KR102069180B1 - 주름 개선 효과를 갖는 발효 로즈힙 오일 및 이를 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 발효를 통하여 알파 및 감마 리놀렌산 등과 같은 유리 필수 불포화지방산 함량을 증대시키고, 결합조직 중에 존재하는 콜라겐이나 엘라스틴 등과 같이 피부의 탄력 유지 및 주름 방지 등에 중요한 역할을 하는 단백질을 분해하는 효소인 콜라게나아제 및 엘라스타아제의 저해 활성을 높여 주름 개선 효과를 갖는 발효 로즈힙 오일 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 로즈힙 오일을 리조푸스 오리제(Rhizopus oryzae), 버크올데리아 멀티보란(Burkholderia multivorans), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescence), 칸디다 루고사(Candida rugosa)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물 유래의 효소농축액으로 발효시켜서 수득되는 것을 특징으로 하는 발효 로즈힙 오일 및 이를 유효성분으로 포함하는 항주름용 화장료 조성물을 제공한다.

Description

주름 개선 효과를 갖는 발효 로즈힙 오일 및 이를 포함하는 화장료 조성물{Fermented rose hip oil having anti-wrinkle effect and cosmetic composition comprising the same}

본 발명은 주름 개선 효과를 갖는 발효 로즈힙 오일 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로 특히, 발효를 통하여 알파 리놀렌산, 감마 리놀렌산, 올레산 등과 같은 유리 필수 불포화지방산 함량을 증대시키고, 결합조직 중에 존재하는 콜라겐이나 엘라스틴 등과 같이 피부의 탄력 유지 및 주름 방지 등에 중요한 역할을 하는 단백질을 분해하는 효소인 콜라게나아제 및 엘라스타아제의 저해 활성을 높여 주름 개선 효과를 갖는 발효 로즈힙 오일 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부는 외부로부터 피부 안쪽의 다양한 기관을 보호하고 있는 인체를 구성하는 기관들 중 가장 큰 기관으로서, 내부의 수분 및 유용성 성분의 피부 밖으로의 유출을 막아주는 장벽기능, 온도조절기능, 배설기능, 호흡기능 등 다양한 생리적 역할을 감당하고 있다.

그러나, 나이가 들어감에 따라 피부의 생리적 기능이 저하되고 피부의 두께가 얇아져 피부장벽으로서의 기능이 저하될 뿐만 아니라, 자외선, 대기오염, 냉난방 시설 등 외적 요인과 과도한 피로, 스트레스 및 연령에 따른 호르몬 변화 등 내적 요인에 의해 피부의 건성화가 이루어지게 되며, 이와 같은 피부 건성화는 역시 피부의 생리적 기능을 저하시켜 외부의 작은 자극원에 의해서도 피부자극 및 손상이 쉽게 일어나게 하는 원인이 되며, 자외선 등의 원인으로 생성된 활성산소종에 의해 항산화 시스템이 파괴되고 이로 인해 방어능력이 현저하게 저하되고, 피부에 산화적 스트레스가 가해지면, 지질과산화, 단백질 산화, 탄력섬유인 콜라겐과 엘라스틴의 사슬절단 및 비정상적인 교차결합, 히알루론산 사슬의 절단, DNA 산화 등 생체 구성성분의 손상을 가져오게 된다. 상기한 생체 구성성분의 손상으로 인하여, 피부 주름의 초기증상인 피부의 처짐, 거칠어짐, 건조함 등이 유발되며, 결과적으로 피부 주름이 형성되게 된다.

한편, 과거에는 여성들이 사용하는 제품이라고 생각되던 화장품은 오늘날에는 단순한 아름다움의 표현 도구만이 아닌 생활용품으로 남녀노소를 불문하고 사용하고 있으며, 산업의 발전에 따라 화장품에 대한 고급화와 다양화의 요구가 증대됨에 따라, 특별한 효과나 효능을 기대하는 기능성 제품에 대한 관심도가 높아지고 있는 실정이다.

특히, 기능성 화장품은 미용 효과뿐만 아니라 신체의 구조나 기능에 영향을 주고, 예방, 개선 및 치료 작용을 하는 화장품으로 해석되고 있다. 특히, 최근에는 화장품 전체 매출에서 기능성 화장품의 매출비중이 현저하게 증가하면서, 인체에 미치는 새로운 효능 성분을 모색하고, 이를 피부에 효율적으로 이용하고자 하는 연구가 활발히 이루어지고 있다.

상기 피부의 주름개선과 관련하여, 피부의 탄력성이 상실되어 느슨해진 상태 즉, 피부외관에 주름살이 형성되는 원인은 자연적 노화에 의한 주름의 생성과 자외선 노출(광노화)에 의한 주름의 생성으로 크게 나눌 수 있는 데, 두 가지 원인에 의한 주름 형성 메커니즘은 아직까지 정확하게 밝혀져 있지 않은 상태이다. 상기 주름과 밀접하게 관련된 피부노화 또한 크게 두 가지로 구분될 수 있으며, 자연적 노화 즉, 시간의 흐름에 따른 생리적 노화(chronological aging)와 자외선 노출을 포함하여 바람, 온도, 습도, 담배연기 및 공해 등과 같은 외재적 요인에 의한 노화(extrinsic aging)를 예로 들 수 있다.

상기 두 가지 주름의 원인 즉, 자연적 노화와 광노화에 의한 피부변화와 관련되어 발견되는 공통적인 현상은 진피 내의 주 구성단백질인 콜라겐, 엘라스틴의 감소 혹은 변형 및 진피의 기질인 히알루론산의 감소에 의한 피부 탄력 감소이다. 특히, 지금까지의 연구결과에 의하면 상기 진피 내 주 단백질인 콜라겐 및 엘라스틴의 감소 및 변형이 주름의 생성 및 피부의 탄력저하에 직접적으로 관여하는 것으로 알려져 있다.

콜라겐은 세포 외 기질(extracellular matrix)의 주요 구성 성분으로, 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로서 세포 외 간질에 존재한다. 또한, 생체 단백질 총 중량의 약 30%를 차지하는 중요한 단백질로서 견고한 3중 나선구조를 가지고 있다. 콜라겐은 피부, 건(tendon), 뼈 및 치아의 유기 물질의 대부분을 형성하는데, 특히 뼈와 피부의 진피에 그 포함량이 높다. 대부분의 다른 체 구조물에서는 섬유상 봉입체로서 존재한다. 콜라겐의 주된 기능으로는 피부에 강도와 장력을 부여하여 피부의 기계적 견고성 확보, 결합조직의 저항력 유도, 조직의 결합, 세포 접착의 지탱, 세포 분할과 분화(유기체의 성장 혹은 상처 치유 시)의 유도 등으로 알려져 있다. 또한, 콜라겐은 상처 치유에 있어서 중요한 역할을 담당하며, 손상된 상피에서 콜라겐의 합성을 촉진시켜서 상처를 신속하게 흉터 없이 회복시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 특히, 진피층의 90%를 차지하고 있는 콜라겐의 감소는 피부의 노화와 매우 밀접한 관계를 가진다고 보고되어 있다. 보다 구체적으로, 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외 기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화의 진행이나 자외선 조사는 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질 분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)의 발현을 촉진시키며, 이러한 콜라게나아제에 의한 콜라겐 분해로 인하여 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다.

엘라스틴은 콜라겐과 함께 결합조직에 존재하고 고무 탄력성과 같은 신축성이 있는 단백질이며 조직의 유연성, 신축성에 관여하고 있다. 따라서 신축이 항상 반복되는 조직에는 함량이 많다. 이러한 엘라스틴은 피부의 탄력, 주름방지에 중요한 역할을 하고 있다. 화장품에 콜라겐을 배합하면 보습성이 좋아지며 특히 텍스쳐가 개선되어 사용감이 향상된다.

지금까지 알려진 피부 노화 억제제로는 피부 노화 억제 기전에 따라 종류가 다양하다. 대표적인 예로는 콜라겐 생성 촉진제, 엘라스틴 활성화제, 히알루론산 생성 증가제, 자유라디칼 소거제, 세포 증식제, 광노화 억제제, 각질세포 증식억제제, 보습제, 유해 활성산소 생성방지제, 세포 재생물질 등이 있다.

또한, 피부 주름을 개선시키기 위한 방법으로 콜라겐을 포함시킨 화장품 또는 연고 등과 같은 피부 외용제 조성물을 사용하는 방법이 제시되었다. 이는 콜라겐의 주름 개선 및 피부 회복 효과를 이용하기 위하여 제시된 것이나, 고분자 물질인 콜라겐의 경피 흡수가 어려워 보습작용 또는 상처치유 효과를 기대할 수 없으므로 본질적인 피부기능 개선 및 상처치유의 기능을 나타낼 수 없다는 문제점이 지적되었다.

종래의 문제점을 해결하기 위해 제시된 것으로, 자유 라디칼의 형성이나 반응을 억제하는 비타민 C, 비타민 E 또는 카로티노이드와 같은 항산화제에 의해 주름의 형성을 예방하는 방법, 레티놀과 같이 진피 내의 콜라겐 생합성을 증가시키는 방법, 콜라겐을 피부 내로 주입하는 방법 또는 보툴리눔 독소를 피부에 주사하는 방법 등이 제시되었다.

그러나, 상기 비타민 C, 비타민 E, 카로티노이드 및 레티놀은 모두 상온에서 쉽게 부서진다는 단점이 있고, 상기 레티놀은 처리농도가 높아지면 피부에 부작용을 나타내는 단점이 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 콜라겐이나 보툴리눔 독소의 경우 피부적용 시 자극과 발적 등의 안전성의 문제로 사용량의 제한이 있거나 효과가 미미하여 실질적으로 피부 기능 개선 또는 상처 치유의 효과를 기대할 수 없다는 단점이 지적되어 왔다.

이러한 기능성 화장품의 원료와 관련하여, 기능성 소재와 관련된 최근 연구는 친환경 열풍과 맞물려 주로 천연물로부터 유래한 천연물질 소재에 집중이 되고 있으며, 주로 허브(herb)나 한방에서 약재로 사용되던 물질들에 관해 연구가 진행되고 있으며, 이에 대한 연구의 필요성이 증대되고 있다.

한국 공개특허공보 공개번호 제2015-0052473호는 차나무 잎 아임계수 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 발명으로서, 차나무(Camellia sinensis) 잎 아임계수 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하며, 유효성분인 차나무 잎 아임계수 추출물은 1 MPa 내지 5 MPa 및 180℃ 내지 240℃의 아임계 조건에서 추출한 차나무 잎 아임계수 추출물에 관하여 개시하고 있다.

한국 공개특허공보 공개번호 2008-0036302호는 차풀 추출물의 제조방법 및 차풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부노화방지 및 피부주름방지용 화장료 조성물에 관한 발명으로서, 차풀 추출물에는 항산화물질인 루테오린 화합물을 포함하고 있으며, 이 루테오린 화합물이 항산화 및 항주름 효능을 포함한 피부노화방지효과를 나타내고, 또한, 차풀 추출물로부터 루테오린의 분리, 정제방법을 제공하며, 차풀 추출물에 함유되어 있는 루테오린 화합물은 엘라스타아제 저해작용, mmp-1 저해작용, 라디칼 포착형 항산화 작용 등을 갖고 있다는 점을 개시하고 있다.

본 발명의 목적은 발효를 통하여 알파 및 감마 리놀렌산 등과 같은 유리 필수 불포화지방산 함량을 증대시키고, 결합조직 중에 존재하는 콜라겐이나 엘라스틴 등과 같이 피부의 탄력 유지 및 주름 방지 등에 중요한 역할을 하는 단백질을 분해하는 효소인 콜라게나아제 및 엘라스타아제의 저해 활성을 높여 주름 개선 효과를 갖는 발효 로즈힙 오일 및 이를 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 발효 로즈힙 오일은 로즈힙 오일을 리조푸스 오리제(Rhizopus oryzae), 버크올데리아 멀티보란(Burkholderia multivorans), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescence), 칸디다 루고사(Candida rugosa)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물 유래의 효소농축액으로 발효시킨 것임을 특징으로 한다.

미생물 유래의 효소농축액은 리조푸스 오리제(Rhizopus oryzae), 버크올데리아 멀티보란(Burkholderia multivorans), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescence), 칸디다 루고사(Candida rugosa)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물을 배지에서 배양시킨 후, 원심분리로 균체를 침강시켜 회수되는 상등액을 염석시켜 수득되는 것일 수 있다.

발효는 미생물 유래의 효소농축액 : 로즈힙 오일을 50 내지 70중량부 : 30 내지 50중량부의 비율로 혼합하고, 50 내지 70시간 동안 수행될 수 있다.

본 발명에 따르면 발효, 특히 리조푸스 오리제(Rhizopus oryzae), 버크올데리아 멀티보란(Burkholderia multivorans), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescence), 칸디다 루고사(Candida rugosa)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물을 이용한 발효를 통하여 알파 및 감마 리놀렌산 등과 같은 유리 필수 불포화지방산 함량을 증대시키고, 결합조직 중에 존재하는 콜라겐이나 엘라스틴 등과 같이 피부의 탄력 유지 및 주름 방지 등에 중요한 역할을 하는 단백질을 분해하는 효소인 콜라게나아제 및 엘라스타아제의 저해 활성을 높여 주름 개선 효과를 갖는 발효 로즈힙 오일 및 이를 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 효과가 있다.

도 1 및 도 2는 본 발명의 실시예(실시예 8, 실시예 11 내지 13) 및 비교예(비교예 1 내지 3)들의 발효 오일들 및 미발효 로즈힙 오일(비교예 4)의 콜라게나아제 저해 활성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3 및 도 4는 본 발명의 실시예(실시예 8, 실시예 11 내지 13) 및 비교예(비교예 1 내지 3)들의 발효 오일들 및 미발효 로즈힙 오일(비교예 4)의 엘라스타아제 저해 활성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5 및 도 6은 본 발명의 실시예 8의 보습력(도 5) 및 탄력도(도 6)에 대한 간이임상시험 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예를 참조하여 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 발효 로즈힙 오일은 로즈힙 오일을 리조푸스 오리제(Rhizopus oryzae), 버크올데리아 멀티보란(Burkholderia multivorans), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescence), 칸디다 루고사(Candida rugosa)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물 유래의 효소농축액으로 발효시킨 것임을 특징으로 한다.

로즈힙 오일은 세계 여러 지역에서 자라는 로즈힙(rosa canina)의 빨간 열매에서 추출한 식물성 기름으로, 성상은 미황색 액상이다. 프로비타민 A(provitamin A; 대부분 베타-카로틴)와, 레티놀산(retinoic acid)을 함유하고 있고 필수 지방산(essential fatty acids; 오메가-6와 오메가-3)이 풍부하다. 로즈힙 오일은 피부에 빠른 흡수를 통해 수분을 보충하고, 막을 형성하여 건조화를 막아주며 피부결을 부드럽게 하여 다양한 화장품의 원료로 사용된다. 피부염, 여드름, 습진 등의 피부질환 및 태양에 입은 화상 피부의 개선, 피부 갈라짐 현상 완화 등에 사용한다. 로즈힙 오일 자체도 화장품의 원료가 되고, 필수 지방산 등이 풍부하기는 하나, 본 발명에 따라 리조푸스 오리제, 버크올데리아 멀티보란, 슈도모나스 플루오레센스, 칸디다 루고사로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물, 특히 리조푸스 속 미생물을 사용한 발효를 통하여 유리 필수 불포화지방산 함량을 증대시키고, 결합조직 중에 존재하는 콜라겐이나 엘라스틴 등과 같이 피부의 탄력 유지 및 주름 방지 등에 중요한 역할을 하는 단백질을 분해하는 효소인 콜라게나아제 및 엘라스타아제의 저해 활성을 높여 주름 개선 효과를 극대화시킬 수 있음이 본 발명자들에 의해 확인되어 본 발명이 완성되기에 이르렀다.

리조푸스 오리제(Rhizopus oryzae)는 리조푸스 속(genus Rhizopus) 미생물의 일종으로, 이는 거미줄곰팡이, 곰팡이 등과 함께 접합균류에 속한다. 전분당화력이 강하고, 근소량이지만 알코올 발효력, 단백질 분해력이 있으며, 젖산, 푸마르산 등 유기산 생성능도 강하기 때문에 발효공업에 이용하는 종류도 많다. 예를 들어, 중국술의 양조나 동남아시아의 미(米)주 제조에 뮤코(Mucor) 속처럼 이용한다. R. delemar, R. japonicus는 알코올 제조용 아밀로균으로 중요하다. R. nigricans는 복숭아, 딸기 등의 과실이나 곡류, 빵에 잘 발생하고 고구마 연부병의 원인도 되지만 푸말산 생성능이 강한 것으로도 알려져 있다.

버크올데리아 멀티보란(Burkholderia multivorans)은 버크올데리아 속 미생물의 일종으로, 버크올데리아 속은 프로테오박테리아의 β-아문이며, 다양한 생태학적 환경에서 서식하는 40 종 이상을 포함한다(문헌[Compant et al., 2008]). 버크올데리아 속의 세균 종은 토양 및 근권에 아주 흔한 유기체이다(문헌[Coenye and Vandamme, 2003]; [Parke and Gurian-Sherman, 2001]). 전통적으로, 이들은 식물 병원체, 비. 세파시아(B. cepacia)로 알려졌으며, 양파에서 질환을 야기하는 병원체로서 첫 번째로 발견 및 확인되었다(문헌[Burkholder, 1950]). 다수의 버크올데리아 종은 그들의 식물 숙주와의 이로운 상호작용을 발달시켰다(예를 들면, 문헌[Cabballero-Mellado et al., 2004], [Chen et al., 2007]을 참조함). 일부 버크올데리아 종은 또한 기회감염 인간 병원체인 것으로 밝혀졌다(예를 들면, 문헌[Cheng and Currie, 2005] 및 [Nierman et al., 2004]을 참조함). 추가로, 일부 버크올데리아 종은 생물적 방제 생성물로서 잠재력을 갖는 것으로 밝혀졌다(예를 들면, 문헌[Burkhead et al., 1994]; [Knudsen et al., 1987]; [Jansiewicz et al., 1988]; Gouge et al., 미국 특허 출원 제2003/0082147호; Parke et al., 미국 특허 제6,077,505호; Casida et al., 미국 특허 제6,689,357호; Jeddeloh et al., WO2001055398; Zhang et al., 미국 특허 제7,141,407호를 참조함). 이 속의 일부 종은 오염된 토양 또는 지하수의 오염 물질을 제거하기 위한 생물적 환경정화에 효과적이었다(예를 들면, 문헌[Leahy et al. 1996]을 참조함). 추가로, 일부 버크올데리아 종은 단백질분해, 지질분해 및 용혈 활성을 갖는 다양한 세포외 효소, 및 독소, 항생물질, 및 철결합체를 분비하는 것으로 밝혀졌다(예를 들면, 문헌 [Ludovic et al., 2007]; [Nagamatsu, 2001]을 참조함).

슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescence)는 토양, 물 및 식물과 동물조직의 표면에서 일반적으로 얻을 수 있는 부패 박테리아이다. 인간이 소비하는 일반적인 식물의 표면의 슈도모나스 플루오레센스의 흔한 상태는 이 세균이 인간에 의해 많이 소비된다는 것을 뒷받침한다. 게다가, 광범위한 병원성 및 독성의 연구는 슈도모나스 플루오레센스의 안정성을 입증한다. 산업적 이용가능성으로 본 슈도모나스 플루오레센스의 안정성 또한 GRAS (generallyrecognized-as safe) α-아밀라아제(Landry et al, Regul Toxicol Pharmacol 37:149-68, 2003) 및 여러 EPA-등록의 생물 농약을 생산하는 세포능력으로 입증할 수 있다(Chew et al, Wiley-VCH, Weinheim, 2005). 슈도모나스 플루오레센스는 내열성 리파아제 및 프로테아제를 생산한다(Frank et al, p. 101-116. In M. P. B. Doyle, L. R.; Montville, T. J. (ed.), Food microbiology: fundamentals and frontiers. ASM Press, 1997). 이들 효소는 점액 생산 및 단백질 응고를 통해 우유를 상하게 만들며, 쓴맛, 카제인 파괴 및 우유의 끈적함을 일으킨다(Jay et al, p. 13-37. In J. M., M. J. Jay, Loessner, and D. A. Golden (ed.), Modern Food Microbiology. Aspen Publishers, Gaithersburg MD, 2000, Ray et al, Spoilage of Specific food groups., 3rd ed. CRC Press, Boca Raton, FL, 1996). 이들 부작용과 대조적으로, 슈도모나스 플루오레슨스는 균주의 다양한 범위를 갖는 외래 단백질의 잠재적인 발현주이다. 발효동안 아세테이트가 축적되지 않기 때문에, 특별히 높은 세포 밀도의 발효에 좋다. 따라서 이 그람음성 저온성(psychrotropic) 박테리아는 약학 및 산업적 단백질을 생산할 수 있는 PMF(protein manufacturing factory)로서 응용될 수 있다.

칸디다 루고사(Candida rugosa)는 칸디다 속의 미생물의 일종이며, 칸디다 (Candida)는 진균류의 한 속으로서, 칸디다병(candidiasis)의 병원균으로 알려져 있는 효모의 일종이다. 칸디다 루고사(Candida rugosa)는 40℃ 이상에서도 생장할 수 있는 고온 효모로서, 섬유소, 녹말 및 포도당을 분해 발효하는 능력이 있다. 다른 효모와 비교해 보았을 때 고온에서 매우 빨리 자라며 질산염 등을 이용하여 다양한 탄수화물을 발효시키는 것으로 알려져 있다. 건강에 유해할 수 있는 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 등의 다른 칸디다 속의 효모와 달리 건강 및 환경에 전혀 무해한 것으로 알려져 있으며, 따라서 초콜릿, 빵, 치즈 등의 식품생산에 이용되고 있다. 이는 국제생물자원센터(ATCC)에서 생물안전등급(biosafety level) 1로 분류한 것으로 건강 및 환경에 유해하지 않는 균주로 되어 있다.

본 발명에서는 리조푸스 오리제(Rhizopus oryzae), 버크올데리아 멀티보란(Burkholderia multivorans), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescence), 칸디다 루고사(Candida rugosa)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물 유래의 효소농축액, 특히 리조푸스 속, 특히 리조푸스 오리제 유래의 효소농축액을 사용하여 로즈힙 오일을 발효시킴으로써 유리 필수 불포화지방산인 올레산(OA: Oleic acid), 리놀레산(LA: Linoleic acid), 감마-리놀렌산(GLA: γ-Linolenic acid), 알파-리놀렌산(ALA: α-Linolenic acid)을 고함량으로 포함하며, 특히 콜라게나아제 및 엘라스타아제의 저해 활성을 높여 주름 개선 효과가 뛰어난 화장료 조성물의 제조에 특히 유용한 발효 로즈힙 오일을 제공하는 점에 특징이 있는 것이다.

미생물 유래의 효소농축액은 리조푸스 오리제(Rhizopus oryzae), 버크올데리아 멀티보란(Burkholderia multivorans), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescence), 칸디다 루고사(Candida rugosa)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물을 배지에서 배양시킨 후, 원심분리로 균체를 침강시켜 회수되는 상등액을 염석시켜 수득되는 것일 수 있다. 배지는 배양되어야 할 미생물에 따라 달라질 수 있으며, 배양하고자 하는 미생물의 배양에 적절한 것은 어느 것이나 가능하며, 하기 실시예에서 상기 미생물들 각각에 대하여 적절한 배지의 예들을 설명하였으며, 이는 단지 설명을 위한 것이고, 본 발명을 제한하는 것으로 이해되어서는 안될 것이다. 미생물을 배지에서 배양시킨 후, 농축시켜 효소농축액을 수득하는 것은 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 공지된 것으로 이해될 수 있으며, 예를 들어, 미생물을 배지에서 배양시킨 후, 원심분리로 균체를 침강시켜 회수되는 상등액을 염석시켜 효소농축액을 수득할 수 있다.

로즈힙 오일의 발효는 미생물 유래의 효소농축액 : 로즈힙 오일을 50 내지 70중량부 : 30 내지 50중량부의 비율로 혼합하고, 50 내지 70시간 동안 수행되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에 따르면 발효 로즈힙 오일 유효성분으로 포함하는 항주름용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 항주름용 화장료 조성물에 있어서, 상기 화장료 조성물은 발효 로즈힙 오일을 바람직하게는 1 내지 100중량%로 함유할 수 있고, 보다 바람직하게는 5 내지 50중량%, 가장 바람직하게는 10 내지 30중량%로 함유할 수 있다.

상기 유효량을 기준으로, 본 발명은 발효 로즈힙 오일 그 자체 또는 화장품학적으로 허용된 담체를 혼합한 조성물을 기능성 성분으로 포함하는 화장료 또는 화장품을 제공하는데, 상기 화장료 또는 화장품은 화장수, 영양로션, 영양크림, 마사지 크림, 팩 및 영양 에센스로 이루어진 군에서 선택된 형태로 제조되어 사용될 수 있다. 이때, 상술한 형태의 화장품 제조방법과 담체는 당업자에게 자명한 사항으로 구체적인 제조방법의 기재는 생략하기로 한다.

이하에서 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예들이 기술되어질 것이다.

이하의 실시예들은 본 발명을 예증하기 위한 것으로서 본 발명의 범위를 국한시키는 것으로 이해되어져서는 안될 것이다.

제조예 1: 리조푸스 속( genus Rhizopus ) 미생물 유래의 효소농축액의 제조

로즈힙 오일을 발효하기 위하여 리조푸스 속 미생물로서 리조푸스 오리제(Rhizopus oryzae)를 배지에서 먼저 배양시켰다. 사용된 배지는 2중량% 올리브오일, 4중량% 감자전분, 1중량% 덱스트로스 및 잔량으로서 멸균수로 조성되었다. 배양조건은 pH 6.0, 온도 28℃이었고, 배양은 120시간 동안 수행되었으며, 미생물 배양이 종료되면 8000 rpm으로 원심분리 하여 미생물 균체를 가라앉히고 상등액만 회수한 다음, 여기에 70% 황산암모늄(ammonium sulfate)으로 4℃ 조건에서 처리하여 리파아제를 침전시켰다. 그 후에 4℃, 12000 rpm의 조건에서 30분간 원심 분리하여 상등액을 제거한 후, 침전물을 0.05 M 인산 완충용액 (pH 7.0)에 녹인 후, 투석막을 이용하여 4℃ 조건에서 농축시켜 리파아제가 풍부한 효소농축액을 제조하였다.

실시예 1 내지 5:

로즈힙 오일의 온도를 37℃로 설정하고, 효소농축액을 pH 7.0의 인산염 완충용액(Sodium phosphate buffer, 50 mM)에 투석한 후 서로 섞어 사용하였다. 즉, 상기 제조예 1의 효소농축액과 오일을 하기 표 1의 비율로 혼합한 후, 믹서기에 10분간 블렌딩한 다음, 다시 30분 동안 초음파 처리하여 물리적 유화과정을 마친 후, 300 rpm, 37℃에서 72시간 동안 발효시켰다. 발효를 마친 오일은 10,000 rpm으로 20분간 원심분리 한 후, 발효 오일과 효소 잔여물을 분리하고 한외 여과하여 발효 로즈힙 오일을 수득하고, 발효 로즈힙 오일 중의 유리 필수 불포화지방산 함량을 측정하였으며, 그 결과를 역시 하기 표 1에 나타내었다.

유리 필수 불포화지방산 함량은 HPLC를 이용하여 측정하였다. 이때 각각의 유리 필수 불포화지방산의 함량을 정량할 때는 각 지방산에 대한 표준시약을 구하여 HPLC로 표준곡선을 먼저 구하고, 분석 대상 오일을 분석한 후, 이 표준곡선과 비교하여 정량하였다. 사용한 HPLC 컬럼은 (C18, 250 × 4.6 ㎜ ID, Phenomenex, USA)를 사용하였고 이동상(mobile phase)으로는 아세토니트릴 중의 0.005% 트리플루오로아세트산 : 물 중의 0.005% 트리플루오로아세트산을 부피비로 8 : 2로 섞어 사용하였으며, 유속은 1.0 ㎖/분, 시료주입량은 0.01 ㎖로 하였으며, 210 ㎚ 파장의 자외선으로 측정하였다. 이동상의 기울기 조건으로는 20 : 80 (v/v)로 시작하여 30분간 유지시킨 후, 극성을 높여가며 지방산들을 분석하였다.

실험 결과, 실시예 4와 같이 효소농축액과 오일의 중량비가 60 : 40에서 가장 높은 유리 필수 불포화지방산 생산 수율을 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시예 6 내지 10:

효소농축액에 의한 최적의 발효 시간 조건을 설정하기 위해, 실시예 4와 같이 효소농축액 60중량% 대 로즈힙 오일 40중량%의 비율로 혼합하고, 발효시간을 달리하면서 발효시킨 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 수행하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

실험결과, 발효 시간이 길어질수록 높은 유리 필수불포화지방산 생산 수율을 보였으나, 60시간 이후에는 유리 필수 불포화지방산의 생산 수율 증가율의 변화가 거의 없는 경향을 보였으며, 따라서 유리 필수 불포화지방산 생산의 경제적인 면과 효율을 고려하여 발효 시간은 60시간(실시예 8)이 적당하다는 결론을 얻을 수 있었다.

비교예 1 내지 3:

로즈힙 오일 대신 올리브 오일(비교예 1), 동백 오일(비교예 2) 및 모링가 오일(비교예 3)을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 8과 동일하게 수행하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

비교예 4:

로즈힙 오일을 발효하지 않고 그대로 유리 필수 불포화지방산 함량을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

상기 표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 발효되지 않은 오일에서는 유리 필수 불포화지방산이 검출되지 않았고, 발효된 오일에서만 유리 필수 불포화지방산들을 검출할 수 있었으며, 이들 중 발효 로즈힙 오일에서 유리 필수 불포화지방산 중 올레산(OA), 알파-리놀렌산(ALA) 그리고 감마-리놀렌산(GLA)의 함량이 가장 높은 것을 알 수 있다.

실시예 11 내지 13 및 비교예 5:

다른 균주 유래의 발효농축액을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 8과 동일하게 수행하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 균주와 배양 배지만 달리하는 것을 제외하고는 제조예 1과 동일하게 수행하여 발효농축액을 수득하였다.

발효 미생물들로서 버크올데리아 멀티보란(Burkholderia multivorans: 실시예 11)은 1중량% 펩톤(Peptone), 0.5중량% 효모 추출물(Yeast extract). 0.02중량% 황산마그네슘, 0.1중량% 인산칼륨(Potassium phosphate dibasic), 1중량% 올리브 오일(Olive oil)의 조성을 갖는 배지를 사용하였고, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescence: 실시예 12)는 영양배지(Nutrient broth: 수육 또는 어육의 추출액을 일반적으로 사용하는 세균배지의 일종으로, 주로 부생 유기영양의 세균배양에 사용하며, 보통 시판되는 스프용 또는 특히 세균학용 추출액 0.3중량%에 펩톤 0.5중량%, 경우에 따라서는 0.5중량% 효모 침출물, 0.8중량% 식염 등을 첨가하여 pH 7 정도로 조정한 것으로서, 기본배지로 사용됨)에 1중량% 올리브 오일(Olive oil)을 사용하였고, 칸디다 루고사(Candida rugosa: 실시예 13)는 배지로서 YMB(효모 추출물 1.5g, 맥아 추출물 1.5g, 펩톤 2.5g, 덱스트로즈 5.0g 및 증류수 500㎖로 조성되는 배지)에 올리브 오일을 상기 배지 총량의 1중량%로 첨가한 것을 사용하였다. 슈도지마 속(Pseudozyma sp .: 비교예 5)의 배지는 0.01중량% 글루코오즈, 0.1중량% 올리브 오일, 0.003중량% 효모 추출물, 0.003중량% 맥아 추출물, 0.003중량% 펩톤, 0.003중량% 콩가루, 0.02중량% 황산암모늄, 0.001중량% 인산칼륨, 0.005중량% 황산마그네슘, 0.001중량% 염화칼슘 및 0.0001중량% 염화나트륨의 조성을 사용하였다. 슈도지마 속 미생물로는 슈도지마 속(Pseudozyma sp.) SY16(KCTC 8950P)을 분양받아 사용하였다.

실험 결과, 상기 표 4에서 볼 수 있듯이, 리조푸스 오리제를 이용하여 로즈힙 오일을 발효하였을 때 유리 필수 불포화지방산의 함량이 가장 높았고, 칸디다 루고사, 슈도모나스 플루오레센스, 버크올데리아 멀티보란 순서로 낮아지고, 슈도지마 속이 가장 낮은 것을 확인하였다.

실험예 1: 발효 로즈힙 오일의 콜라게나아제 저해 활성 측정

콜라게나아제 저해 활성 측정은 문헌 WuE 및 Heindrich HG (WuE, Heidrich HG. 1963. Zur Quantitaiven bestimmung der collagenase. Z. Physiol . Chem . 333: 149-151.) 기재의 방법을 변형하여 측정하였다. 반응구는 0.1 M Tris-HCl 완충제(pH 7.5)에 5 mM CaCl₂를 첨가하여 0.3 ㎎/㎖의 4-페닐 아조벤질옥시카르보닐-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg (Simga, USA)를 녹인 기질액 250 ㎕ 및 시료용액 100 ㎕의 혼합액에 0.2 ㎎/㎖의 콜라게나아제(Sigma, USA) 150 ㎕를 첨가하여 37℃에서 30분간 진탕 배양 한 후, 25 mM 시트르산 500 ㎕을 넣어 반응을 정지시켰다. 그리고 에틸아세테이트 1.5 ㎖ 첨가 후, 실온에서 10분간 방치한 후, 320 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 콜라게나아제 저해 활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. 콜라게나아제 저해율(%)은 하기 수학식 1에 따라 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 5 및 도 1 및 도 2에 나타내었다.

상기 식에서, IR은 저해율이고, OA_a는 시료 첨가군의 흡광도이고, OA_b는 시료 무첨가군의 흡광도이다.

실험 결과, 상기 표 5 및 도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 리조푸스 오리제로 발효시킨 발효 로즈힙 오일(실시예 8)이 콜라게나아제 저해율(%) 71.71%로 가장 높았고, 기타 칸디다 루고사, 슈도모나스 플루오레센스, 버크올데리아 멀티보란의 순서로 낮아지고, 슈도지마 속이 가장 낮음을 확인하였다.

실험예 2: 발효 로즈힙 오일의 엘라스타아제 저해 활성 측정

엘라스타아제 저해 활성 측정은 Can nell (Cannell RJP, Kellan SJ, Owsianks AM, Walker JM (1988) Results of a large scale screen of microalage for the production of protease inhibitiors. Planta Media 54:10-14) 등의 방법을 변형하여 측정하였다. 기질로서 N-숙시닐-(L-Ala)₃-p-니트로아닐리드(Sigma, USA)를 사용하여 25℃에서 10분간 기질로부터 생성되는 p-니트로아닐리드의 생성량을 410 ㎚에서 측정하였다. 0.2 M Tris-HCl 완충제(pH 8.0) 250 ㎕에 시료 20 ㎕를 가한 다음, 기질 2.2 mM N-숙시닐-(L-Ala)₃-p-니트로아닐리드를 20 ㎕ 가하여 25℃에서 10분간 진탕 배양한 다음, 0.03 단위의 엘라스타아제를 10 ㎕ 첨가하였다. 반응 혼합물을 다시 25℃에서 10분 간 진탕 배양 한 후, 냉침으로 반응을 정지시키고, 410 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 엘라스타아제 저해 활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. 엘라스타아제 저해율(%)은 상기 수학식 1에 따라 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 6 및 도 3 및 도 4에 나타내었다.

실험 결과, 상기 표 6 및 도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, 리조푸스 오리제로 발효시킨 발효 로즈힙 오일(실시예 8)이 엘라스타아제 저해율(%) 51.49%로 가장 높았고, 기타 칸디다 루고사, 슈도모나스 플루오레센스, 버크올데리아 멀티보란의 순서로 낮아지고, 슈도지마 속이 가장 낮음을 확인하였다.

실험예 3: 관능 시험을 통한 발효 로즈힙 오일의 피부 보습력 및 탄력도 측정

본 발명에 따른 발효 로즈힙 오일(실시예 8)을 이용하여 피부 보습력과 탄력도를 알아보고자 관능 시험을 실시하였다.

피험자는 남녀노소 불문 10명을 대상으로 하여 기초 화장품만 바른 상태에서 보습력과 탄력도를 측정하고 난 뒤에 발효 로즈힙 오일을 볼에 1 내지 2 방울 정도 떨어뜨려 바른 뒤, 바른 직후와 시간 대 별로 최대 24시간까지 피부측정기인 'Aramo TS'를 사용하여 보습력과 탄력도를 측정하였다. 본 관능 시험에 사용된 피부측정기인 아라모티에스는 피부 표면의 수분, 탄력을 자동 분석하는 피부 진단 시스템이다. 수분 측정은 피부 표면의 정전용량을 이용해 수분값을 측정하며, 탄력 측정은 피부를 흡입과 흡입시간의 지속에 따른 피부 변화와 복원력을 기본 원리로 하여 측정하는 방식으로 수분과 탄력 모두 값이 높을수록 좋은 것을 의미한다. 종합적인 시험 결과는 하기 표 7(보습력) 및 표 8(탄력도)로 나타내었다.

관능 시험 결과, 상기 표 7 및 표 8 그리고 도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 피험자 한 명에 대하여는 보습력과 탄력도가 조금 떨어지는 경향을 보였으나, 비교적 단시간 이내 임에도 불구하고 다른 피험자들에 대하여는 대부분 보습력이나 탄력도가 약간씩 증가하거나 적어도 일정 시간 동안 유지되는 경향을 보임을 확인할 수 있었다.

이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

(도면 부호 없음)

Claims (4)

1. 리조푸스 오리제(Rhizopus oryzae)를 배지에서 배양시킨 후, 원심분리로 균체를 침강시켜 회수되는 상등액을 염석시켜 수득되는 리조푸스 오리제(Rhizopus oryzae) 유래의 효소농축액으로 로즈힙 오일을 발효시킨 것으로 감마-리놀렌산을 6중량%이상 포함하는 것을 특징으로 하는 발효 로즈힙 오일.
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서,
   발효는 리조푸스 오리제(Rhizopus oryzae) 유래의 효소농축액 : 로즈힙 오일을 50 내지 70중량부 : 30 내지 50중량부의 비율로 혼합하고, 50 내지 70시간 동안 수행됨을 특징으로 하는 발효 로즈힙 오일.
4. 제 1 항 또는 제 3 항에 따른 발효 로즈힙 오일을 유효성분으로 포함하는 항주름용 화장료 조성물.

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