KR102069971B1

KR102069971B1 - 세쿠리닌을 포함하는 혈관질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR102069971B1
Application number: KR1020180059693A
Authority: KR
Inventors: 이호섭; 강대길; 은소영; 한병혁; 오영식; 이윤정; 김혜윰; 윤정주
Original assignee: 원광대학교산학협력단
Priority date: 2018-05-25
Filing date: 2018-05-25
Publication date: 2020-01-23
Also published as: KR20190134258A; WO2019225813A1

Abstract

본 발명은 세쿠리닌(securinine)을 유효성분으로 포함하는 혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 세쿠리닌을 포함하는 혈관염증 질환, 고지혈증, 당뇨병 또는 고혈압의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

세쿠리닌을 포함하는 혈관질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating vascular diseases comprising securinine}

세쿠리닌(securinine)은 광대싸리의 식물에 함유되어 있는 알칼로이드계 화합물로, 하기의 화학식 1의 구조를 갖는다

[화학식 1]

세쿠리닌은 중추신경계를 자극하는 효과를 갖는 것으로 알려져 있으며, 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 소아마비(poliomyelitis) 또는 다발성 경화증(multiple sclerosis)과 같은 신경 질환의 치료제로 임상적으로 사용되고 있는 화합물이다.

광대싸리(Securinega suffruticosa)는 나무의 형상이 싸리류와 유사하나, 싸리류의 잎이 3출엽인 반면 광대싸리는 홑잎이다. 중국에서는 이를 타박상 및 신경마비를 치료하는 약으로 사용해 왔으며, 광대싸리의 약효에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 또한, 한국의 전통 의학에서도 광대싸리는 소아마비, 관절통, 중풍 마비, 중풍 재발, 등의 질병에 사용되고 있다.

한편, 혈관염증 반응은 혈관 내피(endothelium)의 기능장애와 관련되어 있다(Aird [0003] W. C., 2003). 내피는 혈관벽의 내부를 감싸는 기관 중의 하나로(Dauphinee S. M. et al., 2006) 내피세포(endothelial cell)로 구성되어 있다. 혈관 내피는 혈관의 확장과 수축, 혈소판 활성, 백혈구 유착(adhesion), 평활근 세포의 증식과 이동 등 혈관의 항상성을 유지하는 주요한 조절 역할을 한다(Pober J. S. et al., 2007). 내피의 기능장애는 염증 반응, 지단백의 산화, 평활근 증식, 세포외 간질 침착과 용해, 혈소판의 활성화를 일으킨다. 내피의 기능장애가 일어나면 혈관 수축과 혈관 확장의 균형이 깨져 내피세포 투과율(permeability)이 증가하고, 혈소판 응집, 백혈구가 내피세포 하부로 이동하여 내피세포 표면에 유착되는 백혈구-내피세포 유착 과정이 단계적으로 발생하고, 사이토카인 생성이 증가한다(정해영 et al., 2010; 김성구, 2001). 이러한 혈관 내피의 기능장애를 일으키는 원인으로 고혈압, 고지혈증, 당뇨병, 심부전증, 흡연, 자연적인 노화, 유전적인 요인 및 미생물에 의한 감염 등이 알려져 있다.

현재 개발된 심혈관계 약물 중에서 널리 사용되는 스타틴(Statin) 등의 합성의약품의 경우에는 불면증, 근육통 등 경미한 부작용에서부터 간 손상, 백내장과 같은 심각한 부작용을 유발한다. 따라서, 이러한 부작용이 발생이 적으면서 동시에 우수한 효과를 갖는 혈관질환을 예방 또는 치료할 수 있는 의약품 개발의 필요성이 대두되고 있다.

이에 본 발명자는 세쿠리닌이 혈관염증 및 기타 혈관질환을 예방 또는 개선하는 효과를 갖는 점을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.

Buravtseva GR (1958) [Result of application of securinine in acute poliomyelitis]. Farmakol Toksikol 21: 712. Copperman R, Copperman G, Der Marderosian A (1973) From Asia securinine a central nervous stimulant is used in treatment of amytrophic lateral sclerosis. Pa Med 76: 3641. Copperman R, Copperman G, Marderosian AD (1974) Letter: Securinine. Jama 228: 288. Lubick K, Radke M, Jutila M (2007) Securinine, a GABAA receptor antagonist, enhances macrophage clearance of phase II C. burnetii: comparison with TLR agonists. J Leukoc Biol 82: 10621069. Shipman M, Lubick K, Fouchard D, Guram R, Grieco P, et al. (2012) Proteomic and Systems Biology Analysis of Monocytes Exposed to Securinine, a GABAA Receptor Antagonist and Immune Adjuvant. PLoS ONE 7(9): e41278.

본 발명은 부작용 및 세포독성이 적고, 혈관염증 및 기타 혈관질환을 예방 또는 치료하는 우수한 효과를 갖는, 세쿠리닌을 포함하는 약학 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 혈관염증 질환, 고지혈증, 동맥경화증, 당뇨병 또는 고혈압을 예방 또는 개선할 수 있는 식품 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 혈관염증 질환, 고지혈증, 동맥경화증, 당뇨병 또는 고혈압을 예방 또는 개선할 수 있는 동물용 사료 조성물을 제공한다.

본 발명은 세쿠리닌을 포함하는 혈관질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 혈관질환은 혈관염증 질환, 고지혈증, 동맥경화증 또는 고혈압일 수 있다.

특히, 본 발명은 혈관염증 질환을 예방 또는 치료하는 신규한 세쿠리닌의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 세쿠리닌을 포함하는 조성물은 세포독성을 갖지 않아, 의약품으로 개발시 부작용의 문제점을 해결할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 세쿠리닌은 ICAM-1, VCAM-1 및 E-selectin의 발현을 감소시켜 항염증 효과를 갖는다.

또한, 본 발명의 세쿠리닌은 MMP-2 및 MMP-9의 발현을 감소시켜 항염증 효과를 갖는다.

또한, 본 발명의 세쿠리닌은 ROS(활성산소종)의 활성도 감소시킴으로써 우수한 항염증 효과를 갖는다.

본 발명의 조성물은 콜레스테롤 및 중성지방의 혈중 농도를 감소시켜 고지혈증을 예방 또는 치료하는 효과를 갖는다.

본 발명은 콜레스테롤 및 중성지방의 혈중 농도를 감소시키고, 혈당 및 혈압을 감소시키는 효과를 동시에 갖는 우수한 혈관질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 세쿠리닌을 포함하는 혈관염증 질환, 고지혈증, 동맥경화, 당뇨병 또는 고혈압의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물에 관한 것이다. 상기 식품 조성물은 건강기능식품, 유제품, 발효제품 또는 식품첨가물일 수 있다.

본 발명은 세쿠리닌을 포함하는 혈관염증 질환, 고지혈증, 동맥경화, 당뇨병 또는 고혈압의 예방 또는 개선을 위한 동물용 사료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 사쿠리닌을 유효성분으로 포함하며, 사쿠리닌은 세포독성이 적어 부작용이 낮고, 우수한 항염증 효과를 가지며, 다양한 염증 관련 인자들의 발현을 억제하여, 특히 혈관염증 질환을 예방 또는 치료하는 우수한 효과를 갖는다.

또한, 콜레스테롤 및 중성지방의 혈중 농도를 감소시키는 동시에, 혈당과 혈압을 감소시켜, 혈관질환의 예방 및 치료에 더욱 효과적이다.

특히, 본 발명의 사쿠리닌은 천연물 유래의 유효성분으로 인체에 부작용이 적을 뿐만 아니라, 장기간 사용하여도 내성이 생길 가능성이 낮다.

따라서, 본 발명의 조성물은 우수한 혈관질환의 예방 또는 치료/개선 효과를 갖는 의약품, 식품조성물, 건강기능식품 및 동물용 사료 등으로 활용될 수 있다.

도 1은 세쿠리닌을 농도별로 처리한 후 세포독성 실험결과를 나타낸다.
도 2는 세쿠리닌을 농도별 전처리 후 TNF-α 자극에 의한 부착 분자의 단백질 발현 시험 결과를 나타낸다.
도 3은 세쿠리닌을 농도별 전처리 후 TNF-α 자극에 의한 MMP-2 및 MMP-9의 발현 시험 결과를 나타낸다.
도 4는 세쿠리닌을 농도별 전처리 후 TNF-α 자극에 의한 NF-κ이동에 대한 시험 결과를 나타낸다.
도 5는 세쿠리닌을 전처리 후 TNF-α 자극에 의한 ROS 활성을 측정한 시험 결과를 나타낸다.
도 6은 대조군, NC 군, PC군 및 세쿠리닌 처리군에서 16주간 혈당 측정 결과를 나타낸다.
도 7은 대조군, NC 군, PC군 및 세쿠리닌 처리군에서 ELISA kit를 이용한 혈당 측정 결과를 나타낸다.
도 8은 대조군, NC 군, PC군 및 세쿠리닌 처리군에서 16주간 혈압 측정 결과를 나타낸다.
도 9 내지 도 11은 아세틸콜린, 니트로프루시드 나트륨 및 심방성 나트륨이뇨펩티드의 발현 측정 결과를 나타낸다.
도 12는 H/E 염색을 이용하여 혈관 내부 병변의 관찰 결과를 나타낸다.
도13 내지 17은 면역 염색법을 통한 ICAM, VCAM, E-selectin, MMP-2 및 MMP-9의 발현 정도를 측정한 결과를 나타낸다.

본 발명의 세쿠리닌(securinine)은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이다.

[화학식 1]

본 발명의 "ICAM-1(Intercellular adhesion molecule-1)"은 세포간 부착분자로서, 염증세포 부착과 이동에 관여하는 염증 단백질이다.

본 발명의 "VCAM-1(Vascular cell adhesion molecules-1)"은 혈관세포 부착분자로서, 염증반응이 있을 때 혈관내피세포에서 발현되는 염증성 단백질이다.

본 발명의 "E-selectin"은 염증 조직 내 혈관내피세포에서 강하게 발현되고, 호중구와 단구가 염증 부위로 침윤하는 것을 촉진하는 염증성 단백질이다.

상기 ICAM, VCAM 및 E-selectin은 염증 반응의 지표가 될 수 있다.

본 발명의 “MMP-2 (Matrix metalloproteinase-2)”는 분자량 72 kDa의 제4형 교원질 분해효소로서 기저막의 중요한 구성성분인 제4형 교원질과 피브로넥틴을 분해하며, 신생혈관 형성에도 관여하여, 암의 침윤과 진행에 관여한다고 알려져 있다

본 발명의 “MMP-9”은 분자량 92 kDa이며, MMP-2와 비슷한 구조를 보이고, 생체의 조직 재조합 과정과 MMP-2와 마찬가지로 악성 종양의 침윤성 성장에 관여하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 "TNF-α"는 종양괴사인자로, 이에 의해 세포활성이 증가 하고 염증반응이 유도된다.

본 발명의 "NF-κ는 염증반응 조절에 관여하는 단백질로서, 다양한 유전자들의 발현을 조절하며 세포내의 신호를 전달한다.

본 발명의 “활성산소종(reactive oxygen species, ROS)”은 정상적인 세포 내 활성작용 과정에서 생성되며 세포분화, 유전자의 발현, 사이토카인에 대한 반응 정도를 포함한 다양한 생물학적 과정에 연관되어 있다. 따라서 이러한 ROS의 항상성을 유지하는 것은 세포 성장과 생존에 매우 중요하다. 산화스트레스는 ROS의 생성과 이를 제거하는 항산화 반응 간의 불균형으로 인해 세포 내의 ROS가 증가하여 DNA, 단백질, 지질과 반응하여 손상시키는 현상이며 이는 노화, 혈관, 심장과 관련된 질병들의 핵심 원인으로 알려져 있다

본 발명은 세쿠리닌을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 약학 조성물은 제형으로 제조될 수 있으며, 상기 제형은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 및 주사제로 이루어진　군으로부터　선택될 수 있다.

본 발명의 조성물은 혈관질환의 예방 또는 치료/개선을 위한 의약품, 건강기능식품, 식품, 음료 및 식품 조성물 등에 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태일 수 있으며, 상기 식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.

또한 상기 건강기능식품은 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리 및 바로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명자는 인위적으로 혈관 질환을 유발시킨 동물 모델인 apoE -/- 동물 모델을 사용하여, 상기 동물 모델에 세쿠리닌을 처리하여, 혈관염증, 당뇨병, 고혈압, 동맥경화 및 고지혈증 등의 질환에 효과를 갖는지 여부를 확인하였다.

또한 실험의 정확성을 높이기 위하여 심혈관계질환의 대표적인 약물로 사용되고 있는 텔미사르탄 처리군(positive control; PC 군)으로 하여 사쿠리닌 처리군과 비교 실험을 실시하였으며, 세쿠리닌의 혈관질환 효과를 확인하였다.

결과적으로 본 발명의 사쿠리닌을 포함하는 조성물은 텔미사르탄 처리군(PC 군)과 비교하여 동일하거나 그 이상의 효과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.

[실시예 1]

세쿠리닌의 분리방법

Sanat Cruz 사에서 세쿠리닌 (CAS 5610-40-2)을 구입하여 제조사에서 제공하는 기술정보에 의거하여 DMSO (≥25 mg/ml)에 용해하여 실험을 진행하였다.

[실시예 2]

세쿠리닌의 세포독성 시험

세쿠리닌의 농도에 따른, 세포 독성을 하기의 방법으로 시험하였다.

3-(4,5-dimethylthinazol-2-yl)-2,3-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay를 이용하여 세포의 생존율 및 독성시험을 진행하였다. 세쿠리닌을 각각의 농도로 96 well plate에 처리한 다음 MTT 용액을 처리하였다. 약 4시간 후 DMSO 100 μl를 각 well에 분주하여 충분히 용해시켜준 다음 ELISA reader를 이용하여 540 nm 파장에서 그 흡광도를 측정하였다.

상기 시험 결과를 도 1에 나타내었으며, 도 1에서 보는 바와 같이, 세쿠리닌을 0, 0.01, 0.1, 1, 5 및 10 μg/ml의 농도로 처리한 결과 세쿠리닌 1 μg/ml까지 대조군과 유의적인 차이를 보이지 않아, 세포 성장에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 실험에 대한 세쿠리닌 처리 농도를 0.01, 0.1 및 1 μg/ml으로 수행하였다.

[실시예 3]

부착 분자(ICAM-1, VCAM-1, E-selectin)의 단백질 발현 시험

세쿠리닌을 농도별로 전처리 후, TNF-α 자극에 의한 부착 분자의 단백질 발현 시험을 하기와 같이 수행하였다.

HUVEC을 100mm cell culture dish에 5X106개의 세포가 되도록 분주하여 배양하였다. 세쿠리닌을 0.01, 0.1, 1 μg/ml의 농도가 되도록 30분 동안 전처리하고 세포부착 분자를 유도하기 위해 TNF-α 을 첨가하여 6 시간 배양하였다. 6시간의 배양 후 PBS를 이용하여 dish를 깨끗이 세척한 후, cell scrapper로 harvest하였다. 13,000rpm에서 10분간 centrifuge한 후, 상층액을 제거하고 세포를 RIPA buffer를 이용하여 세포를 lysis하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질로 sample을 만들어 western blot을 이용하여 단백질 발현의 억제 효과를 관찰하였다.

상기 시험 결과를 도 2에 나타내었으며, 도 2에서 보는 바와 같이, 부착 분자 ICAM-1, VCAM-1 및 E-selectin의 단백질 발현은 세쿠리닌에 의해 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다.

따라서, 세쿠리닌이 혈관내피세포에서 혈관염증을 유도하는 세포부착 분자의 발현을 감소시켜 혈관염증을 예방 또는 치료하는 효과를 갖는 것을 알 수 있다.

[실시예 4]

MMP-2 및 MMP-9의 발현 시험

세쿠리닌을 농도별로 전처리 한 후, TNF-α 자극에 의한 MMP-2 및 MMP-9 발현 변화를 하기의 방법으로 시험하였다.

Western blot analysis를 이용하여 MMP-2/-9의 단백질 발현을 확인하였으며, 세포를 배양한 배지를 이용하여 zymography를 실행하여 MMP-2와 MMP-9의 기질분해 정도를 확인하였다.

상기 시험 결과를 도 3에 나타내었으며, 도 3에서 보는 바와 같이, TNF-α 자극에 의해 증가된 MMP-2 및 MMp-9 단백질 발현 및 활성이 세쿠리닌에 의해 감소되는 것을 확인하였다.

따라서, 세쿠리닌이 기질 분해 효소인 MMP-2 및 MMP-9의 발현을 억제함으로써 혈관염증을 예방 또는 치료하는 효과를 갖는 것을 알 수 있다.

[실시예 5]

NF-κ의 이동 시험

세쿠리닌을 농도별로 전처리한 후, TNF-α 자극에 의한 NF-κ이동을 western blot으로 확인하였다.

상기 시험 결과를 도 4에 나타내었으며, 도 4에서 보는 바와 같이, TNF-α에 의해 증가된 핵 내 NF-κB의 이동이 세쿠리닌에 의해 억제되는 것을 확인하였다. 따라서, 세쿠리닌이 염증성 신호에 의한 NF-κ의 핵으로의 이동을 억제하여 항염증 효과를 갖는 것을 알 수 있다.

[실시예 6]

ROS(활성산소종) 관련 시험

세쿠리닌을 전처리한 후, TNF-α 자극에 의한 ROS 활성을 DCFH-DA 염색 방법을 이용하여 하기의 방법으로 시험하였다.

TNF-α에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 세쿠리닌의 억제 효과를 확인하기 위한 실험을 진행하였다. HUVEC 세포에 세쿠리닌을 한시간 전 처리 해준 후, TNF-α를 처리하여 염증을 유발시켰다. 이 후 CM-H₂DCFDA 형광 염료를 이용하여 HUVEC 세포에 label을 한 후, spectrofluorometer를 이용하여 480 ~ 535 nm 의 파장에서 실험데이터를 산출하였다.

상기 시험 결과를 도 5에 나타내었으며, 도 5에서 보는 바와 같이, TNF-α 자극으로 증가된 ROS 활성이 세쿠리닌 농도에 의존적으로 억제되는 것을 확인하였다. 따라서, 세쿠리닌이 TNF-α 자극으로 인해 유발된 산화적 스트레스에 대해 세포를 보호하는 효과를 갖는 것을 알 수 있다.

[실시예 7]

콜레스테롤 및 중성지방 시험

ApoE -/- 동물 모델을 이용하여, 세쿠리닌의 콜레스테롤 및 중성지방에 대한 효과를 확인 하기 위해서, 하기의 방법으로 실험하였다.

ApoE -/- 동물 모델은 apolipoprotein을 유전적으로 knock-out 시켜서 인위적으로 혈관 질환을 유발시킨 모델이다. 상기 동물 모델에 세쿠리닌을 처리함으로써 혈액에서의 생화학 측정, 혈관 염색 등의 실험 등을 통하여 세쿠리닌이 혈관 질환에 대한 억제 효과를 갖는지 여부를 확인하였다. 또한 실험의 정확성을 높이기 위하여 심혈관계 질환에 약물로 사용되고 있는 텔미사르탄(telmisartan)을 positive control 군으로 설정하여 실험을 진행하였다.

16주 동안의 실험을 종료하며 동물의 혈액을 체혈하여 혈액에 있는 콜레스테롤의 양과 중성지방의 양을 측정하였으며 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

	LDL/VLDL- Cholesterol (mg/dl)	HDL-Cholesterol (mg/dl)	총 Cholesterol (mg/dl)	TG (mg/dl)
대조군	27.51	46.91	64.69	78.71
NC (negative control)	128.58	20.02	271.78	122.30
PC(positive control/텔미사르탄) (1 mg/kg/day)	87.20	32.96	100.52	90.28
저농도 세쿠리닌 (1 mg/kg/day)	105.89	32.51	216.16	104.28
고농도 세쿠리닌 (5 mg/kg/day)	67.44	38.80	142.94	90.06

상기 표 1에서 보는 바와 같이, 혈액에 존재하는 LDL 콜레스테롤, 총 콜레스테롤 및 중성지방의 경우, NC군에서 현저하게 증가하였으며, PC 군 및 세쿠리닌 처리군에서 NC 군과 비교하여 감소하는 것을 확인하였다. 특히, 고농도 세쿠리닌 처리군은 PC군과 유사한 LDL 콜레스테롤, 총 콜레스테롤 및 중성지방 감소 효과를 나타내었다.

또한, HDL 콜레스테롤의 경우, NC 군에서 감소하였고, PC 군 및 세쿠리닌 처리군에서 NC 군과 비교하여 증가하는 것을 확인하였다.

따라서, 세쿠리닌은 혈액 내의 콜레스테롤 및 중성지방의 수치가 감소시키는 효과를 갖는 것을 알 수 있다.

[실시예 8]

혈당 측정 시험

세쿠리닌의 혈당에 대한 효과를 확인하기 위해서, 하기의 방법으로 실험하였다.

4주 간격으로 하루 동안 공복상태를 유지한 후, 각각의 실험 동물의 꼬리의 정맥에서 혈액 sample을 취하여 혈당측정기(One touch^®Ultra™ Blood glucose Meter and Test Strip (Life Scan Inc., CA, USA))를 를 이용하여 각각의 실험동물들의 혈당을 측정하였다. 각 군당 각각 7마리의 sample을 측정하였으며, 각 군의 측정값의 평균을 계산하여 실험데이터를 산출하였다.

혈당을 측정하기 하루 전부터 모든 실험동물 군은 공복상태를 유지하였으며, 혈당 측정기를 이용하여 측정을 진행하였다.

총 16주간의 실험 진행 중에 4주 간격으로 총 4번의 혈당을 측정하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에서 보는 바와 같이, NC 군은 시험 기간 내내 대조군과 비교하여 유의성 있게 높은 혈당 수치를 나타내었으며, PC 군 및 세쿠리닌 처리군은 NC 군과 비교하여 혈당 수치가 감소하는 것을 확인하였다. 16주째 고농도 세쿠리닌 처리군은 PC 군 보다 더 많은 혈당 수치 감소의 효과를 갖는 것을 확인하였다.

최종 실험 종료시 수득한 혈액을 이용하여, ELISA kit를 이용하여 혈당을 측정하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 상기 도 6의 실험결과와 유사하게, NC군에서 혈당 수치가 증가하였고, PC 군 및 고농도 세쿠리닌 처리군에서 혈당 수치가 감소하는 것을 확인하였다.

따라서, 세쿠리닌은 혈당 수치를 감소시키는 효과를 갖는 것을 알 수 있다.

[실시예 9]

혈압 측정 시험

세쿠리닌의 혈압에 대한 효과를 확인하기 위해서, 하기의 방법으로 실험하였다.

실험동물의 수축기 혈압을 noninvasive tail-cuff plethysmography method 를 이용하여 측정하였다. 각 군당 7마리의 표본을 혈압 측정에 사용하였으며, 4주 간격으로 총 5번의 혈압을 측정하였다. 각 개체마다 최소 5번의 혈압을 측정하고 그 중 5 mmHg 내에 있는 3번 이상의 측정값을 평균값으로 이용하였다.

상기 실험 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 보는 바와 같이, NC 군의 혈압은 실험 기간 동안 지속적으로 증가하였고, PC 군 및 세쿠리닌 처리군은 NC군과 비교하여 혈압이 감소한 것을 확인하였다.

따라서, 세쿠리닌은 혈압을 감소시키는 효과를 갖는 것을 알 수 있다.

[실시예 10]

혈관기능 개선 효과 시험

혈관 수축 및 이완에 대한 세쿠리닌의 기능을 확인하기 위하여, 하기의 방법으로 혈관 장력을 실험하였다.

실험동물의 흉부대동맥을 분리한 후, 4℃ Krebs 용액 (118mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.1 mM MgSO₄, 1.2 mM KH₂PO₄, 1.5 mM CaCl₂, 25 mM NaHCO₃, 10 mM glucose, pH 7.4)으로 지방을 제거한 후, 3 mm의 크기로 일정하게 조각 내어 흉부대동맥 절편을 만들었다. Krebs 용액(37℃이 들어있는 장기 수조를 준비하여 95% O₂ 및 5% CO₂의 혼합가스로 포화시켰다. 이때 열 순환 장치(heat circulator, Model CW-10GL, JEIO TECH, Korea)에 의해 일정한 온도를 유지했다.

상기 흉부대동맥 절편의 한쪽 끝을 상기 장기 수조(organ bath)에 고정시키고, 다른 쪽 끝은 힘 전위 변화기(force displacement transducer, Grass FT 03,GRASS Instrument, M, USA)에 연결하여 등척성 장력(isometric tension)을 생리기록계 (Grass Model 7E, Grass Instrument, MA, USA)로 측정했다. 등척성 장력을 측정한 후, 혈관 이완 반응을 실험하였다. 상기 혈관을 0.6 g의 힘까지 당겨 팽팽한 상태로 혈관을 안정시켰다.

안정기에 들어가면 페닐에프린(phenylephrine, PE)을 처리하여 혈관을 수축시킨 후, 혈관 이완과 관련된 인자인, 아세틸콜린 (ACh), 니트로프루시드 나트륨 (SNP; sodium nitroprusside) 및 심방성 나트륨이뇨펩티드 (ANP; Atrial Natriuretic Peptide)의 발현을 측정하였으며, 그 결과를 도 9 내지 11에 나타내었다.

아세틸콜린(도 9)의 경우, 질병 유발 모델에서 아세틸콜린의 수치가 현저하게 감소하였지만 PC 군 및 세쿠리닌 처리군에서 증가하는 것을 확인하였으며, 특히 세쿠리닌 처리시 유의성 있게 증가하는 것을 확인하였다.

SNP(도 10)의 경우, PC 군 및 세쿠리닌 처리군에서 SNP의 수치가 유의성 있게 증가하는 것을 확인하였으며, 특히 저농도 세쿠리닌 처리군에서 유의성 있는 증가를 확인하였다.

ANP(도 11)의 경우, 질병 유발 그룹에서 ANP 수치의 유의성 있는 감소, 및 PC 군 및 고농도 세쿠리닌 처리군에서 유의성 있는 증가를 확인하지는 못하였지만, 저농도 세쿠리닌 처리 군에서는 매우 유의성 있는 증가를 확인하였다.

따라서, 세쿠리닌은 혈관 이완 인자의 발현에 영향을 미쳐, 혈관 기능 개선에 효과를 갖는 것을 알 수 있다.

[실시예 11]

혈관 병변의 확인 시험

H/E 염색을 이용하여 혈관 내부 병증이 유발되었는지 여부를 하기의 방법으로 수행하였다.

실험동물에서 흉부 대동맥을 조직을 적출하여 고정시킨 후 수세를 통하여 고정을 위하여 사용된 조직 내에 남아있는 포르말린을 제거하였다. 에탄올을 이용하여 탈수 과정을 거친 후, xylene을 이용하여 치환하였다. 파라핀 침투과정을 거친 후 포매하여 블록을 제작하였다. 이렇게 준비된 파라핀 블록을 회전형 박절기를 사용하여 절단한 후 슬라이드 위에 부착 시켜 실온에서 건조하였다. 이 후, hematoxylin and eosin (H&E)을 이용하여 염색을 실행하였으며 Axiovision 4 Imaging/Archiving software (Axiovision 4, Carl Zeiss, Germany)를 사용하여 측정을 진행하였다.

상기 시험 결과를 도 12에 나타내었으며, 도 12에서 보는 바와 같이, NC 군에서 혈관 벽이 비후화된 것을 명확히 관찰할 수 있었고, PC 군 및 세쿠리닌 처리군에서 혈관 벽이 비후화되는 병변의 발생이 저해되는 것을 확인하였다.

따라서, 세쿠리닌이 혈관 병변 발생에 대한 억제효과를 나타내는 것을 알 수 있다.

[실시예 12]

혈관염증 인자 발현 시험

혈관 조직을 섹션한 후, 혈관의 단면을 면역 염색으로 관찰하여, 혈관 내벽 염증과 관련된 인자인 세포 부착 분자 및 MMP의 발현 정도에 세쿠리닌이 미치는 영향을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.

상기 세포 부착 분자인 ICAM, VCAM 및 E-selectin에 대한 실험결과를 도 13 내지 15에 나타내었다.

도 13 내지 도 15에 나타낸 바와 같이, NC 군에서 H/E 염색을 통해 확인한 병변 부위에서 집중적으로 ICAM, VCAM 및 E-selectin발현이 증가하는 것을 확인하였으며, PC군 및 세쿠리닌 처리군에서 상기 부착 분자의 발현이 현저히 감소한 것을 확인하였다.

또한, MMP-2 및 MMP-9의 발현 정도에 대한 실험결과를 도 16 및 도 17에 나타내었다.

상기 도 16 및 도 17에 나타낸 바와 같이, NC 군에서 MMP-2 및 MMP-9의 발현이 현저하게 증가하지만, 세쿠리닌 처리군에서 발현이 정상수준으로 감소되는 것을 확인하였다.

결국, 세쿠리닌이 혈관내피세포에서 혈관염증을 유도하는 세포부착 분자의 발현을 감소시킬 뿐만 아니라, 기질 분해 효소인 MMP-2 및 MMP-9의 발현을 억제함으로써 혈관염증을 예방 또는 치료하는 우수한 효과를 갖는 것을 알 수 있다.

Claims

세쿠리닌을 포함하는 고지혈증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 세쿠리닌이 세포독성을 갖지 않는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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제1항에 있어서, 콜레스테롤 및 중성지방의 혈중 농도를 감소시켜 고지혈증을 예방 또는 치료하는 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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세쿠리닌을 포함하는 고지혈증의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물.
제9항에 있어서, 상기 식품 조성물은 건강기능식품, 유제품, 발효제품 또는 식품첨가물인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
세쿠리닌을 포함하는 고지혈증의 예방 또는 개선을 위한 동물용 사료 조성물.