KR102085592B1 - 살비아놀릭산 a를 유효성분으로 포함하는 염증성 피부 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 살비아놀릭산 A를 유효성분으로 포함하는 염증성 피부 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 피부 각질형성세포의 면역반응을 살비아놀릭산 A가 현저히 억제시키는 것을 확인함으로써, 살비아놀릭산 A를 피부 각질형성세포의 과도한 면역반응에 의해 나타나는 건선 등과 같은 염증성 피부 질환 치료제 개발에 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

살비아놀릭산 A를 유효성분으로 포함하는 염증성 피부 질환 예방 또는 치료용 조성물 {Composition comprising salvianolic acid A for preventing or treating for inflammatory skin diseases}

본 발명은 살비아놀릭산 A를 유효성분으로 포함하는 염증성 피부 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

피부는 다양한 환경적인 요인에 대해 신체를 보호하는 물리적 장벽으로서 자외선 등의 물리적 자극, 혹은 화학적 자극으로부터 내부 장기를 보호하며 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 하는 것으로(Athar, M., 2002), 단순히 몸을 보호하는 보호막뿐 만 아니라 하나의 면역 기관으로 간주되고 있다(Seo, W.O., et al., 2014).

인간의 피부 구조는 크게 표피층(epidermis), 진피층(dermis), 피하지방층(subcutis)으로 나뉜다. 피부를 구성하는 세포들로는 표피층의 각질형성세포(keratinocyte), 멜라닌형성세포(melanocyte), 진피층의 섬유아세포(fibroblast), 그리고 피하지방층의 지방세포(fat cell)로 크게 나눌 수 있다.

피부 면역을 담당하는 피부 세포들의 기능이 과활성화 되어 특정 면역인자들을 과량으로 분비하거나, 그 기능을 제대로 수행하지 못할 경우, 건선(psoriasis), 알레르기성 접속성 피부염(allergic contact dermatitis, ACD), 아토피 피부염(atopic dermatitis), 백반증(vitiligo) 등과 같은 다양한 염증성 피부 질환을 야기하게 된다.

피부 각질형성세포는 표피세포의 대부분을 구성하는 성분으로서 각질을 형성하고 여러 사이토카인(cytokine)들을 생산하여 다양한 염증반응과 면역반응에 관여한다(Kim N.M., et al., 2007; Beissert, S., et al., 2006). 피부 각질형성세포가 환경적, 생리적 스트레스에 노출되면 염증반응이 일어나고, 이로 인해 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1β(interleukin-1β), IL-6 및 CCL(chemokine (C-C motif) ligand)과 같은 여러 종류의 염증성 사이토카인들을 분비하게 된다(Kim, J.H., et al., 2015). 이러한 사이토카인들은 피부 각질형성세포의 증식 속도를 감소시키고, 진피층의 기질형성을 방해함으로써 손상된 피부의 치유 속도를 저하시키게 된다. 따라서 염증성 피부 질환에서 피부각질형성세포의 증식은 중요한 역할을 수행하며, 피부의 노화, 아토피성 피부염, 건선 등과 같은 염증성 피부 질환과 밀접한 관련이 있다.

특히, 염증과 면역 이상에 관련된 피부 질환 중, 건선(psoriasis)은 세계적으로 전 인구의 1~2%에서 발생되는 비교적 흔한 피부 질환으로 다양한 임상 증상을 보이며, 악화와 호전을 반복하는 만성 질환이다. 건선의 정확한 발병 원인은 알려지지 않았으나 현재까지는 자가면역질환(autoimmune disease)으로 보고 있다. 즉, 건선 표피의 각질형성세포와 진피의 T 세포, 섬유아세포와 같은 세포들 사이의 상호작용에 의해 건선 병변이 발생된다는 가설이 받아들여지고 있다(Nickoloff, B.J., 1999; Seo, W.O., et al., 2014). 또한, 최근 연구에서 각질형성세포가 TLR(toll-like receptor)을 통해 NF-κB(nuclear factor-κB) 신호전달 체계를 활성화시켜 건선 발병을 매개하는 TNF-α와 IL-8을 분비한다는 것을 밝혀냄으로써 각질형성세포가 건선 발병에 중요한 역할을 담당한다는 사실을 확인하였고, 각질형성세포의 면역조절 기능을 통해 건선 치료제를 개발 할 수 있음을 보고하고 있다(Li, Z.J., et al., 2013).

현재까지 건선을 포함하는 염증성 피부 질환의 치료로서 피부의 수분 유지, 면역계 염증반응 조절을 위한 스테로이드 등이 흔히 사용되어 왔으나, 이러한 치료방법은 일시적으로 증상을 완화시키는 역할을 할 뿐이거나 또는 과량 사용 시 부작용을 초래하는 단점을 지니고 있다(Gates, T., 2007; Wuthrich, B., et al., 2007). 따라서 이러한 문제를 보완할 수 있는 천연물 유래의 약리 효과가 높고 부작용이 낮은 피부 염증 질환 치료제 개발에 대한 연구가 필요한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 천연물 유래 물질을 이용한 염증성 피부 질환 치료제를 연구하는 과정에서, 살비아놀릭산 A가 외부 항원물질인 poly(I:C)에 의해 유도된 피부 각질형성세포의 면역반응을 현저하게 억제시키는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.

종래 선행기술로서 한국공개특허 제2017-0073308호에는 살비아놀릭산 A의 피부 노화, 주름, 탄력저하, 수분함유량 저하 개선 또는 예방 효과가 기재되어 있으나, 본 발명의 각질형성세포의 면역반응 억제를 통한 염증성 피부 질환 치료 효과는 전혀 기재 및 암시되어 있지 않다. 또한, 한국공개특허 제2018-0027213호에는 살비아놀산 C의 피부 트러블 개선 및 항염증 효과가 기재되어 있으나, 본 발명의 살비아놀릭산 A의 각질형성세포의 면역반응 억제를 통한 피부 질환 치료 효과는 전혀 기재 및 암시되어 있지 않다. 한국등록특허 제1070728호에는 각질형성세포의 TNF-α 및 IL-2의 생성 억제를 통한 건선 치료 효과가 기재되어 있으나, 본 발명의 살비아놀릭산 A는 전혀 기재 및 암시되어 있지 않다.

한국공개특허 제2017-0073308호, 피부 개선용 조성물, 2017. 06. 28. 공개. 한국공개특허 제2018-0027213호, 살비아놀산 C를 포함하는 화장료 조성물, 2018. 03. 14. 공개. 한국등록특허 제1070728호, 트리메칠피토스핑고신 유도체를 함유한 건선 예방 및 치료용 조성물, 2011. 09. 29. 등록.

Athar, M., Oxidative stress and experimental carcinogenesis, Indian J. Exp. Biol., 40(6), 656-667, 2002. Beissert, S., et al., Mechanisms of immune-mediated skin diseases: an overview, Clin. Exp. Rheumatol., 24(1 Suppl 40), S1-6, 2006. Gates, T., Atopic dermatitis: diagnosis, treatment, and aeromedical implications, Aviat. Space. Environ. Med., 78(1), 29-37, 2007. Kim, J.H., et al., The immunopathogenesis of psoriasis, Dermatol. Clin., 33, 13-23, 2015. Kim, N.M., et al., Effect of Korean red ginseng on collagen biosynthesis and MMP-1 activity in human dermal fibroblast, J. Ginseng Res., 31(2), 86-92, 2007. Li, Z.J., et al., Roles of TLR7 in activation of NF-kB signaling of keratinocytes by imiquimod, PLoS ONE, 8(10), e77159, 2013. Nickoloff, B.J., The immunologic and genetic basis of psoriasis, Arch. Dermatol., 135(9), 1104-1110, 1999. Seo, W.S., et al., Study for possibility of N,N,N-Trimethylphytosphingosine(TMP) for management of chronic skin diseases, Korean Society for Biotechnology and Bioenginnering Journal, 29(1), 36-41, 2014. Wuthrich, B., et al., Atopic eczema: genetics or environment?, Ann. Agric. Environ. Med., 14(2), 195-201, 2007.

본 발명의 목적은 살비아놀릭산 A를 유효성분으로 포함하는 염증성 피부 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명은 하기 화학식 1의 살비아놀릭산 A를 유효성분으로 포함하는 염증성 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기 약학 조성물은 피부 각질형성세포의 면역반응을 억제할 수 있다.

상기 피부 각질형성세포의 면역반응은 피부 외상, 피부 감염, 화학적 물질 또는 자외선에 의해 유도되는 것일 수 있다. 바람직하게는 바이러스에 의한 피부 감염에 의해 유도되는 것이다.

상기 염증성 피부 질환은 건선, 아토피 피부염, 원형탈모증, 백반증에서 선택될 수 있다. 바람직하게는 건선이다.

상기 살비아놀릭산 A는 조성물 총 중량을 기준으로 0.001~50중량%로 첨가될 수 있다.

상기 약학 조성물은 경구용 투여제, 스프레이제, 겔제, 연고제, 크림제, 또는 외용제로 제형화 된 약학 조성물 일 수 있다. 바람직하게는 피부 외용제로 제형화 된 약학 조성물이다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1의 살비아놀릭산 A를 유효성분으로 포함하는 염증성 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기 화학식 1의 살비아놀릭산 A는 통상적인 방법에 따라 합성할 수 있으며, 약학적으로 허용 가능한 염으로 제조될 수도 있으며, 또는 단삼(Salvia miltiorrhiza)으로부터 분리, 정제될 수 있다.

상기 살비아놀릭산 A는 전체 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001~50중량%, 더 바람직하게는 0.001~40중량%, 가장 바람직하게는 0.001~30중량%로 하여 첨가될 수 있다.

상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 스프레이 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 살비아놀릭산 A에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)-61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학 조성물은 경구용 투여제, 스프레이제, 겔제, 연고제, 크림제 또는 외용제로 제형화 된 약학 조성물일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는 겔제, 연고제, 크림제 또는 외용제로 제형화 된 약학 조성물이고, 더 바람직하게는 피부 외용제로 제형화 된 약학 조성물이다.

본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여 경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사 및 피부 도포에 의해 투여될 수 있다.

상기 약학 조성물은 피부 각질형성세포의 면역반응을 억제할 수 있다.

상기 피부 각질형성세포는 피부의 표피를 구성하는 주요 세포로서, 각질을 형성하고 여러 사이토카인을 생산하여 다양한 염증반응 및 면역반응에 관여한다. 피부 각질형성세포가 환경적, 생리적 스트레스에 노출되면 면역반응 및 염증반응을 유발하여 염증성 피부 질환을 유발할 수 있다.

상기 피부 각질형성세포의 면역반응은 피부 외상, 피부 감염, 화학적 물질 또는 자외선에 의해 유도되는 것일 수 있다. 바람직하게는 피부 감염에 의해 유도되는 것이고, 더욱 바람직하게는 바이러스에 의한 피부 감염에 의해 유도되는 것이다.

상기 "염증성 피부 질환"은 피부 면역을 담당하는 피부 세포들의 기능이 과활성화 되어 특정 면역 인자(사이토카인 등)들을 과량으로 분비하거나, 그 기능을 제대로 수행하지 못하여 발병하는 피부 질환을 의미한다.

본 발명의 염증성 피부 질환은 피부 각질형성세포의 면역반응에 의한 피부 질환으로, 건선, 아토피 피부염, 원형탈모증, 백반증 등에서 선택될 수 있다. 바람직하게는 건선이다.

상기 건선은 피부 각질형성세포가 외부 항원에 의해 선천면역반응이 과도하게 유발되어 나타날 수 있는 질환으로, 박테리아 및 바이러스를 포함하는 병원균의 감염에 의해서 유발된 것일 수 있다. 바람직하게는 바이러스 감염에 의해 유발된 건선이다.

상기 바이러스 감염에 의해 유발된 건선은 바이러스가 가지고 있는 이중가닥 RNA가 항원으로 작용하여 각질형성세포의 선천면역 반응을 활성화함으로서 유발된 것일 수 있다. 상기 바이러스는 레트로바이러스(retrovirus) 또는 C형 간염 바이러스(hepatitis C virus, HCV) 등 일 수 있다.

상기 피부 각질형성세포의 면역반응은 외부물질 또는 환경에 의해 자극을 받은 피부 각질형성세포가 다양한 면역 관련 사이토카인을 생산하고, 면역반응과 관련된 인플라마좀을 활성화시켜 면역반응을 유도하는 것으로, 각질형성세포의 과도한 면역반응은 염증성 피부 질환의 원인이 된다.

상기 피부 각질형성세포가 생산하는 면역 관련 사이토카인은 선천성 면역반응과 관련된 염증성 사이토카인으로, IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, CCL20 등일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 "인플라마좀(inflammaosome)"은 세포의 감염이나 스트레스 등 선천성 면역 방어 체계와 관련된 염증성 사이토카인의 성숙을 유도하는 분자적 기작이 되는 물질로, 불활성화 된 효소 전구체인 프로-카스파제-1(pro-caspase-1)을 활성화된 형태인 카스파제-1으로 변환시키고, 활성화된 카스파제-1은 불활성화 된 IL-1β 및 IL-18 전구체에 작용하여 IL-1β 및 IL-18를 활성화시켜 선천 면역반응을 유도한다.

본 발명은 살비아놀릭산 A를 유효성분으로 포함하는 염증성 피부 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 피부 각질형성세포에 항원물질로 poly(I:C)를 처리하여 유도한 각질형성세포의 면역반응을 살비아놀릭산 A가 현저히 억제시키는 것을 확인하였다.

이에 따라, 본 발명의 살비아놀릭산 A를 각질형성세포의 과도한 면역반응에 의해 나타나는 건선 등과 같은 염증성 피부 질환 치료제 개발에 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 살비아놀릭산 A의 세포 독성 여부를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 2는 살비아놀릭산 A의 피부 각질형성세포에서의 면역반응 억제 효과를 확인한 것으로, 면역반응 관련 사이토카인인 IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α 및 CCL20의 mRNA 발현을 확인 결과를 보여주고 있다.
도 3은 살비아놀릭산 A의 피부 각질형성세포에서의 면역반응 억제 효과를 확인한 것으로, 면역반응 관련 사이토카인인 IL-1β, IL-8 및 TNF-α의 단백질 발현을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 4는 살비아놀릭산 A의 피부 각질형성세포에서의 NF-κB 매개 면역반응 기작의 억제 효과를 확인한 것으로, NF-κB의 서브유닛 중 하나인 p65 및 NF-κB 억제제인 IκBα의 인산화를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 5는 살비아놀릭산 A의 인플라마좀 관련 기작의 억제 효과를 확인한 것으로, (A)는 활성화된 인플라마좀으로부터 생성되는 활성화 형태의 IL-1β 및 카스파제-1(caspase-1)의 발현을, (B)는 인플라마좀 구성 단백질인 NLRP4 및 ASC의 발현을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 6은 살비아놀릭산 A의 염증성 피부 질환의 선택적 치료 효과를 보여주는 것으로, poly(I:C)에 의한 대식세포 대비 피부 각질형성세포의 면역반응이 현저히 증가되고, 살비아놀릭산 A가 현저히 증가된 피부 각질형성세포의 면역반응을 억제함을 보여주고 있다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 인간 표피 각질형성세포 분리 및 배양>

피부 각질형성세포를 분리하기 위해 충남대학교 병원의 임상시험위원회의 윤리위원회 승인 절차에 따라 기증자의 서면 동의를 얻어 피부 조직을 채취하였다. 채취한 피부 조직의 표피로부터 일차 각질형성세포(primary keratinocyte)를 분리한 후, 유인원바이러스 40T 항원(simian virus 40T antigen, SV40Tag)을 발현하는 재조합 레트로바이러스(retrovirus)를 이용하여 불멸화(immortalization)시켜 인간 표피 각질형성세포(SV40Tag-transformed human epidermal keratinocyte, SV-HEK)를 확보하였다.

확보한 인간 표피 각질형성세포(이하, SV-HEK라고 함)는 소의 뇌하수체 추출물(bovine pituitary extract, BPE) 및 재조합 인간 표피 성장인자(recombinant human epidermal growth factor, rhEGF)가 포함되어 있는 K-SFM(keratinocyte-serum free medium) 배지에 배양하였다.

<실시예 2. 살비아놀릭산 A의 세포 독성 확인>

본 발명의 살비아놀릭산 A(salvianolic acid A, SAA) 화합물의 세포 독성 여부를 확인하기 위해 MTT(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 어세이를 수행하였다.

상기 실시예 1에서 확보한 SV-HEK를 24웰 플레이트에 웰당 1×10⁵개가 되도록 분주하고, 24시간 동안 배양한 후, DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시킨 SAA를 1, 5, 10, 20uM이 되도록 각 웰에 넣고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후에 0.5㎎/㎖의 MTT 용액이 첨가되어 있는 새로운 배지로 교체하여 4시간 반응시킨 후, 형성된 침전물을 DMSO로 녹이고 570㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이때, SAA를 처리하지 않은 SV-HEK의 세포 생존율을 100%로 하고, 각 세포의 생존율을 계산하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 보듯이, SAA의 처리 농도가 10uM 까지는 세포 생존율이 아무것도 처리하지 않은 SV-HEK의 세포 생존율과 유사하나, 20uM의 SAA를 처리한 경우에는 세포 생존율이 감소하는 것을 확인하였고, 이에 따라, 본 발명에서는 SAA의 최대 처리 농도를 10uM이 되도록 하였다.

<실시예 3. 살비아놀릭산 A의 피부 각질형성세포의 면역반응 억제 효과 확인>

각질형성세포가 건선과 같은 염증성 피부 질환의 발병에 중요한 역할을 담당하고, 각질형성세포의 면역 조절 기능을 통해 염증성 피부 질환의 치료가 가능하다는 것을 바탕으로, 본 발명의 살비아놀릭산 A(SAA)의 피부 각질형성세포의 면역반응 억제 정도를 확인하였다. 이때, 각질형성세포의 면역반응을 유도하기 위한 항원물질로 바이러스의 이중가닥 RNA(double-stranded RNA) 유사물질인 poly(I:C)(polyinosinic:polycytidylic acid)를 이용하였다.

실시예 3-1. 면역반응 관련 사이토카인의 mRNA 발현 확인

상기 실시예 1에서 배양한 SV-HEK의 배지를 BPE 및 rhEGF가 포함되어 있는 MCDB153 배지로 교체한 후 하룻밤 동안 배양하였다. 이후에 SAA가 5uM 또는 10uM이 되도록 넣고 1시간 동안 전처리(pretreatment)하였다. 1시간 후에, 1㎍/㎖의 poly(I:C)가 포함되어 있는 MCDB153 배지로 교체하고 2시간 동안 배양하였다. 이때, 아무것도 처리하지 않은 SV-HEK를 대조군으로 이용하였다.

상기 시료 처리한 SV-HEK에서의 면역반응 관련 사이토카인인 IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α 및 CCL20의 mRNA 발현량을 확인하기 위해 Easy-blue RNA 추출 키트(인트론사, 대한민국) 및 제조 회사로부터 제공받은 실험 방법을 이용해 각각의 시료를 처리한 SV-HEK 세포로부터 총 RNA를 분리하였다. 분리한 총 RNA 2㎍을 주형(template)으로 하여 엘피스 바이오텍(Elpis Biotech)사(대한민국)의 M-MLV(moloney-murine leukaemia virus) 역전사 효소(reverse transcriptase)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 하고, 하기 표 1의 프라이머와 엘피스 바이오텍사의 SYBR Green Master Mix를 이용하여 PCR을 수행하여 각 사이토카인의 mRNA 발현량을 확인하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 이때, GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 정량 대조군으로 이용하여 mRNA 발현량 분석에 이용하였다.

목적유전자	프라이머 종류	프라이머 염기서열
IL-1β	Forward	5′-TTAAAGCCCGCCTGACAGA-3′
	Reverse	5′-TTAAAGCCCGCCTGACAGA-3′
IL-6	Forward	5′-CTGCGCAGCTTTAAGGAGTTC-3′
	Reverse	5′-CCATGCTACATTTGCCGAAGA-3′
IL-8	Forward	5′-CCTTTCCACCCCAAATTTATCA-3′
	Reverse	5′-TTTCTGTGTTGGCGCAGTGT-3′
TNF-α	Forward	5′-CTCCTTCAGACACCCTCAACCT-3′
	Reverse	5′-CGACCCTAAGCCCCCAATT-3′
CCL20	Forward	5′-CCACCTCTGCGGCGAAT-3′
	Reverse	5′-TGTGTATCCAAGACAGCAGTCAAA-3′
GAPDH	Forward	5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′
	Reverse	5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′

도 2에서 보듯이, 아무것도 처리하지 않은 SV-HEK과 대비하여 poly(I:C)만을 처리한 경우에, IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α 및 CCL20의 mRNA 양이 증가하는 반면에, SAA를 전 처리한 경우에는 SAA 처리 농도 의존적으로 poly(I:C)에 의한 IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α 및 CCL20의 mRNA 발현이 억제되는 것을 확인하였다.

실시예 3-2. 면역반응 관련 사이토카인의 단백질 발현 확인

상기 실시예 3-1의 무처리 또는 시료 처리한 SV-HEK의 배양액과 IL-1β, IL-8 및 TNF-α 분석용 ELISA 키트(enzyme-linked immunosorbent assay kit) 및 제조 회사로부터 제공받은 실험 방법을 이용해 IL-1β, IL-8 및 TNF-α의 단백질 발현량을 측정하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보듯이, 아무것도 처리하지 않은 SV-HEK과 대비하여 poly(I:C)만을 처리한 경우에, IL-1β, IL-8 및 TNF-α의 단백질 양이 증가한 반면에, SAA를 전처리한 경우에는 SAA 처리 농도 의존적으로 poly(I:C)에 의한 IL-1β, IL-8 및 TNF-α의 단백질 발현이 억제되는 것을 확인하였다.

상기 실시예 3-1 및 실시예 3-2의 실험 결과를 통해, 본 발명의 SAA가 피부 각질형성세포에서 외부 항원물질로 인해 유발되는 면역반응을 현저히 억제시키는 것을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 살비아놀릭산 A(SAA)가 각질형성세포의 과도한 면역반응에 의해 발병하는 건선과 같은 염증성 피부 질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

<실시예 4. 살비아놀릭산 A의 피부 각질형성세포의 면역반응 기작 억제 효과 확인>

실시예 4-1. NF-κB 매개 면역반응 기작에서의 효과 확인

각질형성세포가 TLR(toll-like receptor)을 통해 면역반응의 중요 기작인 NF-κB 신호전달 체계를 활성화시켜 건선과 같은 염증성 피부 질환의 발병을 매개하는 TNF-α와 IL-8을 분비한다(Li, Z.J., et al., 2013)는 결과를 바탕으로, 본 발명의 살비아놀릭산 A(SAA)가 각질형성세포의 NF-κB 매개 면역반응 기작을 억제하는지 확인하였다.

상기 실시예 3-1의 방법과 동일한 방법으로 상기 실시예 1에서 배양한 SV-HEK에 시료를 처리한 세포에 세포 용해 완충용액(인트론사의 Proprep solution)을 넣고 세포를 용해시킨 후, 원심 분리하여 상등액을 확보하여, 웨스턴 블롯을 수행하였다. 상등액을 SDS-PAGE(sodium dodecyl polyacrylamide gel electrophoresis)를 통해 분리하고 니트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 옮겼다. 멤브레인을 5% 탈지 우유(nonfat milk)로 블로킹 시킨 다음, 인산화 된 p65(p-p65) 및 인산화 된 IκBα(p-IκBα)에 대한 1차 항체를 처리한 후, 1차 항체에 대한 2차 항체를 처리하여 각 단백질의 발현을 확인하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

상기 p65 단백질은 NF-κB를 이루고 있는 서브유닛(subunit) 중의 하나로, NF-κB가 활성화 되어 p65가 인산화 되면, 인산화 된 p65가 세포 핵 내로 들어가 유전자의 전사를 촉진한다. 반면에, 상기 IκBα는 NF-κB의 억제물질로, NF-κB에 결합하여 NF-κB의 핵 내 이동을 억제하고 있다가, 외부자극에 의해 IκBα가 인산화 되어 NF-κB로부터 떨어져 나와 분해되고, IκBα와 분리된 NF-κB는 핵 내로 이동하여 전사를 촉진한다.

도 4에서 보듯이, poly(I:C)만을 처리한 경우에는 인산화 된 p65(p-p65) 및 IκB(p-IκB)의 양이 증가하였으나, SAA를 전처리한 경우에는 SAA 농도 의존적으로 인산화 된 p65(p-p65) 및 IκB(p-IκB)의 양이 감소하는 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 SAA가 각질형성세포의 면역반응을 억제함으로써 과도한 면역반응으로 인한 염증성 피부 질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 4-2. 인플라마좀(inflammasome) 관련 기작에서의 효과 확인

인플라마좀(inflammasome)은 외부에서 침입한 병원균에게서 유래되는 병원체 관련 분자 패턴(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)과 내재적 스트레스의 결과로 유발되는 위험 관련 분자 패턴(danger-associated molecualr patterns, DAMPs)이 감지되면 세포질로 집결되어 조립되는 다양한 단백질의 복합체로, 선천성 면역 방어체계와 관련된 염증성 사이토카인의 성숙을 유도하는 분자적 기작이 되는 물질이다. 자극의 종류에 따른 인플라마좀 간의 기본적인 차이는 있으나, 대체적으로 인플라마좀은 불활성화 된 효소 전구체 프로-카스파제-1(pro-caspase-1)을 끌어 모으기 위한 지지체로 작동한다. 프로-카스파제-1 단백질의 중합화는 자체적인 단백질 분해 활성화를 유도하여 활성화된 카스파제-1으로 잘리게 된다. 활성화된 카스파제-1은 단백질 분해효소로 작용하여 불화성화 된 IL-1β 및 IL-18 전구체를 잘라서 활성화시킨다. 이러한 인플라마좀은 NLRP3(NOD-lkie receptor family, pyrin domain containing 3)와 ASC(apoptosis associated speck-like protein containing a CARD)와 같은 단백질들이 복합체를 이루고 있다. 이에, 본 발명의 살비아놀릭산 A(SAA)가 피부 각질형성세포의 인플라마좀 관련 기작을 억제하는지 확인하였다.

상기 실시예 4-1의 세포 용해 및 웨스턴 블롯 방법을 이용하여 피부 각질형성세포에서의 인플라마좀으로부터 생성되는 활성화 된 IL-1β 및 카스파제-1의 단백질 발현 및 인플라마좀 구성 단백질인 NLRP4 및 ASC의 발현을 확인하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 보듯이, poly(I:C)만을 처리한 경우에는 IL-1β 및 카스파제-1(caspase-1)의 양이 증가하였으나, SAA를 전처리한 경우에는 SAA 농도 의존적으로 IL-1β 및 카스파제-1의 양이 감소하는 것을 확인하였다(5(A)). 또한, 인플라마좀 구성 단백질의 경우에도, SAA를 전처리하면 poly(I:C)에 의해 증가되는 NLRP4 및 ASC의 양이 감소되는 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 SAA가 피부 각질형성세포의 면역반응에 관련되어 있는 인플라마좀의 기작을 억제함으로써 면역반응으로 인한 염증성 피부 질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 5. 살비아놀릭산 A의 피부 각질형성세포 선택적 면역반응 억제 효과 확인>

살비아놀릭산 A가 이미 대식세포에 의한 염증 반응을 억제한다는 것이 보고되었다. 이에, 살비아놀릭산 A의 면역반응 억제 효과가 피부 각질형성세포에 선택적인지를 확인하기 위해 대식세포와 피부 각질형성세포에서의 살비아놀릭산 A의 면역반응 억제 효과를 비교하였다.

대식세포는 인간 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)로부터 분리한 일차 대식세포를, 피부 각질형성세포는 상기 실시예 1에서 확보한 각질형성세포를 이용하였고, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 살비아놀릭산 A를 처리하고 poly(I:C)를 이용하여 각 세포의 면역반응을 유도하고, 각 세포에서의 IL-6 및 TNF-α의 mRNA 발현량을 확인하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에서 보듯이, 피부 각질형성세포의 경우, poly(I:C)에 의해 IL-6 및 TNF-α의 mRNA 발현량이 현저히 증가한 반면에, 살비아놀릭산 A를 처리한 경우에는 처리 농도 의존적으로 IL-6 및 TNF-α의 mRNA 발현량이 감소하는 것을 확인하였다. 한편, 대식세포의 경우에는 poly(I:C) 및 살비아놀릭산 A를 처리 했음에도 불구하고 IL-6 및 TNF-α의 mRNA 발현량이 아무것도 처리하지 않은 대식세포와 비슷한 수준임을 확인하였다.

이를 통해, 피부 각질형성세포의 경우에 대식세포와 비교하여 바이러스의 이중가닥 RNA 유사물질인 poly(I:C)에 의한 면역반응이 현저히 높게 나타나고, 이러한 피부 각질형성세포의 현저히 높은 면역반응을 본 발명의 살비아놀릭산 A가 효과적으로 억제한다는 것을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 살비아놀릭산 A가 대식세포에서의 염증성 면역반응 억제 효과보다 피부의 각질형성세포에서의 면역반응 억제 효과가 현저히 우수하다는 것을 알 수 있으며, 이는, 살비아놀릭산 A가 대식세포에 의한 염증 대비 건선과 같은 염증성 피부 질환을 좀 더 선택적으로 치료할 수 있음을 보여주는 것이라 사료된다.

< 제제예 1. 약학적 제제>

제제예 1-1. 겔 제형 약학적 제제

조제용기에 푸루로닉 F-127(BASF Co. 제품) 15중량%를 pH 6.0 완충액에 넣은 후 천천히 교반한 다음 4℃에서 20시간 방치하여 맑은 점조성의 액체를 얻었다. 별도의 용기에 pH 6.0 완충액에 본 발명의 살비아놀릭산 A 5중량%를 넣은 후 교반하여 용해시킨 다음 조제용기에 투입하고 교반하였다. 또 다른 별도의 용기에 에탄올 4중량%, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1중량% 및 파라옥시안식향산프로필에스테르 0.1중량%를 투입한 후 교반하고 용해시킨 다음 조제용기에 투입하였다. 투입된 혼합물을 20분 동안 교반한 다음 냉장고에서 4∼5시간 동안 방치함으로써 점조성액을 얻었다. 얻어진 점조성액에서 겔이 얻어질 때까지 서서히 가온하였다.

제제예 1-2. 연고 제형의 약학적 제제

조제용기에 백색 바셀린 15중량%, 세토스테아릴알콜 10중량%, 경질유동파라핀 7중량% 및 세토마크로골 1.5중량%를 약 65℃로 가온하여 용융시킨 다음 용융된 액을 100 메쉬체로 여과하였다. 별도의 용기에 정제수를 붓고 본 발명의 살비아놀릭산 A 5중량%를 넣어 교반하고 용해시킨 다음 조제용기에 투입하였다. 또 다른 별도의 용기에 95℃의 열탕 정제수에 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.12중량%, 파라옥시안식향산프로필에스테르 0.08중량%를 용해시켜 조제용기에 투입한 다음 약 20분 동안 교반 시킨 후 호모게나이저로 약 20분 동안 2500rpm의 속도로 유화시킨 다음 유화가 완료되면 천천히 교반하면서 냉각하였다.

제제예 1-3. 정제의 제조

본 발명의 살비아놀릭산 A 200g을 락토즈 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄하여 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활성 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

Claims (9)

1. 하기 화학식 1의 살비아놀릭산 A를 유효성분으로 포함하는 염증성 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 약학 조성물은 피부 각질형성세포의 면역반응을 선택적으로 억제하며, 상기 염증성 피부 질환은 아토피 피부염, 원형탈모증, 백반증에서 선택되는 것을 특징으로 하는 염증성 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   [화학식 1]
   

   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 피부 각질형성세포의 면역반응은 피부 외상, 피부 감염, 화학적 물질, 자외선에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 염증성 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
4. 제3항에 있어서,
   상기 피부 각질형성세포의 면역반응은 바이러스에 의한 피부 감염에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 염증성 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
5. 삭제
6. 삭제
7. 제1항에 있어서,
   상기 살비아놀릭산 A는 조성물 총 중량을 기준으로 0.001중량% 내지 50중량%로 첨가되는 것을 특징으로 하는 염증성 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
8. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 약학 조성물은 경구용 투여제, 스프레이제, 겔제, 연고제, 크림제, 또는 외용제로 제형화 된 것을 특징으로 하는 염증성 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
9. 제8항에 있어서,
   상기 약학 조성물은 피부 외용제로 제형화 된 것을 특징으로 하는 염증성 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   

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