CN117230118B - 一种靶向精原细胞构建弱精子症小鼠模型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种靶向精原细胞构建弱精子症（asthenozoospermia,AZS）小鼠模型的方法，通过鉴定一种微小RNA（microRNA，miRNA）：miR‑188‑5p，基于该miRNA进行以下步骤：检测其细胞表达定位、利用模拟物mimics和抑制物inhibitor检测其细胞功能、构建慢病毒载体植入小鼠并对精子及其他生理指标进行检测。该方法构建的弱精子症模型效果稳定，模型中精子活性、运动性等生殖指标相较于正常小鼠差异明显、重复性强；靶向性强，该构建方法特异性靶向精原细胞，模型除弱精症状外，其余各项生理指标均不受影响，为弱精症模型的构建提供了一种可靠的方法。
Description
技术领域
本发明涉及动物模型构建技术领域，具体为一种靶向精原细胞构建弱精子症小鼠模型的方法。
背景技术
精子作为雄性生殖的核心，其数量和活性对精卵结合具有决定性作用，精子发生过程复杂且涉及多个生物学事件，包括精原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂以及成熟精子的形成，临床上精子活力低下称为弱精子症(asthenozoospermia,AZS)，AZS是造成男性不育的重要因素。
现有技术中能够通过采用基因敲除、基因突变、药物抑制等方法作用在实验小鼠上来模拟少弱精症的症状，其中包括腹腔注射环磷酰胺制作小鼠少弱精症模型或者雌二醇皮下注射构建的小鼠无精子症模型，但是该现有方案中采用雌二醇皮下注射构建的小鼠无精子症模型方法实施缓慢，且最终的无精子症小鼠模型不够稳定，构建的无精子症模型差异较小；而腹腔注射环磷酰胺制作小鼠少弱精症模型又会对小鼠其它多种生理指标产生影响，干扰代谢等相关参数，无法提供理想的弱精子症模型。
miRNA是由内源基因编码的非编码单链RNA分子，研究表明其参与各项生物学进程，在多种疾病进展中扮演重要角色，目前关于miRNA在精子形成及男性不育方面的报道并不多见，可见miRNA作为潜在生物标志物及药物靶点在生殖方面具有一定挖掘潜力，相关调控机制对男性生殖障碍的诊断与治疗具有良好应用前景。
细胞衰老表现为保持代谢活性的前提下不可逆性生长停滞，细胞堆积在G1期停止增殖。衡量细胞衰老程度目前较权威的检测手段包括β-半乳糖苷酶活性及端粒长度测定。本发明提供的目标miRNA对细胞衰老具有明显调控作用，迄今尚未报道，具有一定原创性。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供一种靶向精原细胞构建弱精子症小鼠模型的方法，以解决上述背景技术中提出的问题，本发明构建的弱精子症模型效果稳定，靶向性强，除弱精症状外，其余各项生理指标均不受影响。
为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案来实现：一种靶向精原细胞构建弱精子症小鼠模型的方法，包括以下步骤：步骤一、通过高通量测序筛选差异表达的miRNA并进行细胞定位检测以确定目标miRNA,所述目标miRNA为miR-188-5P；步骤二、利用模拟物mimics和抑制物inhibitor检测miR-188-5P在精原细胞中的功能；步骤三、构建稳转敲低慢病毒载体植入小鼠并对精子及其他生理指标进行检测。
进一步的，在所述差异表达的miRNA中筛选多个差异miRNA进行细胞定位检测，结果显示miR-188-5p特异性高表达于小鼠精原细胞，且与经典精子特征基因spag6具有潜在相互作用。
进一步的，所述miR-188-5p具体序列为：GGGAGGUGGUACGUUCCCUAC。
进一步的，所述步骤二中，对各组精原细胞进行增殖、凋亡、周期检测，结果显示敲低组精原细胞增殖明显减弱、凋亡不受影响，周期阻滞，即呈现细胞衰老状态。
进一步的，对各组精原细胞进行β-半乳糖苷酶染色及端粒长度检测，结果显示敲低组精原细胞染色明显增强，端粒长度缩短，进一步证实敲低miR-188-5p可促进小鼠精原细胞衰老。
进一步的，所述步骤三中，对小鼠生长、行为学、代谢等方面进行检测，8W取精子进行检测，结果显示两组小鼠除精子状态外各方面无明显差异。
进一步的，根据精子状态显示所述敲低组小鼠精子数量减少、畸形率增加、运动性降低，所述敲低组小鼠表现为典型弱精症。
本发明的有益效果：
1.该靶向精原细胞构建弱精子症小鼠模型的方法构建的弱精子症模型效果稳定，模型中精子活性、运动性等生殖指标相较于正常小鼠差异明显、重复性强，是理想的弱精子症模型。
2.本发明的靶向性强，该构建方法特异性靶向精原细胞，模型除弱精症状外，其余各项生理指标均不受影响，生长发育、代谢等相关参数正常，为弱精症模型的构建提供了一种可靠的方法。该模型的建立可为生殖学者研究AZS提供规范化模型，有助于临床探究AZS的作用机制及药物靶点。
附图说明
图1在实施例中表明miR-188-5p在GC-1细胞中特异性高表达的数据图；
图2在实施例中表明miR-188-5p调控GC-1细胞衰老的数据图；
图3在实施例中表明miR-188-5p稳转敲低小鼠行为学及代谢不受影响的数据图；
图4为实施例中精子形态及运动性状态图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
请参阅图1至图4，本发明提供一种技术方案：一种靶向精原细胞构建弱精子症小鼠模型的方法，通过该方法首先鉴定出一种微小RNA，即：miR-188-5p，实验结果显示其特异性高表达于小鼠精原细胞GC-1。
然后采用模拟物mimics和抑制物inhibitor对其进行过表达和敲低，并对细胞功能进行检测，结果显示miR-188-5p表达在不影响GC-1细胞凋亡的情况下对细胞增殖有明显作用，即：miR-188-5p调控GC-1细胞衰老，敲低miR-188-5p促使GC-1细胞停滞在G1期。
接着构建稳转敲低miR-188-5p慢病毒载体并植入小鼠，随后对精子进行检测，实验结果显示其活性及运动性等生殖指标明显受阻，为典型的弱精症。与此同时对小鼠其他生理指标进行检测，数据显示各项参数不受影响。
该靶向精原细胞构建弱精子症小鼠模型的方法构建的弱精子症模型效果稳定，模型中精子活性、运动性等生殖指标相较于正常小鼠差异明显、重复性强，是理想的弱精子症模型。
本实施例包括以下步骤：
1.正常对照组及弱精组(重金属Cd诱导，本实施例中以此作为阳性对照，详见Ecotoxicol Environ Saf 2020Mar 1；190:110142.doi:10.1016/j.ecoenv.2019.110142.Ep ub 2020Jan 6；Toxicol Lett 2020Jun 15；326:114-122.doi:10.1016/j.toxlet.2020.03.011.Epub 2020Mar 19)各3只C57BL/6N小鼠收集精子，采用Illumina测序平台进行高通量测序。将原始测序数据去除有接头污染、低质量、含N比例大于5％以及与核糖体RNA匹配的reads，得到clean data用于比对和分析。利用miRanda、TargetScan、RNAhybrid、TargetFinder等生物信息学工具分析miRNA的表达丰度和染色体分布，并对得到的miRNA进行整合及注释，筛选5个差异miRNA进行细胞表达定位检测，具体检测引物见表1。结果显示miR-188-5p特异性高表达于小鼠精原细胞GC-1，通过miRBase获得其具体序列：GGGAGGUGGUACGUUCCCUAC。
如附图1所示：A:转录组测序一共检测到112291个miRNA。其中，有26830个(24％)miRNA在两组小鼠中均有分布，而对照组特有的miRNA有59210个(53％)，约为AZS的两倍。表明miRNA在小鼠精子中分布广泛，且在正常小鼠及AZS中差异表达。
B:选取5个典型差异的miRNA在不同小鼠生殖细胞内进行q-PCR检测，其中miR-188-5p高表达于精原细胞GC-1，而在其他细胞中几乎不存在，表明其具有潜在的生殖细胞特异性。其中，TM-3为小鼠睾丸间质细胞，合成分泌雄激素，促进精子发生和雄性生殖器官发育，维持第二性征和性功能；GC-1为小鼠精原细胞，由睾丸精子管上皮的原始生殖细胞经过多次有丝分裂形成；GC-2为小鼠精母细胞，为睾丸的精子管内的二倍体细胞，经减数分裂形成单倍体精细胞；Lbetat2为小鼠促性腺激素腺瘤细胞，主要功能为分泌促性腺激素。
C:TargetScan软件分析显示miR-188-5p与Spag6的3’UTR区存在碱基互补配对，提示其在生精过程中可能发挥重要作用，参与精子发生。其中，Spag6为精子相关抗原6，是精子形成过程中的关键基因。
表1.差异miRNA表达检测引物表
3.设计合成miR-188-5p的双链模拟物mimics和单链抑制物inhibitor，序列如表2所示。待六孔板内GC-1细胞密度约80％时，使用Lipofectamine2000转染，每组至少设置3个重复，转染8h后更换为完全培养基，随后置于37℃、5％CO2的培养箱继续培养。
针对各组GC-1细胞采用CCK-8试剂盒检测细胞生长，分光光度计测量OD450，显微镜拍照并使用Image J软件对有活细胞进行统计；Annexin V-FITC/PI染色后经流式细胞仪检测细胞凋亡；碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色后检测细胞周期；Western Blot检测精子形成关键蛋白TEX15的表达。
接着对各组细胞进行β-半乳糖苷酶染色及端粒长度检测，以进一步证实敲低miR-188-5p促进GC-1细胞衰老。
如附图2所示：A:miR-188-5p过表达及抑制效率，与对照组呈现显著性差异。所述mimics对miR-188-5p的过表达效率为3.26(p<0.01)，inhibitor敲低miR-188-5p至对照组的23.4％(p<0.05)。
B:细胞增殖示意图，检测时段为转染后60h内。过表达miR-188-5p促进GC-1细胞增殖，敲低miR-188-5p则抑制GC-1细胞生长。该结果说明miR-188-5p对GC-1细胞的增殖具有明显效应，在生精过程中具有重要作用。
C:流式细胞仪检测细胞凋亡，数据显示不同处理方式对GC-1细胞几乎不造成损伤，凋亡比例无明显改变。该结果说明miR-188-5p对GC-1细胞的影响较为温和，表达高低会影响GC-1细胞数量但并不改变其存活。
D:GC-1细胞在细胞周期各阶段的数量比，过表达miR-188-5p促进GC-1细胞进入减数分裂期(S期)，大量DNA复制促进细胞增殖生成精子；相应地，敲低miR-188-5p造成GC-1细胞大量停滞在细胞周期前期(G1期)，细胞处于静止状态，表现为细胞衰老，这也对C图结果进行了解释。
E:精子特征蛋白TEX 15表达量检测，其对复合体正确组装以及减数分裂进程至关重要，结果显示过表达miR-188-5p促进其表达，有利于精子发生；敲低miR-188-5p则抑制其表达，阻碍精子形成。D、E结合起来说明miR-188-5p通过调控GC-1细胞衰老参与精子形成。
F:β-半乳糖苷酶染色检测，阳性染色代表衰老细胞。结果显示过表达miR-188-5p降低阳性细胞率，敲低miR-188-5p则增加阳性细胞比例。该结果直观证实miR-188-5p影响GC-1细胞衰老。
G:端粒长度检测，其数值反映细胞衰老程度。结果显示miR-188-5p过表达对端粒具有增长效应，敲低miR-188-5p则促使端粒缩短诱发细胞衰老。F、G结合起来进一步佐证了miR-188-5p对GC-1细胞衰老的调控作用。
表2.合成的寡核苷酸序列
3.使用miR-188-5p敲降和阴性对照慢病毒感染GC-1细胞后，建立miR-188-5p稳定敲减的GC-1细胞系，标记为LV组及LV NC组。将两组GC-1细胞纯化后以106/mL的密度经腹腔注射植入C57BL/6N小鼠，随后2-8周期间监测小鼠生长曲线记录体重；8周后进行航行试验检测行为学，游泳监测时间为60秒，潜伏期10秒，系统自动追踪从入水到找到隐藏平台的数据和过程，记录小鼠运动轨迹并对应激灵敏度进行评分；眼球采血后利用Elisa试剂盒检测三大营养物质代谢及精子生成过程中关键酶的表达。
如附图3所示：
A:航行试验，LV组及LV NC组小鼠行为表现无明显差异，运动路径及频率基本相同，应激评分相近。
B:代谢酶表达，三大营养物质代谢相关的酶类活性无差异，而LV组的T含量显著降低，说明miR-188-5p敲低抑制小鼠精子合成，但对其代谢无影响。
其中，GK为葡萄糖激酶(glucokinase)，主要分布在肝脏，负责调控餐后血糖，是糖代谢过程中的重要酶；ACC为乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-Coenzyme A carboxylase)，是脂肪酸合成限速酶，其活性增加可以促进脂肪合成，是脂代谢过程中的重要酶。GDH为谷氨酸脱氢酶(glutamic acid dehydrogenase)，是催化谷氨酸氧化脱氨或其逆反应的一类不需氧脱氢酶，其含量是肝功能的反应，是氨基酸代谢过程中的重要酶。T为睾酮(testosterone)，促进睾丸内精子的生成和成熟，保证雄性正常的生殖功能。
表3.LV组及LV NC组小鼠体重情况
由上述表3中可知LV组及LV NC组小鼠体重情况，两组体重无统计学差异，miR-188-5p敲低不影响小鼠生长
4.8W后两组小鼠颈椎脱臼处死，摘取其双侧附睾浸入含1mL生理盐水的离心管中，用眼科剪将其剪碎，并置于37℃培养箱中孵育15min。取800μL上清离心清洗两遍，得精子悬液。取20μL精子悬液进行HE染色观察其数量及形态；取10μL利用精子分析仪检测精子活力、密度、运动性，以每秒300帧的速度实时捕捉精子泳道轨迹，轨迹时长4s，并记录4s时的瞬时形态。精子全自动分析系统检测精子运动性、各项运动参数；记录运动轨迹、拍摄运动瞬时照片。
如附图4所示：
A:精子染色情况，200倍镜下可见LV NC组精子密度饱满，头部及尾部均匀着色，而LV处理组则数量减少，头部着色较淡，且出现精子畸形，主要表现为断头、颈部弯折、断尾。
B:精子运动泳道拍照，LV NC组单位容积的精液中精子数量更多，活化的精子以高振幅及鞭毛对称的方式弯曲来回向前摆动；LV处理组中，精子则大多是直线前行运动，泳道轨迹明显缩短。
C:精子瞬时捕捉，LV NC组运动的精子呈现摆尾状态，而LV处理组精子活力不足，鞭毛振幅小，几乎呈原地静止状态。
如下表4所示：
精子运动参数，LV组小鼠精子运动性能不佳，尤以曲线速率(VCL)为重，与LV NC组相比呈现明显差异(p<0.05)。其中，PR代表进行性运动；PR+NP代表总运动性；VSL代表直线速率；VCL代表曲线速率；VAP代表路径平均速率。运动参数是决定精子活性及受孕率的关键因素，该数据miR-188-5p敲低对精子功能产生影响，即弱精症。
表4.精子运动参数
依据本发明所提供的方法已累计完成120只弱精症C57BL/6N小鼠造模，经精子自动分析仪鉴定成模总数为120/120，成模率为100％；实验分6批次完成，生物重复性高；造模过程中小鼠死亡率为0％，提示本方法稳定有效、安全可行。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (5)
1.一种靶向精原细胞构建弱精子症小鼠模型的方法，包括以下步骤：步骤一、通过高通量测序筛选正常小鼠与弱精子症小鼠中差异表达的miRNA，并在小鼠生殖细胞内进行细胞定位检测以确定目标miRNA,所述目标miRNA为miR-188-5P，所述miR-188-5p具体序列为：GGGAGGUGGUACGUUCCCUAC；步骤二、利用模拟物mimics和抑制物inhibitor检测miR-188-5P在小鼠精原细胞中的功能；步骤三、使用miR-188-5p敲降慢病毒感染小鼠精原细胞以建立miR-188-5p稳定敲减的小鼠精原细胞系，将miR-188-5p稳定敲减的小鼠精原细胞纯化后以106/mL的密度经腹腔注射植入C57BL/6N小鼠，饲养8周即得弱精子症小鼠模型。
2.根据权利要求1所述的一种靶向精原细胞构建弱精子症小鼠模型的方法，其特征在于：所述步骤二中，对小鼠精原细胞进行增殖、凋亡和周期检测，结果显示敲低miR-188-5p后，小鼠精原细胞增殖明显减弱、细胞凋亡不受影响、细胞周期阻滞且细胞呈现衰老状态。
3.根据权利要求2所述的一种靶向精原细胞构建弱精子症小鼠模型的方法，其特征在于：对小鼠精原细胞进行β-半乳糖苷酶染色及端粒长度检测，结果显示敲低miR-188-5p后，小鼠精原细胞β-半乳糖苷酶阳性细胞率增加且端粒长度缩短，表明敲低miR-188-5p可促进小鼠精原细胞衰老。
4.根据权利要求1所述的一种靶向精原细胞构建弱精子症小鼠模型的方法，其特征在于：所述步骤三中，对小鼠生长、行为学和代谢方面进行检测，并于第8周取精子进行检测，结果显示弱精子症小鼠与正常小鼠相比，除精子状态外各项生理指标无明显差异。
5.根据权利要求4所述的一种靶向精原细胞构建弱精子症小鼠模型的方法，其特征在于：弱精子症小鼠精子数量减少、畸形率增加、运动性降低，呈现典型弱精子症的症状。
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