KR102078218B1 - 남성 생식기 질환 진단용 조성물, 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 및 이의 용도 - Google Patents

남성 생식기 질환 진단용 조성물, 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

남성 생식기 질환 진단용 조성물, 이를 이용하여 남성 생식기 질환을 진단하는 방법, 남성 생식기 질환의 치료 또는 예방용 조성물, 및 생식기 관련 질환 모델 마우스에 관한 것이다.

Description

남성 생식기 질환 진단용 조성물, 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 및 이의 용도 {Composition for diagnosing male reproductive organ disease, composition for preventing or treating male reproductive organ disease, and use thereof}
남성 생식기 질환 진단용 조성물, 이를 이용하여 남성 생식기 질환을 진단하는 방법, 남성 생식기 질환의 치료 또는 예방용 조성물, 및 생식기 관련 질환 동물 모델에 관한 것이다.
프랑스 남성들의 정자수가 1989년에서 2005년 사이 33% 가량 줄어든 것으로 나타났다. 프랑스 연구팀이 'Human Reproduction' 저널에 밝힌 2만6600명 이상의 남성을 대상으로 한 연구결과에 의하면 지난 16년 동안 프랑스 남성들의 평균 정자수가 32.3% 가량 줄어 연간 1.9% 가량 감소한 것으로 나타났고, 또한 정상 모양의 정자의 비율 역시 33.4% 가량 줄어든 것으로 나타났다 (메디컬투데이, 2012. 12. 05). 이와 같은 측정치는 세계보건기구가 지난 1992년 통상의 성교를 통해서 임신시킬 수 있는 정자수의 최저치를 2천만 마리로 정한 기준으로 볼 때 40대 전후의 남성은 모두 이 기준을 초과했으나 20대 남성들은 86%만이 기준을 넘어선 것으로 나타났다. 지난 2006년 대비 2010년 남성 불임환자는 5년간 24.4%가 증가하였고, 남성 불임의 연평균 증가율은 여성보다 거의 두 배 높은 것으로 나타났다. 남성 불임환자의 급격한 증가는 유전적 요인, 과도한 업무와 스트레스, 또는 환경호르몬이 주된 원인 것으로 알려져 있다.
90년대부터 국내에서는 성기능 향상을 위해서 생약을 주원료로 제조되는 기능성 보조제 위주의 연구가 활발히 수행되었다. 한국인삼공사가 홍삼을 주원료로 개발한 "레드맥스", 및 한국식품연구원에서 더부살이풀, 오리나무 및 오미자 추출 물을 주원료로 하여 제조된 스태미나 증진효과가 있는 "다미나 909" 등이 판매되고 있다. 또한, 대한민국 등록특허 10-1735242호는 천연물 추출물을 포함하는 남성 생식 기관 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 개시하고 있다. 그러나, 이러한 조성물이 남성 생식 기관 질환을 치료할 수 있는 기전에 대하여는 밝히지 못하고 있다.
현재까지 남성 생식 기관 질환을 치료하기 위한 약물은 많이 개발되어 왔으나, 기존의 의약품들은 부작용을 내포하고 있고, 질환의 원인을 정확하게 파악하지 못한 의약품들이 대다수였으며, 그 치료의 대상이 되는 질환 또한 제한적이었다. 따라서 부작용이 비교적 적고, 남성 생식 기관 관련 질환의 원인에 따라 개선, 치료 또는 예방하고자 하는 연구들이 다양하게 수행될 필요성이 있다.
일 양상은 남성 생식기 질환 진단용 조성물을 제공한다.
다른 양상은 남성 생식기 질환 진단용 키트를 제공한다.
다른 양상은 남성 생식기 질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 남성 생식기 질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.
다른 양상은 남성 생식기 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 TAZ 유전자가 결핍된, 남성 생식기 질환 동물 모델을 제공한다.
일 양상은 TAZ 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함하는, 남성 생식기 질환 진단용 조성물을 제공한다.
TAZ (transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) 단백질은 전사 조절자 1을 포함하는 WW-도메인 1 (WW-domain containing transcription regulator 1, WWTR1)으로 알려져있으며, 14-3-3 및 PDZ 도메인에 의해 중간엽 줄기세포에서 전사 조절자로서 기능한다 (Kanai, F. et al., The EMBO Journal, 19(24): 6778-6791, 2000; Hong, J. et al., Science 309(5737): 1074, 2005). TAZ 단백질 구조에서 WW-도메인 또는 감긴 나선 도메인 (coiled-coil domain)은 전사인자 기능을 보이는 다른 단백질과의 결합에 관여하고, C 말단 도메인은 전사 활성을 조절하는데 관여하며, N 말단 도메인은 TEAD 단백질과의 결합에 관여한다. TAZ가 결핍되는 경우 폐 및 신장의 기능이 손상될 수 있다. 또한, TAZ는 RUNX2의 활성을 자극하고 및 PPARγ의 활성을 억제하면서 상호작용하여, 조골 세포 및 지방 세포로의 분화를 조절하는 것으로도 알려져 있다. TAZ 단백질은 단백질의 이름이 상이하더라도, 그와 동일 또는 유사한 활성을 갖는 단백질을 포함하는 것일 수 있다. TAZ 단백질은 인간, 돼지, 소, 말, 개, 고양이, 또는 실험 동물, 예를 들면, 래트, 쥐, 토끼, 기니아피그, 또는 햄스터의 TAZ 단백질인 것일 수 있다. 상기 TAZ 단백질은 예를 들면, NCBI Accession number NP_001161750, NP_001161750.1, NP_001161752.1, NP_056287.1, NP_001161753.1, NP_598545, 또는 NP_598545.2로 등록된 아미노산 서열, 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 그의 일부분인 폴리펩티드인 것일 수 있다. 상기 일부분은 TAZ 단백질에서 WW-도메인 및/또는 감긴 나선 도메인을 포함하는 것일 수 있다. 상기 TAZ 단백질은 NCBI Accession number NP_001161750, NP_001161750.1, NP_001161752.1, NP_056287.1, NP_001161753.1, NP_598545 또는 NP_598545.2로 등록된 아미노산 서열, 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드인 것일 수 있다. 여기에서, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST [참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]나 Pearson에 의한 FASTA [참조: Methods Enzymol., 183, 63(1990)]을 사용하여 결정할 수 있다.
통상의 기술자라면 상기 등록번호를 이용하여 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 용이하게 확인할 수 있을 것이다. UCSC genome browser 또는 GenBank에 등록되어 있는 번호에 해당하는 구체적인 서열은 시간이 지남에 따라 다소 변경될 수 있다. 본 발명의 범위가 상기 변경된 서열에도 미치는 것은 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
상기 TAZ 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드는 TAZ 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드인 것일 수 있다. 상기 TAZ 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드는 단수개 또는 복수개인 것일 수 있다. 상기 TAZ 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드는 항체, 항원 결합 단편, 리간드, 수용체, 작용제 (agonist), 길항체 (antagonist), 또는 이들의 결합 단편; 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 항체, 항원 결합 단편, 리간드, 수용체, 작용제, 길항체는 당해 기술분야에 공지된 것일 수 있다. 항체는 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 상기 항체는 전체 항체 형태인 것일 수 있다. 상기 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결된 것을 의미한다. 항체는 항원 결합 단편인 것일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 의미한다. 예를 들면, scFv 단편, (scFv)2 단편, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편 등을 포함하는 것일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고, 예를 들면, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있으며, 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
상기 TAZ 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드는 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 방법에 이용되는 것일 수 있다. 상기 TAZ 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드는 예를 들면 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법 (radioimmunoassays), 효소결합면역법 (Enzyme Linked Immunoabsorbent assay: ELISA), 면역 블롯 (immunoblotting: IB), 파아르 분석법 (Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 면역크로마토그래피법, 단백질 칩, 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), 면역형광법 또는 이들의 조합을 이용한 방법에 이용되는 것일 수 있다.
상기 남성 생식기 질환은 남성 생식기의 노화에 따른 것일 수 있다. 상기 남성 생식기 질환은 산화적 스트레스에 의해 유발된 것일 수 있다. 상기 남성 생식기 질환은 세포 주기 조절 인자의 발현 또는 활성을 증가시켜, 세포 주기를 정지시키는 것일 수 있다. 상기 남성 생식기 질환은 염증성 사이토카인을 발현 및 분비시키는 것일 수 있다. 상기 세포 주기 조절 인자는 p21, p19, p16 등을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 염증성 사이토카인은 IL-6, TNF-α 등을 포함하는 것일 수 있다. 상기 남성 생식기 질환은 p53의 결합 활성 증가에 따른 세포 주기 조절 인자의 발현 및 활성 증가에 따른 것일 수 있다. 상기 남성 생식기 질환은 예를 들면, 호르몬 이상, 정자감소증 (oligospermia), 무정자증 (azoospermia), 약정자증 (asthenozoospermia), 정세포무형성증 (agenesis of spermatid cell), 고환염, 고환손상, 성선기능저하증 (Hypogonadism), 전립선 비대증 또는 이들의 조합인 것일 수 있다.
다른 양상은 TAZ의 mRNA 또는 그의 상보서열, 또는 cDNA 또는 그의 상보서열에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 남성 생식기 질환 진단용 조성물을 제공한다. 상기 TAZ의 mRNA 또는 그의 상보서열, 또는 cDNA 또는 그의 상보서열에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드는 프라이머, 프로브, 또는 이들의 안티센스 핵산; 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 TAZ 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 또는 이들의 안티센스 핵산; 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 TAZ 단백질을 코딩하는 유전자는 인간, 돼지, 소, 말, 개, 고양이, 또는 실험 동물, 예를 들면, 래트, 쥐, 토끼, 기니아피그, 또는 햄스터의 TAZ 단백질을 코딩하는 유전자인 것일 수 있다. 상기 TAZ 단백질을 코딩하는 유전자는 예를 들면, NCBI Accession number NP_001161750, NP_001161750.1, NP_001161752.1, NP_056287.1, NP_001161753.1, NP_598545 또는 NP_598545.2로 등록된 아미노산 서열, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 일부분인 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다. 상기 TAZ 단백질을 코딩하는 유전자는 NCBI Accession number NM_001168278.2, NM_001168280.2, NM_015472.5, NM_001168281.1, 또는 NM_133784.3로 등록된 뉴클레오티드 서열, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA인 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 또한, 단일가닥 또는 이중가닥 형태인 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 또한, 상보적 뉴클레오티드에 수소 결합에 의하여 혼성화될 수 있는 성질을 갖는 것이면, 천연 뉴클레오티드로 구성된 것뿐만 아니라, 천연 뉴클레오티드, 천연 뉴클레오티드의 유사체, 천연 뉴클레오티드의 당, 염기 또는 인산 부위가 변형되어 있는 뉴클레오티드 또는 이들 조합인 것일 수 있다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584 (1990)). 하나의 단일가닥 폴리뉴클레오티드가 남성 생식기 질환의 발병 위험과 연관되어 있는 경우, 상기 단일가닥 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드도 당연히 남성 생식기 질환 발병 위험과 연관되어 있는 것으로 판단될 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 하나의 특정한 서열을 가진 남성 생식기 질환의 발병 위험과 연관되어 있는 단일가닥 폴리뉴클레오티드, 그에 상보적인 서열을 가진 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
"프라이머"는 중합효소에 의한 뉴클레오티드의 중합반응에서, 개시점으로 작용할 수 있는 단일가닥의 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 예를 들면, 상기 프라이머는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건 (즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소의 존재) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일가닥의 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다. 상기 프라이머는 길이가 15 내지 30nt인 것일 수 있다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 상기 프라이머는 상기한 폴리뉴클레오티드 자체 뿐만 아니라, 상기한 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 서열로서 중합반응에서 개시점으로 작용할 수 있는 것도 포함된다. 예를 들면, 서열번호 3 또는 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 상보성을 갖는 서열인 것일 수 있다. 프라이머의 설계는 주어진 증폭하고자 하는 표적 핵산의 서열을 참조하여 통상의 기술자에 의해 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들면, 상업적으로 구입가능한 프라이머 설계용 프로그램을 사용하여 설계할 수 있다. 상기 상업적으로 구입가능한 프라이머 설계용 프로그램의 예는 PRIMER 3 프로그램이 포함된다.
"프로브"란 특정 표적 서열에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일가닥 형태인 것일 수 있다. 상기 프로브는 길이가 5 내지 100nt, 10 내지 90nt, 15 내지 80nt, 20 내지 70nt, 또는 30 내지 50nt인 것일 수 있다. 상기 프로브는 표적 서열에 대한 특이적 혼성화를 손상하지 않는 범위 내에서, 변형된 뉴클레오티드를 갖는 것일 수 있다.
"안티센스 핵산"은 표적 서열에 대하여 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가지고 있어, 그와 이합체를 형성할 수 있는 핵산 기반의 분자를 의미한다. 상기 안티센스 핵산은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편, 또는 이들에 상보적인 것일 수 있다. 상기 안티센스 핵산은 길이가 10nt 이상, 10 내지 200nt, 10 내지 150nt, 또는 10 내지 100nt인 것일 수 있으나, 검출 특이성을 증가시키기 위하여 적절한 길이를 선택할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 검출 가능한 표지로 표지된 것인 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다. 검출 가능한 표지는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로서, 형광물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질인 것일 수 있다. 상기 검출 가능한 표지로부터 핵산의 혼성화 결과를 확인할 수 있다.
상기 TAZ의 mRNA 또는 그의 상보서열, 또는 cDNA 또는 그의 상보서열에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드는 혼성화 및/또는 증폭을 측정할 수 있는 방법에 이용되는 것일 수 있다. 상기 TAZ의 mRNA 또는 그의 상보서열, 또는 cDNA 또는 그의 상보서열에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들면 역전사 중합효소 연쇄 반응 (reverse transcription polymerase chain reaction: RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR (competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (real time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RNase protection assay: RPA), 노던 블랏팅 (Northern blotting), 유전자 발현의 연속 분석법 (serial Analysis of Gene Expression: SAGE), RNase 보호분석법 (RNase protection assay), DNA를 포함한 핵산 마이크로어레이, 시퀀싱 또는 이들의 조합에 이용되는 것일 수 있다.
다른 양상은 TAZ 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함하는, 남성 생식기 질환 진단용 키트를 제공한다. 상기 TAZ 단백질, TAZ 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드, 및 남성 생식기 질환에 대하여는, 전술한 바와 같다.
상기 키트는 상기 폴리펩티드의 항원-항체 반응 유무를 통하여, 남성 생식기 질환의 발병 위험을 진단하기 위한 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 키트는 단백질 칩 키트인 것일 수 있다. 상기 단백질 칩 키트는 항원과 항체의 결합을 검출 또는 측정하기 위하여, 기재, 적당한 완충 버퍼, 발색 효소 또는 형광 물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함하는 것일 수 있다. 상기 키트에서 기재로는 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지 또는 폴리스틸렌 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색 효소로는 퍼옥시다아제 (peroxidase), 알칼라인 포스파타아제 (alkaline phosphatase) 등이 이용될 수 있다. 또한, 형광 물질로는 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질로는 ABTS (2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD (o-페닐렌디아민), TMB (테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다.
다른 양상은 TAZ의 mRNA 또는 그의 상보서열, 또는 cDNA 또는 그의 상보서열에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 남성 생식기 질환 진단용 키트를 제공한다. 상기 TAZ 단백질, TAZ의 mRNA 또는 그의 상보서열, 또는 cDNA 또는 그의 상보서열에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드, 및 남성 생식기 질환에 대하여는, 전술한 바와 같다. 상기 키트는 상기 유전자 또는 전사체의 존재 유무를 통하여, 남성 생식기 질환의 발병 위험을 진단하기 위한 것일 수 있다.
상기 키트는 상기 폴리뉴클레오티드를 프라이머로서 포함하는 동시에, 증폭에 필요한 시약을 포함하는 것일 수 있다. 상기 증폭 시약은 예를 들면, 데옥시리보뉴클레오티드, 폴리머라제, 역전사 효소, 및 적절한 버퍼를 포함하는 것일 수 있다. 상기 키트는 또한 사용 설명서를 포함하는 것일 수 있다. 상기 사용 설명서는 예를 들면, 상기 특이적 프라이머를 사용한 증폭 반응에서 표적 서열이 증폭되지 않는 경우, 증폭에 사용된 시료 중에서 남성 생식기 구조 및/또는 기능과 연관된 유전자가 결핍되거나 또는 존재하지 않는 것으로 결정하고, 그 결과로부터 개체의 남성 생식기 질환의 발병 위험을 결정하는 것에 대한 설명을 포함한, 결과 판정에 대한 설명을 포함하는 것일 수 있다. 상기 키트는 상기 폴리뉴클레오티드를 프로브로서 포함하는 동시에, 혼성화에 필요한 시약을 포함하는 것일 수 있다. 상기 키트는 또한 사용 설명서를 포함하는 것일 수 있다. 상기 사용 설명서는 예를 들면, 상기 상보적인 프로브를 사용한 혼성화 반응에서 표적 서열이 검출되지 않는 경우, 시료 중에서 남성 생식기 구조 및/또는 기능과 연관된 유전자가 결핍되거나 또는 존재하지 않는 것으로 결정하고, 그 결과로부터 개체의 남성 생식기 질환의 발병 위험을 결정하는 것에 대한 설명을 포함한, 결과 판정에 대한 설명을 포함하는 것일 수 있다.
다른 양상은 남성 생식기 질환이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 TAZ 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 단백질의 양을 정상 대조군 시료의 TAZ 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 남성 생식기 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 TAZ 단백질, 및 남성 생식기 질환에 대하여는, 전술한 바와 같다.
상기 방법은 분리된 생물학적 시료를 수득하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 정소 (testis), 전립선, 부고환, 정관, 세정관 (seminiferous tubule), 정자 (sperm), 세르톨리 세포 (sertoli cell), 정세포 (spermatid cell), 정자발생 세포 (spermatogenic cell), 정모 세포 (spermatocyte cell), 정원 세포 (spermatogonia cell), 레이딕 세포 (leydig cell) 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 조 분리된 단백질, 용해 버퍼에서 용해된 단백질, 또는 조직 또는 세포의 파쇄물인 것일 수 있다.
상기 측정하는 단계는 TAZ 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 상기 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성에 의해 TAZ 단백질의 양을 측정하는 것일 수 있다. 상기 측정하는 단계는 TAZ 단백질의 아미노산 서열을 결정하여 TAZ 단백질의 양을 측정하는 것일 수 있다.
상기 비교하는 단계는 상기 측정된 단백질의 양을 정상 대조군 시료의 TAZ 단백질의 양과 비교하여, 측정된 단백질의 양이 정상 대조군 시료의 TAZ 단백질의 양보다 적은 경우, 남성 생식기 질환 발병의 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 정상 대조군은 참조 유전체 서열을 갖고 있는 군 (reference neucleotide sequence), 정상인 군, NCBI37.1 또는 UCSC hg19 (GRCh37)로 등록된 서열을 갖는 군, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다.
상기 방법은 개체의 남성 생식기 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 것일 수 있다. 상기 개체의 남성 생식기 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 것은, 남성 생식기 질환의 발병의 상대적인 위험을 예측 또는 진단하기 위한 것일 수 있다.
상기 개체는 남성 생식기 질환의 발병 위험을 예측하기 위한 대상을 의미한다. 상기 개체는 척추동물, 포유동물, 예를 들면, 인간 (Homo sapiens), 돼지, 소, 말, 개, 고양이, 또는 실험 동물, 예를 들면, 래트, 쥐, 토끼, 기니아피그, 또는 햄스터를 포함하는 것일 수 있다.
다른 양상은 남성 생식기 질환이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 TAZ의 mRNA의 양을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 mRNA의 양을 정상 대조군 시료의 TAZ mRNA의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 남성 생식기 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 TAZ 단백질, TAZ의 mRNA, 개체, 및 남성 생식기 질환에 대하여는, 전술한 바와 같다.
상기 방법은 분리된 생물학적 시료를 수득하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 정소, 전립선, 부고환, 정관, 세정관, 정자, 세르톨리 세포, 정세포, 정자발생 세포, 정모 세포, 정원 세포, 레이딕 세포 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 정소, 전립선, 부고환, 정관, 세정관, 정자, 세르톨리 세포, 정세포, 정자발생 세포, 정모 세포, 정원 세포, 레이딕 세포 또는 이들의 조합로부터 핵산을 직접적으로 분리하거나, 또는 중합효소 연쇄 반응과 같은 핵산 증폭 방법에 의하여 특정한 영역을 증폭함으로써 분리되는 것일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 순수하게 분리된 핵산뿐만 아니라 조 분리된 핵산, 예를 들면, 핵산을 포함하는 세포 파쇄물을 포함하는 것일 수 있다. 분리된 핵산은 DNA 또는 RNA인 것일 수 있다. 상기 DNA는 게놈 DNA, cDNA 또는 이들의 조합인 것일 수 있고, 상기 RNA는 총 RNA, mRNA 또는 이들의 조합인 것일 수 있다.
상기 측정하는 단계는 TAZ의 mRNA 또는 그의 상보서열, 또는 cDNA 또는 그의 상보서열에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드를 상기 시료와 혼성화시켜 혼성화 산물 형성에 의해 TAZ의 mRNA 또는 그의 상보서열, 또는 cDNA 또는 그의 상보서열의 양을 측정하는 것일 수 있다. 상기 측정하는 단계는 뉴클레오티드 서열을 결정하여, TAZ의 mRNA 또는 그의 상보서열, 또는 cDNA 또는 그의 상보서열이 존재하는지 여부를 확인하는 것일 수 있다. 뉴클레오티드 서열 결정 방법은 생거 시퀀싱 방법, 막삼-길버트 방법, 단일염기 연장 방법 (single base primer extension: SBE), 차세대 서열 분석 (next generation sequencing: NGS) 또는 이들의 조합인 것일 수 있다.
상기 비교하는 단계는 상기 측정된 mRNA의 양을 정상 대조군 시료의 TAZ mRNA의 양과 비교하여, 측정된 mRNA의 양이 정상 대조군 시료의 TAZ mRNA의 양보다 적은 경우, 남성 생식기 질환 발병의 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
다른 양상은 TAZ 단백질, TAZ 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, TAZ 단백질의 발현 또는 활성 촉진제, 또는 이들의 조합을 포함하는, 남성 생식기 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 TAZ의 새로운 용도로서, 상기 용도는 남성 생식기 질환을 치료 또는 예방하는 용도에 관한 것일 수 있다. TAZ 단백질, TAZ 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 TAZ 단백질의 발현 또는 활성 촉진제는 남성 생식기의 노화를 지연시키는 것, 산화적 스트레스에 의한 손상을 억제시키는 것, 세포 주기 조절 인자의 발현 또는 활성을 감소시키는 것, 염증성 사이토카인의 발현 및 분비를 감소시키는 것, 남성 생식기의 구조적 이상을 감소시키는 것, 및/또는 남성 생식기의 호르몬 분비를 조절하는 것일 수 있다.
상기 TAZ 단백질은 인간, 돼지, 소, 말, 개, 고양이, 또는 실험 동물, 예를 들면, 래트, 쥐, 토끼, 기니아피그, 또는 햄스터의 TAZ 단백질인 것일 수 있다. 상기 TAZ 단백질은 예를 들면, NCBI Accession number NP_001161750, NP_001161750.1, NP_001161752.1, NP_056287.1, NP_001161753.1, NP_598545, 또는 NP_598545.2로 등록된 아미노산 서열, 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 일부분인 폴리펩티드인 것일 수 있다. 상기 TAZ 단백질은 NCBI Accession number NP_001161750, NP_001161750.1, NP_001161752.1, NP_056287.1, NP_001161753.1, NP_598545, 또는 NP_598545.2로 등록된 아미노산 서열, 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드인 것일 수 있다. 상기 TAZ 단백질은 남성 생식기 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 개체와 동일한 종의 TAZ 단백질인 것일 수 있다.
상기 TAZ 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 인체, 동물 또는 세포에서 발현되는 선형 DNA 또는 벡터의 형태인 것일 수 있다. 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스성 발현 벡터, 또는 재조합 바이러스 벡터, 예를 들면 재조합 레트로바이러스 (retrovirus) 벡터, 재조합 아데노바이러스 (adenovirus) 벡터, 재조합 아데노 부속 바이러스 (adeno-associated virus: AAV) 벡터, 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus) 벡터, 재조합 렌티바이러스 (lentivirus) 벡터 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 벡터는 숙주에서 목적 단백질인 TAZ 단백질을 발현할 수 있는, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 구조체를 의미한다. 상기 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있고, 자가 복제하거나 숙주의 DNA에 통합되는 것일 수 있다. 상기 세포는 체세포, 조혈 줄기세포 (hematopoietic stem cells), 수지상 세포 (dendritic cells), 자가이식 종양세포 (autologous tumor cells), 정착 종양세포 (established tumor cells) 또는 이들의 조합인 것일 수 있다.
TAZ 단백질의 발현 또는 활성 촉진제는 TAZ 유전자 또는 TAZ 단백질에 직접적 또는 간접적으로 작용하여, TAZ 유전자의 발현 또는 TAZ 단백질의 활성을 조절, 자극 또는 증가시키는 물질을 의미한다. 상기 물질은 유기 화합물, 무기 화합물, 펩타이드, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 상기 TAZ 단백질의 발현 또는 활성 촉진제는 TAZ 유전자의 전사 및/또는 번역을 증대 또는 촉진시키는 것, 비활성형 TAZ 단백질을 활성형으로 전환시키는 것 또는 TAZ 단백질의 위치를 세포질에서 핵 내로 이동 또는 핵 내에 위치시키는 것일 수 있다. 상기 TAZ 단백질의 발현 또는 활성 촉진제는, 테트라졸 화합물, 예를 들면 TM-25659, TM-53, 또는 TM-54, 플라보노이드 화합물, 예를 들면 캠페롤 (kaempferol) 또는 이들의 조합인 것일 수 있다.
"치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질환 범위의 감소, 질환 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질환 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질환 상태의 개선, 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로) 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 질환의 발병율과 비교하여 질환의 발병율을 감소시키는 것일 수 있다. "예방"은 질환의 발생을 억제하거나 그의 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 상기 "남성 생식기에서 질환을 치료 또는 예방"하는 것은 남성 생식기의 노화를 감소 또는 억제하는 것일 수 있다. 상기 "남성 생식기에서 질환을 치료 또는 예방"하는 것은 산화적 스트레스에 의해 유발된 증상을 감소 또는 억제하는 것, 세포 주기 조절 인자의 발현 또는 활성을 감소 또는 억제하는 것, 염증성 사이토카인을 발현 및 분비를 감소 또는 억제하는 것, p53의 결합 활성 증가에 따른 세포 주기 조절 인자의 발현 및 활성을 감소 또는 억제하는 것, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다.
상기 TAZ 단백질, TAZ 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, TAZ 단백질의 발현 또는 활성 촉진제, 또는 이들의 조합은 조성물 중에 유효성분으로 포함되는 것일 수 있다. 상기 유효성분은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.01 중량% 내지 60 중량%, 0.01 중량% 내지 40 중량%, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 60 중량%, 0.05 중량% 내지 40 중량%, 0.05 중량% 내지 30 중량%, 0.05 중량% 내지 20 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 5 중량%로 포함되는 것일 수 있다.
상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는 것일 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘, 탈크, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 부형제는 미정질 셀룰로오스, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오스, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분 글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다.
상기 TAZ 단백질, TAZ 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, TAZ 단백질의 발현 또는 활성 촉진제 또는 이들의 조합은 경구 또는 비경구, 예를 들면, 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내, 정소내, 전립선내, 또는 이들의 조합에 투여를 목적으로 제조되는 것일 수 있다. 예를 들면, 단백질, 폴리뉴클레오티드, TAZ 단백질의 발현 또는 활성 촉진제 또는 이들의 조합은 주사가능한 형태로 사용되는 것일 수 있다.
다른 양상은 TAZ 단백질, TAZ 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, TAZ 단백질의 발현 또는 활성 촉진제, 또는 이들의 조합을 포함하는, 남성 생식기 질환의 개선 또는 예방용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 상기 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 의미한다. 상기 건강기능식품은 남성 생식기 질환의 개선 또는 예방 효과를 갖는 기능성 식품인 것일 수 있다.
상기 조성물은 식품학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것일 수 있다. 상기 건강기능식품은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제를 포함하는 것일 수 있다. 상기 "식품보조첨가제"는 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성 요소를 의미하며, 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 통상의 기술자가 적절히 선택하여 사용하는 것일 수 있다. 상기 건강기능식품은 예를 들면, 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 식품보조첨가제로 포함하는 것일 수 있다. 상기 건강기능식품은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 약학적 조성물과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 남성 생식기 질환의 예방 또는 개선 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
다른 양상은 개체에 TAZ 단백질, TAZ 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, TAZ 단백질의 발현 또는 활성 촉진제, 또는 이들의 조합을 도입하는 단계를 포함하는, 개체의 남성 생식기 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
상기 TAZ 단백질, TAZ 단백질, TAZ 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, TAZ 단백질의 발현 또는 활성 촉진제, 및 남성 생식기 질환에 대하여는, 전술한 바와 같다.
상기 개체는 TAZ 단백질의 발현 또는 활성 수준이 낮은 것, 또는 TAZ 유전자가 결핍된 것일 수 있다. 상기 개체는 TAZ 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상인 개체의 TAZ 단백질의 발현 또는 활성 수준보다 낮은 것, 또는 TAZ 유전자가 정상인 개체의 TAZ 유전자에 비하여 결핍된 것일 수 있다.
상기 방법은 상기 약학적 조성물 또는 유효성분인 TAZ 단백질, TAZ 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, TAZ 단백질의 발현 또는 활성 촉진제, 또는 이들의 조합을 개체로 도입하는 것일 수 있다. 상기 유효성분은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 정소내주사, 뇌혈관내 주사, 흉부내 주사 또는 이들의 조합에 의해 투여될 수 있다. 상기 유효성분의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 조절될 수 있다. 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100 ㎎/㎏, 또는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것일 수 있다.
다른 양상은 TAZ 유전자가 결핍된, 남성 생식기 질환 동물 모델을 제공한다. 상기 동물 모델은 TAZ 유전자가 결핍된 인간, 돼지, 소, 말, 개, 고양이, 또는 실험 동물, 예를 들면, 래트, 쥐, 토끼, 기니아피그, 또는 햄스터인 것일 수 있다.
상기 남성 생식기 질환 동물 모델은 TAZ 유전자 녹아웃 카세트를 제조하는 단계; 상기 TAZ 유전자 녹아웃 카세트를 배아줄기세포에 형질감염시키는 단계; 상기 배아줄기세포를 포배아의 포배강에 주입하여 키메라 동물를 얻는 단계, 상기 키메라 동물로부터 TAZ+/- 유전형질을 갖는 이형접합체 동물을 얻는 단계; 및 상기 이형접합체 동물을 상호교배시켜 TAZ-/- 유전형질을 갖는 동형접합체 동물을 얻는 단계를 수행하여 수득한 동물 모델로서, TAZ 유전자가 결핍된 것일 수 있다. 상기 TAZ 유전자는 인간, 돼지, 소, 말, 개, 고양이, 또는 실험 동물, 예를 들면, 래트, 쥐, 토끼, 기니아피그, 또는 햄스터의 TAZ 유전자인 것일 수 있다.
남성 생식기 질환 진단용 조성물, 이를 이용하여 남성 생식기 질환을 진단하는 방법, 남성 생식기 질환의 치료 또는 예방용 조성물, 및 생식기 관련 질환 모델 마우스에 관한 것으로, TAZ 단백질 또는 TAZ 유전자의 결핍에 의한 남성 생식기 질환 발병 가능성을 효율적으로 진단할 수 있으며, TAZ 단백질 또는 TAZ 유전자의 결핍에 의한 남성 생식기 질환을 효율적으로 치료 또는 예방할 수 있다.
도 1은 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 비정상적인 형상 및 기능을 나타낸 결과이다. 도 1에서 a는 정소의 단백질 용해물에서 TAZ 및 액틴의 발현 수준을 면역 블롯으로 확인한 결과이다. 도 1에서 b는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소, 세정관, 세정관의 정자발생 세포 및 세정관 사이의 레이딕 세포에서 TAZ의 발현을 면역조직화학 분석으로 확인한 결과이다. 도 1에서 c는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소 조직 절편을 H&E 염색 후 (2, 9, 및 12 개월령, n = 그룹 당 6), 현미경으로 관찰한 결과이다. 도 1에서 d 및 e는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 아로마타제 (aromatase)를 면역형광 염색한 결과이다 (2 및 12개월령, n = 그룹 당 6). 도 1에서 f는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스에서 출산률을 확인한 결과이다. 도 1에서 g는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스에서 정자의 수을 확인한 결과이다.
도 2는 TAZ 녹아웃 마우스의 정소와 야생형 마우스의 정소에서 세포 자멸된 세포의 수를 확인한 결과이다 (2개월령 및 12개월령의 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스, n = 그룹 당 6). 도 2에서 a 및 b는 TAZ 녹아웃 마우스에서 TUNEL 양성 세포의 수를 야생형 마우스에서 TUNEL 양성 세포의 수와 비교한 결과이다. 도 2에서 c는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 시토크롬 C 염색한 결과이다. 도 2에서 d는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 아넥신 V를 염색한 결과이다.
도 3은 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 노화 관련 인자의 발현이 증가한 것을 확인한 결과이다. 도 3에서 a는 2개월령 및 12개월령 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소의 동결된 절편을 SA-β 갈락토시다제로 염색한 후, 현미경으로 관찰한 결과이다. 도 3에서 b는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 SA-β 갈락토시다제 양성인 세포의 비율을 나타낸다. 도 3에서 c는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 IL-6 및 TNF-α의 mRNA 수준을 나타낸 결과이다.
도 4는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 노화 및 손상 마커의 발현 수준을 확인한 결과이다 (12개월령, n = 그룹 당 6). 도 4에서 a 및 b는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 p21, p19, p16, γH2AX, 카탈라제, 사이클론 의존성 키나제 (cyclin-dependent kinase: CDK) , 증식 세포 핵 항원 (proliferating cell nuclear antigen: PCNA), 및 액틴의 발현 수준을 확인한 결과이다. 도 4에서 c는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 p21, p19, γH2AX, 카탈라제의 발현 수준을 이미지로부터 정량적으로 분석한 결과이다.
도 5는 TAZ의 도입에 의하여 p21 및 노화 관련 마커의 발현이 감소한 것을 확인한 결과이다. 도 5에서 a 및 b는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 분리된 원발성 정소 내 세포를 3 계대까지 계대한 후, SA-β 갈락토시다제 염색한 결과이다 (12개월령, n = 그룹 당 6). 도 5에서 c 및 e는 마우스 TM3 세포주로부터 녹다운 대조군 세포 (coni), TAZ 녹다운 세포 (Ti), 대조군 세포 (con), 및 TAZ를 안정적으로 과발현하는 세포 (TAZ)를 제작하고, 100 μM의 H2O2를 가하고 4시간 동안 인큐베이션한 후, p21의 발현 수준을 확인한 결과이다. 도 5에서 g 및 h는, con 및 TAZ에 50nM의 아드리아미신을 가하고, 3일 동안 인큐베이션한 후, SA-β 갈락토시다제 염색 및 활성을 분석한 결과이다.
도 6은 TAZ가 p53과 직접적으로 상호작용하여, p53의 활성을 억제하는 것을 확인한 결과이다. 도 6에서 a는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소 (12개월령, n = 그룹 당 6)에서 p53 발현 수준을 확인한 결과이다. 도 6에서 b는 293T 세포에서 p53, PG13-luc, 및 TAZ를 과발현시킨 경우, TAZ의 양이 증가함에 따라 PG13-luc의 활성이 감소한 것을 확인한 결과이며, 도 6에서 d는 p53, p21-luc, 및 TAZ를 과발현시킨 경우, TAZ의 양이 증가함에 따라 p21-luc의 활성이 감소한 것을 확인한 결과이고, 도 6에서 c는 p53 및 TAZ를 과발현시킨 경우, TAZ의 양이 증가함에 따라 p53의 발현 수준을 확인한 결과이다. 도 6에서 e는 TAZ와 p53이 직접적으로 결합하는지 확인한 결과이다. 도 6에서 f는 TAZ는 p53이 p21의 프로모터에 결합하는 활성을 조절하는지 확인한 결과이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. TAZ 결핍 마우스에서의 정소 노화 확인 및 TAZ 도입시에 세포 노화 억제 확인
1. TAZ 결핍 모델 마우스, 및 TAZ 결핍 세포주 및 TAZ 과발현 세포주 제작
(1.1) TAZ 결핍 모델 마우스 제작
수컷 야생형 C57BL/6 마우스를 jackson 실험실 (Minneapolis, MN)에서 구입하였다. TAZ 유전자가 녹아웃된 TAZ 결핍 마우스는, TAZ 유전자 녹아웃 카세트를 배아줄기세포에 형질감염시키고; 상기 배아줄기세포를 포배아의 포배강에 주입하여 키메라 마우스를 얻은 후, 상기 키메라 마우스로부터 TAZ+/- 유전형질을 갖는 이형접합체 마우스을 얻고; 이어서 상기 이형접합체 동물을 상호교배시켜 TAZ-/- 유전형질을 갖는 동형접합체 마우스를 수득하여 제작하였다 (Hossain et al. 2007). 모든 마우스는 이화여자대학교 무균 동물 시설에서 사육하고 유지하였다. 이 때, 상기 동물은 통제된 환경 (온도 22 ± 2℃, 습도 60 ± 5%, 및 12 시간 광환경 / 12시간 암환경)에서 사육되었으며, 동물 실험은 IACUC (2012-01-020 및 15-006)으로부터 승인받았고, IACUC 지침에 따라 실시되었다.
도 1에서 a는 정소의 단백질 용해물에서 TAZ 및 액틴의 발현 여부를 면역 블롯으로 확인한 결과이다. 도 1에서 b는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소, 세정관 (seminiferous tubule), 세정관의 정자발생 세포 (spermatogenic cell) 및 세정관 사이의 레이딕 세포에서 TAZ의 발현 여부를 면역조직화학 분석으로 확인한 결과이다. 도 1에서 a 및 b에 나타낸 바와 같이, TAZ는 야생형 마우스의 정소에서 발현되고, TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서는 거의 발현되지 않는 것을 알 수 있다.
(1.2) TAZ 결핍 세포주 및 TAZ 과발현 세포주 제작, 및 원발성 (primary) 정소 세포 수득
(1.2.1) TAZ 결핍 세포주 및 TAZ 과발현 세포주 제작
마우스 레이딕 (Leydig) TM3 세포주를 ATCC (CRL-1714, Manassas, VA)로부터 구입하였다. TM3 세포는 10%의 우태아혈정 (fetal bovine serum: FBS)를 함유하는 둘베코 수정 이글 배지 (Dulbecco’s modified Eagle’s medium: DMEM)에서 배양하였다. 안정적인 세포주 (Stable cell line)는, TM3 세포에 녹아웃 대조군 벡터 (coni), TAZ 녹다운 벡터 (Ti), TAZ 발현 벡터 (T), 및 먹 (mock) 벡터 (con) 각각으로, 바이러스 형질도입 (viral transduction)하여 제작하였다. 안정적인 세포 클론에 100 μM의 과산화수소 (H2O2, Sigma-Aldrich)를 가하여 4시간 동안 인큐베이션하거나, 또는 50 nM의 아드리아미신 (adriamycin: ADM) (Sigma-Aldrich)을 가하고 3시간 동안 인큐베이션하여, 세포 노화를 유도하였다.
(1.2.2) 원발성 (primary) 정소 세포 수득
야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스 각각으로부터 정소를 수득하고, 정소를 잘게 세절한 후, 원심분리하여, 원발성 정소 내 세포를 수득하고, 완전 DMEM에서 배양하였다 (Chang et al. 2011).
2. TAZ 결핍 마우스의 교배 및 자손 측정
수컷 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스 (2 내지 6개월 령, n = 15; 8 내지 12 개월 령, n = 15)를 각각 2 내지 3 마리의 암컷 (10 내지 12주령)의 마우스와 교배시켰다. 교배 후, 매일 아침, 교배한 암컷에서 질전 (Vaginal plug)이 관찰되는지 확인하였다 (n = 교배 그룹 당 45). 질전을 보인 마우스를 별도의 케이지로 분리시키고, 임신 여부를 확인하였다. 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 자손을 각각 계수하여 출산율 (fertility rate)을 측정하였다.
도 1에서 f는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 출산률을 확인한 결과이다. 도 1에서 f에 나타낸 바와 같이, 2 내지 6개월령의 경우, 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 출산율에 유의한 차이가 없었으나, 연령이 증가함에 따라 8 내지 12개월령의 경우, TAZ 녹아웃 마우스의 출산율은 야생형 마우스의 출산율에 비하여 유의하게 감소하였다.
3. 정자 계수
정자 계수는 수컷 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스를 사용하여 수행하였다 (8 내지 12 개월령, n = 10). 정소를 분리하고, DMEM에서 가위로 잘게 세절한 다음, 1 ㎖ 주사기의 플런저 (plunger)를 사용하여 압축하였다. 정자 현탁액을 30분 동안 배양하고, 헤모사이토미터 (hemocytometer)를 이용하여 정자의 수를 계산하였다.
도 1에서 g는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스에서 정자의 수를 확인한 결과이다. 도 1에서 g에 나타낸 바와 같이, TAZ 녹아웃 마우스의 정자의 수는 야생형 마우스의 정자의 수에 비하여 35% 이상 낮은 것을 알 수 있다.
4. TAZ 결핍 마우스에서 정소의 구조 이상 확인
(4.1) 헤마톡실린 및 에오신 ( hematoxylin 및 eosin : H&E) 염색
다양한 연령의 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스로부터 정소를 분리하고 (2 내지 15 개월령), 신선한 Bouin 고정액 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)에서 16 시간 동안 고정하고, 70%의 에탄올로 세척하고, 탈수시킨 다음, 파라핀에 내장하였다. 조직을 5㎛의 두께로 절편화하고, 탈파라핀화하고, 수화시킨 후, H&E (Sigma-Aldrich)으로 염색하였다. 디지털 카메라 (Olympus, Melville, NY)가 장착된 Nikon Eclipse E200 현미경 (Nikon, Melville, NY)을 사용하여 절편을 분석하였다.
도 1에서 c는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소 조직 절편을 H&E 염색 후 (2, 9, 및 12 개월령, n = 그룹 당 6), 현미경으로 관찰한 결과이다. 도 1에서 c에 나타낸 바와 같이, TAZ 녹아웃 마우스의 정소는 세정관이 위축되고, 세정관 사이의 공간이 넓어져 있는 것을 알 수 있다. 또한, 연령이 증가함에 따라, 아생형 마우스의 정소에 비하여, TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 세정관이 위축되고 레이딕 세포가 비정상적으로 팽창되는 정도가 증가하였다.
5. TAZ 결핍 마우스의 정소에서 노화 및 세포 자멸 ( apoptosis ) 관련 인자의 발현 수준 확인
(5.1) TUNEL 염색
정자발생 세포 (spermatogenic cell)의 생존율이 TAZ에 의해 영향을 받는지 확인하였다. 12개월령 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스로부터 정소 조직을 수득하고, 상기 정소 조직을 4%의 파라포름알데히드 용액에서 고정시켰다. 제조사 (Sigma-Aldrich)의 지시에 따라, 조직 절편을 프로테나제 K 용액을 이용하여 투과시키고, TdT 효소 및 형광 표지된 dUTP (Sigma-Aldrich)와 인큐베이션 시킨 다음, 인산염 완충 심염수로 세척하였다. 형광 현미경 LSM-510 META (Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 상기 절편 슬라이드를 분석하였으며, ImageJ 프로그램으로 형광 양성 세포를 정량 분석하였다.
도 2는 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 야생형 마우스의 정소에 비하여 세포 자멸이 증가한 것을 확인한 결과이다 (2개월령 및 12개월령 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스, n = 그룹 당 6). 도 2에서 a 및 b는 TAZ 녹아웃 마우스에서 TUNEL 양성 세포의 수를 야생형 마우스에서 TUNEL 양성 세포의 수와 비교한 결과이다. 도 2에서 a 및 b에 나타낸 바와 같이, 야생형 마우스의 정소에 비하여 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 세포 자멸된 세포의 수가 증가한 것을 알 수 있다.
(5.2) 면역조직화학 및 면역 블롯
정소 조직을 분리하고, 즉시 동결 또는 10%의 중화된 포르말린으로 고정시켰다. 파라핀에 내장된 조직을 절편화하고, 절편을 탈파라핀화하고, 수화시키고, 1%의 염산에서 인큐베이션시키고, 증류수로 세척하였다. 동결된 절편을 미리 냉각된 아세톤에 고정하고, 0.3%의 과산화수소 용액과 인큐베이션하였다. 비특이적인 항체와 결합하지 않도록 정소 조직의 슬라이드를 블로킹하고, 아넥신 V (annexin V), 시토크롬 C (cytochrome C), p21, p19, γH2AX, 카탈라제 (Abcam, Cambridge, MA), 또는 TAZ (#2149, Cell signaling Technology, Danvers, MA)의 1차 항체와 인큐베이션하고, 이어서 2차 항체 (Molecular Probes, Eugene, OR)와 인큐베이션하였다. 슬라이드를 1.5 mg/㎖의 4,6-디아미디노-2-페닐인돌 (4, 6-diamidino-2-phenylindole: DAPI)로 대조 염색하고, 형광 현미경 및 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량 분석하였다.
RIPA 용해 버퍼를 이용하여 정소 조직으로부터 단백질 용해물을 수득하였다. 추출된 단백질을 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동법 (Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis: SDS-PAGE)으로 분리하고, 폴리비닐리덴 플루오리드 (Polyvinylidene fluoride: PVDF) 막으로 이동시켰다. 상기 PVDF 막을 p21, p19, p16, γH2AX, 카탈라제, 사이클론 의존성 키나제 (cyclin-dependent kinase: CDK), 증식 세포 핵 항원 (proliferating cell nuclear antigen: PCNA), 및 액틴 각각의 1차 항체와 결합하도록 인큐베이션하고, 이어서, 2차 항체인 페록시다제가 결합된 2차 항체와 인큐베이션하였다. 그 후, 단백질 밴드를 증강된 화학발광 (enhanced chemiluminescence: ECL)과 방사선자동사진법 (autoradiography)을 이용하여 확인하였다.
도 2에서 c는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 시토크롬 C 염색한 결과이다. 여기서, 핵은 DAPI로 염색되었다. 2에서 c에 나타낸 바와 같이, TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 시토크롬 C가 발현되는 수준은 야생형 마우스의 정소에서 시토크롬 C가 발현되는 수준에 비하여 약 100% 증가한 것을 알 수 있다. 도 2에서 d는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 아넥신 V를 염색한 결과이다. 도 2에서 d에 나타낸 바와 같이, TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 아넥신 V가 발현되는 수준은 야생형 마우스의 정소에서 아넥신 V가 발현되는 수준에 비하여 100% 이상 증가한 것을 알 수 있다. 특히, TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 아넥신 V 양성 세포는 정소의 세정관 사이의 공간에 다수 존재하는 것을 확인하였다.
도 4는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 노화 및 손상 마커의 발현 수준을 확인한 결과이다 (12개월령, n = 그룹 당 6). 도 4에서 a 및 b는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 p21, p19, p16, γH2AX, 카탈라제, CDK, PCNA, 및 액틴의 발현 수준을 확인한 결과이다. 도 4에서 c는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 p21, p19, γH2AX, 카탈라제의 발현 수준을 이미지로부터 정량적으로 분석한 결과이다. 도 4에서 a 내지 c에 나타낸 바와 같이, 야생형 마우스에 비하여, TAZ 녹아웃 마우스의 정소, 정원 세포 및 레이딕 세포에서 사이클린-의존성 키나제 억제제인 p21, p19 및 p16의 발현 수준이 증가한 것을 알 수 있다. 또한, 야생형 마우스에 비하여, TAZ 녹아웃 마우스의 정소, 특히 세정관에서 γH2AX 및 카탈라제의 발현 수준이 증가한 것을 확인하였다. 반면, 야생형 마우스의 정소와 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서, CDK4 및 PCNA의 발현 수준은 유사하였다.
도 5에서 c 및 e는 마우스 TM3 세포주로부터 녹다운 대조군 세포 (coni), TAZ 녹다운 세포 (Ti), 대조군 세포 (con), 및 TAZ를 안정적으로 과발현하는 세포 (TAZ)를 제작하고, 각각의 세포에 100 μM의 H2O2를 가하고 4시간 동안 인큐베이션한 후, p21의 발현 수준을 확인한 결과이다. 도 5에서 c 및 e에 나타낸 바와 같이, TAZ를 과발현시키는 경우, 산화적 스트레스에 의해 유도된 p21의 발현이 억제되는 것을 알 수 있다.
(5.3) 노화 관련 β- 갈락토시다제 (Senescence associated β-galactosidase: SA- βgal ) 염색
야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스에서 정소 조직을 분리하고, 즉시 OCT (Sigma-Aldrich)가 채워진 몰드 위에 놓은 다음 액체 질소에서 동결시켰다. 동결된 절편 Cryostat (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 이용하여 동결된 조직을 절편화하고, 동결된 절편을 10분 동안 고정시켰다. 절편의 슬라이드를 인산염 완충 식염수로 세정하고 β-갈락토시다제 염색 용액 (Cell signalling Technology)으로 밤새 염색하였다. 이어서, 상기 슬라이드를 에오신으로 대조 염색하고, 현미경으로 관찰하였다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 이미지 상의 신호를 정량 분석하였다.
도 3은 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 노화 관련 인자의 발현이 증가한 것을 확인한 결과이다. 도 3에서 a는 2개월령 및 12개월령 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소의 동결된 절편을 SA-β 갈락토시다제로 염색한 후, 현미경으로 관찰한 결과이다. 도 3에서 b는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 SA-β 갈락토시다제 양성인 세포의 비율을 나타낸다. 도 3에서 a 및 b에 나타낸 바와 같이, 2개월령 및 12개월령 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 SA-β 갈락토시다제 양성 세포의 수는 아생형 마우스의 정소에서 SA-β 갈락토시다제 양성 세포의 수에 비하여 증가한 것을 확인하였다. 또한, 연령이 증가함에 따라, TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 SA-β 갈락토시다제 양성 세포의 수는 야생형 마우스의 정소에서 SA-β 갈락토시다제 양성 세포의 수에 비하여 더욱 증가한 것을 알 수 있다.
도 5에서 a 및 b는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 분리된 원발성 정소 내 세포를 3 계대까지 계대한 후, SA-β 갈락토시다제 염색한 결과이다 (12개월령, n = 그룹 당 6). 도 5에서 a 및 b에 나타낸 바와 같이, TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 SA-β 갈락토시다제 양성 세포의 수는 야생형 마우스의 정소에서 SA-β 갈락토시다제 양성 세포의 수에 비하여 현저하게 증가한 것을 확인하였다. 도 5에서 g 및 h는, con 및 TAZ에 50nM의 아드리아미신을 가하고, 3일 동안 인큐베이션한 후, SA-β 갈락토시다제 염색 및 활성을 분석한 결과이다. 도 5에서 g 및 h에 나타낸 바와 같이, TAZ를 안정적으로 과발현하는 세포는 아드리아미신에 의해 유도된 SA-β 갈락토시다제 양성 세포의 수를 감소시킨 반면, 대조군 세포는 아드리아미신를 가한 후, TAZ를 안정적으로 과발현하는 세포에 비하여 노화를 겪는 것을 알 수 있다.
(5.4) 역전사 및 실시간 중합효소 연쇄 반응 (real time-polymerase chain reaction: PCR )
TRIzol 시약을 사용하여 마우스 레이딕 TM3 세포 또는 정소로부터 RNA를 분리하였다. cDNA 합성 키트 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 분리된 RNA를 역전사시켜, cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 사용하고, 하기 표에 기재된 노화 관련 유전자 특이적인 프라이머 세트 및 SYBR 그린 프리 믹스 버퍼 (Applied Biosystems)를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄 반응을 수행하였다. 상기 실시간 중합효소 연쇄 반응은 ABI-Prism 7700 서열 검출기 (Applied Biosystems)를 사용하여 수행되었으며, 상대적인 발현 수준은 β-액틴의 수준으로 정규화하여 계산하였다.
정방향 프라이머 5'->3' 역방향 프라이머 5'->3'
p21 5'-cgagaacggtggaactttgac-3'
(서열번호 5)		 5'-tcccagacgaagttgccct-3′
(서열번호 6)
TNF-α 5'-catcttctcaaattcgagtgacaa-3′
(서열번호 7)		 5'-tgggagtagacaaggtacaaccc-3′
(서열번호 8)
IL-6 5'-gaggataccactcccaacaga-3'
(서열번호 9)		 5'-aagtgcatcatcgttgttcataca-3'
(서열번호 10)
β-액틴 5'-agagggaaatcgtgcgtgac-3′
(서열번호 11)		 5'-caatagtgatgacctggccgt-3′
(서열번호 12)
도 3에서 c는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 IL-6 및 TNF-α의 mRNA 수준을 나타낸 결과이다. 도 3에서 c에 나타낸 바와 같이, TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 IL-6 및 TNF-α의 mRNA 수준은 야생형 마우스의 정소에서 IL-6 및 TNF-α의 mRNA의 수준에 비하여 현저하게 증가한 것을 알 수 있다.
도 5에서 d 내지 f는 마우스 TM3 세포주로부터 녹다운 대조군 세포 (coni), TAZ 녹다운 세포 (Ti), 대조군 세포 (con), 및 TAZ를 안정적으로 과발현하는 세포 (TAZ)를 제작하고, 100 μM의 H2O2를 가하고 4시간 동안 인큐베이션한 후, p21의 mRNA 수준을 확인한 결과이다. 도 5에서 d 및 f에 나타낸 바와 같이, TAZ를 과발현시키는 경우, 산화적 스트레스에 의해 유도된 p21의 mRNA 수준이 감소된 것을 알 수 있다.
6. TAZ 결핍 마우스에서 성호르몬 분비 이상 확인
TAZ가, 정자발생에 필수적이며, 안드로겐을 에스트로겐으로 전환시키는, 구체적으로 테스토르테론을 에스트라디올로 전환시키거나 또는 안드로스텐디온을 에스트론으로 전환시키는데 작용하는 아로마타제의 발현 수준에 미치는 영향을 확인하였다.
도 1에서 d 및 e는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 아로마타제 (aromatase)를 면역형광 염색한 결과이다 (2 및 12개월령, n = 그룹 당 6). 도 1에서 d에 나타낸 바와 같이, 연령이 증가함에 따라 12개월령 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 아로마타제가 발현되는 수준은 아생형 마우스의 정소에서 아로마타제가 발현되는 수준에 비하여 60% 이상 감소한 것을 알 수 있다.
7. TAZ가 세포 주기 및 노화를 억제시키는 기전 확인
(7.1) TAZ 단백질과 p53 단백질의 상호작용 분석
TAZ가 p53과의 직접적인 상호작용을 통해 p53의 전사 및 DAN 결합 활성을 억제하는지 확인하였다. 형질전환 (transfection) 효율이 높은 293T 세포를 칼슘 포스페이트 형질전환 방법을 사용하여 Flag이 태깅 (tag)된 p53 및/또는 Myc이 태깅된 TAZ 발현 벡터로 일시적으로 형질전환하였다. 형질전환된 세포를 인큐베이션 한 후, 세포 용해물을 회수하고, Flag-M2 아가로스 비드 (Sigma-Aldrich)와 인큐베이션시켜, p53 단백질과 비드가 결합하도록 한 후, 비드를 세척하여 면역 침전을 수행하였다. 세포 용해물 (whole cell extract: WCE) 및 면역 복합체 (pull-down된 단백질)를 SDS-PAGE로 분리하고, 면역 블롯을 수행하였다. 이 때, 1차 항체는, Flag (Sigma-Aldrich) 또는 Myc 펩티드 (9E10, Santa Cruz)에 대한 항체를 사용하였다.
도 6은 TAZ가 p53과 직접적으로 상호작용하여, p53의 활성을 억제하는 것을 확인한 결과이다. 도 6에서 a는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 p53 발현 수준을 확인한 결과이다 (12개월령, n = 그룹 당 6). 도 6에서 a에 나타낸 바와 같이, 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 p53의 발현 수준은 유사하였다. 도 6에서 e는 TAZ와 p53이 직접적으로 결합하는지 여부를 확인한 결과이다. 도 6에서 e에 나타낸 바와 같이, TAZ는 p53과 직접적으로 결합하여 상호 작용하고, TAZ가 p53의 기능에 영향을 미칠 것임을 예상할 수 있다.
(7.2) 리포터 유전자 분석
293T 세포를, 복수의 p53 보존적인 결합 영역을 포함하는 리포터 유전자인 PG13-luc, 및 p53 및/또는 TAZ 발현 벡터로 형질전환시켰다. 또는 293T 세포를, p21 프로모터 리포터 유전자인 p21 pro-luc, 및 p53 및/또는 TAZ 발현 벡터로 형질전환 시켰다. 이 때, pCMVβ 벡터를 함께 형질전환시켰고, 대조군으로 사용하여 형질전환 효율을 확인하였다. 리포터 활성을 루시퍼라제 분석 키트 (Promega, Madison, WI) 및 β-갈락토시다제 분석 키트 (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 분석하였다. 상대적인 루시퍼라제 활성은 β-갈락토시다제 활성으로 정규화하였다.
도 6에서 b는 293T 세포에서 p53, PG13-luc, 및 TAZ를 과발현시킨 경우, TAZ의 양이 증가함에 따라 PG13-luc의 활성이 감소한 것을 확인한 결과이며, 도 6에서 d는 p53, p21-luc, 및 TAZ를 과발현시킨 경우, TAZ의 양이 증가함에 따라 p21-luc의 활성이 감소한 것을 확인한 결과이고, 도 6에서 c는 p53 및 TAZ를 과발현시킨 경우, TAZ의 양이 증가함에 따라 p53의 발현 수준이 변화한 정도를 확인한 결과이다. 도 6에서 b 내지 c에 나타낸 바와 같이, p53에 의해 유도된 리포터의 활성은 TAZ의 양이 증가함에 따라, 농도 의존적으로 억제되었다. 또한, p53의 타겟 유전자로 알려진 p21의 프로모터 활성은 TAZ의 양이 증가함에 따라, 농도 의존적으로 억제되었다. 단, p53의 발현 수준은 TAZ가 과발현되는 양을 증가시키는 경우에 유의한 변화를 보이지 않았다.
(7.3) 단백질-DNA 결합 분석
TAZ와 p53의 직접적으로 상호 작용하는지 및 TAZ가 p53의 DNA 결합 활성을 약화시키는지 확인하였다. 293T 세포를, p53과 TAZ 발현 벡터와 함께, 또는 p53 발현 벡터 단독으로 형질전환시켰다. 프로테아제 억제제를 포함하는 HKMG 버퍼를 사용하여 세포 용해물을 추출하고, 상기 추출물을 바이오틴화된 p21 유전자 프로모터의 p53 결합 영역 (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA)과 인큐베이션하고, 이어서 스트렙타비딘 (streptavidin)-아가로스 비드와 인큐베이션하여, 면역 침전을 수행하였다. 세포 용해물 및 단백질-DNA 침전물을 SDS-PAGE로 분리하고, p53 항체를 이용하여 면역 블롯을 수행하였다. 이 때, p21 유전자 프로모터의 p53 결합 영역은 두개의 합성된 올리고머를 어닐링하여 제작하였다.
올리고머 올리고머
p53 결합 영역 5'-TTCAGGAACATGTCTTGACATGTTC-AGCCCTGGA-3'
(서열번호 13)		 5'-TTCCAGGGCTGAACATGTC-AAGACATGTTCCTGA-3'
(서열번호 14)
도 6에서 f는 TAZ가 p53이 p21의 프로모터에 결합하는 활성을 조절하는지 확인한 결과이다. 도 6에서 f에 나타낸 바와 같이, TAZ는 p53이 p21의 프로모터에 결합하는 활성을 약화시키는 것을 알 수 있다.
<110> Ewha University-Industry Collaboration Foundation EWHA WOMANS UNIVERSITY <120> Composition for diagnosing male reproductive organ disease, composition for preventing or treating male reproductive organ disease, and use thereof <130> PN117999 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 400 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asn Pro Ala Ser Ala Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Gly Gln Gln 1 5 10 15 Val Ile His Val Thr Gln Asp Leu Asp Thr Asp Leu Glu Ala Leu Phe 20 25 30 Asn Ser Val Met Asn Pro Lys Pro Ser Ser Trp Arg Lys Lys Ile Leu 35 40 45 Pro Glu Ser Phe Phe Lys Glu Pro Asp Ser Gly Ser His Ser Arg Gln 50 55 60 Ser Ser Thr Asp Ser Ser Gly Gly His Pro Gly Pro Arg Leu Ala Gly 65 70 75 80 Gly Ala Gln His Val Arg Ser His Ser Ser Pro Ala Ser Leu Gln Leu 85 90 95 Gly Thr Gly Ala Gly Ala Ala Gly Ser Pro Ala Gln Gln His Ala His 100 105 110 Leu Arg Gln Gln Ser Tyr Asp Val Thr Asp Glu Leu Pro Leu Pro Pro 115 120 125 Gly Trp Glu Met Thr Phe Thr Ala Thr Gly Gln Arg Tyr Phe Leu Asn 130 135 140 His Ile Glu Lys Ile Thr Thr Trp Gln Asp Pro Arg Lys Ala Met Asn 145 150 155 160 Gln Pro Leu Asn His Met Asn Leu His Pro Ala Val Ser Ser Thr Pro 165 170 175 Val Pro Gln Arg Ser Met Ala Val Ser Gln Pro Asn Leu Val Met Asn 180 185 190 His Gln His Gln Gln Gln Met Ala Pro Ser Thr Leu Ser Gln Gln Asn 195 200 205 His Pro Thr Gln Asn Pro Pro Ala Gly Leu Met Ser Met Pro Asn Ala 210 215 220 Leu Thr Thr Gln Gln Gln Gln Gln Gln Lys Leu Arg Leu Gln Arg Ile 225 230 235 240 Gln Met Glu Arg Glu Arg Ile Arg Met Arg Gln Glu Glu Leu Met Arg 245 250 255 Gln Glu Ala Ala Leu Cys Arg Gln Leu Pro Met Glu Ala Glu Thr Leu 260 265 270 Ala Pro Val Gln Ala Ala Val Asn Pro Pro Thr Met Thr Pro Asp Met 275 280 285 Arg Ser Ile Thr Asn Asn Ser Ser Asp Pro Phe Leu Asn Gly Gly Pro 290 295 300 Tyr His Ser Arg Glu Gln Ser Thr Asp Ser Gly Leu Gly Leu Gly Cys 305 310 315 320 Tyr Ser Val Pro Thr Thr Pro Glu Asp Phe Leu Ser Asn Val Asp Glu 325 330 335 Met Asp Thr Gly Glu Asn Ala Gly Gln Thr Pro Met Asn Ile Asn Pro 340 345 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Arg Lys Val Met Asn 145 150 155 160 Gln Pro Leu Asn His Val Asn Leu His Pro Ser Ile Thr Ser Thr Ser 165 170 175 Val Pro Gln Arg Ser Met Ala Val Ser Gln Pro Asn Leu Ala Met Asn 180 185 190 His Gln His Gln Gln Val Val Ala Thr Ser Leu Ser Pro Gln Asn His 195 200 205 Pro Thr Gln Asn Gln Pro Thr Gly Leu Met Ser Val Pro Asn Ala Leu 210 215 220 Thr Thr Gln Gln Gln Gln Gln Gln Lys Leu Arg Leu Gln Arg Ile Gln 225 230 235 240 Met Glu Arg Glu Arg Ile Arg Met Arg Gln Glu Glu Leu Met Arg Gln 245 250 255 Glu Ala Ala Leu Cys Arg Gln Leu Pro Met Glu Thr Glu Thr Met Ala 260 265 270 Pro Val Asn Thr Pro Ala Met Ser Thr Asp Met Arg Ser Val Thr Asn 275 280 285 Ser Ser Ser Asp Pro Phe Leu Asn Gly Gly Pro Tyr His Ser Arg Glu 290 295 300 Gln Ser Thr Asp Ser Gly Leu Gly Leu Gly Cys Tyr Ser Val Pro Thr 305 310 315 320 Thr Pro Glu Asp Phe Leu Ser Asn Met Asp Glu Met Asp Thr Gly Glu 325 330 335 Asn Ser Gly Gln Thr Pro Met Thr Val Asn Pro Gln Gln Thr Arg Phe 340 345 350 Pro Asp Phe Leu Asp Cys Leu Pro Gly Thr Asn 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ccagaggtac ttcctcaatc acatagaaaa aatcaccaca tggcaagacc 720 ctaggaaggc gatgaatcag cctctgaatc atatgaacct ccaccctgcc gtcagttcca 780 caccagtgcc tcagaggtcc atggcagtat cccagccaaa tctcgtgatg aatcaccaac 840 accagcagca gatggccccc agtaccctga gccagcagaa ccaccccact cagaacccac 900 ccgcagggct catgagtatg cccaatgcgc tgaccactca gcagcagcag cagcagaaac 960 tgcggcttca gagaatccag atggagagag aaaggattcg aatgcgccaa gaggagctca 1020 tgaggcagga agctgccctc tgtcgacagc tccccatgga agctgagact cttgccccag 1080 ttcaggctgc tgtcaaccca cccacgatga ccccagacat gagatccatc actaataata 1140 gctcagatcc tttcctcaat ggagggccat atcattcgag ggagcagagc actgacagtg 1200 gcctggggtt agggtgctac agtgtcccca caactccgga ggacttcctc agcaatgtgg 1260 atgagatgga tacaggagaa aacgcaggac aaacacccat gaacatcaat ccccaacaga 1320 cccgtttccc tgatttcctt gactgtcttc caggaacaaa cgttgactta ggaactttgg 1380 aatctgaaga cctgatcccc ctcttcaatg atgtagagtc tgctctgaac aaaagtgagc 1440 cctttctaac ctggctgtaa tcactaccat tgtaacttgg atgtagccat gaccttacat 1500 ttcctgggcc tcttggaaaa agtgatggag cagagcaagt ctgcaggtgc accacttccc 1560 gcctccatga ctcgtgctcc ctccttttta tgttgccagt ttaatcattg cctggttttg 1620 attgagagta acttaagtta aacataaata aatattctat tttcattttc tgcaagcctg 1680 cgttcttgtg acagattata cagaattgtg tctgcaggat tgattatgca gaatactttt 1740 ctctttcttc tctgctgccc catggctaag ctttatgggt gttaattgaa atttatacac 1800 caattgattt taaaccataa aaagctgacc acaggcagtt acttctgagg gcatcttggt 1860 ccaggaaatg tgcacaaaat tcgacctgat ttacagtttc aaaaactgta ttgatgacag 1920 tagtaccaaa tgctttaaaa actatttaac ttgagcttta aaaatcattg tatggatagt 1980 aaaattctac tgtatggaat acaatgtaat tttgaatcca tgctggctct gatggctctt 2040 attagtctgt atttataaag gcacacagtc ctattgtagc ttatctttcg ttattttact 2100 gcagagcatc tagacaactt agtccctcca gcgggaaagt agcagcagca gcattagtca 2160 caggtcttac actacagatc ttgtgaaaga gaccagtttg gtactaatta tgagcatttt 2220 attcaaacaa aagtttttga aatattacaa ctggggattt aaaaaattgc agcttagaat 2280 ctgatggttt ttttttttct tgatgttgtt tgtttgtttt tgagatcgag ttttgctctt 2340 gttgtccagg ctggaatgca atggcacaat ctcggctcac tgcaacctct gccttctggg 2400 ttcaagcgat tctcctgcct tagcctcccg agtagctggg attacaggca cctgccacca 2460 cgtccggcta attttttgta ttttgagtag agacggggtt tcaccataat ggtcaggctg 2520 ttctcaaact cctgatctca ggtgatccac ccatctcggc ctcccaaagt gctgggatta 2580 ctggcgtgag ccaccgcacc cggccttgat gtttatttta taaagcactg taattttgta 2640 gctgatgaca aaaggcagcc aaatgttttt gataaatcag tggcaactgt atttttgtct 2700 tttgaaataa ctctgaaaac atcaggacaa catagatttc aacctgatag cacaccacac 2760 acagtgagct gttgcttttt aaattctgaa gccttgtcag gtttgcttcc tagatttcaa 2820 gtgtttaaaa taattctatc tatgaaactg aaggatgaag cagatctctg actgacatgt 2880 aaaaaaaaat gccctttgag ggtgtatggt ggagataaat gtttctgaat tcagtaaaat 2940 tgattcctaa gtatattatc ctaatcctgt ttgctacagt tggtataaaa aggcatgaaa 3000 tatgtattca atacctctta tgtaaccaaa accattttta attagctttt aaggactgag 3060 agagcatcat gttcaactgg catgcagtct gcctgcattg ccaatgaagt cctcaactgt 3120 ttaatatttt gaactaatat tatttataat ctatgaattt aatctttttt gaaagacttt 3180 aataatttga gtctctgaga ggatactttc aatttccatg ggggacttat ttgttgggga 3240 tcttaaataa gattcctttt gatctaccgg aatatacatg tacagagtac attggatcat 3300 gttggaaaga aggcaagtga aaaggtcaga gatgaagtag caaagttatg gaatatcgtg 3360 gaaaggatac tagttgtgaa atggaaagag acaagttata gtaccccaaa agcaaaacaa 3420 gcaggagatg caagagatgc cccaaaagga caaagcaaca attttctgtt gccaccttta 3480 taccggaaga ctctgttgta gaagaaaaga aggctttggt gcaccttatg tgggaggagg 3540 aggggcaggg catgctgatg ctgagcgtac aggcagacaa gagcgtagcc tgctgttgcc 3600 tccatcacta tgaaatgact tattttacct gaaggaccca tggtttatgt tcctctaatt 3660 cctttcactc tccctaagcc ctctgagaga gatgaagata gatgatttta ttgctactaa 3720 attgaaggga gcactatttc tttttgtctt ttgttagcaa aaaattgcaa aaagaattgt 3780 acattcttgc taaaaataaa taaataaata aaaaattaaa aaaacaaggg acctaacaaa 3840 actcagcagt gttactgtat ttttaaaaaa tatttttata gactcatttt caggttatta 3900 aatgtaagag aaacagatac ccctcttttt taaagtaggt aaatcattga tgatttatat 3960 taccaatttt tagaagtaat tttctagtaa gcttgtggca tcagaaaata ctagaagatt 4020 tttttagtta aattagttag aacatttatg aatgaatata ataaatattt tttcagaata 4080 aaatatggac cctttgtgtt tactaataga taaagccaga tataattttt tgtttttaag 4140 gccacaaaat atggcctttg ttaaagaaca ctaaagttag aaatctaaag ttagagcaac 4200 tttttaatgg ctatttccta ttattgtaag tgttaaaacc cctgcagaat tcttgataag 4260 gtgctattta tactatattt cttattataa gataactgtc tttagtcttc ttagtactag 4320 tctttttagt actaaatcaa tcagtaaaca tcatcatttc accccaaaat tttgtcacag 4380 aaaaggcgta tcaaatgaaa aataatttca gagatctttc tttcaagata ttttttcctg 4440 ataaaataca ttgtcttgaa gtaaatacat tgtcaaaacc taattgcaat tctgttaaat 4500 ctaagtaatt tttagacagt gtttcaccgt attatttagg atgtgaaatg ccatttcttt 4560 cactgattac accatataca ggaaacaggt aaaacagtga aaactttatt gtgctggttg 4620 atgccaactt ggttgaaaag ctctctgcag aagaagtgat ctagactgac agaagtgttg 4680 ctaattacaa gttgtgttct catgacgtaa ttagaaagta acttctcaaa gtacaacttt 4740 tatgaaaaaa ataagctgtt aaaaaaagga aatcgtaggt taatttaatt gggaaaatgg 4800 gcaattgaca gagaccattt tcctaacaca tatatgtgct agtactttaa ctttttaaaa 4860 ttttacttct acgttttgta atataaaaat ttctatttta agtttagaat gttatacgta 4920 ccgaaagtat gcagccaaat cgatcagatc aaaccatttt acctggagtt tggtactggt 4980 ttttacttct ctgaatctgt ataagaaaaa taaagacaat tgaacttcca cttggaaaaa 5040 aaaaaaaaaa aaa 5053 <210> 4 <211> 4767 <212> DNA <213> Mouse <400> 4 ataattcaac agctccactt tcggcccgcc tctttcctaa gggtgggagt ttgcttcaaa 60 ctttgtttat gggacagtcc gggagccgcg gcggctgcgc tcgtctacgt cttctctgtc 120 gcctcctcgc gcagtgggag cgcccgaggc cggttccggg gatgtaagag gataagcctt 180 cggctgctgg gaatccgctc gggatctgcc agccgggacc gggttccagc tcgtcagttc 240 gggaggcgcc caggcttggc ttccccgagt ccccagaaag atgaatccgt cctcggtgcc 300 ccatccgctc ccgccgccag ggcagcaagt catccacgtc acgcaggacc tggacaccga 360 cctcgaagcc ctcttcaact ctgtcatgaa ccccaagccc agctcatggc ggaaaaagat 420 cctcccggag tccttcttta aggagcccga ttccggctcg cactcgcgcc aatccagcac 480 agactcatca ggcggccacc cggggcctcg actagctggc ggcgcgcagc acgtccgctc 540 gcactcgtcg cccgcatccc tgcagctggg caccggtgcg ggagccgctg gaggccctgc 600 acagcagcat gcacatctcc gccagcagtc ctatgacgtg accgacgagc tgccgttgcc 660 ccccgggtgg gagatgacct tcacggccac tggccagaga tacttcctta atcacataga 720 gaaaatcacc acatggcaag accccaggaa ggtgatgaat cagcctctga atcatgtgaa 780 cctccacccg tccatcactt ccacctcggt gccacagagg tccatggcag tgtcccagcc 840 gaatctcgca atgaatcacc aacaccagca agtcgtggcc actagcctga gtccacagaa 900 ccacccgact cagaaccaac ccacagggct catgagtgtg cccaatgcac tgaccactca 960 gcagcagcag cagcagaaac tgcggcttca gaggatccag atggagagag agaggattag 1020 gatgcgtcaa gaggagctca tgaggcagga agctgccctc tgccgacagc tccccatgga 1080 aaccgagacc atggcccctg tcaacacgcc tgccatgagc acagatatga gatctgtcac 1140 caacagtagc tcagatcctt tcctcaatgg agggccctat cattcacggg agcagagcac 1200 agacagtggc ctggggttag ggtgctacag tgtccccaca actccagaag acttcctcag 1260 caacatggac gagatggata caggtgaaaa ttccggtcag acacccatga ccgtcaatcc 1320 ccagcagacc cgcttccctg atttcctgga ctgccttcca ggaacaaatg ttgacctcgg 1380 gactttggag tctgaagatc tgatccctct cttcaatgat gtagagtctg ctctgaacaa 1440 aagcgagccc tttctaacct ggctgtaatc actactgttg taacgtgatg cagctgtgag 1500 ctgacgcgag tcttgggcct tgcggaccaa gtgatgaggc agagcgggcc tgcagctgca 1560 ccacgttctg cctttgtact cacactcctt gtccgtgtgg ccacttaatc attgcctggt 1620 gttgattcgc aggaacttgc gttacacaga aataaatact ctcttttcat tttctgcaag 1680 cctgcatttc tgtggcagat aaagcaggat gggttgtgca gaatgacttt agagaatgtc 1740 tgcagcccta tggctgggtt ttattacagt tagcttaaat tcatatatca actgattcta 1800 agccatacaa agctgacctc aggcagtgaa ttctgatagg cagcttggtc caggaagtga 1860 tttacagttt caaaagctgt attgataaca gtagtaacaa atgctttaaa acttatttaa 1920 cttgagcttc aaaaaaaaaa aatcattgta tagatagtaa ttttctcctg tagggaatac 1980 agtgtagttt ggaatccatg ctggctctga tggcttctct cattctgtgt ttacaagggc 2040 acagagtacc aatgttgcca ccgttcatca ttttcctgct tagcagctcc attctgtgag 2100 caggagagta acttcaacat ctgtcacaat tcttgcatga cagatcgtgt gaaagagacc 2160 agtttggtca caatatgaat gattacagaa caaaattgtt ttgttttttt ttaattgcag 2220 cttggttttt ttttcaaaat gcagcttaga atttgatgtt tgttatatat atatatatat 2280 atatatatat atatatatat atatatataa actctgtaat 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tcataataag gtgctattca 4020 tatacatcat actataagcc aactgtcaga ctatctagtc ttcttagtcc taaatcaaca 4080 aattttacca tgtcatctcc aaattttgtc ataggataga cacatttttt taaaaagttg 4140 gattcaaaac acgtttttct tgataagata cacttcactg aagcatttaa atagctacac 4200 accctgtcat ttgttaacag caggtggtat ttaggccttg ttttactgta gtatgtagga 4260 tataaagtgt atttctttca gtgatttctc agtgcataag aagtgcataa gtctcagccg 4320 cctgggcatt gctcagcaga aaggaatctg cagatggtga cgtgacttgt ccgtgatgga 4380 catgtcacgg agtactgcgt tcttacgatg tcattagaag caccttgtga aagtgtaact 4440 ttcgtggaac aaaacaagcc atttgaaaag gaaaacggtt attttaaaat ggtgattgac 4500 agagacccct tcccctgacc ctgtattata cagtgtgcta atactttaac ttaatttttt 4560 ttttacactt ctacgtttta ccaaataaac gtttacctgt gttgttgatt ataatccagt 4620 atgttgtaca tacaggaact gtgccgccaa atccatcaga tgaaaccatt ttatctagag 4680 tctggtacag ggtttacttc tcaattctat atataaaaaa aataataaat acgattgagc 4740 ttccacttgg aaaaaaaaaa aaaaaaa 4767 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p21 primer <400> 5 cgagaacggt ggaactttga c 21 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p21 primer <400> 6 tcccagacga agttgccct 19 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-a primer <400> 7 catcttctca aattcgagtg acaa 24 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-a primer <400> 8 tgggagtaga caaggtacaa ccc 23 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 primer <400> 9 gaggatacca ctcccaacag a 21 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 primer <400> 10 aagtgcatca tcgttgttca taca 24 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-actin primer <400> 11 agagggaaat cgtgcgtgac 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-actin primer <400> 12 caatagtgat gacctggccg t 21 <210> 13 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligomer for p53-response element of the p21 gene promoter <400> 13 ttcaggaaca tgtcttgaca tgttcagccc tgga 34 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligomer for p53-response element of the p21 gene promoter <400> 14 ttccagggct gaacatgtca agacatgttc ctga 34

Claims (10)

  1. TAZ (transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함하는, 노화에 따른 남성 생식기 질환 진단용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 노화에 따른 남성 생식기 질환은 p53의 결합 활성 증가에 따른 세포 주기 조절 인자의 발현 및 활성 증가에 따른 것인 조성물.
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 노화에 따른 남성 생식기 질환은 호르몬 이상, 정자감소증 (oligospermia), 무정자증 (azoospermia), 약정자증 (asthenozoospermia), 정세포무형성증 (agenesis of spermatid cell), 고환염, 고환손상, 성선기능저하증 (Hypogonadism), 전립선 비대증 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
  5. TAZ의 mRNA에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 노화에 따른 남성 생식기 질환 진단용 조성물.
  6. 노화에 따른 남성 생식기 질환이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 TAZ 단백질의 양을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 단백질의 양을 정상 대조군 시료의 TAZ 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 노화에 따른 남성 생식기 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 측정하는 단계는 TAZ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 상기 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성에 의해 TAZ 단백질의 양을 측정하는 것인 방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 생물학적 시료는 정소 (testis), 전립선, 부고환, 정관, 세정관 (seminiferous tubule), 정자 (sperm), 세르톨리 세포 (sertoli cell), 정세포 (spermatid cell), 정자발생 세포 (spermatogenic cell), 정모 세포 (spermatocyte cell), 정원 세포 (spermatogonia cell), 레이딕 세포 (leydig cell) 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  9. TAZ 단백질, TAZ 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, TAZ 단백질의 발현 또는 활성 촉진제, 또는 이들의 조합을 포함하는, 노화에 따른 남성 생식기 질환의 치료 또는 예방용 조성물.
  10. TAZ 유전자가 결핍된, 노화에 따른 남성 생식기 질환 동물 모델.
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Adrien Levasseur et al., 'Yes-associated protein and WW-containing transcription regulator 1 regulate the expression of sex-determining genes in Sertoli cells, but their inactivation does not cause se*
Zakir Hossain et al., 'Glomerulocystic kidney disease in mice with a targeted inactivation of Wwtr1', PNAS, 2007, Vol. 104, pp 1631-1636. 1부.*

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