肽组合物及其应用
KR100687246B1 (ko) 탄시논ⅰ을 함유하는 간질환 치료 및 예방을 위한 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant