KR102043472B1

KR102043472B1 - 새로운 박테리아 및 상기 박테리아의 추출물들 또한 피부과학에서 그의 용도

Info

Publication number: KR102043472B1
Application number: KR1020137016743A
Authority: KR
Inventors: 필립 르바롱; 뮈리엘 뷔렝; 나딸리 까스떼-리찌; 띠앙 느귀앙
Original assignee: 삐에르화브르데르모-코스메띠끄; 유니베르시테 피에르 에 마리에 쿠리에 (파리 6); 쌩뜨레 나티오날 데 라 르세르쉬 생띠끄 (씨. 엔. 알. 에스)
Priority date: 2010-12-22
Filing date: 2011-12-22
Publication date: 2019-11-11
Also published as: PT2655595T; US20130316033A1; FR2969657A1; ES2689138T3; CL2013001853A1; SG191236A1; MY173066A; BR112013015998A2; PL2655595T3; US9084811B2; WO2012085182A1; MX2013007217A; RU2013132895A; AR084454A1; CN103403144B; JP2017099393A; US9662357B2; FR2969657B1; AU2011347254A1; MA34734B1

Abstract

본 발명은 지하수로부터 분리된 새로운 박테리아 균주에 관한 것이다. 본 발명은 또한 염증들의 치료의 맥락에서 박테리아 추출물들 및 그들의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 염증성 장애들, 명확하게는 피부과학적 병리학들의 치료 및 예방에서 관심 있는 새로운 조성물들에 관한 것이다.

Description

새로운 박테리아 및 상기 박테리아의 추출물들 또한 피부과학에서 그의 용도 {Novel bacterium and extracts of said bacterium and the use of same in dematology}

본 발명은 지하수로부터 분리된 새로운 박테리아 균주에 관한 것이다. 본 발명은 또한 염증들의 치료의 맥락에서 박테리아 추출물들 및 그의 용도에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 염증성 장애들, 명확하게는 피부과학적 병리학들의 치료 및 예방에서 관심 있는 새로운 조성물들에 관한 것이다.

아토피 피부염, 소양증, 습진 및 건선과 같은 피부과학적 질환들이 어린 아동들에서 점차 빈도가 증가하고 있다. 아토피 피부염의 유병율은 지난 30년 동안 선진국들에서 두 배 또는 세 배가 되어 왔다: 아동들의 15% 내지 30% 또한 성인들의 2% 내지 10%가 고생하고 있다 (Williams H. et al ., JACI 2006; 118: 209-13). 아토피 피부염은 아토피의 피부적 소견이다; 이것은 유전적으로 결정된 환경들의 집합으로 인해 발생하는, 만성적인 염증성 피부병 또는 습진이다. 현재 이것은 주요한 공공보건의 관심사로서 고려되고 있다. 아토피 피부염은 종종 알레르기성 비염 및 천식과 같은 다른 아토피 장애들과 연관된다. 본 침범은 초기 아동기 동안 가장 자주 발생하고, 수년 동안 반복된 발병들을 특징으로 한다. 이것은 자발적인 소강 상태들에 의해 중단되기도 하는 피부 발적들과 함께 진행된다.

아토피 피부염을 앓고 있는 환자들의 삶의 질은 심각하게 방해된다. 허용된 치료법들은 국소적 코르티코스테로이드들 및 면역조절인자들, 빈번한 부작용들이 장기간 사용을 제한하는 전신적 제제들, 또한 피부연화제들을 포함한다. 현재까지의 요법들은 반응적 - 발병들의 치료 - 이지만, 아토피 피부염이 아토피 진행의 초기 단계로서 간주되기 때문에 지금은 발병들 및 피부 염증들의 조절에 중점을 두는 조기 개입이 질환 또한 천식 및/또는 비염의 잠재적인 출현 모두의 조절의 견지에서 유익할 수 있는 것으로 여겨진다 (Bieber, T. 2008, Atopic dermatitis, The New England Journal of Medicine, vol. 358(14) 1483-1494). 대부분의 경우들에서, 치료들은 환자들에게 안정을 최고로 제공하도록 국소적 성분을 포함한다.

명확하게 아토피 피부염을 위한 표준 치료들은, 상세하게 이러한 치료들이 아동들에서 역효과들을 주는데도 불구하고, 국소적 코르티코스테로이드들 또는 면역억제제들을 사용하고 있다.

아토피 피부염은 복잡미묘하고 다수의 요인들을 가진다. 문헌에서, 역학적 연구들은 도시적 환경들에 있는 "위생" 요인이 알레르기 및 자가면역과 같은 질환을 촉진시키는 것을 보여주었다. 한편으로, 사람이 미생물들 및/또는 알레르기원들과 지속적으로 접촉하는 농촌의 환경들에서는, 이러한 노출은 출생 시부터 사람의 방어적 면역 체계를 자극한다.

아토피 피부염에서, 피부의 장벽 기능은 약해지고 손상을 입으며, 이는 병원균들 (박테리아들, 바이러스들), 상세하게 피부의 공생 박테리아를 우점하는 것으로 알려진 스태필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)의 칩입 및 군집화를 촉진시킨다.

면역학의 견지에서, 쟁점은 면역 반응 불균형의 하나이다. 아토피는 종종 알레르기 재연 (IgE 매개성, 사이토카인들 IL-4, IL-5, IL-13의 우세) 또는 Th2 반응으로서 기술된다. 후자는 스태필로코커스 아우레우스의 "항원성 자극"의 존재 시 더욱 더 가속된다. 면역조정은 면역 항상성을 Th1/Th2 균형으로 회복시키는 것에 있다.

선천적 면역은 포유동물들에서 면역반응의 일차적이고, 신속한, 비특이적 반응이다. 세포의 첫 번째 방어 장벽들은 톨-유사 수용체들 (TLRs)이다. 각각의 TLR은 핵산들 (TLR3), 펩타이드들, 표면 단백질들, 리포테이코산 (lipoteichoic acid, TLR2), 편모들 (TLR5) 및 외래 미생물로부터 나온 지질다당류들 (TLR4)와 같은 병원균-관련 분자적 패턴 (PAMPs)을 특이적으로 인식한다. 모티브 (작동제) 및 TLR 간의 특이적 상호작용은 NFκB의 전사를 유도하는 복잡한 반응들의 연쇄를 촉발하고, 전염증성 및 항염증성 사이토카인들 및 케모카인들의 생산으로 이어진다 (Kang et al ., 2006). 그 결과로 나온 기타 약물학적 결론들은 병원균들 (박테리아들, 바이러스들, 기생충들)의 성장을 저해하는 능력을 가지는 항미생물성 펩타이드들 (AMPs)이다 (Glaser, R. et al . 2005, Nat. Immunol. 6: 57-64).

아토피 피부염은 종종 가려움 및 소양증이 수반되고, 따라서 일상 생활에서 불편 및 괴로움 (긁힌 자국, 수면 부족 등)을 초래한다. 본 염증성 병리학의 원인들의 하나는 PAR2 (프로테아제-활성화 수용체 2)라고 불리는 G 단백질-결합 수용체의 활성화로 인한 것이다 (Steinhoff, M. et al . 2003 J Neurosci. 23:6176-6180). PAR2는 많은 세포들, 상세하게는 각질세포들, 내피세포들, 결장 근육세포들, 장내세포들, 장내 뉴런들 및 면역 세포들의 표면 상에서 발현된다. 표피에 풍부하게 존재하는 프로테아제들 (트립신, 트립타제)은 PAR2를 본 동일한 수용체를 활성화하는 특이적 펩타이드를 노출하는 N-말단에서 절단한다 (자가-활성화의 현상) (Vergnolle, N. 2009 Pharmacol. Ther. 123: 292-309). 본 과정은 전염증성 사이토카인들의 유도로 이어지고 따라서 염증을 촉발하는, NFκB 유전자의 활성화가 관여한다. 본 맥락에서, PAR2 길항제 및/또는 프로테아제 저해제들의 개발은 소양증의 병리학을 치료하는 높은 잠재력을 가진다.

건선도 역시 만성적인 진행을 가지는 피부의 염증성 질환이다; 이것은 인구의 2%이 이환되어 있다. 아토피 피부염과 함께, 건선은 가장 보편적인 만성 피부의 염증성 질환들의 하나이다. 이것은 염증 반응과 연관된 표피 세포들의 비정상적 성장을 특징으로 한다. 염증 현상의 중심적 기작은 면역 체계의 T 세포들, 우세하게는 Th1 세포들의 작용과 관련되고 (Wilsmann-Theis, D. et al ., Eur J Dermatol., vol. 18(2) 172-180), 이는 염증 과정을 개시하고 유지하며 다음으로 가속된 불완전한 분화 단계를 거쳐서 진행하는 각질세포들의 과다한 증식을 자극시킨다. 각질세포들은 염증 신호들에 민감하게 만들고 전염증성 매개인자들을 방출하는 수용체들을 발현한다. 따라서 건선의 염증은 T 세포들 및 각질세포들의 상호적 자극에 의해 유지된다.

따라서 질환은 장기간 동안 치료되어야 한다. 따라서 이들 염증성 피부병들의 치료요법적 대안들을 위한 필요성 및 높은 수요가 존재한다.

비트레오실라 필리포르미스 (V. filiformis)의 박테리아 추출물의 아토피 피부염의 치료를 위한 용도를 기술하고 있는 유럽 특허 제 EP2018891호 (Gueniche A., 2009) 및 구엔니케 등에 의한 문헌이 언급될 수 있다 (Gueniche A. et al., 2006, European Journal of Dermatology, 16, 4, 380-384). 이러한 추출물은 무황의 미네랄 물을 포함하는 배지 상에서 상기 미세섬유성 박테리아 V. 필리포르미스의 배양을 요구하는 단점을 가진다.

본 맥락에서, 본 발명은 이전에 전혀 기술된 바 없었던 새로운 박테리아의 분리, 특성분석 및 분획화에 의해 이들 염증성 장애들의 치료에 대한 용액을 제공한다.

맨처음으로, 또한 놀라운 방식으로, 본 출원인은 지하수로부터 새로운 박테리아 종에 속하는 균주를 분리하는 데 성공하였고, 상기 새로운 박테리아 균주 (또는 박테리아)는 LMB64라고 명명된다.

본 박테리아 LMB64는 분리되었던 사실에 추가하여 특성분석되었고, 베타프로테오박테리아 (Betaproteobacteria) 목 (class), 네이세리아시애 (Neisseriaceae) 아과 (subfamily)에 속하고, 아마도 아직까지 정의되지 않은 새로운 속으로서 정의될 것이다. 16S 리보좀 RNA (rRNA)를 코딩하는 유전자 서열의 분석은 본 박테리아를 크로모박테리움 (Chromobacterium), 팔루디모나스 (Paludimonas), 루텔리아 (Lutelia) 및 글루벤키아나 (Glubenkiana) 속들과 근접하게 두는 것을 가능하도록 하였고, 이들과 95% 서열 유사도를 공유하고 있다.

본 비병원성 박테리아는 그램-음성이고, 실시예들에서 보다 자세하게 기술될 것이다. 본 박테리아는 비미세섬유성 (nonfilamentous)이 되는 특징도 역시 가진다. 게다가, 본 박테리아는 물의 유형이라면 모두, 보다 상세하게는 보통의 물을 포함하는 배지 상에서 배양될 수 있는 장점을 가진다. 예로서, V. 필리포르미스와는 대조적으로 본 발명의 박테리아 LMB64의 배양은 특정한 배양 조건들을 요구하지 않고, 보다 상세하게는 적어도 하나의 무황 유형의 미네랄을 포함하는 배지 및/또는 고온 물을 요구하지 않는다. 이것은 배양 조건들 및 시설들 둘 다의 견지에서 또한 경제학적 관점으로부터 분명한 장점을 나타낸다.

16S rRNA를 코딩하는 유전자는 거의 완전하게 서열결정 되었다 (1487　bp, 서열번호 1의 서열에 해당함). 박테리아 LMB64는 10,948　bp의 원형 플라스미드를 가진다. 본 플라스미드는 완전하게 서열결정되었고, 본 서열은 서열번호 2의 서열에 나타나 있다.

첫 번째 구현예에 따르면, 본 발명은 16S rRNA를 코딩하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 1의 서열, 또는 상기 서열번호 1의 서열과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 뉴클레오타이드 서열이라면 모두를 포함하거나 이들로 구성되는, 베타프로테오박테리아 목, 네이세리아시애 아과에 속하는 비병원성 그램-음성 박테리아에 관한 것이다.

바람직한 방식으로, 본 발명은 상기 박테리아의 16S rRNA 유전자의 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 1의 서열을 포함하거나 이로 구성되는 것을 특징으로 하는, 베타프로테오박테리아 목, 네이세리아시애 아과에 속하는 비병원성 그램-음성 박테리아에 관한 것이다.

본 발명의 맥락에서, 두 개 핵산 서열들 간의 "일치도 백분율 (percentage identity)"은 최고의 정렬 이후에 획득되는 (최적의 정렬) 비교될 두 개 서열들 간의 일치하는 뉴클레오타이드들의 백분율을 말하고, 여기에서 본 백분율은 순수하게 통계학적이고 두 개 서열들 간의 차이들은 무작위로 또한 그들의 전체 길이를 통해 분포된다. 두 개 핵산 서열들 간의 서열들의 비교는 정상적으로 그들을 최적의 방식으로 정렬한 이후에 이들 서열들을 비교하여 이루어지고, 여기에서 상기 비교는 분절 마다 또는 "비교창" 마다 이루어질 수 있다. 비교를 위한 서열들의 최적의 정렬은 수작업에 추가하여, 스미스 및 워터맨의 로칼 상동성 알고리즘에 의해 [Smith and Waterman (1981), Ad. App. Math. 2: 482], 니들만 및 운쉬의 로칼 상동성 알고리즘에 의해 [Needleman and Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48: 443], 피어슨 및 립만의 유사도 탐색 방법에 의해 [Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. The USA 85: 2444] 또는 이들 알고리즘들을 사용하는 컴퓨터 소프트웨어에 의해 (위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지에 있는 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 유전학 그룹 컴퓨터, 575 Science Dr., 매디슨, WI, 또는 BLAST N 또는 BLAST P 비교 소프트웨어)에 의해 수행될 수 있다.

두 개 핵산 서열들 간의 일치도 백분율은 비교될 핵산 서열이 이들 두 개 서열들 간의 최적의 정렬의 경우 기준 서열과 대비하여 첨가들 또는 결실들을 포함 할 수 있는 최적의 방식으로 이들 두 개의 정렬된 서열들을 비교하여 결정된다. 일치도 백분율은 뉴클레오타이드가 두 개 서열들 간에 일치하는 자리들의 수를 결정하는 것에 의해, 본 일치하는 자리들의 수를 비교창에 있는 자리들의 전체 수로 나누는 것에 의해 또한 이들 두 개 서열들 간의 일치도 백분율을 획득하도록 획득된 결과를 100으로 곱하는 것에 의해 계산된다.

예를 들어, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html에서 입수가능한 "BLAST 2 서열들" (Tatusova et al ., "Blast 2 서열들 - 단백질 및 뉴클레오타이드 서열들을 비교하는 새로운 도구", FEMS Microbiology Lett. 174: 247-250)이 디폴드 매개변수들로 (상세하게, 매개변수들의 경우 "오픈 갭 감점": 5점, 및 "연장 갭 감점": 2점; 예를 들어 프로그램에 의해 제안된 "BLOSUM 62" 매트릭스가 되는 선택된 매트릭스로), 비교될 두 개 서열들 간의 일치도 백분율이 프로그램에 의해 직접 계산되면서 사용될 수 있다. "ALIGN" 또는 "매그얼라인 (Megalign)" 소프트웨어 (DNASTAR)와 같은 다른 프로그램들을 사용하는 것도 역시 가능하다.

또 다른 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 박테리아는 서열번호 2의 서열, 또는 상기 서열번호 2의 서열과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열이라면 모두를 포함하는 적어도 하나의 플라스미드를 포함한다.

바람직한 방식으로, 박테리아 LMB64는 서열번호 2의 서열을 포함하는 적어도 하나의 플라스미드를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 박테리아 LMB64는 비미세섬유성 (nonfilamentous)인 것을 특징으로 한다.

상기 박테리아 LMB64의 다른 특징들은 하기 실시예들에서 자세하게 기술될 것이다.

또한, 본 발명의 박테리아 LMB64는 부다페스트 조약에 따라 본 출원인의 이름으로 파리, 파스퇴르 연구소, 국가 미생물 배양 수집기관 (CNCM)에 2010년 4월 8일자로 기탁번호 제 I-4290호 하에 기탁되었다.

따라서, 본 발명의 한 가지 목적은 CNCM 기관에 2010년 4월 8일자로 기탁번호 제 I-4290호 하에 기탁된 박테리아, 또는 상동체, 자손 또는 기타 다른 돌연변이체라면 모두이다.

용어 "돌연변이체 (mutant)"는 균주 I-4290로부터 직접 나온 박테리아라면 모두를 말하고, 자연적인 돌연변이들 또는 재조합들, 예를 들어 세포 증식, 세포 분열 (박테리아 분열 또는 DNA 복제 동안 발생하는 오류들로 인한 돌연변이) 또는 주어진 화합물에 저항하거나 저항하게 되는 돌연변이체들의 선택과 같은 자연적인 선택의 기작이라면 모두와 관련된 재조합이라면 모두를 포함할 수 있다. 이들 돌연변이체들 중에는 그들의 게놈 서열 (또는 그들의 플라스미드의 서열)에서, 방사선 조사에 의해, 바이러스에 의해, 트랜스포존들에 의해 또는 변이생성 화합물들에 의해 유발되는 하나 이상의 돌연변이들을 포함하는 균주 I-4290로부터 나온 박테리아라면 모두가 포함된다.

본 발명의 첫 번째 구현예에 따르면, 박테리아 배양으로부터 나온 생물량 (biomass) 전부는, 예를 들어 여과, 알코올 (에탄올, 이소프로판올, 이소부탄올)로의 응집에 의해, 마찰된 층 (prelayer)을 가진 실린더 상의 건조에 의해서와 같은 다양한 기지의 방법들에 의해 분리된 다음, 동결-건조 또는 열-불활성화된 형태로 사용될 수 있다.

또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 일반적인 방식으로 상기 기술된 바와 같은 박테리아, 즉 박테리아 LMB64의 현탁액으로부터 획득된, 박테리아성 분획이라고도 불리는 박테리아 추출물에 관한 것이다.

용어 "박테리아 추출물 (bacterial extract)"은 박테리아성 생물량의 추출물 또는 분획이라면 모두 또는 상기 추출물의 활성을 가진 분획이라면 모두를 말한다. 예를 들어, 이러한 추출물은 제조 방법이 적어도 하나의 박테리아의 용해 단계 또한 원심분리 또는 여과로 구성되는 적어도 하나의 다양한 분획들의 분리 단계를 포함하는, 박테리아 LMB64의 배양액으로부터 획득될 수 있다.

비제한적인 방식으로, 본 발명에 따른 추출물은, 예를 들어 원심분리에 의해 농축되었던 배양 배지로부터 분리된 박테리아 세포들; 또는 세포 외막이 초음파 또는 고압멸균의 작용에 의해서와 같은 당업자들에게 숙지되어 있는 수단이라면 모두에 의해 파쇄되었던 작동을 거쳤던 농축된 박테리아 세포들; 또는 여과에 의해 획득된 상청액으로 구성될 수 있다.

본 발명에 따른 추출물 제조 방법의 중요한 단계는, 예를 들어 핵산들 (염색체 DNA, 염색체외 원형 DNA, 플라스미드들), 리보좀들 또한 글리코겐, 전분 및 폴리-β-하이드록시부틸레이트 등과 같은 세포내 저장된 물질들과 같은 다양한 세포내 구성성분들의 제거를 포함한다.

바람직한 방식으로, 본 발명에 따른 박테리아 추출물은 세포내 구성성분들을 제거하는 방식으로 상기 박테리아 현탁액의 처리 이후에 획득된다.

그 결과는 본 발명에 따른 추출물이 주로 막으로부터, 주변 세포질 공간으로부터 및/또는 세포외 공간으로부터 나온 구성성분들을 포함하는 것이다.

보다 상세하게, 상기 세포내 구성성분들은 적어도 핵산들을 포함한다.

세포내 화합물들의 제거에 추가하여, 또한 비제한적인 예로서, 당업자들이라면 박테리아의 용해 및 원심분리 이후에 배양 상청액의 구성성분들 (이하, 분획 S0) 및 펠렛을 구성하는 구성성분들 (이하, E0)을 분리하는 것도 역시 쉽게 가능하다. 예를 들어, S0 및 E0의 성분들 사이에 분리 한계는 분자량 100 kDa 주변인 것으로 제시될 수 있다. 결론적으로, 분획 S0의 성분들은 대부분 100 kDa 이하의 분자량을 가지는 한편, 분획 E0의 성분들은 대부분 100 kDa 이상의 분자량을 가진다.

보다 상세하게, 주로 표면 단백질들을 포함하는 것들로부터 배양 상청액에서 발견되는 생체분자들 (S0) 또한 박테리아의 주변 세포질 공간에 위치하는 단백질들 (E0)을 추출하고 분리하는 것은 따라서 당업자들에게 숙지되어 있는 기법들에 의해 가능하다.

본 발명의 한 가지 구현예에 따르면, 박테리아 추출물은 적어도 막 단백질들, 세포막간 단백질들 및 편모로부터 나온 단백질들을 포함하는 분획 E0를 포함한다.

세포막간 단백질들은 삼투압 충격에 의해 또는 무질서유발제 또는 계면활성제들을 포함하는 배지에서의 배양에 의해 방출될 수 있는, 그램-음성 박테리아의 주변 세포질 공간에 정착된 단백질들을 포함한다 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제 3판: Sambrook and Russell. CSHL Press).

편모로부터 나온 단백질들은 편모의 다량체 단백질들 또는 편모의 단편들을 포함한다. 박테리아 편모 전부를 계면활성제들로 분리하고 정제하고 초원심분리가 (CsCl 구배의 존재 시) 이어지는 방법들이 문헌에 기술되고 있다. 본 발명에서, 추출 방법들의 예들은 편모 단편들을 회수하는 것을 가능하게 한다.

막 단백질들은 막에 고정되고 일부가 표면 상에 노출된 단백질들 (외부 막 단백질들, 또는 Omp), 막의 표면에 부착된 단백질들, 지질단백질들 및 포린들을 포함한다 (Ward JB., Microbial adhesion to surfaces, 1980).

바람직한 방식으로, 상기 막 단백질들은 포린들 (porins), OmpA, 지질다당류들 (lipopolysaccharides) 및/또는 지질단백질들 (lipoproteins)로 구성된다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 분획 S0을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

보다 상세하게, 본 발명에 따른 박테리아 추출물은 적어도 분비된 펩타이드들 및 단백질들 또한 이차 대사물들을 포함하는 분획 S0를 포함한다.

분비된 펩타이드들 및 단백질들은 박테리아 LMB64에 의해 자연적으로 생산되고 분비되고, 또한 원심분리에 의해 또는 여과에 의해 회수될 수 있는 펩타이드들 및 단백질들을 포함한다.

이차 대사물들은 박테리아 LMB64가 생산하고 배양 배지에 분비하는 작은 분자들을 포함한다.

본 명세서에서 분획 S0 내의 지질다당류들의 존재가 언급되어야 한다. 따라서, 지질다당류들은 주로 분획 E0에서 발견되기는 하더라도, 분획 S0에서 더 적은 양들로 그럼에도 불구하고 역시 발견된다.

유익한 방식으로, 분획들 E0 및 S0는 분획 ES0를 획득하는 방식으로 조합될 수 있고, 예를 들어 배양 배지를 대략 5시간 동안 4℃의 온도에서 배양하고 염기성 배지 (pH 9 내지 11)에서 반응하도록 남겨두는 것에 의해, 원심분리에 의해 또한 투명한 ES0 용액을 획득하도록 0.2 μm에서 여과에 의한다.

따라서 박테리아 추출물 ES0는, 무엇보다도 막 단백질들, 지질다당류들, 세포막간 단백질들, 편모의 단백질 단편들 또한 박테리아에 의해 생산되는 일차 및 이차 대사물들로 구성된다.

바람직한 방식에서, 추출물 ES0는 SDS-PAGE 기법에 따라:

- 밴드 1: 30　kDa 및 36　kDa, 선호하기로는 34　kDa;

- 밴드 2: 41　kDa 및 45　kDa, 선호하기로는 43　kDa;

- 밴드 3: 47　kDa 및 51　kDa, 선호하기로는 49　kDa; 범위의

분자량들에 각각 해당하는 3개의 기본 밴드들을 포함하는 적어도 12개의 밴드들을 포함하는 단백질 프로파일을 가진다 (분자량 표준들, 명확하게는 바이오래드사 (Bio-Rad Laboratories)에 의해 제공된 것과 대비하여 주어진 분자량들과 대략 비교됨).

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 박테리아 추출물은 적어도 분획 E0 및 분획 S0를 포함하는 분획 ES0를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 박테리아 추출물은 각각 30 kDa 및 36 kDa, 41 kDa 및 45 kDa, 또한 47 kDa 및 51 kDa 사이의 범위의 분자량들에 해당하는 3개의 기본 밴드들을 포함하는, SDS-PAGE에 의해 획득된 단백질 프로파일을 가진 분획 ES0를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 박테리아 추출물은 각각 34 kDa, 43 kDa 및 49 kDa의 분자량들에 해당하는 3개의 기본 밴드들을 포함하는, SDS-PAGE에 의해 획득된 단백질 프로파일을 가진 분획 ES0를 포함한다.

또 다른 관점에 따르면, 본 발명은:

a) 박테리아 LMB64를 적합한 배지에서 배양하고; 또한

b) 세포내 구성성분들을 제거하는;

단계들을 포함하는, 박테리아 추출물을 제조하는 방법을 기술하고 있다.

또 다른 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 방법은:

a) 박테리아 LMB64를 적합한 배지에서 배양하고;

b) 상기 배양액을 원심분리하고; 또한

c) 상청액 S0를 회수하는;

단계들을 포함하는, 박테리아 추출물 S0를 제조하는 방법으로 구성된다.

또 다른 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 방법은:

a) 박테리아 LMB64를 적합한 배지에서 배양하고;

b) 상기 배양액을 원심분리하여 상청액을 제거하고;

c) 세포내 구성성분들을 제거하는 방식으로 단계 b)로부터 나온 생물량을 처리하고; 또한

d) 베이스 E0를 회수하는;

단계들을 포함하는, 박테리아 추출물 E0를 제조하는 방법으로 구성된다.

바람직한 방식으로, 단계 c)는 단계 b)로부터 나온 생물량의 초음파 파쇄 처리, 다음으로 상기 세포내 구성성분들을 포함하는 펠렛을 제거하는 것을 목표로 하는 초기 원심분리, 다음으로 상청액의 두 번째의 원심분리로 구성된다.

또 다른 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 방법은:

a) 박테리아 LMB64를 적합한 배지에서 배양하고;

b) 상기 배양액을 원심분리하여 상청액을 제거하고;

c) 단계 b)로부터 나온 생물량을 초음파 파쇄로 처리하고;

d) 초음파 파쇄로 처리된 상기 생물량을 원심분리하여 획득된 생물량을 제거하고;

e) 단계 d)로부터 나온 상청액을 원심분리하고; 또한

d) 베이스 E0를 회수하는;

상기에 기술된 다양한 방법들은 설명을 위해서만 제공되고, 당업자들에게 숙지되어 있는 방법들이라면 모두가 사용될 수 있는 점을 주목해야 한다.

하기 실시예들로부터 자명해질 바와 같이, 본 출원인은 본 유형의 추출물의 경우 기대되는 활성들에 추가하여, 이전에 전혀 기술된 적이 없었던 여러 가지의 새로운 활성들을 보여주었다.

본 발명의 첫 번째 유익한 관점은 면역조정과 관련하여 전면역성 사이토카인들의 조정 (modulation) 특성에 있다. 보다 상세하게, I본 발명에 따른 박테리아 및/또는 추출물의 사용은 Th1 면역 반응에 선호적으로 관여하는 사이토카인들 IL-10, IL-12 및 TNF-α을 유의하게 유도하고, 사이토카인들 IL-4 및 IL-6을 유의하게 저해한다. 그 결과는 랑게르한스 세포들의 활성화 및 Th1/Th2 균형의 회복이다.

또한, 또 다른 관찰은 본 발명에 따른 박테리아 및/또는 추출물의 사용이 IgE 수용체들의 발현을 크게 감소시키는 것을 가능하게 하고, 이는 IgE가 알레르기 현상을 강화시키는 점에서 흥미롭다.

본 발명의 또 다른 장점은, 실시예들로부터 자명하게 될 바와 같이 본 발명에 따른 박테리아 및/또는 추출물의 사용이 예를 들어 펩타이드들 hBD-2, hBD-3, S1007A 및 LL-31와 같은 항미생물성 펩타이드들의 생산을 유도하는 점에 있다.

보다 상세하게, 상기에서 언급된 바와 같이 박테리아 비트레오실라 필리포르미스 (Gueniche A. et al., Eur J Dermatol 2006; 16: 380)의 추출물은 OmpA의 존재로 인한 TLR2 상의 활성, 또한 지질다당류들의 존재로 인한 TLR4 상의 활성으로 알려져 왔다. V. 필리포르미스 박테리아에서 편모의 부재 때문에, V. 필리포르미스로부터 획득된 추출물은 TLR5 활성을 전혀 가지지 않는다.

맨처음으로, 본 출원인은 TLR2 및 TLR4 상의 활성에 추가하여, TLR5 상의 활성을 가지는 본 발명에 따른 박테리아 추출물을 기술하고 있다.

따라서 본 발명은 상기에 기술된 바와 같이 TLR2, TLR4 및 TLR5의 활성인자로서 박테리아 및/또는 박테리아 추출물의 용도에 관한 것이다.

바람직한 방식으로, 상기 박테리아 추출물 TLR2, TLR4 및 TLR5의 활성인자는 편모로부터 나온 단백질들 모두 또는 일부를 포함하는 추출물로 구성된다. 본 경우에 예로서, 상기 추출물은 바람직하게 추출물 E0 또는 추출물 ES0이다.

상기 TLR5 활성화 활성은 TLR5가 소리아신 (psoriasin, S100A7) 및 hBD-2 (Glaser et al ., Journal of Investigative Dermatology (2009) 129, 641-649)와 같은 소정의 항미생물성 펩타이드들을 유도하는 것으로 알려져 있는 점에서 유의하게 흥미롭다. 게다가, TLR5 작동제들은 TLR2 및 TLR4의 작동제들과 상승 작용을 하여, 항미생물성 펩타이드들의 생산을 강화시키는 것을 가능하게 한다. TLR5를 항체로 차단하여, 후자가 거의 또는 전혀 생산되지 않는 점이 확인되어 왔다.

따라서 본 관점은 상세하게 본 발명에 따른 박테리아 및/또는 추출물들에 대한 면역조정 출원들의 견지에서 혁신적이다.

또한 예기치 않는 방식으로, 본 출원인은 지금까지 기술된 박테리아 추출물들과는 대조적으로 PAR2로의 길항적 활성도 역시 보여주었다. 본 활성은 항염증 치료들의 맥락에서 유의하게 흥미롭다.

따라서 본 발명은, 매우 상세하게 상기 기술된 바와 같은 박테리아 및/또는 박테리아 추출물의 PAR2 길항제로서의 용도에 관한 것이다.

바람직한 방식으로, 상기 PAR2 길항제 박테리아 추출물은 추출물 S0 또는 추출물 ES0로 구성된다.

PAR2는 내피세포들, 결장 근육세포들, 내장세포들, 내장 뉴런들, 면역세포들 및 각질세포들에서 과다 발현된다. 환경에 풍부하게 존재하는 프로테아제들 (트립신, 트립타제)은 PAR2를 본 동일한 수용체를 활성화하는 특이적 펩타이드를 노출하는 N-말단에서 절단한다 (자가-활성화의 현상). 결론적으로, 이것은 전염증성 사이토카인들의 생산을 활성화하고 염증을 촉발시킨다 (Vergnolle, N. 2009 Pharmacol. Ther. 123: 292-309). 본 현상은 야생의 마우스에서 관찰되지만 KO 마우스 (PAR2 결핍)에서는 출현하지 않는다. 항프로테아제 및/또는 PAR2 길항제로의 치료는 본 염증 현상을 피하는 것을 가능하게 한다.

이들 활성들 모두의 조합 및 상승작용은 본 박테리아 LMB64, 또는 본 동일한 박테리아로부터 나온 추출물이라면 모두에게 염증성 질환들, 매우 상세하게는 PAR2가 관여하는 및/또는 면역 체계가 약화되거나 교란되거나 불균형된 염증성 질환들을 치료하도록 높은 잠재력을 부여한다.

따라서 본 발명은 피부과학적 염증성 장애들의 치료 및/또는 예방을 목적으로 하는 조성물의 제조를 위한, 상기에 기술된 바와 같은 박테리아 및/또는 상기 박테리아로부터 나온 추출물의 용도에 관한 것이다.

바람직한 방식으로, 상기 피부과학적 염증성 장애들은 아토피 피부염, 소양증, 습진 및 건선을 포함한다.

또 다른 구현예에 따르면, 본 특허 출원의 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 박테리아 및/또는 적어도 하나의 박테리아 추출물을 활성 성분으로서 포함하는, 조성물에 관한 것이다.

따라서 본 발명은 바람직한 방식으로 미용적 또는 피부과학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 조성물은 피부과학적 염증성 장애들의 치료에 관한 것이다.

본 발명에 따른 조성물은 상세하게 연화제들, 경화제들, 젤화제들, 물 결합제들, 도말제들, 안정화제들, 채색제들, 향료들 및 보존제들과 같은 첨가제들 및 제형물 보조제들을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 미용적 또는 피부과학적 조성물은 상기에 더하여 하나 이상의 전형적인 피부과학적으로 적합한 부형제들을 포함한다.

본 발명에 따른 조성물은 오일-내-물 (W/O) 또는 물-내-오일 (O/W) 에멀전, 예를 들어 물-내-오일-내-물 (W/O/W) 또는 오일-내-물-내-오일 (O/W/O) 에멀전과 같은 복수의 에멀전, 마이크로에멀전의 형태로, 또는 수성분산액 또는 지질분산액, 젤 또는 에어로졸의 형태로 제조될 수 있다.

피부과학적으로 또는 미용적으로 적합한 부형제들은 밀크, 크림, 밤, 오일, 로션, 젤, 거품형성 젤, 포메이드, 스프레이 등의 형태로의 국소적 적용을 위한 조성물을 획득하기 위하여 당업자들에게 숙지되어 있는 부형제들 중에 있는 부형제라면 모두일 수 있다.

피부과학적 및 미용적 조성물들에 추가하여, 본 발명은 약물로서 사용을 위한 약제학적 조성물들에 관한 것이기도 하다.

따라서 본 발명은 상기에 더하여 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 상세한 설명에서, "약제학적으로 허용가능한 담체 (pharmaceutically acceptable carrier)"은 이차 반응들을 유발하지 않고, 또한 예를 들어 활성을 가진 화합물들의 투여를 용이하게 하여 신체에서 그들의 수명 및/또는 효율성을 증가시키거나, 용액에서 그들의 용해도를 증가시키거나 그들의 보존성을 개선시키는 약제학적 조성물의 일부가 되는 화합물 또는 화합물들의 조합을 말한다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체들은 잘 알려져 있으며, 선택된 활성을 가진 화합물들의 성질 및 투여의 방식에 따라 당업자들에 의해 적응될 것이다.

바람직하게, 상기 화합물들은 근육내, 피부내, 복강내 또는 피하적 경로에 의해, 또는 경구적 경로에 의해 전신적으로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 항체들을 포함하는 조성물은 일정 기간에 걸쳐서 여러 번의 용량들로 투여될 수 있다.

그들의 최적의 투여 방식들, 투여 스케쥴들 및 생약 형태들은, 예를 들어, 환자의 연령 또는 체중, 환자의 일반적인 건강의 중증도, 치료에 대한 내성 및 주목된 부작용들과 같은 환자에게 적응된 치료의 확립에서 고려된 판정기준들에 따라 결정될 수 있다.

본 발명은 그의 범주를 제한하지 않고 본 발명을 설명하는 하기 실시예들의 고려할 시 더 잘 이해될 것이다.

도 1은 균주 LMB64의 16S rRNA를 코딩하는 서열의 계통유전학적 위치를 나타낸 것이다.
도 2A 및 2B는 투과 전자현미경 (A) 및 주사 전자현미경 (B) 하의 박테리아 LMB64의 영상들을 나타낸 것이다.
도 3은 R3 배양 배지의 온도, pH 및 염도의 함수로서 결정된 성장 최적 조건들을 나타낸 것이다.
도 4는 추출물 E0에 의한 사이토카인들 IL-10 및 IL-12의 유도 (용량-의존성 효과)를 나타낸 것이다.
도 5는 추출물 EO에 의한 표면 분자들 CD80, CD86, CD83 및 CD54의 유도 (용량-의존성 효과)를 나타낸 것이다.
도 6은 추출물 E0에 의한 IgE 수용체들의 저해를 나타낸 것이다.
도 7은 추출물 ES0에 의한 TLR2의 활성화를 나타낸 것이다.
도 8은 추출물 ES0에 의한 TLR4의 활성화를 나타낸 것이다.
도 9는 추출물 ES0에 의한 TLR5의 활성화를 나타낸 것이다.
도 10은 추출물 ES0에 의한 특이적 PAR2 길항제 활성을 나타낸 것이다.
도 11은 추출물 ES0에 의한 항미생물성 펩타이드들 및 단백질의 유도를 나타낸 것이다.
도 12는 추출물 ES0의 SDS-PAGE 젤을 나타낸 것이다.

실시예 1: 박테리아 LMB64 의 선별 및 특성분석

박테리아 AV13이 지하수로부터 분리되었다.

새로운 박테리아 LMB64의 분류적 위치는 도 1에 제안되어 있다.

보다 상세하게, 박테리아 LMB64는 대략 2.3 μm (± 0.3)의 길이 및 대략 1.0 μm (± 0.1)의 너비를 가진 막대-모양이다. 본 박테리아의 구별되는 특징은 극성 편모의 존재이다 (도 2A 및 2B). 이들 영상들에서 역시 관찰될 수 있는 바와 같이, 박테리아 LMB64는 비미세섬유성 박테리아이다.

상기에서 언급된 바와 같이, 박테리아 LMB64는 대략 11 kpb의 원형의 플라스미드를 가진다. 본 플라스미드는 완전하게 서열결정 되었다 (서열번호 2).

16S rRNA를 코딩하는 유전자도 역시 서열결정 되었다 (서열번호 1). 박테리아는 합성 배지를 넣은 발효기에서 배양되었다. 성장 속도는 배지가 낮은 농도의 탄소 기질들을 가질 때 더 높다.

테스트된 배양 배지는 하기 표들 1a, 1b 및 1c에서 그들의 조성들이 각각 기술되어 있는 R3, MS-포도당 및 LB 배지이다.

박테리아 LMB64의 성장 속도들은 배양 배지의 함수로서 하기 표 2에 나타나 있다.

성장의 최적 조건들은 R3 배양 배지의 온도, pH 및 염도의 함수로서 결정되었다 (도 3).

박테리아에 의해 동화가능한 탄소의 출처들은 API 50CH 갤러리를 사용하여 (배양 온도: 25℃) 특성분석되었다. 그 결과들은 하기 표 3에 요약되어 있다.

API ZYM 갤러리 상에 보여진 효소적 활성들로는: 알칼라인 포스파타제, 에스터라제 (C4), 에스터라제/리파제 (C8), 루이신 아릴아미다제, 발린 아릴아미다제, 산 포스파타제, 나프톨-AS-BI-포스포하이드로라제, 및 α-글루코시다제이다.

박테리아 LMB64는 하기 표 4에서 관찰된 바와 같이 테스트된 항생제들 모두에 대해 민감하다.

실시예 2: 분획들 E0 , S0 및 ES0 를 추출하는 방법

전배양 : 균주 AV13은 250 mL의 MS 포도당 피루베이트 배지를 포함하는 얼렌마이어 플라스크에 접종되고 (하기 표 5를 참조하라), OD₆₀₀ ≒ 1.5가 획득될 때까지 30℃ 및 200 rpm에서 대략 40시간 동안 교반 하에서 배양이 이어진다.

배양: 전배양액은 다음으로 3.7 L의 MS 피루베이트 배지 + 114 mL의 20% 포도당 용액을 포함하는 발효기 (아프리콘사 (Applikon))에 접종된다. 온도 센서가 바람직하게 30℃ 주변으로 온도를 조절한다. 산소 센서 (아플리센스사 (AppliSens))가 배지에 용해된 산소의 농도를 18 내지 25%로 유지하는 데 사용된다. pH 센서 (아플리센스사)가 고정된 유속 펌프를 통한 10% NH₄OH의 첨가에 의해 pH를 7로 유지하는 데 사용된다. 웨지우드 분석 센서가 실시간으로 광학 밀도에서 변화들을 감시하는 데 사용된다. 배양은 배지첨가-회분식 방식으로 프로그램화된다; 가변성 유속 펌프를 통해 배양액은 20% 포도당 용액이 보충된다. 발효는 OD₆₀₀ ≒22 내지 26일 때, 일반적으로 대략 30시간 이후에 정지된다.

추출 S0 : 상청액은 4℃에서 1시간 동안 4,000 rpm으로 원심분리에 의해 생물양으로부터 분리된다.

추출 E0 : 젖은 생물량은 NaCl 용액 (1　M)에 넣어둔다. 4℃에서 15분 동안 9,000 g로 원심분리 이후에, 상청액은 버리고 펠렛은 1　M NaCl 용액에 넣어둔다. 다음으로 시료 튜브는 식힌 초음파 수조 내에 50 내지 60　W의 전원 설정으로 수 분 동안 담구어 둔다. 4℃에서 30분 동안 6,000 g로 원심분리 이후에, 펠렛은 버리고 상청액은 회수된다. 두 배의 차가운 에탄올이 첨가되고 현탁액을 4℃에서 하룻밤 방치한다. 4℃에서 30분 동안 9,000 g로 원심분리 이후에, 상청액은 버리고 펠렛은 25　mM 트리스 완충액, pH 8.8에 넣어둔다.

추출 ES0: 배양액은 염기성 완충액으로 염기성 pH (pH 9 내지 11)로 맞춘다. 다음 단계는 4℃의 온도에서 5시간 동안 교반 하에서 배양이다. 원심분리 이후에, 상청액은 남아있는 생물량 잔재를 제거하도록 미리 여과된 다음 0.2 μm 필터 상에서 여과된다. 투명한 노란색 용액이 획득된다 (ES0).

단백질들은 DC 단백질 검정 키트 Ⅱ (바이오래드사) 프로토콜에 따라 검정된다. 슈가들은 페놀/황산 방법에 따라 포도당 당량으로 검정된다 (Dubois, M. et al., 1956).

예로서, 하기 표 6은 상기에 기술된 조건들 하에서 획득된 바와 같이 추출물 ES0의 소정의 특이적 특징들을 제시하고 있다.

상기 데이타는 본 명세서에서 단지 설명의 목적들을 위해 제시된 것으로 분명하게 이해된다.

보다 명확하게, 본 데이타는 세 개의 기본 밴드들을 나타내는 SDS-PAGE에 의해 획득된 단백질 프로파일에 관한 것이다.

SDS - PAGE 프로토콜:

추출물 ES0은 완충액 (20　mM 트리스-HCl, pH 8.0; 1　mM EDTA; 2.5% SDS 및 0.01% 브로모페놀 블루) 및 1　M DTT (1,4-디티오트레이톨)에 넣어둔다. 시료 및 분자량 마커들의 혼합물 (WesternC, 바이오래드사)은 8 내지 16% SDS-PAGE 아크릴아마이드 젤 (GeBaGel, 진 바이오-어플리케이션사 (Gene Bio-Application))의 웰들에 각각 올려졌다. 전개 완충액은 2.5　mM 트리스, 19.2　mM 글리신 및 0.01% SDS (w/v)를 포함한다. 전개는 대략 1시간 동안 160　V의 일정한 전압 하에서 진행되도록 허용된다 (GeBaGel 시스템). 다음으로 단백질 밴드들은 쿠마시 블루 (인스턴트 블루, 엑스페디온사 (Expedeon))로 염색되었다. 크기들은 기지의 표준들 (STD)과 대비하여 계산되었다.

획득된 젤은 도 12에 나타낸다.

본 발명의 한 가지 구현예에 따르면, 이들 세 개의 밴드들은 대략 34　kDa, 43　kDa 및 49　kDa의 분자량들을 각각 가진다.

실시예 3: 분획들 E0 및 ES0 의 약물학적 활성들의 확인

랑게르한스 세포들 (LC)은 프랑스 국립 혈액원 (French National Blood Service, Etablissement Francais du Sang (EFS) Pyrenees Mediterranee)으로부터 나온 백혈구-연층 파우치들로부터 분리된 인간 단핵구들로부터 시험관내 생성되었다: 피콜 구배 상의 분리 (림프구 분리 배지, 밀도 1.077　g/ml) 및 자기 면역선택에 의한 정제 (밀테니 바이오테크사 (Miltenyi Biotec)); LC 분화는 사이토카인 칵테일 (GM-CSF/IL-4/TGFβ)의 존재 시 6일 동안 수행된다. RPMI-5% FCS 배양 배지를 넣은 24-웰 플레이트들 상에 배분된 LC는 추출물 ES0와 함께 24시간 동안 배양된다.

표면 분자들은 유동 세포측정법 (FACSCalibur, BD Biosciences)에 의해 삼중 또는 사중 염색: CD1a/CD54/CD80/CD83/CD86/FcεRI으로 분석된다; 배양 상청액들에서 분비된 사이토카인들은 유동 세포측정법에서 세포측정법 비드 어레이 (Cytometry Bead Array, 카탈로그 번호 550749, BD)로 분석된다: IL-6, IL-8, TNF, IL-4, IL-10, IL-12.

3.1 Th1 극성화를 위한 핵심 사이토카인들의 유도

추출물 E0는 용량-의존성 효과에 따라 랑게르한스 세포들에 의한 사이토카인들 IL-10 및 IL-12의 발현을 유도한다 (도 4). 이들 사이토카인들은 순수한 T 림프구들의 TH1 극성의 유도를 촉진한다.

3.2 랑게르한스 세포 성숙 및 IgE 수용체 ( Fc ε RI ) 저해

추출물 E0는 표면 분자들 CD80, CD86, CD83 및 CD54의 용량-의존성 유도에 의해 관찰되는 랑게르한스 세포들의 성숙을 유도한다 (도 5). 유사하게, 추출물 E0는 용량-의존성 효과에 따라 IgE 수용체들 (FcεRI)의 발현을 저해한다 (도 6).

3.3 톨-유사 수용체들 ( TLRs )의 활성화

추출물 EO의 TLR 활성은 TLR2, TLR4 또는 TLR5를 위한 유전자에 의해 또한 리포터 유전자 NFκB-sAP (분비된 알칼라인 포스파타제)에 의해 공형질전환된 HEK293 세포들의 모델을 사용하여 TLR2, TLR4 및 TLR5 상에서 평가되었다. 그의 TLR과 리간드의 결합은 전사인자 NFκB의 활성화를 유발하고; sAP 유전자는 NFκB에 의해 유도될 수 있는 프로모터의 조절 하에 배치된다. 본 리포터 유전자는 TLRs를 통한 세포 신호전달을 감시하는 것을 가능하게 한다: ES0에 의해 유도되고 비색 검정법에 의해 측정되는 sAP의 방출은 TLR2, TLR4 또는 TLR5 작동제로서 본 활성 성분의 활성을 결정하는 것을 가능하게 한다.

본 연구는 다음의 인간 배아 신장 (HEK293) 세포주들 상에서 수행되었다:

- TLR2를 위한 HEK-Blue^TM-2 세포들,

- TLR4를 위한 HEK-Blue^TM-4 세포들,

- TLR5를 위한 HEK-Blue^TM-5 세포들.

이들 세포주들은 HEK-Blue^TM 선택 10% FCS 배양 배지에서 유지되었고, 다음으로 ES0 존재 시 HEK-Blue^TM 검출 배지를 넣은 96-웰 플레이트에 18시간 동안 배분되었다. 플레이트들은 620　nm에서 비색측정법을 사용하여 해독되었다.

3.3.1 TLR2의 활성화

추출물 ES0는 용량-의존성 효과에 따라 100　ng/mL에서 최대의 활성으로 TLR2의 활성화를 유도한다 (도 7).

3.3.2 TLR4의 활성화

추출물 ES0는 10　ng/mL에서 최대의 활성으로 TLR4의 활성화를 유도한다 (도 8).

3.3.3 TLR5의 활성화

추출물 ES0는 용량-의존성 방식으로 TLR5의 활성화를 유도한다. 본 활성은 항-TLR5 항체의 존재 시 저해되고, TLR5 상에서 추출물 ES0의 활성화 특이도를 보여준다 (도 9).

3.4 프로테아제-활성화 수용체 2 ( PAR2 )의 저해

추출물 ES0에 의한 프로테아제-활성화 수용체들의 저해는 세포주 (HaCaT)로부터 나온 인간 각질세포들 상에서 각질층 트립신 효소 (SCTE)로 PAR2의 특이적 자극 이후에 유도된 세포내 칼슘 유입을 측정하여 평가된다. 형광성 탐침 Fluo-4/AM이 사용된다: 그의 에스테르화된 형태는 세포에서 수동적 확산에 의해 그의 침투를 용이하게 한다; 칼슘 이온들과 결합된 탈에스테르화된 형태만이 485 nm 형광 하에서 여기가능하고 535 nm에서 방출한다.

형광성 탐침은 96-웰 플레이트들에 접종된 세포들에서 30분 동안 도입되고 다음으로 추출물 ES0가 30분 동안 배양된다. 칼슘 유동이 SCTE의 주입 이전 및 이후에 역학에 따라 실시간으로 웰마다 측정된다. 플레이트들은 미스라스 LB940^TM 리더 (베르톨드 테크놀로지사^® (Berthold Technologies^®)를 사용하여 해독된다.

추출물 ES0은 용량-의존성 방식으로 인간 SCTE에 의해 유도된 PAR2의 활성화를 저해한다 (도 10).

3.5 각직세포들 상의 아토피 피부염의 표적들의 조정

본 연구는 아토피 피부염 표현형의 유도의 맥락에서 정상적인 인간 표피 각질세포들 (NHEK, K-SFM 배양 배지) 상에서 수행되었다. ES0의 활성은 폴리 I:C + IL-4 + IL-13 + TNF-α로 24시간 동안 자극 이후에 아토피 피부염을 나타내는 각질세포들 상에서 연구되었고 32개 선택된 유전자 패널의 발현 상에서 PCR 어레이에 의해 분석된다.

각질세포들 상에서, 추출물 ES0는 하기 표 7에서 분명하게 관찰될 수 있는 바와 같이, 아토피 피부염 병리학에 관여하는 매개인자들 중에서 15개 표적들을 용량-의존성 효과에 따라 저해하였다 (결과들은 각 표적 유전자를 위한 획득된 저해의 백분율을 가리킴).

3.6 항미생물성 펩타이드들의 유도

항미생물성 펩타이드들 및 단백질들의 발현에 주는 추출물 ES0의 활성이 HaCaT 각질세포 세포주에 관해 연구되었다: ES0의 존재 시 3시간의 치료 이후에, 세포들이 정량적 RT-PCR에 의한 항미생물성 표적들의 발현의 분석을 위해 회수된다; 전체 RNA가 추출되고 검정된다; mRNA의 cDNA로 역전사 이후에, 정량적 PCR 증폭 단계가 iCycler 정량적 PCR 시스템 (바이오래드사) 상에서 96-웰 플레이드들에 넣어 수행된다. 획득된 결과들은 활성 성분이 없는 대조군과 대비하여 ES0로의 처리 이후에 mRNA의 상대적인 양 (RQ)으로서 표현된다. IL-1β가 항미생물성 펩타이드 발현의 기준 양성 유도인자로서 동시에 사용된다. 관심 있는 유전자의 발현은 RQ ≥ 2 (유도) 또는 RQ ≤ 0.5 (저해)일 때 조절되는 것으로 사료된다.

추출물 ES0은 항미생물성 펩타이드들 및 단백질들 hBD2, hBD3, S1007A, LL37, PI3, RNase 7 및 NOD2의 발현을 유도한다 (도 11).

실시예 4: 박테리아 추출물 ES0 를 포함하는 "몸과 얼굴" 크림의 제형물

실시예 5: 박테리아 추출물 ES0 를 포함하는 "몸과 얼굴" 세정젤의 제형물

COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES

CNCMI-4290

20100408

SEQUENCE LISTING <110> PIERRE FABRE DERMO-COSMETIQUE UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE (PARIS 6) CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) <120> NOVEL BACTERIUM AND EXTRACTS OF SAID BACTERIUM AND THE USE OF SAME IN DERMATOLOGY <130> D29306 <140> PCT EP2011/073747 <141> 2011-12-22 <150> FR 1061081 <151> 2010-12-22 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1487 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Novel bacteria LMB64, belonging to the class of betaproteobacteria, from groundwater <400> 1 agtttgatca tggctcagat tgaacgcggg cggcatgctt tacacatgca agtcgaacgg 60 cagcacgggc ttcggcctgg tggcgagtgg cgaacgggtg agtaatgcgt cggaacgcgc 120 cgagtagtgg gggataacgc agcgaaagct gtgctaatac cgcatacgta ctgaggtaga 180 aagtggggga ccttcgggcc tcacgctatt cgagcggccg acgtctgatt agctagttgg 240 tggggtaaag gcccaccaag gcgacgatca gtagcgggtc tgagaggatg atccgccaca 300 ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat tttggacaat 360 gggcgcaagc ctgatccagc catgccgcgt gtctgaagaa ggccttcggg ttgtaaagga 420 cttttgtccg ggagcaaagc ctgcttgtta ataccgagtg gggatgagag taccggaaga 480 ataagcaccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggtgc aagcgttaat 540 cggaattact gggcgtaaag cgtgcgcagg cggttgtgca agtctgatgt gaaagccccg 600 ggctcaacct gggaacggca ttggagactg cacggctaga gtgcgtcaga ggggggtaga 660 attccacgtg tagcagtgaa atgcgtagag atgtggagga ataccgatgg cgaaggcagc 720 cccctgggat gacactgacg ctcatgcacg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac 780 cctggtagtc cacgccctaa acgatgtcaa ttagctgttg ggggtttgaa tccttggtag 840 cgaagctaac gcgtgaaatt gaccgcctgg ggagtacggc cgcaaggtta aaactcaaag 900 gaattgacgg ggacccgcac aagcggtgga tgatgtggat taattcgatg caacgcgaaa 960 aaccttacct gctcttgaca tgtaccgaag cctgaagaga tttgggtgtg cccgaaaggg 1020 agcggtaaca caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag 1080 tcccgcaacg agcgcaaccc ttgtcattag ttgccatcat ttggttgggc actctaatga 1140 gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcctcat ggcccttatg 1200 agcagggctt cacacgtcat acaatggtcg gtacagaggg tcgccaagcc gcgaggtgga 1260 gccaatctca gaaagccgat cgtagtccgg atcgcactct gcaactcgag tgcgtgaagt 1320 cggaatcgct agtaatcgca gatcagcatg ctgcggtgaa tacgttcccg ggtcttgtac 1380 acaccgcccg tcacaccatg ggagtggggg ataccagaag tgggtaggct aaccgcaagg 1440 gaggccgctt accacggtat gcttcatgac tggggtgaag tcgtaac 1487 <210> 2 <211> 10948 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Novel bacteria LMB64, belonging to the class of betaproteobacteria, from groundwater <400> 2 gggcgcagca ccatcgccca ggccaaaagc cacccgtgcc gattcggcgg cctgttgctc 60 gcgctcaatg cgctgcgcct ggtcggccaa gtcggcggct tgctgctcgg ccttgcccgc 120 cagggtgtca cgctcgcggg tcagttccgc cacctgctcg gctagggcat cgcgctcggc 180 ctcgatcacc tcaccagcgg ccgccagctc ggcggcttcg ctctgcgcct ggaccaagcg 240 gccctcgacc tcggcgcggg cctgggcggc tgcgcgctcg atctcggcgg caatggcggc 300 ggtcaatgcc tggggcagtt ccggcgcagc agcagcggcc accggccggg cctctcgcca 360 ggcagttaga tgcttgtgaa cggtattcgg gctgccggtg cccaaacgct cgcggatcgc 420 gcggatagtc ggctgctgcc cttcgccgac cagcgcatca gcggcggcgg cgaacgggtg 480 gcccgtgcag aggcccgcgt cgagcagatc gagcagcagg ccgccaaggc ggcacaggcc 540 cacgaagaag cccgcgccgc cgccacgcag gaagcccggc aagtgcaagc cgaacgcgac 600 gaagcccgca aggtggccgc cgaggcgcgc gagcagaccg cgcgcctggc tgggcaactc 660 gaagccctca ccgcgaagga gcgaaaagcc gatgaaagac cgtgaccaca acgaagcgat 720 ggccggcatg tttcaggccg acccccgatt tgccgccgac tatctgcgcc aggtgttggc 780 cgatggcgag cctaccgacg tgcgcgccgg cttgcggcaa atggcggatg tgctgcgcgt 840 cagtcaggcc gccgcgccga ccgattctgc gccttcggcg ggcctctttg accgggccgg 900 cgtgcgctac gaagtggcgt gcgatgtgat cggggcgttg attgcccatt acgccgaaat 960 catgggacgg gaacgcgagc aggcgcagcc gaatgaggcg gttttgcgcg tggccggagc 1020 catgaaggcg gcgctggccg gggagcggga tgatctcgat ccgcgcgata gcgccggcat 1080 cgaggcggcg atttcgcgct atgcgccact ggcgcgccgg ctgtatggcc aggctgaaaa 1140 cgaccacgcc cgccaggaac agcgtcgcgc cgatttcgac caggtgcatg cttcgctggc 1200 cttggagggg ctggccatga gcgcggacga tttggcggtt caggcgctgc tgatccgggg 1260 cgacattacc cacgatgagg cggtgcagtg ctaccgcatc ctgcatcgcc atgcgcggta 1320 aaaccgactg gccgcccgag gtggccggtg tgctgggttt gctcgaatcg cagccgccag 1380 aggcggcgat gctggtgggc tgttttctgg cggcggtagc ccatcccgat catgcggccg 1440 aattggcgat gttcgacaaa ttgccgccag cggcccggat ggtcgtcggg cgatttttcc 1500 tcgtttttct ggcgggcggc ctggacgatg ccgggcgcga aaaactgcat tcgcacatgc 1560 aggcatggtt tgtccgtcag cgccgttttc ggtgaatggc ttgcctcatc cactagggcc 1620 gggcaagggg tgaacagcgg gcgatgctgg cttgcgggac gaccccgcac ccccggaaaa 1680 cttgtcacac accacgcaac tcccgttgct tcgctaaaag ccttgtgccg caaggctttt 1740 agcgaggcga caccgaagac acatcgcggc gacaccgaaa gggccgaacc ggcctaaaac 1800 ccttgctgcg caaggagaac agccgcgctt tcgcgcgcga aagtgcttca aatgcctgtc 1860 ggcatcagca gggtatggat cggcacgccg aaggcgttgg cgatgcgctc caggttgtcc 1920 aaggagatgt ttctgacttg gcgctcgcag tgcgcaacga aggtgcgatg taggccgcac 1980 tcaaaggcga gcgcttcttg tgaccagcct ctttcccggc gtaatcggat catgttggcc 2040 gcgagcacgg cccgcgcgga atgcgcggtt ggtgcgggag gttgagcggc gggagacatg 2100 caaaccagtc tcctgatatg ccgcttttac gtcagccgtg tttaagtcac aatatggttt 2160 tctcatagag aaagacggcg tgacgatggg 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gccgatgaaa aagggccggt acggctccat 3900 cgcggtcagg ctgccaaccc atgagccacc aatgccaagc accagcagga caagcggccc 3960 gacacagcac accgacgcgc cgatggcggt cagtacgctc acgatcaacg agcttttttc 4020 agtgagtcgt gccatgtcgc tttccttgta cctgtttgcc caagtgttac tctaaatccc 4080 gtacctaagt acggagtcaa gggggtgtga tgggaacaga actgaccatc ggcaagctgg 4140 ctgacgctgc cggggtgaat atcgagacga ttcgctacta ccagcggcgc ggcctgctgg 4200 atgagccgcc taaaccgcca ggggggcatc ggcgctatgc gcctgagcag gcaaaacgtg 4260 tgcgatttat caagcgggca caggcgcttg gtttcacgct ggacgaggta ggcgcgctac 4320 tgaccctgga tgcggcctgc gcctgcggtg agacgcgagc gctggctgtg cgcaagctgg 4380 gtctgatcga gcagaagatg gctgacctcg cggccatgcg gcaggcgctg ggtggattgg 4440 tgcagcagtg tgatgcgggc gacggtggag ccagctgtcc catcatcgac gtgctggcag 4500 gtaattagat gtgttcaaaa aatggtggtt ttctggacac atgccggttt gccctgtcct 4560 gagttgtcct gatgcgttaa agtgttcatt tattcgttca gctttcaatg tggcggaact 4620 gttcatgaat caacgcatcg gctatgcccg cgtttcgacc gacgaccaaa acctagacct 4680 gcaacgggac gcactccggc aggctggatg 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tatgccgatc agggcaacgg ccgcaggcag 5580 tacccggtgg ttgacctcgt ggtctgccac ggcgacttcc tcaacgccga tcacaactac 5640 gtccataaga acaagagcgt aaagggcttt ggcacctacg gcgacatcat gatccgcgac 5700 cggaagatgt acgtcgcgcc gacgccattt gcgctgaccg aaggcaccac tggcctgatg 5760 actttgatcc tgccggagaa cttcggcacc gatgaccgtt accaggtggt cggtaacctc 5820 actcgcgtcg aggcggaaac gctggtggtt ggctacaact ttgacctgcg cacgaacgag 5880 ctgagcgcag agcgcgtgcc caatcccaac gcaggcaccc agcaccgatt cgtggcctac 5940 cggctcaagg atcaagcgag caagcctgtc tccatgactg gcacccaggt gcagcccgac 6000 gagaacaacc tgccggacga cgaatgaaca ccatcaccga caagatcggg ttcgcttacc 6060 cggttgcagc gaccgcgctg gagtgcgact tcccgctggt cgaaatcagc cagatcgccg 6120 agcaggaaag ttggcgaaag gagatcaaca ggccgatcta ccacatccac aagtggtggg 6180 cgaccagact tgggtcggtg tttcgtggca ttacccttgg tgctttgagt cagcctggta 6240 ctgacctctg ggcgcagttc tacaaaacgc acgacctggc cggtaaggta gtgctcgatc 6300 ccttcatggg cagtggcacg acgcttggcg aggccgtcaa gctgggtgcc aaggccatcg 6360 gctgcgacat caacccagtc agtaccttcc 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agttgtggaa atacgtatct acacaactgc 8940 gtaaaatttg atataatacg tacatgcgta ttaatggaga tacgtaaatg gctaaaactg 9000 catctttgac tgccggcctg gtggccaaga aaggggaggc gtcccctgct acggttgtcg 9060 cggcacccca ggttcaacct atcgaagtga aggcatcggc gactggcggc ggccgggatt 9120 actacaaggc gttgaccgtc aagttggatc gtgaccgcta cgagagtctg aaaagcatgg 9180 gcgtgaagct ggacaagaag agccaggaaa tctttgtcga ggccctggat ttgtggatga 9240 agtcggccgc tggccagcaa cacgcctaag aggcccctat gcgttcagtg cgctctgccg 9300 tcgaactcgc caaggagttg gccgaaaaag ccaaggcccg ccgcctagcg gcggaaaaga 9360 acgagctggg acttgaaggc ccggcgcagg gcaacgccgg caccactccc agcccggtga 9420 aggttgcggc cgaagtggtg ggcgagcagc cggcacgacg caagggagcg ccgaaagggc 9480 cgcgtggcct gatgccggtg catcatccaa accgcgattt cttcttgtgc gatctgtttg 9540 actacgccct aaaggatgac ggcgtgagca tggaggcccc catcttcacc ttggcaacca 9600 ggccggacac ctctgtttgg cattgggaaa gcaaggatgg gacacgcgcc atcaccgtca 9660 cgccaagcgt gaaggggagg gccacgcagt ttgataagga tttacttatt tacgtagtta 9720 gccagatgac cgaggctatc aatcgcggtc ggcctgatgc gaacaatcga accgtgcgct 9780 ttcgcgtcta tgactacttg gtctcaacca acaagccgac tggcggcaag gagtaccagc 9840 gactggagga tgccctagac aggctgcggg gtacatcgat caagacgaac atcaagacgg 9900 gtggccagcg tgtgaaggaa ggcttcggca tcgtcgatag ctggacgatc atcgagaagg 9960 cccccgacga tgaccgcatg attgccgtcg aggtcacgct ctccaagtgg cttttcaatg 10020 cagtgcaggc ccacgaggtt ctgaccatca acccggacta tttccggctg cgtaagccaa 10080 ttgagcgccg tttgtacgag ctggccagga agcactgtgg cgaccaggcc ttttttgtga 10140 ttgggctgga actgttgcag gacaagtgcg gcagcaagtc ggcactgttc gagttccgcc 10200 gtgccttgcg cgagatcatc aaggccgaca ccttgccaga ctaccgcatg acgcttgatg 10260 acgagaaaga ccaggtgatt ttctacaccc gcgacacgaa gaagctagcg gcgtctaccg 10320 ctctggcccg gcgcttccag tgacgcccaa agtattgacg gtcaatactt cgttatttca 10380 cccatgcggt gttaccgctg cgtgttggac gttcccttga cctagcggcc gaggcagggc 10440 tttcgcgctt tgcattgagc caccaagtgc gtctcgctcc ttcgagcatc aagccctaac 10500 gcgtttcatg tcactttcgc gcacgaaagt cgaggcaaga ggcttgatcg tgtctatcgt 10560 tacatcaccc atgcctgtgg atggacacgt tacatcaccc atgttttctg tggatgggca 10620 cgttacatca cccatacctc acttcgttac atcgcccatg cagcgatttg tggaagcctt 10680 gagcagcaag gctttacgag cgttatccac agccgtaaca cgcgcgcgcg attttttaac 10740 tttataaatc tttaacgcgg ttgcggacaa agcccgcgcc gcctcttggg ggctacgccc 10800 ccgccggctc ctacgggccg caagcggccc tccgcccgcg cttcgcgctc cctcccggca 10860 tccccgaggg gtttcgcttc gctgcacccc tcgcgcttcg cgctcacccg catatcgagg 10920 cccccaaagg gggccggatg gtgccccc 10948

Claims

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활성 성분으로서 박테리아 추출물을 포함하는 피부 염증 치료용 조성물로서, 상기 박테리아 추출물은, 베타프로테오박테리아 (Betaproteobacteria) 목 (class), 네이세리아시애 (Neisseriaceae) 아과 (subfamily)에 속하고, 16S rRNA 유전자의 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 1의 서열을 포함하고, 적어도 하나의 플라스미드는 서열번호 2의 서열로 구성되고, CNCM 기관에 2010년 4월 8일자로 기탁번호 제 I-4290호 하에 기탁된, 비병원성 그램-음성 박테리아의 현탁액으로부터 획득된 박테리아 추출물로서, 상기 박테리아 추출물은 pH 9 내지 11의 염기성 배양 배지에서 상기 박테리아를 5시간 동안 4℃의 온도에서 배양한 후 배양액을 원심분리하고, 0.2μm 필터에서 여과하여 투명한 용액으로 획득되는 추출물을 포함하고, 상기 박테리아 추출물은 막 단백질들, 세포막간 단백질들 (periplasmic proteins), 편모로부터 나온 단백질들, 및 상기 박테리아에 의해 생산되는 일차 및 이차 대사물들을 포함하는, 조성물.
제9항에 있어서,
상기 피부 염증은 아토피 피부염, 소양증, 습진 및 건선을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제9항에 있어서,
피부에 적합한 하나 이상의 부형제들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
활성 성분으로서 박테리아 추출물 및 피부에 적합한 하나 이상의 화장용 부형제들을 포함하는 화장용 조성물로서, 상기 박테리아 추출물은, 베타프로테오박테리아 (Betaproteobacteria) 목 (class), 네이세리아시애 (Neisseriaceae) 아과 (subfamily)에 속하고, 16S rRNA 유전자의 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 1의 서열을 포함하고, 적어도 하나의 플라스미드는 서열번호 2의 서열로 구성되고, CNCM 기관에 2010년 4월 8일자로 기탁번호 제 I-4290호 하에 기탁된, 비병원성 그램-음성 박테리아의 현탁액으로부터 획득된 박테리아 추출물로서, 상기 박테리아 추출물은 pH 9 내지 11의 염기성 배양 배지에서 상기 박테리아를 5시간 동안 4℃의 온도에서 배양한 후 배양액을 원심분리하고, 0.2μm 필터에서 여과하여 투명한 용액으로 획득되는 추출물을 포함하고, 상기 박테리아 추출물은 막 단백질들, 세포막간 단백질들 (periplasmic proteins), 편모로부터 나온 단백질들, 및 상기 박테리아에 의해 생산되는 일차 및 이차 대사물들을 포함하는, 조성물.
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