KR102060056B1

KR102060056B1 - 유산균류 및 테아닌을 포함하는 스트레스 개선용 조성물

Info

Publication number: KR102060056B1
Application number: KR1020180064069A
Authority: KR
Inventors: 신임철; 윤준호
Original assignee: 메타볼라이트코리아 주식회사
Priority date: 2018-06-04
Filing date: 2018-06-04
Publication date: 2019-12-30
Also published as: KR20190138030A

Abstract

본 명세서에는 유산균류 및 테아닌을 포함하는 스트레스 개선용 조성물이 개시된다. 본 발명의 일 측면인 조성물은, 비장세포 증식, 및/또는 코르티코스테론 분비 억제능이 우수하여, 스트레스로 인한 신체적 증상 및 심리적 증상의 개선 효과가 우수하다. 또한, 상기 조성물은, 천연물을 사용하므로, 인체 동성이 없어 화장료, 식품 또는 약학 조성물로 활용도가 높다.

Description

유산균류 및 테아닌을 포함하는 스트레스 개선용 조성물{Composition for improve stress comprising lactic acid bacteria and theanine }

본 명세서에는 유산균류 및 테아닌을 포함하는 스트레스 개선용 조성물이 개시된다.

스트레스의 어원은 'Strictus : 팽팽한 혹은 좁은' 또는 'Stringere : 팽팽하다' 이며 심리학에서 스트레스 는 스트레스 요인에 대항하기 위한 심신의 변화과정을 뜻하고 우리말로는 정신압박 이라고도 한다.

스트레스는 일상에 만연되어 있는 요소로 유발되며, 거의 모든 질환과 의학적 질병의 발생에 기여하는 것으로 알려져 있다.

구체적으로, 스트레스를 유발하는 원인과 그로 인한 인체 내 생리적 변화는 다양하지만, 공통적으로 뇌하수체-부신계를 자극하여 스트레스 호르몬이 분비되고, 이러한 스트레스가 지속되면 인체의 기능이 저하되어 신경 과민, 두통, 소화 불량 등의 증상을 유발하며, 이것이 위십이지장궤양, 고혈압, 과민성대장염, 협심증 등의 2차 질병으로 발전된다.

지금까지 스트레스를 치유하기 위하여 항우울제, 항불안제 등의 인공 화합물을 포함하는 의약품을 사용하는 약물요법이 이용되고 있지만, 이러한 약물요법은 장기간 사용시 약물에 대한 내성 및 부작용 위험이 있어 지속적 이용이 불가능하므로, 부작용이 없고, 지속적으로 복용할 수 있는 방안에 대한 니즈가 높다.

이에 다양한 식물 추출물 등을 활용하는 방법이 계속해서 연구되고 있지만, 아직까지 만족할만한 효과를 얻은 연구 결과는 없는 실정이다.

한국공개특허 제10-2014-0043544호

일 측면에서, 본 발명의 목적은, 스트레스를 효과적으로 개선할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.

일 측면에서, 본 발명의 목적은, 천연물을 사용하여 인체에 대한 독성이 없는 스트레스 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

일 측면에서, 본 발명의 목적은, 유산균과 테아닌 각각이 갖는 효능을 극대화하는 것이다.

일 측면에서, 본 발명의 목적은, 유산균과 테아닌의 조합으로부터 극대화된 스트레스 완화 효과를 얻는 것이다.

일 측면에서, 본 발명의 목적은, 스트레스로 인해 유발된 신체적 증상 및 심리적 증상을 완화 또는 개선시키는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 일 측면에서, 유산균류; 및 테아닌, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 프로드럭, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 포함하는, 스트레스 개선용 조성물을 제공한다.

또한, 일 측면에서, 본 발명은, 유산균류 및 테아닌을 포함하는 스트레스 개선용 조성물; 및 지시서를 포함하며, 상기 지시서는, 대상에 유산균류는 10⁸~10¹⁰CFU/ day로 투여하고, 테아닌은 5~500mg/kg/day로 투여하는 내용을 포함하는, 스트레스 개선용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 측면인 조성물은, 비장세포 증식 촉진능과 코르티코스테론 분비 억제능이 우수하여, 스트레스로 인한 신체적 증상 및 심리적 증상의 개선 효과가 우수하다. 또한, 상기 조성물은, 천연물을 사용하므로, 인체 독성이 없어 화장료, 식품 또는 약학 조성물로 활용도가 높다.

도 1 내지 도 3은 스트레스 유도 마우스의 혈중 코르티코스테론 농도 변화를 검측한 결과에 대한 것으로, 도 1은 L-테아닌, 락토바실러스 헬베티쿠스, 및 비피도박테리움 롱검을 각각 투여한 경우, 도 2와 3은 L-테아닌과 락토바실러스 헬베티쿠스, 및 비피도박테리움 롱검을 병용한 경우의 결과를 나타낸다.
도 1 내지 도 3에서, 락토바실러스 헬베티쿠스는 R52로 표시하고, 비피도박테리움 롱검은 R175로 표시하였다.
도 4 및 도 5는 스트레스 유도 마우스의 혈중 사이토카인 변화를 검측한 결과에 대한 것으로, 도 4는 IFN-γ 농도 변화 측정 결과, 도 5는 IL-4 농도 변화 측정 결과를 나타낸다.
도 6은, L-테아닌과 유산균류(락토바실러스 헬베티쿠스, 및 비피도박테리움 롱검)을 각각 투여한 경우, 또는 병용 투여한 경우 십자형 미로 실험 결과를 보이는 것이다.

이하, 첨부한 도면들을 참조하여, 본 출원의 실시예들을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 본 출원에 개시된 기술은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 출원의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 또한, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 출원의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 출원의 사상을 다양한 다른 형태로 구현할 수 있을 것이다.

본 명세서에서 "약학적으로 허용 가능"이란 통상의 의약적 복용량(medicinal dosage)으로 이용할 때 상당한 독성 효과를 피함으로써, 동물, 더 구체적으로는 인간에게 사용할 수 있다는 정부 또는 이에 준하는 규제 기구의 승인을 받을 수 있거나 승인 받거나, 또는 약전에 열거되거나 기타 일반적인 약전으로 인지되는 것을 의미한다.본 명세서에서 "약학적으로 허용 가능한 염"은 약학적으로 허용 가능하고 모 화합물(parent compound)의 바람직한 약리 활성을 갖는 본 발명의 일측면에 따른 염을 의미한다. 상기 염은 (1) 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산으로 형성되거나; 또는 아세트산, 프로파이온산, 헥사노산, 사이클로펜테인프로피온산, 글라이콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-하이드록시벤조일) 벤조산, 신남산, 만델산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 1,2-에테인-디설폰산, 2-하이드록시에테인설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캄퍼설폰산, 4-메틸바이사이클로 [2,2,2]-oct-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로파이온산, 트리메틸아세트산, tert-부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 하이드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산과 같은 유기산으로 형성되는 산 부가염(acid addition salt); 또는 (2) 모 화합물에 존재하는 산성 프로톤이 치환될 때 형성되는 염을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 "프로드럭(prodrug)"은 어떤 약물을 화학적으로 변화시켜 물리적, 화학적 성질을 조절한 약물을 의미하며, 그 자체는 생리 활성을 나타내지 않지만 투여 후 체내에서 화학적 혹은 효소의 작용에 의해 원래의 약물로 바뀌어 약효를 발휘할 수 있다.

본 명세서에서 "수화물(hydrate)"은 물이 결합되어 있는 화합물을 의미하며, 물과 화합물 사이에 화학적인 결합력이 없는 내포 화합물을 포함하는 광범위한 개념이다. 본 명세서에서 "용매화물"은 용질의 분자나 이온과 용매의 분자나 이온 사이에 생긴 고차의 화합물을 의미한다.

일 측면에서, 본 발명은 유산균류; 및 테아닌, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 프로드럭, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 포함하는, 스트레스 개선용 조성물이다.

상기 테아닌(theanine)은, 아미노산의 일종으로, 바람직하게는, L-γ-글루타밀에틸아미드(glutamylethylamide) 및 N⁵-에틸-L-글루타민(N⁵-ethyl-L-glutamine)으로도 알려져 있는 L-테아닌 포함할 수 있다.

상기 유산균은, 유산균 자체, 그 파쇄물, 그 배양산물, 또는 그 추출물을 포함하는 것일 수 있다.

일 측면에서, 상기 유산균류는, 락토바실러스속 균주; 및 비피도박테리움속 균주를 포함할 수 있다.

상기 락토바실러스속 균주는, 제한되지 않고, 예컨대, 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플라타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 또는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 락토바실러스 헬베티쿠스이다.

또한, 상기 비피도박테리움속 균주는, 제한되지 않고, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 브레비스(Bifidobacterium brevis), 비피도박테리움 인팬티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 또는, 비피도박테리움 비피듐(Bifidobacterium bifidum)을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 비피도박테리움 롱검이다.

상기 락토바실러스속 균주 및 비피도박테리움속 균주는 1:1 내지 20:1의 비율로 포함될 수 있다. 상기 락토바실러스속 균주 및 비피도박테리움속 균주는, 바람직하게 1:3 내지 1:17, 더욱 바람직하게 5:1 내지 16:1, 더욱 바람직하게 5:1 내지 13:1, 더욱 바람직하게 7:1 내지 13:1, 더욱 바람직하게 8:1 내지 11:1의 비율로 포함될 수 있다. 상기 락토바실러스속 균주와 비피도박테리움속 균주의 비율은, 예컨대 단위부피당 콜로니 수(CFU/ml)의 비율로 표현될 수 있다.

상기 락토바실러스속 균주와, 비피도박테리움속 균주가 상기 비율로 포함될 때 양자로부터 극대화된 효과를 얻을 수 있다.

상기 조성물로부터 얻을 수 있는 효과는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다:

i) 비장세포 증식; 및 ii) 코르티코스테론(corticosterone)의 분비 억제.

상기 조성물은 스트레스로 인한 신체적 증상 및 심리적 증상 중 하나 이상을 개선하는 것일 수 있다.

상기 스트레스로 인한 신체적 증상은, 소화기 질환, 신경계 질환, 비뇨기 질환, 심혈관 질환 및 피부 질환으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 스트레스로 인해 유발되는 신체 질환이라면 종류 여부를 불문하고 포함될 수 있다.

상기 소화기 질환은, 예컨대, 과민성 대장염, 소화불량, 위염, 위경련, 위십이지장궤양, 변비 등을 포함할 수 있고, 상기 신경계 질환은, 편두통을 포함할 수 있으며, 상기 비뇨기 질환은 발기부전, 불감증 등을 포함할 수 있다.

또한, 상기 심혈관 질환은, 고혈압, 저혈압, 협심증 등을 포함할 수 있으며, 상기피부 질환은 탈모, 두드러기 등을 포함할 수 있다.

또한, 상기 스트레스로 인한 심리적 증상은 우울증, 불안장애, 강박증, 불면증 및 신경과민으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일 측면에서, 상기 조성물은, 화장료 조성물, 식품 조성물 또는 약학적 조성물을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따른 화장료 조성물은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유하여 제형화될 수 있다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로서, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

또한, 화장료 조성물은 분체, 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다. 본 발명의 실시예들에 따른 화장료 조성물은 피부 개선 효과를 증가시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 더 함유할 수 있다.

또한, 상기 유효성분을 포함하는 다양한 형태의 식품 조성물, 예컨대, 식품 첨가제 또는 건강 기능성 식품으로 제공될 수 있다. 상기 유효성분을 포함하는 발효유, 치즈, 요구르트, 주스, 생균제제 및 건강식품 등으로 가공될 수 있으며, 그 외 다양한 식품 첨가제의 형태로 사용될 수 있다.

상기 건강 기능성 식품은 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분(기능성원료)을 사용하여 제조한 것으로, 인체의 정상적인 기능을 유지하거나 생리기능 활성화를 통하여 건강을 유지하고 개선하는 식품을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 식품 조성물은 상기 유효성분을 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 80중량%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 건강 식품용 조성물은 환제, 캅셀제, 정제, 과립제, 캬라멜제 또는 드링크제 등으로 제형화할 수 있다. 다른 구현예에서, 액제, 분말, 과립, 정제 또는 티백 등의 형태로 가공될 수도 있다.

상기 조성물은 본 발명의 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다. 예를 들어, 물성 개선을 위하여 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 무기염류, 유화제 및 합성 고분자 물질 등의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 그 외에도, 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당 및 해초 엑기스 등의 보조 성분을 더 포함할 수도 있다. 상기 성분들은 제형 또는 사용 목적에 따라서 당업자가 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 그 첨가량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 성분들의 첨가량은, 조성물 전체 중량을 기준으로, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 예를 들어 0.01중량% 내지 5중량% 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

조성물에 있어서, 약학 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 연질 또는 경질 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 약학 조성물의 유효 성분은 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이나, 하기 기재된 투여량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 관점에 따른 조성물은, 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 경피(trandermally), 정맥, 근육, 피하주사에 의해 투여될 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 상기 조성물; 및 지시서를 포함하며, 상기 지시서는, 유산균류는 10⁸~10¹⁰CFU/day로 투여하고, 테아닌은 5~500mg/kg/day로 투여하는 내용을 포함하는, 스트레스 개선용 키트이다.

본 명세서에서 "키트"는, 물품(article)을 의미할 수 있으며, 예컨대, 상기 키트 또는 물품은 화장품, 식품, 또는 약품을 포함할 수 있다.

상기 유산균류는, 바람직하게는 10⁸~0.8X10¹⁰CFU/day로 투여될 수 있고, 더욱 바람직하게는 2X10⁸~0.7X10¹⁰ 로 투여될 수 있다.

또한 상기 지시서는 유산균류는, 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus); 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)을 포함하고, 상기 락토바실러스 헬베티쿠스와 비피도박테리움 롱검은, 순서대로 5X10⁷~5X10⁹ CFU/day, 1X10⁷~1X10⁹ CFU/day로 투여하는 내용을 포함할 수 있다.

바람직하게, 상기 락토바실러스 헬베티쿠스와 비피도박테리움 롱검은, 순서대로 10⁸~5X10⁹ CFU/day, 2X10⁷~1X10⁹ CFU/day로 투여될 수 있으며, 더욱 바람직하게, 2X10⁸~5X10⁹ CFU/day, 2X10⁷~7X10⁸ CFU/day로 투여될 수 있다.

또한, 상기 테아닌의 투여량은, 바람직하게 10~450mg/kg/day, 더욱 바람직하게는 40~450 mg/kg/day, 더욱 바람직하게, 80~450 mg/kg/day일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실험예 1] 마우스 비장세포 증식능 평가

본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 R52 (Lactobacillus helveticus Rosell-52)을 MRS 액체배지 (Difco, USA)에서 37℃, 20시간 동안 배양하였다. 균체를 원심분리한 후 PBS로 2~3번 세척한 후 남아있는 배지성분을 제거하였다. 연속희석법 (serial dilution)의 과정을 거쳐 균수를 측정하여 균체의 농도가 1~5X10⁹ CFU/mL이 되도록 PBS에 희석한 후 시험에 사용하였다.

본 발명의 비피도박테리움 롱검 R175 (Bifidobacterium longum Rosell-175)을 BL 액체배지 (Difco, USA)에서 혐기조건 하에서 37℃, 20시간 동안 배양하였다. 균체를 원심분리한 후 PBS로 2~3번 세척한 후 남아있는 배지성분을 제거하였다. 연속희석법 (serial dilution)의 과정을 거쳐 균수를 측정하여 균체의 농도가 1~5X109 CFU/mL이 되도록 PBS에 희석한 후 시험에 사용하였다.

상기 균주들은, Lallemand Health Solutions Inc. (Mirabel QC, Canada)로부터 구입한 것을 사용하였다.

실험동물은 20g 전후의 6주령 암컷 마우스 (C57BL/6)을 사용하였으며, 명암주기 12시간, 온도 25±5℃, 습도60±10%의 조건하에서 사육하였다. 스트레스 유발을 위해 마우스는 50 mL튜브에 사료 및 음수 급여없이 17시간 억제스트레스를 유발시켰다 (Iwakabe K, Shimada M, Ohta A, Yahata T, Ohmi Y, Habu S, Nishimura T. 1998. The restraint stress drives a shift in Th1/Th2 balance toward Th2-dominant immunity in mice. Immuno Letter 62:39-43).

스트레스 유도 마우스의 비장을 무균적으로 적출하고 비장세포를 분리한 후 RPMI 1640배지에 10% FBS (fetal bovine serum)을 넣고, 이를 이용하여 1X10⁷ cell/mL로 현탁하여 96 well 플레이트에 분주하였다. 각 well에 락토바실러스 헬베티쿠스 R52 (Lactobacillus helveticus Rosell-52)및 비피도박테리움 롱검 R175 (Bifidobacterium longum Rosell-175)를 희석배수에 따라 10% FBS-RPMI 1640 배지액에 현탁시켜 well 당 20㎕씩 가하였다. 여기에 Concanavalin A (ConA；2㎍/ml) 또는 10% FBS-RPMI 1640 배지액을 20㎕ 가한 후 72시간동안 배양(37℃, 5% CO2)하였다. 비장세포의 증식정도는 생존세포의 효소작용에 의해 MTT 시약이 환원되어 생성되는 formazan의 양을 측정함으로써 평가하는 MTT assay를 이용하여 측정하였다. 즉, 배양 후 각 well에 MTT용액(5 mg/ml)을 50㎕ 씩 (250㎍/ml) 가하고 4시간 동안 배양한 후에 원심분리(400 rpm, 5 min, 4℃)하여 상등액을 제거하였다. Dimethyl sulfoxide (DMSO)원액을 well당 50㎕씩 가하고 10분 이내에 ELISA reader로 흡광도(570 nm)를 측정하였다.

스트레스유도 마우스의 비장세포는 정상 마우스에서 분리한 비장세포를 ConA로 자극한 경우 나타내는 증식능보다 30% 감소하는 경향을 나타내었다. 락토바실러스 헬베티쿠스 R52 및 비피도박테리움 롱검 R175의 비율에 따라 증식능 (+, 0~10; ++, 10~20; +++, 20~30; ++++, >30)을 평가하였다.

그 결과, 락토바실러스 헬베티쿠스와, 비피도박테리움 롱검을 약 3:1~15:1의 비율로 혼합하였을 때, 스트레스에 노출된 비장세포의 증식 효과가 우수함을 확인할 수 있었다(표 1).

	콜로니 형성 단위 (CFU)
R52:R175	1x10⁹ CFU	2x10⁹ CFU	3x10⁹ CFU	4x10⁹ CFU	5x10⁹ CFU
15:1	+	+	++	++	++
12:1	+	++	+++	+++	+++
9:1	++	+++	++++	++++	++++
6:1	+	+	++	++	++
3:1	+	+	+	+	+
1:0	-	-	-	+	+
0:1	-	-	+	+	+

[실험예 2] 스트레스 유도 마우스의 혈중 코르티코스테론 농도의 변화

실험동물은 20g 전후의 6주령 암컷 마우스 (C57BL/6)을 사용하였으며, 명암주기 12시간, 온도 25±5℃, 습도60±10%의 조건하에서 사육하였다. 비교예 1~6 및 실시예 1~4를 마우스 전용사료 (AIN-93 M diet, maintenance formulation, Korea)에 혼합하여 1주일간 급여하였다. 스트레스 유도는 50 mL튜브에 사료 및 음수 급여없이 17시간 동안 물리적으로 고정하여 스트레스를 유발하였다 (Iwakabe K, Shimada M, Ohta A, Yahata T, Ohmi Y, Habu S, Nishimura T. 1998. The restraint stress drives a shift in Th1/Th2 balance toward Th2-dominant immunity in mice. Immuno Letter 62:39-43).

마우스 용량은 마우스의 일일 평균사료섭취량 (2~3g)을 사람에 대한 용량으로의 환산하여 나타내었다.인간등가용량 (HED) 은 체표면적을 기준으로 animal dose (in mg/kg) = HED (human equivalent dose, in mg/kg, 60 kg 기준)/BSA-CF(body surface area dose conversion factor)의 계산식(Guidance for Industry and Reviewers - Estimating the Safe Starting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers: Table 3) Conversion of Animal Doses to Human Equivalent Doses (HED) Based on Body Surface Area 등 참조)으로 산출하였다.

스트레스 유도 후 마우스 혈액에서 혈중 코르티코스테론 농도를 ELISA kit (MP Biomedicals, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.

상기 실험에 사용된 조성물들의 조성과, 조성물을 이용한 실험 결과는 하기 표 2 및 표 3에 기재된 바와 같다.

	인간등가용량 (HED, mg/day)
	L-테아닌 (mg/day)	락토바실러스 헬베티쿠스 R52 (CFU/day)	비피도박테리움 롱검 R175 (CFU/day)
비교예 1	0	0	0
비교예 2	10	0	0
비교예 3	50	0	0
비교예 4	100	0	0
비교예 5	200	0	0
비교예 6	400	0	0
비교예 7	0	2.7X10⁹	0
비교예 8	0	0	0.3X10⁹
비교예 9	0	2.7X10⁹	0.3X10⁹
실시예1	10	2.7X10⁹	0.3X10⁹
실시예2	50	2.7X10⁹	0.3X10⁹
실시예3	100	2.7X10⁹	0.3X10⁹
실시예4	200	2.7X10⁹	0.3X10⁹
실시예5	400	2.7X10⁹	0.3X10⁹
실시예6	200	0.27 X10⁹	0.03 X10⁹
실시예7	200	0.9 X10⁹	0.1 X10⁹
실시예8	200	4.5 X10⁹	0.5 X10⁹

	Plasma corticosterone conc. (pg/mL, Mean±SD)
대조군	128.0±46.0
비교예 1	300.0±72.1
비교예 2	294.0±61.1
비교예 3	270.0±51.4
비교예 4	244.0±23.0
비교예 5	217.1±54.0
비교예 6	203.0±38.4
비교예 7	265.8±47.2
비교예 8	263.6±74.0
비교예 9	249.6±46.5
실시예 1	225.9±46.7
실시예 2	177.7±50.9
실시예 3	128.0±24.9
실시예 4	108.0±27.7
실시예 5	102.0±39.9
실시예 6	187.5±71.7
실시예 7	131.0±43.0
실시예 8	102.4±40.1

그 결과, 상기 표 3에서 볼 수 있듯이, L-테아닌와 유산균을 병용할 경우, L-테아닌 또는 유산균 각각을 사용할 경우에 비하여, 현저히 우수한 혈중 코르티코스테론 저감 효과가 있음을 알 수 있었고, 특히, 락토바실러스 헬베티쿠스와 비피도박테리움 롱검이 약 9:1로 포함될 경우 가장 우수한 코르티코스테론 저감 효과를 확인할 수 있었다.

[실험예 3] 스트레스 유도 마우스의 혈중 사이토카인 농도의 변화

스트레스 유도 마우스의 비장을 무균적으로 적출하고 비장세포를 분리한 후 RPMI 1640배지에 10% FBS (fetal bovine serum)을 넣고, 이를 이용하여 1X10⁷ cell/mL로 현탁하여 96 well 플레이트에 분주하였다. 각 well에 락토바실러스 헬버티쿠스 R52 및 비피도박테리움 롱검 R175를 희석배수에 따라 10% FBS-RPMI 1640 배지액에 현탁시켜 well 당 20㎕씩 가하였다. 여기에 Concanavalin A (ConA；2㎍/ml) 또는 10% FBS-RPMI 1640 배지액을 20㎕ 가한 후 72시간동안 배양 (37℃, 5% CO2)하였다. 배양 종료 후, 배양상층액에 존재하는 IFN-γ 및 IL-4의 양은 각 사이토카인에 대한 ELISA kit (BD Biosciences, USA)를 사용하여 분석하였다.

	Cytokine conc. (Mean±SD)
	IFN-γ (ng/mL)	IL-4 (pg/mL)
대조군	46.0±14.7	51.0±14.3
비교예 1	16.4±8.5	17.6±6.4
비교예 5	19.6±7.6	20.6±7.8
비교예 9	25.2±4.5	20.6±11.7
실시예 4	40.0±10.2	38.8±11.9

그 결과, L-테아닌과 유산균을 병용투여했을 경우에, 그렇지 않은 경우에 비하여 스트레스 유도 마우스의 사이토카인 분비량이 더 높음을 확인할 수 있었다(표 4 및 도 2 참조).

[실험예 4] 십자형 미로 검사 (Elevated plus-maze test)

본 발명에 따른 혼합물의 불안감소 또는 억제효과를 확인하기 위하여, 실험예 2의 결과를 바탕으로 L-테아닌 및 유산균 혼합물을 하기와 같이 십자형 높은 미로검사를 통하여 평가하였다.

실험동물은 20g 전후의 6주령 암컷 마우스 (C57BL/6)을 사용하였으며, 명암주기 12시간, 온도 25±5℃, 습도60±10%의 조건하에서 사육하였다. L-테아닌 및 유산균 혼합물은 마우스 전용사료 (AIN-93 M diet, maintenance formulation, Korea)에 혼합하여 4주일간 급여하였다. 이때 L-테아닌의 농도는 200 mg/day 용량, 락토바실러스 헬버티쿠스 R52는 2.7X10⁹ CFU/day 용량, 비피도박테리움 롱검 R175는 0.3X10⁹CFU/day 용량으로 투여하였다.

마우스에 시험물질의 급여를 종료한 후, 마우스를 십자로 시험장치의 중앙에 위치시켜 불안증을 유발하게 만든 후, 상기 장치위에서 마우스의 행동양상 변화를 관찰하여 혼합물의 불안감소 또는 억제를 평가하였다.

십자형 미로는 아크릴로 제작되며, 바닥으로부터 40cm 떨어진 곳에 십자형(+)의 미로가 구성된다. 상기 미로의 통로 4개 중 마주보는 2개의 통로는 개방(open arm) 되어 있고, 또 다른 마주보는 2개의 통로(closed arm)는 높이 20cm의 벽으로 둘러싸여 있다. 중앙의 플랫폼은 가로와 세로의 길이가 각각 8cm이며, 실험 시작 시 마우스를 중앙 플랫폼에 두고 5분 동안 미로를 자유롭게 탐색하도록 하였다. 그 후, 마우스가 개방된 통로(open arm)와 폐쇄된 통로(closed arm)에 머문 시간을 분석하였다. 양성 대조군은 행동약리 시험 전 30분전에 Diazepam을 2 mg/kg 용량으로 복강투여하였으며, 음성 대조군으로는 시험물질을 투여하지 않은 마우스를 사용하였다.

EPM은 흔히 불안 완화제나 불안유도 약물의 효과를 확인하는데 사용되는 모델로 쥐가 좁고 어두운 곳을 선호하는 습성을 이용한 것이다. 벽이 설치된 closed arm보다 벽이 없는 open arm에서 더 많은 불안을 느끼므로 불안이 많을수록 open arm에 머무는 시간이 짧아진다. 항불안 약물의 검색은 open arm에서 머문 시간의 연장 및 open arm으로의 진입 횟수의 증가로 평가되는데 이는 close arm 으로의 진입 횟수 및 머문 시간의 감소로 표현된다. 본 발명에서 EPM을 이용한 불안 실험동물 모델에서 L-테아닌 및 유산균 혼합물의 경우 open arm에 머문 시간 및 open arm으로의 진입 횟수가 대조군에 비하여 증가됨을 관찰할 수 있었다. L-테아닌 및 유산균 혼합물 단독 투여군에 비해 L-테아닌과 유산균 혼합물의 병용투여군에서 open arm에 머무르는 시간 및 진입횟수가 증가하였다.

이러한 시험결과로부터, 본 발명에 따라 L-테아닌과 유산균 혼합물(락토바실러스 헬버티쿠스 R52 및 비피도박테리움 롱검 R175의 혼합물)을 유효 성분으로 함유하는 조성물을 이용할 경우, 시험 동물의 불안증을 감소시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다(도 3).

Claims

락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)와 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)을 포함하는 유산균류; 및
L-테아닌, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물;
을 포함하는 스트레스 개선용 조성물; 및
지시서;를 포함하며,
상기 지시서는,
유산균류는 10⁸~10¹⁰CFU/day로 투여하고,
테아닌은 100~400mg/kg/day로 투여하는 내용을 포함하는, 스트레스 개선용 키트.
삭제
제1항에 있어서,
상기 조성물은,
스트레스로 인한, 신체적 증상; 및 심리적 증상 중 하나 이상을 개선하는, 스트레스 개선용 키트.
제1항에 있어서,
상기 락토바실러스 헬베티쿠스 및 비피도박테리움 롱검은,
단위부피당 콜로니 수(CFU/ml)가 3 ~ 15 : 1의 비율로 포함되는, 스트레스 개선용 키트.
삭제
제1항에 있어서,
상기 조성물은, 하기 중 하나 이상의 특징을 포함하는, 스트레스 개선용 키트:
i) 비장세포 증식 촉진; 및
ii) 코르티코스테론(corticosterone)의 분비 억제.
제3항에 있어서,
상기 스트레스로 인한 신체적 증상은, 소화기 질환, 신경계 질환, 비뇨기 질환, 심혈관 질환 및 피부 질환으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하고,
상기 스트레스로 인한 심리적 증상은, 우울증, 불안장애, 불면증 및 신경과민으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 스트레스 개선용 키트.
삭제
제1항에 있어서,
상기 조성물은,
화장료 조성물, 식품 조성물 또는 약학적 조성물인, 스트레스 개선용 키트.
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