KR102059503B1 - 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별을 위한 단일염기다형성 마커 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별을 위한 신규한 단일염기다형성(SNP) 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 CD163 유전자에 존재하는 단일염기다형성을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별용 조성물, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별용 바이오 마커조성물 및 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별용 키트에 관한 것이며, 또한 본 발명은 (1) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; 및 (2) 본 발명의 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별용 조성물을 이용하여 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체를 판별하는 단계를 포함하는, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별을 위한 단일염기다형성(SNP) 마커 조성물에 관한 것이다.
돼지생식기호흡기증후군을 유발하는 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome(PRRS) 바이러스는 크게 북미형과 유럽형으로 나뉘며, 변이가 심해 수많은 종들이 존재한다. 또한 폐포 대식세포를 파괴하여 다른 병원체의 2차 감염이 일어나기 쉽도록 하고, 직접적으로 폐에 간질성 폐렴을 일으키며, 모돈에 급성 감염되면 고열을 동반하여 유산을 일으킨다. 유산이 일어나지 않은 임신돈의 경우는 태반을 통하여 PRRS 바이러스가 감염되어 태아의 폐사를 유발한다.
PRRS 바이러스는 돼지의 비강, 근육, 경구, 자궁, 그리고 질 등을 통해서 돼지생식기호흡기증후군을 유발한다. 일반적으로 돼지들은 경구 감염보다는 비 경구감염에 더 큰 감수성을 가진다. PPRS 바이러스의 감염의 유형에는 비 간접적인 전파, 수직 감염, 지속 감염, 농장 내에서의 전파, 농장 사이의 전파가 있다. 비 간접적인 전파는 장비, 도구, 의복, 물, 음식, 매개곤충 (모기, 파리), 공기 중의 비말, 고기의 육즙 등을 통해서 일어날 수 있으며, PRRS 바이러스에 급성 감염된 돼지를 접촉한 후 60분 이내의 작업자의 작업복, 장화, 손 등에서도 PPRS 바이러스가 검출된다. 특히 겨울철 영하의 추운 날씨에서 PRRS 바이러스의 간접 전파가 더 촉진될 수 있다.
또한 PRRS 바이러스는 바이러스 혈중을 보이는 임신 말기 모돈의 태반을 통해서 태아에게 전염되는데 이를 수직감염이라 한다. 또한, PRRS 바이러스는 돼지에서 만성의 지속적인 감염을 일으킨다. 바이러스는 수개월 동안 임상증상이 명확히 나타나지 않은 돼지의 감수성 세포 내에서도 복제된다. 이것은 PPRS 바이러스 전파의 가장 중요한 특징이며, 감염된 모돈이 99일까지도 바이러스를 전파시킬 수 있다고 보고되고 있다.
한편, PRRS의 원인체인 PRRS 바이러스(PRRSV)를 발견한 이후 약 20년 동안 이 바이러스에 대한 예방법을 개발하기 위하여 많은 노력이 투자되었음에도 아직까지 효과적인 예방법 및 관리법이 개발되어지지 않은 실정이다. PRRS 바이러스 제어를 위해 불활화 백신과 약독화 생백신 등 다양한 백신이 개발되었으나 오직 감염성이 확보된 약독화 백신만이 만족스러운 수준의 방어효과를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 하지만, PRRS 바이러스가 유전적으로 매우 다양하게 존재하기 때문에 다양한 바이러스들 간의 교차면역의 부재함으로 백신만으로 PRRS 바이러스의 감염을 완벽하게 방어하기는 어렵다. PRRSV에 노출되어 동일한 환경에서 사육이 되는 돼지들이라도 감염에 대한 임상증상 및 피해는 개체적으로 매우 다양한 것으로 알려져 왔다.
따라서, PRRSV에 대한 저항성이 높은 돼지를 선별하는 방법이 개발된다면 PRRS 바이러스에 의한 전세계 양돈산업의 엄청난 경제적 피해를 감소시킬 수 있을 것으로 예상된다.
이에 본 발명자들은 돼지의 CD163 유전자에 존재하는 특정 SNP를 돼지생식기호흡기증후군바이러스 저항성 개체 판별을 위한 용도로 사용할 수 있음을 확인하였고, 이러한 SNP를 이용할 경우 육안으로 구별되지 않는 돼지의 PRRSV 저항성을 빠르고 정확하게 판별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 CD163 유전자 염기서열에서 2509번째, 2638번째 및 3534번째 위치에 존재하는 단일염기다형성(SNP)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 SNP를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1로 표시되는 CD163 유전자 염기서열에서 2509번째, 2638번째 및 3534번째 위치에 존재하는 단일염기다형성(SNP)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 SNP를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별용 바이오 마커조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 본 발명의 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별용 조성물을 포함하는, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 CD163 유전자 염기서열에서 2509번째, 2638번째 및 3534번째 위치에 존재하는 단일염기다형성(SNP)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 SNP를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제제는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 CD163 유전자 염기서열에서 2509번째, 2638번째 및 3534번째 위치에 존재하는 단일염기다형성(SNP)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 SNP를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별용 바이오 마커조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별용 조성물을 포함하는, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은, (1) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; 및 (2) 제1항의 조성물을 이용하여 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체를 판별하는 단계를 포함하는, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시료는 뇨, 혈액, 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 CD163 유전자 염기서열에서 2509번째에 위치하는 SNP(CD163 c.2509)의 유전자형이 GG인 경우, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체로 판별할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 CD163 유전자 염기서열에서 2638번째에 위치하는 SNP(CD163 c.2638)의 유전자형이 GA인 경우, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체로 판별할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 CD163 유전자 염기서열에서 3534번째에 위치하는 SNP(CD163 c.3534)의 유전자형이 CC인 경우, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체로 판별할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 CD163 유전자 염기서열에서 2509번째에 위치하는 SNP(CD163 c.2509) 또는 3534번째에 위치하는 SNP(CD163 c.3534)의 유전자형이 C 대립유전자를 가지고 있는 경우, CD163의 발현이 억제되어 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 대한 저항성을 갖는 것으로 판별할 수 있다.
본 발명에서 규명한 CD163 유전자 염기서열에 존재하는 단일염기다형성 마커를 포함하는 조성물은 육안으로 확인하기 어려웠던 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체를 정확하고 신속하게 판별할 수 있는 효과가 있는 바, 돼지 유통 시장 및 축산업 분야에 널리 활용될 수 있는 특징이 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에서 돼지 동물모델을 대상으로 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 접종 후, 시료를 수득하는 타임 스케줄을 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 CD163에 존재하는 SNP들의 위치를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에서 규명한 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별용 SNP들과 바이러스 접종 후, 혈중 바이러스 농도 및 체중변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 CD163에 존재하는 SNP들의 위치를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에서 규명한 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별용 SNP들과 바이러스 접종 후, 혈중 바이러스 농도 및 체중변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 대한 저항성 개체를 효과적으로 판별할 수 있는 바이오 마커 조성물을 제공함에 특징이 있다.
본 발명에서 규명한 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개채 판별용 바이오 마커는 CD163에 존재하는 단일염기다형성(SNP)으로서, 구체적으로 서열번호 1로 표시되는 CD163 유전자 염기서열에서 2509번째, 2638번째 및 3534번째 위치에 존재하는 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개채 판별용 바이오 마커를 제공한다.
상기 CD163 유전자는 세포 표면과 엔도좀 구획 내에 위치하고 있으며, 비리온(virion)의 도막 제거(uncoating)에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이러한 CD163은 17개의 엑손으로 구성되어 있으며, 엑손 7은 SRCR 도메인 5를 코딩한다. 도메인 5는 PRRSV 감염에 직접적으로 영향을 미치는 SRCR 도메인 5가 인간의 도메인 8 (돼지에서 CD163 도메인 5는 인간에서 CD163L 도메인 8과 유사함)로 대체될 때 유형 1 감염성 소실을 초래한다는 연구가 보고되었고(Van Gorp et al., 2010), 3-6 도메인에 대한 항체도 감염을 막는 것으로 보고되었다(Li et al., 2015). 또한, SRCR 3은 CD163 헤모글로빈-헴 흡수의 엔도사이토시스를 매개하고 산화스트레스로부터 세포를 보호한다(Schaer et al., 2006a, b). CD163은 또한 종양괴사인자와 같은 세포 사멸 유도제(TWEAK : SRCR1-4 & 6-9), 병원체 수용체(African Swine Fever Virus, 박테리아 : SRCR2) 및 적혈구 결합과 같은 수용체로서도 기능하며, PRRSV에 의해 감염된 세포인 폐포대식세포에도 존재하고 PRRSV의 감염에 가장 중요한 리셉터를 암호화하는 유전자로 알려져 있을 뿐만 아니라, CD163의 발현은 비침투 세포(non-permissive cells)에서 PRRSV의 침투(permissive)를 허용하도록 한다는 연구결과가 보고된 바 있다.
그러나 아직까지 CD163 유전자에 존재하는 단일염기다형성과 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별과의 관련성에 대해 연구된 바가 없다.
이에 본 발명에서는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별과 CD163 유전자에 존재하는 단일염기다형성과의 관련성을 분석한 결과, CD163 유전자에 존재하는 다수의 단일염기다형성 중에서 특히 3개의 SNP인 G2509C, A2638G 및 C3534T의 3개 SNP가 유의적인 관련성을 갖는다는 것을 처음으로 규명하였다.
구체적으로 본 발명의 일실시예에서, PRRSV JA142로 감염된 돼지 개체로부터 게놈 DNA를 분리하고 CD163의 cDNA를 PCR을 이용하여 증폭한 후, CD163에 존재하는 SNP들과 바이러스로 감염된 돼지의 혈증 및 체중증가 변화의 관련성을 분석하였다.
그 결과, CD163에 존재하는 SNP들 중에서 G2509C, A2638G 및 C3534T의 3개 SNP만이 유의적인 상관관계를 보이는 것으로 나타났다. 따라서 이들 3개의 SNP 단독 또는 둘 이상으로 조합된 SNP들은 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별용 바이오마커로서 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 CD163 유전자 염기서열에서 2509번째, 2638번째 및 3534번째 위치에 존재하는 단일염기다형성(SNP)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 SNP를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별용 바이오 마커조성물을 제공할 수 있으며, 또한 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 CD163 유전자 염기서열에서 2509번째, 2638번째 및 3534번째 위치에 존재하는 단일염기다형성(SNP)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 SNP를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 용어 "개체"는 PRRSV 저항성을 확인하고자 하는 대상을 의미하는 것으로, 포유동물을 포함할 수 있고, 바람직하게는 돼지일 수 있다.
본 발명에서 용어 "바이오 마커"는 DNA, RNA, 대사물질, 단백질 및 단백질 조각(potein fragments) 등에서 유래 된 단일 분자 또는 분자들의 패턴을 근거로 한 분자적 정보로서 생명체내에서 유전적 또는 후생 유전적 변화의 영향으로 유발 된 신체의 변화를 감지할 수 있는 지표를 가리킨다. 바이오 마커는 혈중포도당 같은 저분자 물질에서 단백질이나 특정 핵산 같은 고분자물질까지 다양하며, 생화학의 발전과 더불어 진화해 온 개념이다.
본 발명에서 상기 제재는 상기 염기서열 부위를 검출할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 이때, PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명의 일실시예에서는, 본 발명에 따른 CD163 c.2509 및 CD163 c.2638에 존재하는 SNP 유전자형 분석을 위한 프라이머로서, 상기 서열번호 36 및 37의 프라이머 쌍을 사용하였고, CD163 c.3534에 존재하는 SNP의 유전자형 분석을 위해서는 서열번호 38 및 39의 프라이머쌍을 사용하여 분석하였다.
본 발명에서 용어 "프로브"는 특정 표적 서열에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일가닥 형태일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 또한, 상보적 뉴클레오티드에 수소 결합에 의하여 혼성화될 수 있는 성질을 갖는 것이면, 천연 뉴클레오티드로 구성된 것 뿐만 아니라, 천연 뉴클레오티드, 천연 뉴클레오티드의 유사체, 천연 뉴클레오티드의 당, 염기 또는 인산 부위가 변형되어 있는 뉴클레오티드 및 이들 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 PNA를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 분석 반응에서 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그가 결합되어 있는 복합체의 검출의 편이를 위하여, 검출가능한 표지(예, Cy3, Cy5 형광성 물질)가 부착, 예를 들면, 3'말단 또는 5'말단에 부착되어 있는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별용 조성물을 포함하는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있으며, 내열성 DNA 중합효소, dNTPs, 버퍼 등 을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면 상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명에서 용어 "유전자형"은 생물의 개체, 세포, 기관의 특징(character)을 결정하는 유전자의 구성으로, 유전 인자에 의해서 생물 내부적으로 결정되는 숨겨진 형질을 의미한다.
본 발명의 일실시예에서는, PRRSV 저항성 개체 판별용 사용하기에 유의미하다고 판단한 G2509C, A2638G 및 C3534T의 3개 SNP에 대하여, PRRSV의 공격감염 이후 돼지의 성장(몸무게, 증체량), 혈중 바이러스 농도 및 돼지 유전자형의 상관관계를 분석하였는데, 그 결과, CD163 c.2509의 유전형 다형성은 GG가 CC 및 CG에 비해 체중증가가 높고 및 혈중 바이러스 농도가 낮아 PRRSV에 대한 저항성이 높은 것으로 나타났고, CD163 c.2638의 유전형 다형성은 GA가 GG에 비해 PRRSV에 대한 저항성이 높은 것으로 나타났으며, CD163 c.3534의 유전형 다형성은 CC가 CT 및 TT에 비해 PRRSV에 대한 저항성이 높은 것으로 나타났다.
따라서 이러한 결과를 토대로 볼 때, 서열번호 1로 표시되는 CD163 유전자 염기서열에서 2509번째에 위치하는 SNP(CD163 c.2509)의 유전자형이 GG인 경우 또는 CD163 유전자 염기서열에서 2638번째에 위치하는 SNP(CD163 c.2638)의 유전자형이 GA인 경우 또는 CD163 유전자 염기서열에서 3534번째에 위치하는 SNP(CD163 c.3534)의 유전자형이 CC인 경우, 다른 유전형을 갖는 SNP에 비해 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성을 갖는 개체임을 알 수 있다.
나아가 본 발명은 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별방법을 제공할 수 있으며, 상기 방법은 바람직하게 (1) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; 및 (2) 상기 본 발명의 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별용 조성 물을 이용하여 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체를 판별하는 단계를 포함한다.
상기 시료는 이에 제한되지는 않으나, 뇨, 혈액, 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액일 수 있다.
상기 (2) 단계에서 구체적으로 판별은, 서열번호 1로 표시되는 CD163 유전자 염기서열에서 2509번째에 위치하는 SNP(CD163 c.2509)의 유전자형이 GG인 경우, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체로 판별할 수 있고, 서열번호 1로 표시되는 CD163 유전자 염기서열에서 2638번째에 위치하는 SNP(CD163 c.2638)의 유전자형이 GA인 경우, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체로 판별할 수 있으며, 서열번호 1로 표시되는 CD163 유전자 염기서열에서 3534번째에 위치하는 SNP(CD163 c.3534)의 유전자형이 CC인 경우, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체로 판별하는 단계를 추가로 더 포함할 수 있다.
또한 본 발명자들은 CD163의 발현 수준과 이들 본 발명의 SNP들과의 관련성을 분석하였는데, 그 결과, 서열번호 1로 표시되는 CD163 유전자 염기서열에서 2509번째에 위치하는 SNP(CD163 c.2509) 또는 3534번째에 위치하는 SNP(CD163 c.3534)의 유전자형이 C 대립유전자를 가지고 있는 경우, CD163의 발현이 억제되어 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 대한 저항성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험방법>
① 동물준비
PRRSV 음성이며 3주령의 교잡종(Duroc × Landrace × Yorkshire) 돼지 65마리를 같은 사육실에서 사육한 후, 북미 PRRSV인 JA142 균주를 RPMI-1640 배지(Life Technologies, CA, USA)로 희석하여 103 TCID50 / mL의 역가로에 6일 동안 투여 및 적응시켰다. 또한 SNP 관련성 확인을 위해 국립동물학회(NIAS)와 다비 번식 회사 (Darby Breeding Company)에서 3 종류의 돼지 품종(Landrace, Yorkshire 및 Duroc)의 DNA 샘플을 채취하여 사용하였고, 돼지 모델을 대상으로 본 발명의 하기 실험을 위해 시료를 수득한 시점 등의 모식도를 도 1에 나타내었다.
② 바이러스
혈증의
정량분석
바이러스 추출키트(Life Technologies, CA)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 혈액 및 폐로부터 바이러스 RNA를 추출하였다. 바이러스 titre는 TaqMan Chemistry를 이용한 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 이용하여 측정하였다. 또한, ORF7의 보존영역에 특이적인 프라이머 및 MGB 형광 프로브를 Kim et al., 2013 및 Niu et al., 2016의 방법에 따라 분석하였다.
③
프라이머
디자인,
PCR
및 시퀀싱 분석
CD163 유전자의 시퀀싱을 위한 프라이머는 gDNA(Accession number : NC_010447.5)를 대상으로 oligo 6 프로그램 (Molecular Biology Insight, CO, USA)을 사용하여 디자인 하였다. PCR은 PTC-200 thermocycler (MJ Research, MA)를 사용하였고, h-Taq polymerase (Solgent, South Korea)를 DNA 중합 효소로 사용하였다. PCR 반응액은 25ng의 주형 DNA, 0.01 μM 프라이머, 5 mM dNTP, 2.5 μl의 10X PCR 완충액 및 0.625 유닛의 h-Taq DNA 중합효소가 혼합된 혼합액을 사용하였다 (PCR 길이가 2000 bp 이상일 때 EF-Taq 사용함).
또한, 반응 조건은 95℃에서 15 분간의 예비 변성(preliminarily denaturation), 95 ℃에서 30 초간 변성, 30초 동안 어닐링, 72℃에서 40초간 (1000 bp 당 1 분간) 연장반응을 35 사이클 반응시켰고, 72℃에서 10 분간 최종연장 반응으로 완료하였다. 각각의 프라이머 서열, 어닐링 온도 및 단편 크기는 하기 표 1에 나타내었다. 증폭산물은 2% 아가로오스 겔에서 100mv 전압으로 20분 동안 전기영동에 의해 동정하였다. 반응 산물은 또한 Geneclean 터보 키트(MP Biomedicals, CA, USA)를 사용하여 정제하였고 Applied Biosystems 3730 DNA 분석기 (Applied Biosystems, CA, USA)를 사용하여 시퀀싱 분석을 수행하였으며, 분석된 염기서열은 Sequencer ver 4.7 (Gene Codes, MI, USA)로 검사하였다.
본 발명에 따른 CD163 c.2509 및 CD163 c.2638에 존재하는 SNP 유전자형 분석을 위한 프라이머는 상기 서열번호 36 및 37의 프라이머 쌍을 사용하였고, CD163 c.3534에 존재하는 SNP의 유전자형 분석을 위한 프라이머는 서열번호 38 및 39의 프라이머쌍을 사용하여 분석하였다.
④ 돼지 폐 조직에서 CD136
mRNA
발현의 정량분석
돼지 폐 조직으로부터 RNA의 분리는 키트 제조회사의 지침에 따라 total RNA isolation kit (GeneAll Biotechnology, South Korea)를 사용하여 추출하였고 대용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems, CA, USA)를 사용하여 RNA에 상보적인 cDNA를 합성하였다. 이후, CD163 유전자 발현에 대한 특이 프라이머 세트(Jiang (Jiang, Jiang, Germany))를 사용하여 제조업자의 권고에 따라 7500 Fast Real-time PCR 시스템 (Applied Biosystems, CA, USA)을 사용하여 상기 합성된 cDNA에 대한 실시간 qPCR을 수행하였다. qPCR 반응조건은 2X Power SYBGR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 10μl, cDNA 2μl, 0.5μl의 각 순방향 및 역방향 프라이머(10pm/μl) 및 nuclease가 없는 7μl를 첨가하여 총 20μl의 반응용액이 되도록 하였다. qPCR 사이클링 조건은 다음과 같이 수행하였다: (a) 95℃에서 10 분간 유지; (b) 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분간 40 사이클 반응; 및 (c) 95 ℃에서 15 초, 60℃에서 1 분, 95℃에서 15 초, 60℃에서 15초 동안 용융 곡선 단계의 과정으로 수행하였고, 각각의 샘플을 두 번 수행하였다. CD163에 대한 mRNA 발현의 상대적인 양 (RQ)은 β-actin mRNA으로 일반화 시켰고, 발현양은 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 결정하였다(Winer et al., 1999).
⑤ 통계 분석
상관 관계 및 연관성은 SAS 버전 9.4 패키지로 평가하였고, 상관관계는 혈증 농도(혈청 및 폐)와 CD163 발현 수준 사이의 관계를 계산하였다. GLM 절차에 의해 각 3가지 SNP (c.2509G> C, c.2638G> A 및 c.3534C> T)와 각 형질 (발현 수준 및 폐렴) 간의 연관성을 평가했다. 통계 분석에 사용된 선형 모델은 다음과 같다.
Yijk = μ + Si + Gj + Dk + eijk
여기서 Yijk는 성장 및 면역 표현형의 관측 값, μ는 표본의 평균, Si는 성의 영향, Gj는 유전형의 영향, Dk는 도살 날짜의 영향이며 eijk는 무작위 오차이다.
연계 분석은 HaploView 소프트웨어 패키지 (Barrett et al., 2004)를 사용하여 수행하였고, 변형 사이의 D '및 r2 값은 Stephens et al(2001)에 의해 계산하였다.
<
실시예
1>
돼지생식기호흡기증후군
바이러스 저항성 개체판별용 CD163의 SNP 선정 및 각 SNP 유전형과
PRRSV의
혈중 바이러스 농도와의 상관관계 분석
본 발명자들은 상기 실험방법에서 PRRSV JA142로 감염된 돼지 개체로부터 게놈 DNA를 추출하고, PRRSV 저항성 개체 판별용 마커 후보를 CD163 유전자로 선택한 후, CD163에 특이적인 프라이머를 사용하여 유전자를 증폭한 후, 유전형을 분석하였고, 각 유전형과 바이러스 혈증(viremia) 및 체중증가(weight gain)간의 상관성을 분석하였다(하기 표 3 참조). 이때 CD163 cDNA 증폭을 위해 사용한 프라이머 서열은 하기 표 2에 기재된 바와 같다.
또한, 상기 표 3에서 각 돼지 개체의 혈증(viremia) 및 체중증가(WG) 체크는 바이러스 감염 후의 해당 날짜(dpi, 예컨대 3dpi: 감염 후 3일째)에 각각 시료를 채취하여 분석한 것이다.
분석 결과, 표 3 및 도 3에 나타낸 바와 같이, CD163에 존재하는 SNP들 중에서 G2509C, A2638G 및 C3534T의 3개 SNP가 유의적인 상관관계를 보이는 것으로 나타났다. 구체적으로 CD163 c.2509의 유전형 다형성은 GG가 CC 및 CG에 비해 체중증가가 높고 및 혈중 바이러스 농도가 낮아 PRRSV에 대한 저항성이 높은 것으로 나타났고, CD163 c.2638의 유전형 다형성은 GA가 GG에 비해 PRRSV에 대한 저항성이 높은 것으로 나타났으며, CD163 c.3534의 유전형 다형성은 CC가 CT 및 TT에 비해 PRRSV에 대한 저항성이 높은 것으로 나타났다.
따라서 이러한 결과를 통해, CD163 c.2509의 유전형 다형성이 GG이거나, CD163 c.2638의 유전형 다형성이 GA 이거나, CD163 c.3534의 유전형 다형성이 CC인 경우에는 PRRSV에 대한 저항성을 갖는 개체라는 것을 알 수 있다.
<
실시예
2>
돼지생식기호흡기증후군
바이러스 저항성 개체판별용 SNP와 CD163 유전자와의 상관관계 분석
나아가 본 발명자들은 본 발명에서 규명한 상기 PRRSV 저항성 개체 판별용 SNP들과 CD163의 발현과의 상관관계를 분석하였다. 앞서 분석한 결과에서 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 규명한 3개의 SNP(c.2509 G>C, c.2638 G>A and c.3534 C>T)는 혈중 바이러스의 농도 및 체중증가 요인과 밀접한 상관관계를 보임을 알 수 있었다. 이에 이들 3개의 SNP의 유형과 CD163의 유전자 발현정도와의 상관관계를 분석하였다.
그 결과, 상기 표 4에 나타낸 바와 같이, CD163 c.2509의 SNP의 유전자형이 GG인 경우 CC 또는 CG에 비해 CD163의 발현 억제가 우수한 것으로 나타났고, CD163 c.3534의 SNP 유전자형이 TT인 경우 CC 또는 CT에 비해 CD163의 발현 억제가 미비한 것으로 나타났으며 CC인 경우가 TT 및 CT에 비해 CD163의 발현 억제가 우수한 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 토대로 볼 때, CD163 c.2509의 SNP 유전자형이 GG인 경우 또는 CD163 c.3534의 SNP 유전자형이 CC인 경우 CD163의 발현억제를 통한 PRRSV 저항성에 효과적이라는 것을 알 수 있었다.
그러므로 이상의 결과를 통해, 본 발명에 따른 CD163에 존재하는 상기 3개의 SNP들을 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성을 갖는 개체를 판별하기 위한 마커용도로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Chungbuk National University
<120> SNP marker composition for resistance individual discriminating
of porcine respiratory and reproductive syndrome virus
<130> NPDC68420
<160> 51
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 3623
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sus scrofa CD163 DNA sequence
<400> 1
gtaataatac aagaagattt aaatggcata aaaccttgga atggacaaac tcagaatggt 60
gctacatgaa aactctggat ctgcagactt tagaagatgt tctgcccatt taagttcctt 120
cacttttgct gtagtcgctg ttctcagtgc ctgcttggtc actagttctc ttggaggaaa 180
agacaaggag ctgaggctaa cgggtggtga aaacaagtgc tctggaagag tggaggtgaa 240
agtgcaggag gagtggggaa ctgtgtgtaa taatggctgg gacatggatg tggtctctgt 300
tgtttgtagg cagctgggat gtccaactgc tatcaaagcc actggatggg ctaattttag 360
tgcaggttct ggacgcattt ggatggatca tgtttcttgt cgagggaatg agtcagctct 420
ctgggactgc aaacatgatg gatggggaaa gcataactgt actcaccaac aggatgctgg 480
agtaacctgc tcagatggat ctgatttaga gatggggctg gtgaatggag gaaaccggtg 540
cttaggaaga atagaagtca aatttcaagg acggtgggga acagtgtgtg atgataactt 600
caacataaat catgcttctg tggtttgtaa acaacttgaa tgtggaagtg ctgtcagttt 660
ctctggttca gctaattttg gagaaggttc tggaccaatc tggtttgatg atcttgtatg 720
caatggaaat gagtcagctc tctggaactg caaacatgaa ggatggggaa agcacaattg 780
cgatcatgct gaggatgctg gagtgatttg cttaaatgga gcagacctga aactgagagt 840
ggtagatgga gtcactgaat gttcaggaag attggaagtg aaattccaag gagaatgggg 900
aacaatctgt gatgatggct gggatagtga tgatgccgct gtggcatgta agcaactggg 960
atgtccaact gctgtcactg ccattggtcg agttaacgcc agtgagggaa ctggacacat 1020
ttggcttgac agtgtttctt gccatggaca cgagtctgct ctctggcagt gtagacacca 1080
tgaatgggga aagcattatt gcaatcatga tgaagatgct ggtgtgacat gttctgatgg 1140
atcagatctg gaactgagac ttaaaggtgg aggcagccac tgtgctggga cagtggaggt 1200
ggaaattcag aaactggtag gaaaagtgtg tgatagaagc tggggactga aagaagctga 1260
tgtggtttgc aggcagctgg gatgtggatc tgcactcaaa acatcatatc aagtttattc 1320
caaaaccaag gcaacaaaca catggctgtt tgtaagcagc tgtaatggaa atgaaacttc 1380
tctttgggac tgcaagaatt ggcagtgggg tggacttagt tgtgatcact atgacgaagc 1440
caaaattacc tgctcagccc acaggaaacc caggctggtt ggaggggaca ttccctgctc 1500
tggtcgtgtt gaagtacaac atggagacac gtggggcacc gtctgtgatt ctgacttctc 1560
tctggaggcg gccagcgtgc tgtgcaggga actacagtgc ggcactgtgg tttccctcct 1620
ggggggagct cactttggag aaggaagtgg acagatctgg gctgaagaat tccagtgtga 1680
ggggcacgag tcccaccttt cactctgccc agtagcaccc cgccctgacg ggacatgtag 1740
ccacagcagg gacgtcggcg tagtctgctc aagatacaca caaatccgct tggtgaatgg 1800
caagacccca tgtgaaggaa gagtggagct caacattctt gggtcctggg ggtccctctg 1860
caactctcac tgggacatgg aagatgccca tgttttatgc cagcagctta aatgtggagt 1920
tgccctttct atcccgggag gagcaccttt tgggaaagga agtgagcagg tctggaggca 1980
catgtttcac tgcactggga ctgagaagca catgggagat tgttccgtca ctgctctggg 2040
cgcatcactc tgttcttcag ggcaagtggc ctctgtaatc tgctcaggga accagagtca 2100
gacactatct ccgtgcaatt catcatcctc ggacccatca agctctatta tttcagaaga 2160
aaatggtgtt gcctgcatag ggagtggtca acttcgcctg gtcgatggag gtggtcgttg 2220
tgctgggaga gtagaggtct atcatgaggg ctcctggggc accatctgtg atgacagctg 2280
ggacctgaat gatgcccatg tggtgtgcaa acagctgagc tgtggatggg ccattaatgc 2340
cactggttct gctcattttg gggaaggaac agggcccatt tggctggatg agataaactg 2400
taatggaaaa gaatctcata tttggcaatg ccactcacat ggttgggggc ggcacaattg 2460
caggcataag gaggatgcag gagtcatctg ctcagagttc atgtctctga gactgatcag 2520
tgaaaacagc agagagacct gtgcagggcg cctggaagtt ttttacaacg gagcttgggg 2580
cagcgttggc aggaatagca tgtctccagc cacagtgggg gtggtatgca ggcagctggg 2640
ctgtgcagac agaggggaca tcagccctgc atcttcagac aagacagtgt ccaggcacat 2700
gtgggtggac aatgttcagt gtcctaaagg acctgacaca ctatggcagt gcccatcatc 2760
tccatggaag aagagactgg ccagcccctc agaggagaca tggatcacat gtgccaacaa 2820
aataagactt caagaaggaa acactaattg ttctggacgt gtggagatct ggtacggagg 2880
ttcctggggc actgtgtgtg acgactcctg ggaccttgaa gatgctcagg tggtgtgccg 2940
acagctgggc tgtggctcag ctttggaggc aggaaaagag gccgcatttg gccaggggac 3000
tgggcccata tggctcaatg aagtgaagtg caaggggaat gaaacctcct tgtgggattg 3060
tcctgccaga tcctggggcc acagtgactg tggacacaag gaggatgctg ctgtgacgtg 3120
ctcagaaatt gcaaagagcc gagaatccct acatgccaca ggtcgctcat cttttgttgc 3180
acttgcaatc tttggggtca ttctgttggc ctgtctcatc gcattcctca tttggactca 3240
gaagcgaaga cagaggcagc ggctctcagt tttctcagga ggagagaatt ctgtccatca 3300
aattcaatac cgggagatga attcttgcct gaaagcagat gaaacggata tgctaaatcc 3360
ctcaggagac cactctgaag tacaatgaaa aggaaaatgg gaattataac ctggtgagtt 3420
cagcctttaa gataccttga tgaagacctg gactattgaa tgagcaagaa tctgcctctt 3480
acactgaaga ttacaataca gtcctctgtc tcctggtatt ccaaagactg ctgctgaatt 3540
tctaaagaat agattggtga atgtgactac tcaaagttgt atgtaagact ttcaagggca 3600
ttaaataaaa aagaatattg ctg 3623
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD163_gDNA_1_F Primer
<400> 2
cacatgaaag cctggattat a 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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tagtgaccaa gcaggca 17
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<211> 21
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<213> Artificial Sequence
<220>
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taaatggcat aaaaccttgg a 21
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<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 6
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<211> 18
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
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<211> 21
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<220>
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<211> 16
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<220>
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<400> 12
tctgctgaca aatccc 16
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<211> 21
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 21
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<213> Artificial Sequence
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<211> 21
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<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD163_gDNA_10_F Primer
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<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> CD163_gDNA_10_R Primer
<400> 21
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<211> 21
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<213> Artificial Sequence
<220>
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ggcaaagggt agtgaggcat a 21
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<211> 21
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<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD163_gDNA_12_R Primer
<400> 25
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD163_gDNA_13_F Primer
<400> 26
ggacacaagg aggatgctgc t 21
<210> 27
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD163_gDNA_13_R Primer
<400> 27
agggattctc ggctctt 17
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD163_gDNA_14_F Primer
<400> 28
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 29
ttcatccaga accatataag c 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD163_gDNA_15_F Primer
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atgcttatat ggttctggat g 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD163_gDNA_15_R Primer
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ccacacagta ccgagtaaa 19
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD163_gDNA_16_F Primer
<400> 32
ggactttata gtgagaatgg c 21
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD163_gDNA_16_R Primer
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tcccattttc cttttcattg t 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD163_Genotype_1_F Primer
<400> 34
ttccctgctc tggtcgtgtt g 21
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD163_Genotype_1_R Primer
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aaccctaccc tcttcatggc 20
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<220>
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<400> 36
accaagtcat ccagaagcta t 21
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD163_Genotype_2_R Primer
<400> 37
cctgcacacc aaattaaaca 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD163_Genotype_3_F Primer
<400> 38
ttgatgaaga cctggactat t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD163_Genotype_3_R Primer
<400> 39
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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acaaactcag aatggtgcta c 21
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<211> 18
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
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<400> 42
agctaatttt ggagaaggtt c 21
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<211> 18
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD163_cDNA_2_R Primer
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tgccttggtt ttggaata 18
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<220>
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ctgaaagaag ctgatgtggt t 21
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<211> 19
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<220>
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD163_cDNA_4_F Primer
<400> 46
cgtcggcgta gtctgctcaa g 21
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD163_cDNA_4_R Primer
<400> 47
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD163_cDNA_5_F Primer
<400> 48
ttaatgccac tggttctgct c 21
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD163_cDNA_5_R Primer
<400> 49
cattcccctt gcacttca 18
<210> 50
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD163_cDNA_6_F Primer
<400> 50
gtgacgactc ctgggacct 19
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD163_cDNA_6_R Primer
<400> 51
tgcccttgaa agtcttacat a 21
Claims (10)
- 서열번호 1로 표시되는 CD163 유전자 염기서열에서 2509번째 및 2638번째 위치에 존재하는 단일염기다형성(SNP)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는,
돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 제제는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별용 조성물. - 서열번호 1로 표시되는 CD163 유전자 염기서열에서 2509번째 및 2638번째 위치에 존재하는 단일염기다형성(SNP)을 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별용 바이오 마커조성물.
- 제1항의 조성물을 포함하는, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별용 키트.
- (1) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; 및
(2) 제1항의 조성물을 이용하여 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체를 판별하는 단계를 포함하는,
돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별방법. - 제5항에 있어서,
상기 시료는 뇨, 혈액, 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액인 것을 특징으로 하는, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별방법. - 제5항에 있어서,
서열번호 1로 표시되는 CD163 유전자 염기서열에서 2509번째에 위치하는 SNP(CD163 c.2509)의 유전자형이 GG인 경우, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체로 판별하는 것을 특징으로 하는, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별방법. - 제5항에 있어서,
서열번호 1로 표시되는 CD163 유전자 염기서열에서 2638번째에 위치하는 SNP(CD163 c.2638)의 유전자형이 GA인 경우, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체로 판별하는 것을 특징으로 하는, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별방법. - 삭제
- 삭제
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| KR1020180089487A KR102059503B1 (ko) | 2018-07-31 | 2018-07-31 | 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 저항성 개체 판별을 위한 단일염기다형성 마커 조성물 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR19980018687A (ko) * | 1996-08-20 | 1998-06-05 | 가나이 쯔도무 | 내연 기관용 혼합기 형성 장치 및 엔진 시스템 |
| CN114480674A (zh) * | 2022-03-03 | 2022-05-13 | 佛山科学技术学院 | 一种用于筛选抗蓝耳病猪的生物标志物及其应用 |
| CN114774468A (zh) * | 2022-04-20 | 2022-07-22 | 温氏食品集团股份有限公司 | 一种新的等位基因分子标记及抗蓝耳病猪群体组建方法 |
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| JP2018525000A (ja) | 2015-08-06 | 2018-09-06 | ザ・キュレーターズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミズーリＴｈｅ Ｃｕｒａｔｏｒｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ | 改変ｃｄ１６３遺伝子を有する病原体抵抗性動物 |
-
2018
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN114774468B (zh) * | 2022-04-20 | 2022-12-20 | 温氏食品集团股份有限公司 | 一种等位基因分子标记及抗蓝耳病猪群体组建方法 |
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