MX2013007217A - Nueva bacteria y extractos de dicha bacteria y su uso en dermatologia. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una nueva cepa bacteriana aislada de agua subterránea. La invención además se refiere a extractos bacterianos y a su uso en el contexto del tratamiento de inflamaciones. Más en particular, la presente invención se refiere a nuevas composiciones de interés en el tratamiento y la prevención de trastornos inflamatorios, en especial, de patologías dermatológicas.

Description

NUEVA BACTERIA Y EXTRACTOS DE DICHA BACTERIA Y SU USO EN DERMATOLOGÍA La presente invención se refiere a una nueva cepa bacteriana aislada de agua subterránea. La invención además se refiere a extractos bacterianos y a su uso en el contexto del tratamiento de inflamaciones.

Más en particular, la presente invención se refiere a nuevas composiciones de interés en el tratamiento y la prevención de trastornos inflamatorios, en particular, patologías dermatológicas.

Las enfermedades dermatológicas, tales como dermatitis atópica, prurito, eccema y soriasis, son cada vez más frecuentes en niños. La incidencia de la dermatitis atópica se ha duplicado o triplicado en los países desarrollados durante los últimos 30 años: 15% a 30% de los niños y 2% a 10% de los adultos están afectados (Williams H. et al., JACI 2006; 1 18: 209-13). La dermatitis atópica es la manifestación cutánea de atopia; es una dermatosis inflamatoria crónica o eccema, que se produce debido a un conjunto de circunstancias determinadas genéticamente. Se considera actualmente una preocupación mayor de la salud pública. La dermatitis atópica a menudo se asocia con otros trastornos atópicos, tales como rinitis alérgica y asma. Esta afección aparece con mayor frecuencia en la niñez temprana, y se caracteriza por repetidos brotes durante varios años. Avanza con exacerbaciones, interrumpidas por remisiones espontáneas.

La calidad de vida de los pacientes que sufren de dermatitis atópica se altera profundamente. Los tratamientos aceptados incluyen corticoesteroides tópicos e inmunomoduladores, agentes sistémicos cuyos frecuentes efectos secundarios limitan el uso a largo plazo, y emolientes. Las terapias actuales son reactivas -tratamiento de los brotes- si bien ahora se cree que la intervención temprana focalizada en el control de los brotes y de la inflamación cutánea puede ser beneficiosa, tanto en términos del control de la enfermedad, como de la potencial aparición de asma o rinitis (Bieber, T. 2008, Atopic dermatitis, The New England Journal of Medicine, vol. 358 (14) 1483-1494), ya que la dermatitis atópica se considera la fase inicial del avance atópico. En la mayoría de los casos, los tratamientos incluyen un componente local, a fin de proporcionar el mejor alivio a los pacientes.

Los tratamientos convencionales para la dermatitis atópica, notablemente, utilizan corticoesteroides tópicos o inmunosupresores, si bien dichos tratamientos no están libres de efectos adversos, en particular, en niños.

La dermatitis atópica es compleja y multifactorial. En la literatura, algunos estudios epidemiológicos han demostrado que el factor de "higiene" en los entornos urbanos favorece la enfermedad, como alergia y autoinmunidad. Por otra parte, en contextos rurales, donde el hombre está en contacto constante con microorganismos y alérgenos, dicha exposición estimula el sistema inmunitario de defensas del hombre desde el nacimiento.

En la dermatitis atópica, la función de barrera de la piel es debilitada y alterada, lo que favorece la invasión y la colonización de patógenos (bacterias y virus), en particular, de Staphylococcus aureus, que se sabe predomina entre las bacterias comensales de la piel.

En términos de inmunología, el problema es el desequilibrio de la respuesta inmunitaria. La atopia con frecuencia se describe como una manifestación alérgica (mediada por IgE, dominio de citoquinas IL-4, IL-5, IL- 13) o de la respuesta Th2. Esta última es más acentuada en presencia de "estímulos antígenos" de Staphylococcus aureus. La inmunomodulación consiste en el retorno de la homeostasis inmunitaria a un equilibrio de Th1/Th2.

La inmunidad innata es la respuesta primaria, rápida y no específica de las respuestas inmunitarias en mamíferos. Las primeras barreras de defensa de la célula están compuestas por receptores de tipo Toll (TLR, según su sigla en inglés). Cada TLR reconoce específicamente patrones moleculares asociados con patógenos (PAMP, según su sigla en inglés) tales como ácidos nucleicos (TLR3), péptidos, proteínas de superficie, ácido lipoteicoico (TLR2), flagelos (TLR5) y lipopolisacáridos (TLR4), que se originan a partir de microorganismos extraños. Una interacción específica entre un motivo (agonista) y un TLR dispara una cascada de complejas reacciones que logran la transcripción de NFKB, seguida de la producción de citoquinas proinflamatorias y antiinflamatorias y de quimioquinas (Kang et al., 2006). Otras consecuencias farmacológicas resultantes son la inducción de péptidos antimicrobianos (AMP, según su sigla en inglés), que tienen la capacidad de inhibir el crecimiento de patógenos (bacterias, virus, parásitos) (Glaser, R. er a/. 2005, Nat. Immunol., 6: 57-64).

La dermatitis atópica a menudo se acompaña de picazón y prurito, de manera de causar incomodidad y molestia en la vida diaria (rascado, pérdida de sueño, etc.). Una de las causas de esta patología inflamatoria se debe a la activación de un receptor acoplado a proteína G denominado PAR2 (receptor 2 activado por proteasa) (Steinhoff, M. er a/., 2003, J. Neurosci., 23: 6176-6180). PAR2 se expresa sobre la superficie de muchas células, en particular, queratinocitos, células endoteliales, miocitos colónicos, enterocitos, neuronas entéricas y células inmunitarias. Las proteasas (tripsina, triptasa), presentes en abundancia en la epidermis, disocian el PAR2 en el término N, de manera de exponer un péptido específico que activa este mismo receptor (fenómeno de autoactivación) (Vergnolle, N., 2009, Pharmacol. Ther., 123: 292-309). Este proceso involucra la activación del gen NFKB, seguida de la inducción de citoquinas proinflamatorias, de modo de disparar la inflamación. En este contexto, el desarrollo de antagonistas de PAR2 o inhibidores de proteasa tiene un alto potencial para el tratamiento del prurito patológico.

La soriasis es también una enfermedad inflamatoria cutánea con un avance crónico; afecta al 2% de la población. Junto con la dermatitis atópicá, l soriasis es una de las enfermedades inflamatorias cutáneas crónicas más comunes. Se caracteriza por el crecimiento anormal de células epidérmicas asociadas con una reacción inflamatoria. El mecanismo central del fenómeno de la inflamación se relaciona con la acción de células T del sistema inmunitario, principalmente, células Th1 (Wilsmann-Theis, D. et al., Eur. J. Dermatol., vol. 18 (2) 172-180), que inician y mantienen el proceso inflamatorio y estimulan la excesiva proliferación de queratinocitos, que entonces proceden a través de una fase de diferenciación acelerada e incompleta. Los queratinocitos expresan receptores que los hacen sensibles a la señales inflamatorias y liberan mediadores proinflamatorios. La inflamación soriásica es así mantenida por la mutua estimulación de células T y queratinocitos.

Por lo tanto, la enfermedad debe ser tratada a largo plazo. En consecuencia, existe una necesidad y una alta demanda de la búsqueda de alternativas terapéuticas para estas dermatosis inflamatorias.

Puede hacerse mención del documento de patente EP 2018891 (Guéniche A., 2009) y del documento de Guéniche A. et al., 2006 (European Journal of Dermatology, 16, 4, 380-384), que describen el uso de un extracto bacteriano de Vitreoscilla fíliformis (V. fíliformis) para el tratamiento de la dermatitis atópica. Dicho extracto posee la ventaja de requerir el cultivo de dicha bacteria filamentosa V. fíliformis en un medio que contiene agua mineral libre de azufre.

En este contexto, la presente invención provee una solución para el tratamiento de estos trastornos inflamatorios mediante la aislación, la caracterización y la fraccionación de una nueva bacteria nunca antes descripta.

Por primera vez, y de manera sorprendente, el Solicitante logró el aislamiento de una cepa que pertenece a una nueva especie bacteriana de agua subterránea, donde dicha nueva cepa bacteriana (o bacteria) se denomina LMB64.

Esta bacteria LMB64, además de haber sido aislada, fue caracterizada y definida de manera de pertenecer a la clase de Betaproteobacteria, una subfamilia de Neisseriaceae, y probablemente, de un nuevo género aún no definido. El análisis de la secuencia de genes que codifica para el ARN ribosómico (ARNr) 16S hizo posible la colocación de esta bacteria cerca de los géneros Chromobacterium, Paludimonas, Lutelia y Glubenkiana, con los cuales comparte 95% de similitud de secuencia.

Esta bacteria no patógena es Gram-negativa, y se describirá en mayor detalle en los ejemplos. Esta bacteria además posee la característica de ser no filamentosa. Asimismo, esta bacteria posee la ventaja de que es capaz de ser cultivada en un medio que contiene cualquier tipo de agua, y más en particular, agua común. A modo de ejemplo, en contraste a V. fíliformis, el cultivo de la bacteria LMB64 de la presente invención no requiere condiciones de cultivo particulares, y más en particular, no requiere un medio que contenga por lo menos un tipo libre de azufre de agua mineral o térmica. Esto representa una clara ventaja, tanto en términos de condiciones de cultivo como de facilidades, y desde el punto de vista económico.

El gen que codifica para el ARNr 16S ha sido secuenciado casi por completo (1487 p. b., correspondientes a la secuencia de SEC. ID. NRO. 1 ). La bacteria LMB64 tiene un plásmido circular de 10948 p. b. Este plásmido fue secuenciado por completo, y la secuencia se representa en la secuencia de SEC. ID. NRO. 2.

De acuerdo con una primera realización, la presente invención se refiere a una bacteria no patógena Gram-negativa, que pertenece a la clase de Betaproteobacteria, una subfamilia de Neisseriaceae, cuya secuencia de nucleótidos del gen que codifica para el ARNr 16S incluye o comprende la secuencia de SEC. ID. NRO. 1 , o cualquier secuencia de nucleótidos con por lo menos 80%, preferentemente, 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con dicha secuencia de SEC. ID. NRO. 1.

En una manera preferida, la presente invención se refiere a una bacteria no patógena Gram-negativa que pertenece a la clase de Betaproteobacteria, una subfamilia de Neisseriaceae, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos del gen de ARNr 16S de dicha bacteria incluye o comprende la secuencia de SEC. ID. NRO. 1 .

En el contexto de la presente invención, el "porcentaje de identidad" entre dos secuencias de ácido nucleico se refiere a un porcentaje de nucleótidos idénticos entre las dos secuencias por ser comparadas, obtenido después de la mejor alineación (alineación óptima), donde este porcentaje es puramente estadístico, y las diferencias entre las dos secuencias se distribuyen en forma aleatoria y sobre su longitud entera. Las comparaciones de secuencias entre dos secuencias de ácido nucleico normalmente se realizan mediante la comparación de estas secuencias luego de haberlas alineado de manera óptima, donde dicha comparación puede efectuarse por segmento o por "ventana de comparación". La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede llevarse a cabo, además de en forma manual, por medio del algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981 ) [Ad. App. Math., 2: 482], por medio del algoritmo de homología local de Needleman y Wunsch (1970) [J. Mol. Biol., 48: 443], por medio del método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) [Proc. Nati. Acad. Sci. The USA, 85: 2444] o mediante soporte lógico informático usando estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete informático Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Group Computer, 575 Science Dr., Madison, Wl, o el programa informático de comparación BLAST N o BLAST P).

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico se determina mediante la comparación de estas dos secuencias alineadas de manera óptima, donde la secuencia de ácido nucleico por comparar puede incluir adiciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, para una alineación óptima entre estas dos secuencias. El porcentaje de identidad es calculado mediante la determinación del número de posiciones para las cuales el nucleotido es idéntico entre las dos secuencias, la división de este número de posiciones idénticas por el número total de posiciones en la ventaja de comparación, y la multiplicación del resultado obtenido por 100, a fin de obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.

Por ejemplo, el programa de "secuencias BLAST 2" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett., 174: 247-250), que puede obtenerse en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, puede usarse con los parámetros por defecto (en particular, para los parámetros de "penalidad de espacio abierto": 5, y "penalidad de espacio de extensión": 2; donde la matriz seleccionada es, por ejemplo, la matriz "BLOSUM 62" propuesta por el programa), donde el porcentaje de identidad entre las dos secuencias por comparar es calculado directamente por el programa. Es posible además utilizar otros programas, tales como los programas informáticos "ALIGN" o "Megalign" (DNASTAR).

De acuerdo con otra realización, la bacteria de acuerdo con la invención incluye por lo menos un plásmido que comprende la secuencia de SEC. ID. NRO. 2, o cualquier secuencia con por lo menos 80%, preferentemente, 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con dicha secuencia de SEC. ID. NRO. 2.

En una manera preferida, la bacteria LMB64 incluye por lo menos un plásmido que comprende la secuencia de SEC. ID. NRO. 2.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, la bacteria LMB64 se caracteriza porque es no filamentosa.

Otras características de dicha bacteria LMB64 se detallarán a continuación, en los ejemplos.

Además, la bacteria LMB64 de la presente invención ha sido depositada de acuerdo con el Tratado de Budapest a nombre del Solicitante, én la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, Paris, el 8 de abril de 2010, con la referencia I-4290.

Por lo tanto, un objetivo de la invención es la bacteria depositada en la CNCM el 8 de abril de 2010, con la referencia I— 4290, o un homólogo, un descendiente o cualquier otra muíante.

El término "muíante" se refiere a cualquier bacteria que surge directamente de la cepa I-4290, y puede comprender mutaciones naturales o recombinaciones, por ejemplo, cualquier recombinación relacionada con la proliferación celular, la división celular (mutación debida a errores que sé producen durante la división bacteriana o la replicación de ADN) o cualquier otro mecanismo de selección natural, tal como la selección de mutantes que son resistentes o que se tornan resistentes a un compuesto determinado. Se incluyen entre estas mutantes cualquier bacteria que surja a partir de la cepa I-4290 que comprenda una o más mutaciones en su secuencia genómica (o aquella de su plásmido), en la cual las mutaciones fueron causadas por radiación, por un virus, por transposones o por agentes químicos mutágenos.

De acuerdo con una primera realización de la invención, a partir dé un cultivo bacteriano, puede aislarse la biomasa entera por medio de diversos métodos conocidos, tales como la filtración, la coagulación con un alcohol (etanol, isopropanol, isobutanol), el secado sobre un cilindro con una precapa raspada, etc., y luego, puede usarse en forma liofilizada o inactivada por calor.

De acuerdo con otra realización preferida, la invención se refiere, de manera general, a un extracto bacteriano, también denominado una fracción bacteriana, obtenido a partir de una suspensión de bacterias como se describe anteriormente, a decir, la bacteria LMB64.

El término "extracto bacteriano" se refiere a cualquier extracto o fracción de la biomasa bacteriana, o cualquier fracción activa de dicho extracto. Por ejemplo, dicho extracto puede obtenerse a partir de un cultivo de la bacteria LMB64, donde el método de preparación comprende por lo menos un paso de lisis de la bacteria y un paso de separación de las diversas fracciones de las cuales está constituida, mediante la centrifugación o la filtración.

En una manera no restrictiva, el extracto de acuerdo con la invención puede consistir en células bacterianas aisladas del medio de cultivo, que han sido concentradas, por ejemplo, mediante la centrifugación; o células bacterianas concentradas que han sido sometidas a una operación en la cual la envoltura celular ha sido interrumpida por cualquier medio conocido por los expertos en el arte, tal como la acción de ultrasonido o autoclave; o el sobrenadante obtenido mediante la filtración.

Un paso importante del método de preparación de extracto de acuerdo con la invención consiste en la eliminación de los diversos componentes intracelulares, tales como ácidos nucleicos (ADN cromosómico, ADN circular extracromosómico, plásmidos), ribosomas y sustancias almacenadas intracelulares tales como glucógeno, almidón y poli— ß— hidroxibutirato, etc.

En una manera preferida, el extracto bacteriano de acuerdo con la invención se obtiene luego del tratamiento de dicha suspensión bacteriana de modo tal de eliminar los componentes intracelulares.

El resultado es que el extracto de acuerdo con la invención incluye principalmente componentes que se originan en la membrana, el espacio periplásmico o el espacio extracelular.

Más en particular, dichos componentes intracelulares comprenden por lo menos los ácidos nucleicos.

Además de la eliminación de compuestos intracelulares, y como un ejemplo no restrictivo, es también posible si dificultad, para los expertos en el arte, separar, luego de la lisis de las bacterias y la centrifugación, los componentes del sobrenadante de cultivo (de aquí en adelante, la fracción SO) y los componentes que constituyen la miniesfera (de aquí en adelante, EO). Por ejemplo, puede sugerirse que el umbral de separación entre los constituyentes de SO y EO sea de alrededor de un peso molecular de 100 kDa. En consecuencia, los constituyentes de la fracción SO tienen, en su mayoría, un peso molecular inferior a 100 kDa, mientras que los componentes de la fracción EO tiene, en su mayoría, un peso molecular superior a 100 kDa.

Más en particular, es posible, en consecuencia, mediante técnicas conocidas por los expertos en el arte, extraer y separar las biomoléculas halladas en el sobrenadante de cultivo (SO) de aquellas principalmente compuestas por proteínas de superficie, y proteínas ubicadas en el espacio periplásmico de la bacteria (E0).

De acuerdo con una realización de la invención, el extracto bacteriano incluye una fracción E0 que comprende por lo menos proteínas de membrana, proteínas periplásmicas y proteínas que se originan a partir del flagelo.

Las proteínas periplásmicas incluyen proteínas alojadas en el espacio periplásmico de bacterias Gram-negativas, que pueden liberarse por choque osmótico o mediante la incubación en un medio que contiene un agente caotrópico o detergentes (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd editión: Sambrook and Russell. CSHL Press).

Las proteínas que se originan a partir del flagelo incluyen proteínas multiméricas del flagelo o fragmentos del flagelo. Los métodos para el aislamiento y la purificación de flagelos bacterianos enteros con detergentes, y luego, mediante separaciones de ultracentrifugación (en presencia de un gradiente CsCI) se describen en la literatura. En la invención, los ejemplos de métodos de extracción hicieron posible la recuperación de fragmentos de flagelos.

Las proteínas de membrana incluyen proteínas que están ancladas en la membrana y de las cuales una parte se expone sobre la superficie (proteínas de membrana externa, u Omp), proteínas que se adhieren a la superficie de la membrana, lipoproteínas y porinas (Ward J. B., Microbial adhesión to suríaces, 1980).

En una manera preferida, dichas proteínas de membrana consisten en porinas, OmpA [proteína de membrana externa A, según su sigla en inglés], lipopolisacáridos y lipoproteínas.

De acuerdo con otra realización de la invención, puede preferirse el uso de la fracción SO.

Más en particular, el extracto bacteriano de acuerdo con la invención incluye una fracción SO que comprende por lo menos péptidos y proteínas secretados y metabolitos secundarios.

Los péptidos y proteínas secretados incluyen péptidos y proteínas que son naturalmente producidos y secretados por la bacteria LMB64, y que pueden recuperarse mediante la centrifugación o la filtración.

Los metabolitos secundarios incluyen las moléculas pequeñas que la bacteria LMB64 produce y secreta en el medio de cultivo.

Debe mencionarse aquí la presencia de lipopolisacáridos dentro de la fracción SO. De hecho, los lipopolisacáridos, si bien se hallan principalmente en la fracción E0, se encuentran también, sin embargo, en cantidades menores en la fracción SO.

En una manera conveniente, las fracciones EO y SO pueden combinarse de modo tal de obtener una fracción ESO, por ejemplo, mediante la incubación del medio de cultivo y la reacción en un medio básico (pH 9 a 1 1 ) durante aproximadamente 5 horas a una temperatura de 4°C, mediante la centrifugación y la filtración en un filtro de 0,2 pm, a fin de obtener una solución transparente de ESO.

El extracto bacteriano ESO, en consecuencia, está compuesto, entre otros componentes, por proteínas de membrana, lipopolisacáridos, proteínas periplásmicas, fragmentos de proteínas del flagelo y metabolitos primarios y secundarios producidos por la bacteria.

En una manera preferida, el extracto ESO tiene un perfil de proteína que comprende por lo menos, de acuerdo con la técnica SDS-PAGE, doce bandas que incluyen tres bandas principales que corresponden, respectivamente, a pesos moleculares (pesos moleculares aproximados en relación con los modelos moleculares, notablemente provistos por Bio-Rad Laboratories) que varían entre: - banda 1 : 30 kDa y 36 kDa, preferentemente, 34 kDa; - banda 2: 41 kDa y 45 kDa, preferentemente, 43 kDa; - banda 3: 47 kDa y 51 kDa, preferentemente, 49 kDa.

De acuerdo con otra realización de la invención, el extracto bacteriano incluye una fracción ESO que comprende por lo menos la fracción EO y la fracción SO.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, el extracto bacteriano incluye una fracción ESO con un perfil de proteína, obtenido por SDS-PAGE, que incluye tres bandas principales que corresponden a pesos moleculares que varían entre 30 kDa y 36 kDa, 41 kDa y 45 kDa y 47 kDa y 51 kDa, respectivamente.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, el extracto bacteriano incluye una fracción ESO con un perfil de proteína, obtenido por SDS-PAGE, que incluye tres bandas principales que corresponden a pesos moleculares de 34 kDa, 43 kDa y 49 kDa, respectivamente.

De acuerdo con otro aspecto, la invención describe un método para la preparación de un extracto bacteriano que comprende los pasos de: a) el cultivo de la bacteria LMB64 en un medio adecuado; y b) la eliminación de los componentes intracelulares.

De acuerdo con otra realización, el método de acuerdo con la invención consiste en un método para la preparación de un extracto bacteriano SO, donde dicho método comprende los pasos de: a) el cultivo de la bacteria LMB64 en un medio adecuado; b) el centrifugado de dicho cultivo; y c) la recuperación del sobrenadante SO.

De acuerdo con otra realización, el método de acuerdo con la invención consiste en un método para la preparación de un extracto bacteriano E0, donde dicho método comprende los pasos de: a) el cultivo de la bacteria LMB64 en un medio adecuado; b) el centrifugado de dicho cultivo y la eliminación del sobrenadante; c) el tratamiento de la biomasa resultante del paso b) de modo tal de eliminar los componentes intracelulares; y d) la recuperación de la base E0.

En una manera preferida, el paso c) consiste en el tratamiento ultrasónico de la biomasa resultante del paso b), y luego, una centrifugación inicial destinada a la eliminación de la miniesfera que comprende dichos componentes intracelulares; y a continuación, una segunda centrifugación del sobrenadante.

De acuerdo con otra realización, el método de acuerdo con la invención consiste en un método para la preparación de un extracto bacteriano EO, donde dicho método comprende los pasos de: a) el cultivo de la bacteria LMB64 en un medio adecuado; b) el centrifugado de dicho cultivo y la eliminación del sobrenadante; c) el tratamiento, con ultrasonido, de la biomasa resultante del paso b); d) el centrifugado de dicha biomasa tratada con ultrasonido, y la eliminación de la biomasa obtenida; e) el centrifugado del sobrenadante resultante del paso d); y f) la recuperación de la base EO.

Debe observarse que los diversos métodos descriptos anteriormente se proveen solo con propósitos de ilustración, y que puede usarse cualquiera dé los métodos conocidos por los expertos en el arte.

Como será evidente a partir de los Ejemplos expuestos a continuación, el Solicitante ha demostrado, además de las actividades esperadas para este tipo de extracto, varias actividades novedosas, nunca antes descriptas.

Un primer aspecto conveniente de la invención, relacionado coh la ¡nmunomodulación, se basa en la propiedad de modulación de las citoquinas proinflamatorias. Más en particular, el uso de una bacteria o de un extracto de acuerdo con la invención induce de manera significativa citoquinas IL-10, IL-12 y TNF-a, que, preferentemente, participan en la respuesta inmunitaria Th1 , e inhibe significativamente las citoquinas IL— 4 y IL-6. El resultado es la activación de células de Langerhans y un retorno al equilibrio de Th1/Th2.

Además, otra observación demostró que el uso de una bacteria o de un extracto de acuerdo con la invención hace posible disminuir en gran medida la expresión de receptores IgE, hecho de interés, en términos de que IgE potencia los fenómenos alérgicos.

Otra ventaja de la invención yace en el hecho de que, como será evidente a partir de los ejemplos, el uso de una bacteria o de un extracto de acuerdo con la invención induce la producción de péptidos antimicrobianos, por ejemplo, los péptidos hBD-2, hBD-3, S1007A y LL-31.

Más en particular, como se menciona con anterioridad, se conoce un extracto de la bacteria Vitreoscilla filiformis (Guéniche A. et al., Eur. J. Dermatol., 2006; 16: 380) con actividad en TLR2, debido a la presencia de OmpA, y en TLR4, debido a la presencia de lipopolisacáridos. Debido a la ausencia de flagelos en la bacteria V. filiformis, el extracto obtenido de V. filiformis no tiene actividad en TLR5.

Por primera vez, el Solicitante describe un extracto bacteriano de acuerdo con la invención que tiene, además de la actividad en TLR2 y TLR4, actividad en TLR5.

En consecuencia, la invención se refiere al uso de una bacteria o de un extracto bacteriano, tal como se describe anteriormente, como un activador de TLR2, TLR4 y TLR5.

En una manera preferida, dicho extracto bacteriano activador de TLR2, TLR4 y TLR5 consiste en un extracto que comprende la totalidad o parte de las proteínas que se originan a partir del flagelo. En este caso, a modo de ejemplo, dicho extracto es, preferentemente, el extracto EO o el extracto ESO.

Dicha actividad de activación de TLR5 es de interés significativo, en términos de que se sabe que TLR5 inducen ciertos péptidos antimicrobianos tales como soriasina (S100A7) y hBD-2 (Glaser et al., Journal of Investigative Dermatology (2009) 129, 641-649). Además, los agonistas de TLR5 actúan en sinergia con aquellos de TLR2 y TLR4, de manera de hacer posible la potenciación de la producción de péptidos antimicrobianos. Se ha demostrado que mediante el bloqueo de TLR5 con un anticuerpo, estos se producen en pequeña medida, o no se producen.

Este aspecto es, en consecuencia, particularmente innovador en términos de aplicaciones de inmunomodulacion para la bacteria o los extractos de acuerdo con la invención.

Asimismo, en una manera no esperada, el Solicitante además ha demostrado, en contraste a los extractos bacterianos descriptos hasta la fecha, actividad antagonista hacia PAR2. Esta actividad es de interés significativo en el contexto de los tratamientos antiinflamatorios.

Por lo tanto, la invención se refiere, muy en particular, al uso de una bacteria o de un extracto bacteriano como se describen anteriormente, como antagonista de PAR2.

En una manera preferida, dicho extracto bacteriano antagonista de PAR2 consiste en el extracto SO o el extracto ESO.

PAR2 es sobreexpresado en células endoteliales, miocitos colónicos, enterocitos, neuronas entéricas, células inmunitarias y queratinocitos. Las proteasas (tripsina, triptasa) presentes en abundancia en el entorno disocian el PAR2 en el término N, de modo de exponer un péptido específico que activa este mismo receptor (fenómeno de autoactivación). En consecuencia, este activa la producción de citoquinas proinflamatorias y dispara la inflamación (Vergnolle, N., 2009, Pharmacol. Ther., 123: 292-309). Este fenómeno es observado en el ratón silvestre, si bien no aparece en el ratón KO (deficiente en PAR2). El tratamiento con una antiproteasa o un antagonista de PAR2 hace posible evitar este fenómeno de inflamación.

La combinación y la sinergia de todas estas actividades proporcionan a esta bacteria LMB64, o a cualquier extracto que se origine a partir de esta misma bacteria, un alto potencial para tratar enfermedades inflamatorias, y muy en particular, enfermedades inflamatorias en las cuales participa PAR2, o en las cuales el sistema inmunitario está debilitado, alterado o desequilibrado.

La invención, en consecuencia, se refiere al uso de una bacteria tal como se describe con anterioridad, o de un extracto bacteriano que se origina a partir de dicha bacteria, para la preparación de una composición propuesta para el tratamiento o la prevención de trastornos inflamatorios dermatológicos.

En una manera preferida, dichos trastornos inflamatorios dermatológicos consisten en dermatitis atópica, prurito, eccema y soriasis.

De acuerdo con otra realización, la invención de la presente solicitud de patente se refiere a una composición que comprende, como ingrediente activo, por lo menos una bacteria o un extracto bacteriano de acuerdo con la invención.

En consecuencia, la invención se refiere, en una manera preferida, a una composición cosmética o dermatológica.

La composición de acuerdo con la invención se refiere al tratamiento de trastornos inflamatorios dermatológicos.

En una manera preferida, dichos trastornos inflamatorios dermatológicos consisten en dermatitis atópica, prurito, eccema y soriasis.

La composición de acuerdo con la invención puede contener, en particular, aditivos y auxiliares de la formulación tales como emulsionantes, espesadores, agentes gelificantes, aglutinantes acuosos, agentes de diseminación, estabilizadores, colorantes, fragancias y conservantes.

La composición cosmética o dermatológica de acuerdo con la invención además comprende uno o más excipientes típicos dermatológicamente compatibles.

La composición de acuerdo con la invención puede prepararse en forma de una emulsión de tipo agua en aceite (W/O, según su sigla en inglés) o del tipo aceite en agua (O/W, según su sigla en inglés), una emulsión múltiple tal como una emulsión del tipo agua en aceite en agua (W/O/W, según su sigla en inglés) o del tipo aceite en agua en aceite (O/W/O, según su sigla en inglés); una microemulsión; o en forma de una hidrodispersión o una lipodispersión; un gel o un aerosol.

Los excipientes dermatológica o cosméticamente compatibles pueden ser cualquier excipiente seleccionados de aquellos conocidos por los expertos en el arte, a fin de obtener una composición para la aplicación tópica en forma de una leche, una crema, un bálsamo, un aceite, una loción, un gel, un gel espumante, una pomada, una pulverización, etc.

Además de composiciones dermatológicas y cosméticas, la invención además se refiere a composiciones farmacéuticas para el uso como, un fármaco.

Por lo tanto, la invención se refiere a una composición farmacéutica qué además comprende un portador farmacéuticamente aceptable.

En la presente descripción, el término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un compuesto o una combinación de compuestos parte de una composición farmacéutica, que no produce reacciones secundarias, y que, por ejemplo, facilita la administración de los compuestos activos, aumenta su vida media o eficacia en el organismo, aumenta su solubilidad en solución o mejora su conservación. Dichos portadores farmacéuticamente aceptables son bien conocidos, y serán adaptados por los expertos en el arte de acuerdo con la naturaleza y el modo de administración de los compuestos activos seleccionados.

Preferentemente, dichos compuestos pueden administrarse sistémicamente, por las vías intramuscular, intradérmica, intraperitoneal o subcutánea, o por la vía oral. La composición que comprende los anticuerpos de acuerdo con la invención puede administrarse en varias dosis, repartidas en el tiempo.

Los modos de administración óptimos, los esquemas de dosificación, y las formas galénicas pueden determinarse de acuerdo con los criterios generalmente considerados en el establecimiento de un tratamiento adaptado a un paciente, por ejemplo, la edad o el peso del paciente, la gravedad del estado de salud general del paciente, la tolerancia al tratamiento y los efectos secundarios observados.

La invención será mejor comprendida con la consideración de los ejemplos expuestos a continuación, que ilustran la invención, sin limitar su alcance.

Descripción de las figuras.

La Figura 1 ilustra la posición filogenética de la secuencia que codifica para el ARNr 16S de la cepa LMB64. Las secuencias que aparecen en este árbol son secuencias de la base de datos GenBank más cercanas a la secuencia de LMB64.

Las Figuras 2A y 2B presentan imágenes de la bacteria LMB64 bajo el microscopio electrónico de transmisión (A) y el microscopio electrónico de barrido (B).

La Figura 3 presenta el crecimiento óptimo determinado como una función de la temperatura, el pH y la salinidad del medio de cultivo R3.

La Figura 4 ilustra la inducción de citoquinas IL-10 e IL-12 por el extracto EO (efecto dependiente de la dosis).

La Figura 5 ilustra la inducción de moléculas de superficie CD80, CD86, CD83 y CD54 por el extracto EO (efecto dependiente de la dosis).

La Figura 6 ilustra la inhibición de receptores IgE por el extracto EO.

La Figura 7 ilustra la activación de TLR2 por el extracto ESO.

La Figura 8 ilustra la activación de TLR4 por el extracto ESO.

La Figura 9 ilustra la activación de TLR5 por el extracto ESO.

La Figura 10 ilustra la actividad antagonista de PAR2 específica por el extracto ESO.

La Figura 1 1 ilustra la inducción de proteínas y péptidos antimicrobianos por el extracto ESO.

La Figura 12 consiste en un gel de SDS-PAGE del extracto ESO.

Ejemplo 1 : Selección v caracterización de la bacteria LMB64.

La bacteria AV13 se aisló de agua subterránea.

La posición taxonómica de la nueva bacteria LMB64 se propone en la Figura 1.

Más en particular, la bacteria LMB64 tiene forma de varilla, con una longitud de aproximadamente 2,3 µ?? (± 0,3) y un ancho de alrededor de 1 ,0 pm (± 0,1 ). Una característica distintiva de esta bacteria es la presencia de un flagelo polar (Figuras 2A y 2B). Como puede observarse además en estas imágenes, la bacteria LMB64 es una bacteria no filamentosa.

Como se menciona con anterioridad, la bacteria LMB64 tiene un plásmido circular de aproximadamente 11 kpb. Ese plásmido fue secuenciádo por completo (SEC. ID. NRO. 2).

El gen que codifica para el ARNr 16S también fue secuenciádo (SEC. ID. NRO. 1 ). La bacteria se cultivó en un termentador en un medio sintético. La tasa de crecimiento fue más alta cuando el medio tuvo una baja concentración de sustratos de carbono.

Los medios de cultivo ensayados son R3, MS-glucosa y medios LB cuyas composiciones se describen a continuación, en las Tablas 1a, 1 b y 1c, respectivamente.

Tabla 1a COMPOSICIÓN DE MEDIO MS -GLUCOSA Glucosa 6.0 g/l Ácido cítrico 0,84 g/l MgS04, 7H20 0,25 g/l NH4CI 1 ,06 g/l K2HP04 anhidro 8,75 g/l Sal sódica de ácido pirúvico 0,5 g/l Sulfato de zinc, 7H20 4 mg/l Cloruro de cobalto, 6H20 3,5 mg/l Molibdato sódico, 2H20 3,5 mg/l Sulfato de manganeso, 1 H20 5 mg/l Ácido bórico 2 mg/l Ácido clorhídrico concentrado 50 mg/l Sulfato de cobre, 5H20 4 mg/l Cloruro de hierro, 6H20 27 mg/l Tabla 1 c Las tasas de crecimiento de la bacteria LMB64 como una función del medio de cultivo se presentan en la Tabla 2, expuesta a continuación.

Tasa de crecimiento (/h) LB 0,25 (±0,05) LB (½ dilución) 0,46 (±0,1 1 ) LB (1 /5 dilución) 0,60 (±0,14) LB (1 /10 dilución) 0,69 (±0,15) MS-glucosa 0,13 (±0,04) R3 0,62 (±0,14) Tabla 2 El crecimiento óptimo se determinó como una función de la temperatura, el pH y la salinidad del medio de cultivo R3 (Figure 3).

Las fuentes de carbono asimilables por la bacteria se caracterizaron usando una galería API 50CH (temperatura de incubación: 25°C). Los resultados se resumen en la Tabla 3, a continuación.

Tiempo de incubación 4 días 5 días 1. Glicerol 2. Eritritol 3. D-arabinosa 4. L-arabinosa 5. D-ribosa 6. D-xilosa 7. L-xilosa 8. D-adonitol 9. Metil-p-D-xilopiranosida 13. D-manosa 14. L-sorbosa 15. L-ramnosa 18. D-manitol 19. D-sorbitol 20. Metil-a-D-manopiranosida 21. Metil-a— D-glucopiranosida 22. N-acetilglucosamina 23. Amigdalina 24. Arbutina 25. Esculina/citrato de hierro 26. Salicina 29. D-lactosa (origen bovino) 33. Inulina 34. D-melezitosa 35. D-rafinosa 36. Almidón 37. Glucógeno 38. Xilitol 41. D-lixosa 42. D-tagatosa 43. D-fucosa 44. L-fucosa 45. D-arabitol 46. L-arabitol 47. Gluconato de potasio 48. 2-Cetogluconato de potasio 49. 5-Cetogluconato de potasio +: sustrato utilizable, 1: bajo uso Tabla 3 Las actividades enzimáticas demostradas sobre la galería API ZYM son: fosfatasa alcalina, esterasa (C4), esterasa/lipasa (C8), leucina arilamidasa, valina arilamidasa, fosfatasa ácida, naftol-AS-BI-fosfohidrolasa y a-glucosidasa.

La bacteria LMB64 es sensible a todos los antibióticos ensayados, como puede observarse en la Tabla 4 expuesta a continuación.

Zona de diámetro de inhibición (mm) Actividad inhibitoria Antibióticos ensayados R3 LE 1/2 LE US Ampicilina (10 µg) 29 28 29 + Cloranfenicol (30 µg) 29 26 24 + Ciprofloxacina (5 µg) 38 34 34 + Kanamicina (30 µg) 27 30 27 + Penicilina (6 µg) 21 26 20 + Polimixina B (50 .g) 11 15 13 + Rifampicina (30 µg) 20 19 15 + Tetraciclina (30 µg) 30 25 20 + Estreptomicina (10 µd) 25 25 24 + Vancomicina (30 g) 20 21 21 + Tabla 4 Ejemplo 2: Método para la extracción de fracciones EO, SO y ESO.

Precultivo: La cepa AV13 se inoculó en un matraz de Erlenmyer que contenía 250 mi de medio MS glucosa piruvato (ver Tabla 5 a continuación), y a continuación, se realizó la incubación con agitación durante aproximadamente 40 horas a 30°C (pH 7) y a 200 r. p. m. hasta obtener una OD6oos ,5.

Tabla 5 Cultivo: El precultivo fue entonces inoculado en un fermentador (Applikon) que contenía 3,7 I de medio MS piruvato + 114 mi de solución de glucosa al 20%. Un sensor de temperatura regulaba la temperatura, preferentemente, cercana a los 30°C. Se usó un sensor de oxígeno (AppliSens) para mantener la concentración de oxígeno disuelto en el medio a 18-25%. Se utilizó un sensor de pH (AppliSens) a fin de mantener el pH a 7 mediante la adición de NH4OH al 10% por medio de una bomba de caudal fijo. Se usó un sensor analítico Wedgewood Analytical con el objetivo de controlar los cambios en la densidad óptica en tiempo real. El cultivo se programó en modo de alimentación de lotes; mediante una bomba de caudal variable, se suministró al cultivo una solución de glucosa al 20%. La fermentación se detuvo cuando la OD6oos22-26, en general, después de alrededor de 30 horas.

Extracción SO: El sobrenadante se separó de la biomasa mediante la centrifugación durante 1 hora a 4°C y 4000 g.

Extracción E0: La biomasa húmeda se recogió en solución de NaCI (1 M). Después de la centrifugación durante 15 minutos a 4°C y 9000 g, el sobrenadante se desechó, y se recogió la miniesfera en solución de NaCI, 1¡ M. El tubo de muestra entonces fue sumergido en un baño ultrasónico enfriado con un parámetro de potencia establecido de 50-60 W, durante varios minutos. Después de la centrifugación durante 30 minutos a 4°C y 6000 g, la miniesfera se descartó, y se recuperó el sobrenadante. Se agregaron dos volúmenes de etanol frío, y la suspensión se dejó durante la noche a 4°C. Después de la centrifugación durante 30 minutos a 4°C y 6000 g, el sobrenadante se desechó, y la miniesfera se recogió en regulador Tris, 25 mM, pH 8,8.

Extracción ESO: El cultivo se llevó a pH básico (pH 9-1 1 ) con un regulador base. El siguiente paso fue la incubación con agitación durante 5 horas a una temperatura de 4°C. Después de la centrifugación, el sobrenadante se prefiltró a fin de eliminar los restos de biomasa restantes, y luego se filtró en un filtro de 0,2 pm. Se obtuvo una solución de color amarillo claro (ESO).

Las proteínas se ensayaron de acuerdo con el protocolo del equipo de ensayo de proteína DC Protein Assay Kit II (Bio-Rad). Los azúcares ; se ensayaron en equivalente de glucosa de acuerdo con el método de fenol/ácido sulfúrico (Dubois, M. er a/. , 1956).

A modo de ejemplo, la Tabla 6 expuesta a continuación presenta ciertas características específicas del extracto ESO, obtenido en las condiciones que se describen anteriormente.

Tabla 6 Se entiende claramente que los datos anteriores se presentan aquí solo con propósitos ilustrativos.

Más precisamente, los datos se refieren a un perfil de proteína obtenido por SDS-PAGE que exhibe tres bandas principales.

Protocolo de SDS-PAGE: El extracto ESO se recogió en regulador (Tris, 20 mM-HCI, pH 8,0; EDTA, 1 mM; 2,5% SDS y 0,01% azul de bromofenol) y DTT, 1 M (1 ,4- ditiotreitol). La muestra y la mezcla de marcadores de peso molecular (WesternC, Bio-Rad) se depositaron, respectivamente, en receptáculos de un gel de acrilamida SDS-PAGE 8-16% (GeBaGel, Gene Bio-Application). El regulador de migración contenía Tris, 2,5 mM, glicina, 19,2 mM y SDS al 0,01% (p/v). La migración se deja proceder con un voltaje constante de 160 V durante aproximadamente 1 hora (sistema GeBaGel). Las bandas de proteína luego se tiñeron con azul de Coomassie (Instant Blue, Expedeon). Se calcularon los tamaños en relación con modelos conocidos (STD, según su sigla en inglés).

El gel obtenido se presenta en la Figura 12.

De acuerdo con una realización de la invención, estas tres bandas tienen pesos moleculares de aproximadamente 34 kDa, 43 kDa y 49 kDa, respectivamente.

Ejemplo 3: Demostración de las actividades farmacológicas de las fracciones E0 y ESO.

Se generaron células de Langerhans (LC) in vitro a partir de monocitos humanos aislados de sacos Buffy-Coat del Servicio Nacional de Sangre Francés (Etablissement Frangais du Sang (EFS) Pyrénées Méditerranée) aislamiento en un gradiente Ficoll (medio de separación de linfocitos, densidad 1 ,077 g/ml) y purificación por inmunoselección magnética (Miltenyi Biotec); la diferenciación de LC se llevó a cabo durante 6 días en presencia de un cóctel de citoquinas (GM-CSF/IL-4n _^). Las LC distribuidas en placas de 24 receptáculos en medio de cultivo RPMI-5% FCS se incubaron durante 24 horas con extracto ESO.

Las moléculas de superficie se analizan por citometría de flujo (FACSCalibur, BD Biosciences) con triple o cuádruple tinción: CD1 a/CD54/CD80/CD83/CD86/Fc£RI; las citoquinas secretadas en los sobrenadantes de cultivo se analizan con la serie de cuentas de citometría Cytometry Bead Array (cat. no. 550749, BD) en citometría de flujo: IL-6, IL-8, TNF, IL-4, IL-10, IL-12. 3.1. Inducción de citoquinas clave para la polarización Th1.

El extracto E0 induce, con un efecto dependiente de la dosis, la expresión de citoquinas IL-10 e IL-12 por células de Langerhans (Figura 4). Estas citoquinas favorecen la inducción de la polaridad TH1 de linfocitos T sin tratamiento previo. 3.2. Maduración de células de Langerhans e inhibición del receptor IqE (FceRQ.

El extracto E0 induce la maduración de células de Langerhans observada por la inducción dependiente de la dosis de moléculas de superficie CD80, CD86, CD83 y CD54 (Figura 5). De manera similar, el extracto E0 inhibe la expresión de receptores IgE (FCERI) de acuerdo con un efecto dependiente de la dosis (Figura 6). 3.3. Activación de receptores de tipo Toll (TLR).

La actividad TLR de ESO fue evaluada en TLR2, TLR4 y TLR5 usando el, modelo de células HEK293 cotransfectadas por el gen para TLR2, TLR4 o TLR5 y por el gen reportero NFKB-SAP (fosfatasa alcalina secretada). La unión de un ligando a su TLR conduce a la activación del factor de transcripción NFKB; el gen sAP se coloca bajo el control de un promotor que puede ser inducido por NFKB. Este gen reportero hace posible controlar la señalización celular mediante TLR: la liberación de sAP inducida por ESO y medida por el ensayo colorimétrico hace posible determinar la actividad de este ingrediente activo como un agonista de TLR2, TLR4 o TLR5.

El estudio se llevó a cabo en las siguientes estirpes celulares de riñon embrionario humano (HEK293): - células HEK-Blue™-2 para TLR2, - células HEK-Blue™-4 para TLR4, - células HEK-Blue™-5 para TLR5.

Estas estirpes celulares se mantuvieron en medio de cultivo HEK-Blue™ Selection 10% FCS y luego se distribuyeron en placas de 96 receptáculos en medio de detección HEK-Blue™, en presencia de ESO durante 18 horas. Las placas se leyeron usando calorimetría a 620 nm. 3.3.1. Activación de TLR2.

El extracto ESO induce la activación de TLR2 de acuerdo con un efecto dependiente de la dosis, con una actividad máxima a 100 ng/ml (Figura 7). 3.3.2. Activación de TLR4.

El extracto ESO induce la activación de TLR4 con una actividad máxima a 10 ng/ml (Figura 8). 3.3.3. Activación de TLR5.

El extracto ESO induce la activación de TLR5 de una manera dependiente de la dosis. Esta actividad es inhibida en presencia de anticuerpo anti-TLR5, lo que demuestra la especificidad de activación del extracto ESO sobre TLR5 (Figura 9). 3.4. Inhibición del receptor 2 activado por proteasa (PAR2).

La inhibición de receptores activados por proteasa por el extracto ESO es evaluada en queratinocitos humanos a partir de un estirpe celular (HaCaT) mediante la medición de la afluencia de calcio intracelular inducida después de la estimulación específica de PAR2 con la enzima tríptica del estrato córneo (SCTE, según su sigla en inglés). Se usa la sonda fluorescente Fluo-4/??: su forma esterificada facilita su penetración por la difusión pasiva en la célula; solo la forma desesterificada ligada a iones de calcio es excitable bajo 485 nm de fluorescencia, y emite a 535 nm.

La sonda fluorescente es incorporada durante 30 minutos en células inoculadas en placas de 96 receptáculos, y luego el extracto ESO es incubado durante 30 minutos. Se mide el flujo de calcio receptáculo por receptáculo en tiempo real de acuerdo con la cinética, antes y después de la inyección de SCTE. Las placas se leen usando un lector Mithras LB940™ (Berthold Technologies®).

El extracto ESO inhibe de manera dependiente de la dosis la activación de PAR2 inducida por SCTE humana (Figura 10). 3.5. Modulación de blancos de dermatitis atópica en queratinocitos.

El estudio se llevó a cabo en queratinocitos epidérmicos humanos normales (NHEK, según su sigla en inglés, medio de cultivo K-SFM) en el contexto de la inducción de un fenotipo de dermatitis atópica. La actividad de ESO se estudió en queratinocitos que exhibían un fenotipo de dermatitis atópica luego de la estimulación durante 24 horas con Poly I: C + IL-4 + IL- 3 + TNF-a, y se analizó por medio de una serie de PCR [sigla en inglés de: reacción en cadena de la polimerasa] sobre la expresión de un panel de 32 genes seleccionados.

Sobre los queratinocitos, el extracto ESO inhibió, con un efecto dependiente de la dosis, 15 blancos entre los mediadores involucrados en la patología de dermatitis atópica, como puede observarse claramente en la Tabla 7 a continuación (los resultados indican, para cada gen blanco, el porcentaje de inhibición obtenido).

Tabla 7 3.6. Inducción de péptidos antimicrobianos.

La actividad del extracto ESO sobre la expresión de proteínas y péptidos antimicrobianos se estudió en la estirpe celular de queratinocitos HaCaT: después de 3 horas de tratamiento en presencia de ESO, las células se recuperaron para el análisis de la expresión de blancos antimicrobianos mediante la RT-PCR [sigla en inglés de: reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real] cuantitativa; se extrajo el ARN total y se ensayó; luego de la transcripción inversa del ARNm en ADNc, se llevó a cabo el paso de amplificación de PCR cuantitativa en placas de 96 receptáculos, en un sistema de PCR cuantitativa iCycler (Bio-Rad). Los resultados obtenidos se expresaron como la cantidad relativa (CR) de ARNm luego del tratamiento por ESO en relación con el control, sin el ingrediente activo. Se usó IL-?ß en forma paralela como inductor positivo de referencia de la expresión de péptidos antimicrobianos. La expresión del gen de interés se consideró regulada cuando RQ>2 (inducción) o RQ<0,5 (inhibición).

El extracto ESO induce la expresión de proteínas y péptidos antimicrobianos hBD2, hBD3, S1007A, LL37, PI3, RNasa 7 y NOD2 (Figura 11 ).

Ejemplo 4: Formulación de una crema para "el cuerpo y el rostro" que comprende el extracto bacteriano ESO.

Extracto ESO: 0,1-5% Aceite de onagra: 1-3% Glicina: 0,1-0.4% Ceramidas: 0,1-0.3% Humectantes: 5-20% Emulsionante: 2-7% Triglicéridos cápricos/caprílicos: 1-10% Conservantes Agua c. s. p. 100% Eiemplo 5: Formulación de un qel de limpieza para "el cuerpo y el rostro" que comprende el extracto bacteriano ESO.

Extracto ESO: 0,1-5% Aceite de onagra: 0,5-2% Glicina: 0,1-0.4% Ceramidas: 0,1-0.4% Surfactantes: 10-20% en materia activa Humectantes: 5-15% Conservantes Agua c. s. p. 100%

Claims (20)

REIVINDICACIONES Habiendo así especialmente descripto y determinado la naturaleza de la presente invención y la forma como la misma ha de ser llevada a la práctica, se declara reivindicar como de propiedad y derecho exclusivo:

1 . Una bacteria no patógena Gram-negativa que pertenece a la clase de las Betaproteobacteria, una subfamilia de las Neisseriaceae, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos del gen de ARNr 16S de dicha bacteria incluye la secuencia de SEC. ID. NRO. 1 .

2. La bacteria de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizada porque incluye por lo menos un plásmido que comprende la secuencia de SEC. ID. NRO. 2, o cualquier secuencia con por lo menos 80% de identidad con dicha secuencia de SEC. ID. NRO. 2.

3. La bacteria de acuerdo con la reivindicación 1 o con la reivindicación 2, caracterizada porque es no filamentosa.

4. La bacteria de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, depositada en la CNCM el 8 de abril de 2010, con la referencia I-4290, o cualquier otra mutante.

5. Un extracto bacteriano obtenido a partir de una suspensión de bacterias de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. El extracto bacteriano de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque se obtiene luego del tratamiento de dicha suspensión bacteriana de modo tal de eliminar los componentes intracelulares.

7. El extracto bacteriano de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque dichos componentes intracelulares incluyen por lo menos los ácidos nucleicos.

8. El extracto bacteriano de acuerdo con la reivindicación 6 o con la reivindicación 7, caracterizado porque incluye una fracción EO que comprende por lo menos proteínas de membrana, proteínas periplasmicas y proteínas que se originan a partir del flagelo.

9. El extracto bacteriano de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque dichas proteínas de membrana consisten en porinas, OmpA [proteína de membrana externa A, según su sigla en inglés], lipopolisacáridos o lipoproteínas, o todas ellas.

10. El extracto bacteriano de acuerdo con la reivindicación 6 o con la reivindicación 7, caracterizado porque incluye una fracción SO que comprende por lo menos proteínas y péptidos secretados y metabolitos secundarios.

1 1 . El extracto bacteriano de acuerdo con la reivindicación 6 o con la reivindicación 7, caracterizado porque incluye una fracción ESO que comprende por lo menos la fracción EO y la fracción SO.

12. El extracto bacteriano de acuerdo con la reivindicación 1 1 , caracterizado porque incluye una fracción ESO con un perfil de proteína, obtenido por SDS-PAGE, que comprende tres bandas principales que corresponden a los pesos moleculares que varían entre 30 kDa y 36 kDa, 41 kDa y 45 kDa, y 47 kDa y 51 kDa, respectivamente.

13. El uso de una bacteria de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o de un extracto bacteriano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 y 12, o de ambos, para la preparación de una composición propuesta para la activación de TLR2, TLR4 y TLR5.

14. El uso de una bacteria de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o de un extracto bacteriano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 o 12, o de ambos, para la preparación de una composición antagonista de PAR2.

15. El uso de una bacteria de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o de un extracto bacteriano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, para la preparación de una composición propuesta para el tratamiento o la prevención de trastornos inflamatorios dermatológicos.

16. El uso de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque dichos trastornos inflamatorios dermatológicos consisten en dermatitis atópica, prurito, eccema y soriasis.

17. Una composición que comprende, como ingrediente activo, por lo menos una bacteria de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un extracto bacteriano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, o ambos.

18. Una composición de acuerdo con la reivindicación 15, para el tratamiento de trastornos inflamatorios dermatológicos.

19. Una composición de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizada porque dichos trastornos inflamatorios dermatológicos consisten en dermatitis atópica, prurito, eccema y soriasis.

20. Una composición cosmética o dermatológica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, caracterizada porque además incluye uno o más excipientes típicos dermatológicamente compatibles.