CN103403144B - 新型细菌及所述细菌提取物、以及其在皮肤病中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种分离自地下水的新型细菌株。本发明还涉及细菌提取物及涉及其在炎症治疗内容中的用途。更特别地，本发明涉及有兴趣的新型组合物用于炎性疾病的治疗及预防，尤其是皮肤科病症。

Description

新型细菌及所述细菌提取物、以及其在皮肤病中的用途
技术领域
本发明涉及一分离自地下水的新型细菌株。本发明还涉及细菌提取物及关于其在炎症治疗内容中的用途。
更特别地，本发明涉及有兴趣的新型组合物在炎性疾病中的治疗及预防，尤其是皮肤科病症。
背景技术
皮肤科疾病诸如特应性皮肤炎（atopicdermatitis）、搔痒病、湿疹以及牛皮癣在小孩中逐渐增加地频繁，特应性皮肤炎在发达国家中的患病率已在过去30年来已加倍或三倍：15%至30%的儿童以及2%至10%的成人有受到影响(WilliamsH.等人,JACI2006;118:209-13)。特应性皮肤炎是特异体质过敏症（atopy）的皮肤表現形式；其为慢性炎症的皮肤病或湿疹，由于遗传上所决定的情况组而发生。其现在被视为是重要的公共卫生议题。特应性皮肤炎通常与其他特应性病症诸如过敏性鼻炎及气喘有所关联。此病症最常出现在孩提早期且特征为几年间反复的爆发。其病程为突发伴随以自发性缓解中断。
对于遭受特应性皮肤炎的病患，生活品质深深地受到干扰。已接受的治疗包括局部性皮质类固醇及免疫调节剂、其频繁的副作用限制长期使用的全身性药剂、以及软化剂。当今的疗法是爆发的反应性治疗─但现在相信专注于爆发以及皮肤炎症控制的早期介入就疾病的控制及潜在的气喘及/或鼻炎的出现两者而言是有益的(Bieber,T.2008,Atopicdermatitis,TheNewEnglandJournalofMedicine,vol.358(14)1483-1494)，因为特应性皮肤炎被视为特应性进程的初始阶段。在大部分的案例中，治疗包括局部组分以最佳地对病患提供缓解。
对于特应性皮肤炎的标准治疗特别使用局部性皮质类固醇或免疫抑制剂，虽然此等治疗并不是没有不良的影响，特别是对于儿童。
特应性皮肤炎是复杂且多因素的。在文献中，某些流行病学的研究已经显示市区环境中的“卫生”因素促进了如过敏及自体免疫的疾病。另一方面，在郊区环境中，其中人们经常接触微生物及/或过敏原，此等暴露刺激人们从出生以来的防御性免疫系统。
在特应性皮肤炎中，皮肤的障壁功能弱化且受损的，其促使致病原(细菌、病毒)的入侵及定居，特别是金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，其已知在皮肤的共生细菌中占有优势。
就免疫学而言，此议题为一种免疫反应失衡。特异体质过敏症通常被描述为过敏的表现形式(由IgE所介导，主要为细胞因子IL-4、IL-5、IL-13)或Th2反应。后者在金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的“抗原性刺激物”存在下更加强化。免疫调节作用在于回复免疫稳态至Th1/Th2平衡。
先天免疫是哺乳类中免疫反应的原始、快速及非特异性的反应。细胞的第一防御屏障包括Toll样受体(Toll-likereceptors)(TLRs)。各个TLR特异性地识别致病原相关分子型态(PAMPs)，诸如源自外来微生物的核酸(TLR3)、肽、表面蛋白、脂壁酸(TLR2)、鞭毛(TLR5)以及脂多醣(TLR4)。基序(motif)(激动剂)与TLR之间的特异性相互作用引发一连串的复杂反应，导致NFκB的转录作用，继而产生促炎及抗炎细胞因子以及趋化因子(Kang等人,2006)。其他得到的药理学结果为抗微生物肽(AMPs)的诱导，其具有抑制致病原(细菌、病毒、寄生虫)生长的能力(Glaser,R.等人2005,Nat.Immunol.6:57-64)。
特应性皮肤炎通常伴随搔痒及搔痒病，因而造成日常生活的不适与烦恼(抓搔、睡眠丧失等等)。此炎症病理的原因之一归因于称为PAR2(蛋白酶活化受体2)的G蛋白偶联受体的活化(Steinhoff,M.等人2003JNeurosci.23:6176-6180)。PAR2在许多细胞的表面上表达，特别是角质细胞、内皮细胞、结肠肌细胞、肠细胞、肠神经元及免疫细胞。在表皮中大量存在的蛋白酶(胰蛋白酶、纤溶酶)在N端切割PAR2、暴露特定的肽，其活化此相同的受体(自我活化的现象)(Vergnolle,N.2009Pharmacol.Ther.123:292-309)。此过程涉及NFκB基因的活化，继而有促炎细胞因子的诱导，因而引发炎症。在此情况下，PAR2拮抗剂及/或蛋白酶抑制剂的发展对于治疗搔痒病的病理具有高度潜力。
牛皮癣亦为一具有慢性进程的皮肤炎性疾病；其影响2%的人口。与特应性皮肤炎一起，牛皮癣为最常见的慢性皮肤炎性疾病之一。其特征在于与炎症反应相关的表皮细胞异常生长。炎症现象的中心机制与免疫系统的T细胞的作用有关，主要是Th1细胞(Wilsmann-Theis,D.等人,EurJDermatol.,vol.18(2)172-180)，其启动且维持炎症过程并刺激角质细胞的过度增殖，其而后进展经过一经加速且不完全的分化期。角质细胞表达受体，该受体使其对于炎症信号敏感并且释放促炎介质。因而牛皮癣性炎症通过T细胞与角质细胞的互相刺激而维持。
此疾病因此必须长时间治疗，因此对于此等炎症皮肤病的治疗性替代品有需要及高度需求。
可提及专利文献EP2018891(GuénicheA.,2009)及GuénicheA.等人2006(EuropeanJournalofDermatology,16,4,380-384)的文献，其描述了线状透明颤菌（Vitreoscillafiliformis）(V.filiformis)的细菌提取物用于治疗特应性皮肤炎的用途，此种提取物具有需要在含无硫矿泉水的培养基上培养该线状细菌线状透明颤菌（V.filiformis）的缺点。
发明内容
在本文中，本发明通过分离、特征描述及分级在之前从未被描述过的新型细菌而提供对治疗该等炎性疾病的解决方式。
第一次、且以惊人的方式，申请人成功从地下水分离出一属于新型细菌种的菌株，其中该新型菌株(或细菌)命名为LMB64。
此细菌LMB64，除了被分离的事实之外，也被描述特征及定义为属于乙型变形菌纲(Betaproteobacteria)，奈瑟氏菌(Neisseriaceae)亚科，且可能为尚未被定义的新型属别。分析编码16S核糖体RNA(rRNA)的基因序列使得将此细菌归于接近色杆菌(Chromobacterium)属、Paludimonas（无对应中译文）属、Lutelia（无对应中译文）属及Glubenkiana（无对应中译文）属成为可能，其与该等属别具有95%序列相似性。
此非致病性细菌为革兰氏阴性且将在实施例中更详细地描述。此细菌亦具有非线状的特征。此外，此细菌具有能够在含有任何类型的水的培养基上培养的优点，且更特别地，为一般水。例如，相对于线状透明颤菌(V.filiformis)，本发明细菌LMB64的培养不需要特定的培养条件，且更特别地，不需要含有至少一种无硫型矿泉水及/或温泉水的培养基。就培养条件及设备两者以及从经济的观点，此表现明确的优点。
编码16SrRNA的基因几乎已被完整地测序(1487bp，对应于序列SEQIDNo.1)。细菌LMB64具有10948bp的环状质粒，此质粒被完整地测序且序列在序列SEQIDNo.2中呈现。
根据第一实施方式，本发明涉及一种非致病性革兰氏阴性细菌，其属于乙型变形菌纲(Betaproteobacteria)，奈瑟氏菌(Neisseriaceae)亚科，其编码16SrRNA的基因的核苷酸序列包括或包含序列SEQIDNo.1，或任何与该序列SEQIDNo.1有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的核苷酸序列。
在一优选的方式中，本发明涉及一种非致病性革兰氏阴性细菌，其属于乙型变形菌纲(Betaproteobacteria)，奈瑟氏菌(Neisseriaceae)亚科，其特征在于该细菌的16SrRNA基因的核苷酸序列包括或包含序列SEQIDNo.1。
在本发明的上下文中，两核酸序列之间的“百分比同一性”表示两将要被比较的序列之间相同核苷酸的百分比，其在最好的配对(最佳配对)之后获得，其中此百分比是纯粹地统计的且该两序列之间的差异随机分布且遍及其整个长度。两核酸序列之间的序列比较通常在以最佳的方式比对之后通过比较这些序列而做到，其中可就每个片段或每个“比较窗”而做到该比较。用于比较的序列的最佳比对，除了手动地，可通过Smith及Waterman(1981)[Ad.App.Math.2:482]的局部同源性演算法的方式、通过Needleman及Wunsch(1970)[J.Mol.Biol.48:443]的局部同源性演算法的方式、通过Pearson及Lipman(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.TheUSA85:2444]的相似性搜寻方法的方式或通过使用此等演算法的电脑软件(575ScienceDr.,Madison,WI，遗传集团电脑，威斯康辛遗传软件包裹中的GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，或BLASTN或BLASTP电脑软件)的方式而实行。
两核酸序列之间的百分比同一性是通过比较以最佳方式比对的此两个序列而决定，其中将要被比较的核酸序列相对于用于此两序列间最佳比对的参照序列可包括添加或缺失。百分比同一性是通过决定该两序列之间核苷酸相同的位置的数目、通过将此相同位置的数目除以比较窗中位置的总数以及通过将所获得的结果乘以100以获得此两序列之间的百分比同一性而计算出。
例如，“BLAST2序列”程序(Tatusova等人,“Blast2sequences–anewtoolforcomparingproteinandnucleotidesequences,”FEMSMicrobiolLett.174:247-250)，可获自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html，可以内定参数而使用(特别是对于参数“开放间隙罚分”：5；以及“延伸间隙罚分”：2；其具有经选择的矩阵，例如程序所建议的“BLOSUM62”矩阵)，将要被比较的两序列之间的百分比同一性是直接通过该程序而计算的。亦可能使用其他程序，诸如“ALIGN”或“Megalign”软件(DNASTAR)。
根据另一实施方式，根据本发明的细菌包括至少一个质粒，该质粒包含序列SEQIDNo.2，或任何与该序列SEQIDNo.2有至少80%，优选85%、90%、95%及98%同一性的序列。
在一优选的方式中，细菌LMB64包括至少一个包含序列SEQIDNo.2的质粒。
根据本发明一个优选的实施方式，细菌LMB64特征在于其为非线状。
该细菌LMB64的其他特征将于下实例中被详细说明。
此外，本发明细菌LMB64已依据布达佩斯条约以申请人之名在2010年4月8日保藏于巴黎巴斯德研究所的国家微生物保藏中心（CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes(CNCM)），保藏号为I-4290。
因此，本发明的一个目标为于2010年4月8日保藏于CNCM的细菌，保藏号为I-4290，或同源物、后代或任何其他突变体。
用语“突变体”表示直接由菌株I-4290而来的任何细菌，可包含天然突变或重组，诸如，例如，涉及细胞增殖、细胞分裂(基于发生在细菌分裂或DNA复制期间的错误的突变)或任何其他天然选择的机制，诸如对给定化合物具有抗性或变成有抗性的突变体的选择的任何重组。包括在此等突变体中的是由菌株I-4290而来的任何细菌，在其基因组序列(或其质粒的基因组)中包含一个或多个突变，其中突变由辐射、由病毒、由转座子或由致突变化学品所引起。
根据本发明第一个实施方式，可由各种已知的方法分离来自细菌培养物的整个生物质，诸如，例如，通过过滤、与醇类(乙醇、异丙醇、异丁醇)凝集，通过在具有经刮除的预先层的柱上干燥等等，以及而后于冷冻干燥或热去活化形式使用。
根据另一优选实施方式，本发明以一般方式涉及细菌提取物，亦称为细菌级分（fraction），其获自如上所述的细菌，即细菌LMB64的悬浮液。
用语“细菌提取物”表示细菌生物质的任何提取物或级分或该提取物或任何活性级分。例如，此提取物可获自细菌LMB64的培养物，其中制备方法包含至少一个细菌裂解的步骤以及一个通过离心或通过过滤而分离构成其的各种级分的步骤。
在一个非限制性的方式中，根据本发明的提取物可由经浓缩，例如，通过离心的培养基中分离的细菌细胞组成；或由经浓缩的细菌细胞组成，其已进行其中细胞包被已通过本领域技术人员已知的任何手段，诸如通过超音波或高压蒸气灭菌的作用而被破坏的操作；或由通过过滤所获得的上清液组成。
根据本发明的提取物制备方法的一个重要步骤由除去各种细胞内组份组成，诸如，例如，核酸(染色体DNA、染色体外环状DNA、质粒)、核糖体以及胞内储存的物质，诸如糖原、淀粉以及聚-β-羟丁酸酯等等。
在一优选的方式中，根据本发明的细菌提取物在以除去细胞内组份的方式处理该细菌悬浮液之后而获得。
结果是根据本发明的提取物主要地包括来自膜、来自周质空间和/或来自胞外空间的组份。
更特别是，该细胞内组份包含至少核酸。
除了除去胞内化合物之外，且作为非限制性示例，在细菌裂解且离心之后，对于本领域技术人员可轻易地分离培养上清液的组份(此后为S0级分)以及构成沉淀物的组份(此后为E0)。例如，可建议S0与E0的构成物之间的分开阈值为约100kDa的分子量。因此，S0级分的构成物具有，对于大部分而言，分子量小于100kDa，而E0级分的组份则具有，对于大部分而言，分子量大于100kDa。
更特别是，因此可以通过本领域技术人员已知的技术提取以及将培养上清液(S0)中所找到的生物分子与主要由表面蛋白及位于细菌的周质空间中的蛋白质(E0)组成的生物分子分开。
根据本发明的一个实施方式，细菌提取物包括E0级分，其包含至少膜蛋白、周质蛋白及来自鞭毛的蛋白质。
周质蛋白包括位于革兰氏阴性细菌的周质空间中的蛋白质，其可通过渗透冲击或通过在含有促溶剂(chaotropicagent)或清洁剂的培养基中培养而被释放(MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdedition:SambrookandRussell.CSHLPress)。
来自鞭毛的蛋白质包括鞭毛的多聚体蛋白或鞭毛的片段。以清洁剂继而以超高速离心分离(在CsCl梯度存在下)分离及纯化整个细菌鞭毛的方法在文献中已被描述。在本发明中，提取方法的示例使得回收鞭毛片段成为可能。
膜蛋白包括锚定在膜中的蛋白质且其一部分系暴露在表面上(外膜蛋白，或称为Omp)、粘附在膜表面的蛋白质、脂蛋白以及孔蛋白(WardJB.,Microbialadhesiontosurfaces,1980)。
在一各优选的方式中，该膜蛋白由孔蛋白、OmpA、脂多醣及/或脂蛋白组成。
根据本发明另一实施方式，优选为使用S0级分。
更特别是，根据本发明的细菌提取物包括S0级分，其包含至少经分泌的肽与蛋白质以及二次代谢物。
经分泌的肽与蛋白质包括由细菌LMB64所天然产生及分泌的肽与蛋白质，其可通过离心或通过过滤而回收。
二次代谢物包括细菌LMB64在培养基中所产生及分泌的小分子。
脂多醣在S0级分中的存在在此应被提及，确实，脂多醣，虽然其主要在E0级分中被发现，尽管如此仍在S0级分中被少量发现。
在一有利的方式中，可以组合E0级分及S0级分从而获得ES0级分，其通过由，例如，使培养基温育及在碱性培养基(pH9至11)中在4°C的温度反应约5小时、通过离心及提供在0.2μm过滤以获得清澈的ES0溶液。
因此细菌提取物ES0由，除其它以外，膜蛋白、脂多醣、周质蛋白、鞭毛的蛋白质片段以及细菌所产生的初级及二次代谢物所构成。
在一个优选的方式中，提取物ES0具有一蛋白质谱，其包含至少，根据SDS-PAGE技术的12个条带，其包括三个主要的条带分别对应于分子量(相关于分子标准品所给予的约略分子量，特别是由Bio-RadLaboratories所提供者)范围介于下列之间：
条带1：30kDa与36kDa，优选为34kDa；
条带2：41kDa与45kDa，优选为43kDa；
条带3：47kDa与51kDa，优选为49kDa。
根据本发明的另一实施方式，细菌提取物包括ES0级分，其包含至少E0级分与S0级分。
根据本发明的一优选实施方式，细菌提取物包括具有通过SDS-PAGE所获得的蛋白质谱的ES0级分，其包括分别对应于分子量范围介于30kDa与36kDa、41kDa与45kDa以及47kDa与51kDa之间的三个主要的条带。
根据本发明的一优选实施方式，细菌提取物包括具有通过SDS-PAGE所获得的蛋白质谱的ES0级分，其包括分别对应于分子量34kDa、43kDa以及49kDa的三个主要的条带。
根据另一方面，本发明描述一个用于制备细菌提取物的方法，包含下列步骤：
a)于适当的培养基中培养细菌LMB64；以及
b)除去细胞内组份。
根据另一实施方式，根据本发明的方法由用于制备细菌提取物S0的方法组成，其中该方法包含下列步骤：
a)于适当的培养基中培养细菌LMB64；
b)离心该培养物；以及
c)回收上清液S0。
根据另一实施方式，根据本发明的方法由用于制备细菌提取物E0的方法组成，其中该方法包含下列步骤：
a)于适当的培养基中培养细菌LMB64；
b)离心该培养物以及除去上清液；
c)以除去细胞内组份的方式处理由步骤b)所获得的生物质；以及
d)回收基底E0。
在一优选的方式中，步骤c)由超音波处理由步骤b)所获得的生物质、而后的初始离心目标在除去包含该细胞内组份的沉淀物，以及而后的上清液的第二次离心组成。
根据另一实施方式，根据本发明的方法由用于制备细菌提取物E0的方法组成，其中该方法包含下列步骤：
a)于适当的培养基中培养细菌LMB64；
b)离心该培养物以及除去上清液；
c)以超音波处理由步骤b)所获得的生物质；
d)离心该经超音波处理的生物质以及除去所获得的生物质；
e)离心由步骤d)所获得的上清液；以及
f)回收基底E0。
应注意的是以上所描述的各种方法系提供以仅用于说明且本领域技术人员已知的任何方法可被使用。
如由下面示例可清楚了解，除了对于此类型的提取物所预期的活性，申请人已展示数种之前从未被描述过的新型活性。
涉及免疫调节的本发明的第一有利的方面，在于促炎细胞因子的调节性质，更特别是，根据本发明的细菌和/或提取物的使用显著地诱导细胞因子IL-10、IL-12及TNF-α，其等偏向涉及于Th1免疫反应中，并且显著地抑制细胞因子IL-4及IL-6。结果为兰格汉氏细胞(Langerhanscell)的活化及转回到Th1/Th2平衡。
此外，另一观察显示使用根据本发明的细菌和/或提取物使得大大地减少IgE受体的表达成为可能，其为有兴趣地因为IgE可能会造成过敏现象。
本发明另一优点在于，如可由示例清楚了解，使用根据本发明的细菌和/或提取物会诱导抗菌肽诸如，例如，肽hBD-2、hBD-3、S1007A及LL-31的产生的事实。
更特别是，如上所述，细菌线状透明颤菌(Vitreoscillafiliformis)的提取物(GuénicheA.等人,EurJDermatol2006;16:380)已知由于OmpA的存在，对TLR2具有活性，以及由于脂多醣的存在，对TLR4具有活性。由于线状透明颤菌(V.filiformis)细菌中没有鞭毛，由线状透明颤菌(V.filiformis)所获得的提取物没有TLR5活性。
做为第一次，申请人描述了根据本发明的细菌提取物，其除了对TLR2及TLR4具有活性外，对TLR5具有活性。
本发明因此涉及诸如如上所描述的细菌及/或细菌提取物做为TLR2、TLR4及TLR5活化剂的用途。
在一优选的方式中，该TLR2、TLR4及TLR5的细菌提取物活化剂由提取物组成，该提取物包含所有或部份由鞭毛而来的蛋白质。在此案例中，做为示例，该提取物优选为提取物E0或提取物ES0。
该TLR5活化活性具有重大的兴趣，因为TLR5已知会诱导特定抗菌肽诸如牛皮癣素(S100A7)及hBD-2(Glaser等人,JournalofInvestigativeDermatology(2009)129,641–649)。此外，TLR5激动剂与TLR2及TLR4的激动剂协同作用，因而使得能够造成抗菌肽的产生成为可能。已显示通过以抗体阻断TLR5，TLR5被产生少许或根本没有。
因此此方面对于根据本发明的细菌及/或提取物的免疫调节的应用而言特别地有创造性。
此外，以一不可预期的方式，与迄今已描述的细菌提取物不同，申请人还证实了对于PAR2的拮抗活性。此活性在抗炎症治疗的内容中具有重大的兴趣。
本发明因此相当特别地涉及细菌和/或细菌提取物的用途，诸如以上所描述的作为PAR2拮抗剂。
在一优选的方式中，该PAR2拮抗剂细菌提取物由提取物S0或提取物ES0组成。
PAR2在内皮细胞、结肠肌细胞、肠细胞、肠神经元、免疫细胞及角质细胞中过度表达。大量存在于环境中的蛋白酶(胰蛋白酶、纤溶酶)在N端切割PAR2、暴露一特定肽，其活化此相同的受体(自我活化的现象)。结果，其激活促炎细胞因子的产生并引发炎症现象(Vergnolle,N.,2009Pharmacol.Ther.123:292-309)。此现象在野生型小鼠中观察到但在KO小鼠(PAR2缺陷)中则未出现。以抗蛋白酶和/或PAR2拮抗剂治疗使得避免此炎症现象成为可能。
所有这些活性的组合与协同作用赋予此细菌LMB64，或任何由该细菌而来的提取物，一高度的潜力以治疗炎症疾病及，尤其特别是，其中涉及PAR2和/或其中免疫系统弱化、扰乱或不平衡的炎症疾病。
因此本发明涉及诸如上文所描述的细菌和/或来自该细菌的细菌提取物在制备组合物中的用途，该组合物意欲用于皮肤科炎性疾病的治疗和/或预防。
在一优选的方式中，该皮肤科炎性疾病由特应性皮肤炎、搔痒病、湿疹及牛皮癣组成。
根据另一实施方式，本专利申请案的发明涉及组合物，其包含至少一种根据本发明的细菌和/或细菌提取物作为活性成分。
因此在一优选的方式中，本发明涉及一化妆品或皮肤科组合物。
根据本发明的组合物涉及皮肤科炎性疾病的治疗。
在一优选的方式中，该皮肤科炎性疾病由特应性皮肤炎、搔痒病、湿疹及牛皮癣组成。
根据本发明的组合物可特别含有添加物及制剂辅助剂诸如乳化剂、增稠剂、成胶剂、水结合剂、展开剂、安定剂、成色剂、芳香剂及防腐剂。
根据本发明的化妆品或皮肤科组合物进一步包含一种或多种典型的皮肤科上相容的赋形剂。
根据本发明的组合物可被制备为油包水(W/O)或水包油(O/W)乳化液、多重乳化液诸如，例如水包油包水(W/O/W)或油包水包油(O/W/O)乳化液、微乳化液的形式或为水分散液或脂分散液、凝胶或气溶胶的形式。
皮肤科上或化妆品上相容的赋形剂可为本领域技术人员所知的任何赋形剂，以获得以乳剂、乳霜、香膏、油脂、洗剂、凝胶、发泡胶、发胶、喷雾等等形式的用于局部施用的组合物。
除了皮肤科及化妆品组合物之外，本发明还涉及用作药物的药学组合物。
本发明因此涉及药学组合物，其进一步包含药学上可接受的载剂。
在本案说明书中，“药学上可接受的载剂”意指作为药学组合物的一部分的化合物或化合物的组合，其不会造成二次反应且其，例如，帮助活性化合物的投药、增加其在体内的寿命和/或功效、增加其在溶液中的溶解度或改善其保存。该药学上可接受的载剂广为周知且可根据所选用活性化合物的本质及投药模式而被本领域技术人员所调整使用。
优选地，该化合物可通过肌肉内、皮内、腹膜内或皮下途径，或通过经口路径而全身性地投药。包含根据本发明的抗体的组合物可以数个剂量、分散于时间上被投药。
投药、给药排程及制剂形式的最佳模式可根据在建立适用于病患的治疗时普遍上考虑到的准则而决定，诸如，例如，病患的年纪或体重、病患一般健康的严重性、对该治疗的耐受性以及注意到的副作用。
本发明在考量到以下举例说明本发明而不限制其范围的实施例时可被更加了解。
附图说明
图1说明编码菌株LMB64的16SrRNA的序列的种系发生位置。出现在此树上的序列系来自GenBank与LMB64的序列最接近的序列。
图2A及2B呈现穿透式电子显微镜(A)及扫描式电子显微镜(B)下细菌LMB64的影像。
图3呈现R3培养基的温度、pH及盐度的函数所决定的生长最佳化。
图4说明通过提取物E0诱导的细胞因子IL-10及IL-12(剂量依赖效果)。
图5说明通过提取物E0诱导的表面分子CD80、CD86、CD83及CD54(剂量依赖效果)。
图6说明通过提取物E0抑制IgE受体。
图7说明通过提取物ES0活化TLR2。
图8说明通过提取物ES0活化TLR4。
图9说明通过提取物ES0活化TLR5。
图10说明通过提取物ES0的特异性PAR2拮抗剂活性。
图11说明通过提取物ES0诱导抗菌肽及蛋白质。
图12由提取物ES0的SDS-PAGE凝胶组成。
具体实施方式
实施例1：细菌LMB64的筛选及定性
细菌AV13分离自地下水。
新型细菌LMB64的分类学位置提议于图1中。
更特别地，细菌LMB64是杆状，具有大约2.3μm(±0.3)的长度及1.0μm(±0.1)的宽度。此细菌的一可区别的特征是极性鞭毛的存在(图2A及2B)。如在这些影像中所见的，细菌LMB64是非线状细菌。
如上所提及，细菌LMB64具有大约11kbp的环状质粒，此质粒被完整地测序(SEQIDNo.2)。
编码16SrRNA的基因亦被测序(SEQIDNo.1)。细菌在发酵槽中在合成培养基中培养。当培养基中具有低浓度的碳底物时生长速率较高。
受试培养基为R3、MS-葡萄糖及LB培养基，其组份分别描述在下表1a、1b及1c中。
表1a
表1b
表1c
作为培养基的函数的细菌LMB64的生长速率如下表2所呈现。
表2
生长速率(/h)
LB0.25(±0.05)
LB(1/2稀释)0.46(±0.11)
LB(1/5稀释)0.60(±0.14)
LB(1/10稀释)0.69(±0.15)
MS-葡萄糖0.13(±0.04)
R30.62(±0.14)
生长最佳化作为R3培养基温度、pH及盐度的函数而决定(图3)。
可被该细菌同化的碳源通过使用API50CH设备而被定性(培养温度：25°C)，结果总结于下表3中。
表3
+：可使用的底物，l：低使用
显示在APIZYM设备上的酶活性是：碱性磷酸酶、酯酶(C4)、酯酶/脂肪酶(C8)、亮氨酸芳基酰胺酶、缬氨酸芳基酰胺酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶及α-葡萄糖苷酶。
细菌LMB64对所有如下表4中所见的受测试抗生素敏感。
表4
实施例2：用于提取E0、S0及ES0级分的方法
预培养：菌株AV13接种于含有250ml的MS葡萄糖丙酮酸培养基的锥形瓶中(见如下表5)，接着在30°C(pH7)及200rpm下震荡培养约40小时，直到获得OD600≈1.5。
表5
培养：预培养物接着接种于含有3.7l的MS丙酮酸培养基+114ml的20%葡萄糖溶液的发酵槽中(Applikon)。温度感应器调节温度优选地接近30°C。使用氧气感应器(AppliSens)以维持培养基中溶氧的浓度为18-25%。使用pH感应器(AppliSens)以通过固定流速的泵通过添加10%NH4OH而维持pH于7。使用维吉伍德(Wedgewood)分析感应器以实时监控吸光度的改变。培养物被程序化为批次供给的模式；通过可变的流速泵，培养物被提供20%葡萄糖溶液。当OD600≈22-26时发酵停止，一般在大约30小时后。
提取S0：上清液由在4°C及4000g离心1小时而自生物质分离。
提取E0：将湿生物质溶于NaCl溶液(1M)中。在4°C及9000g离心15分钟后，舍弃上清液且将沉淀物溶于1MNaCl溶液中。样品管接着插入在功率设定50-60W的冷超音波浴中历时数分钟。在4°C及6000g离心30分钟后，舍弃沉淀物并回收上清液。加入两倍体积的冰乙醇且悬浮液留在4°C过夜。在4°C及6000g离心30分钟后，舍弃上清液且将沉淀物溶于25mMTris缓冲液，pH8.8中。
提取ES0：培养物以碱性缓冲液调至碱性pH(pH9-11)。下一步为在4°C的温度下搅拌5小时孵育。在离心后，预过滤上清液以去除残存的生物质残渣，且接着在0.2μm过滤器上过滤。获得澄清黄色溶液(ES0)。
蛋白质是根据DC蛋白质试验试剂盒II(Bio-Rad)的操作流程而试验。糖类是根据酚/硫酸方法(Dubois,M.等人,1956)而检测葡萄糖当量。
作为一示例，下列表6呈现上述条件下所获得的提取物ES0的某些特定特征。
表6
可清楚地了解到以上资料呈现在本文中仅供说明性的目的。
更精确地来说，关于由SDS-PAGE所获得的蛋白质谱的数据具有3条主要的条带。
SDS-PAGE操作流程：
提取物ES0溶于缓冲液(20mMTris-HCl，pH8.0；1mMEDTA；2.5%SDS及0.01%溴酚蓝)及1MDTT(1,4-二硫苏糖醇)中。样本及分子量标记的混合物(WesternC,Bio-Rad)分别沉积于8-16%SDS-PAGE丙烯酰胺凝胶(GeBaGel,GeneBio-Application)的槽孔中。迁移缓冲液含有2.5mMTris，19.2mM甘氨酸及0.01%SDS(w/v)。允许在固定电压160V下进行大约1小时(GeBaGelsystem)的迁移，接着以考马斯蓝(CoomassieBlue)(InstantBlue,Expedeon)染色蛋白质条带。以相关于已知标准品(STD)计算大小。
所获得的胶体呈现在图12中。
根据本发明的实施方式，此三个条带分别具有大约34kDa、43kDa及49kDa的分子量。
实施例3：E0及ES0级分的药理学活性的证实
兰格汉氏细胞(LC)是自分离自棕黄层(Buffy-Coat)囊的人类单核细胞于体外产生，棕黄层囊来自法国国家血液服务(EtablissementduSang(EFS)PyrénéesMéditerranée)：于Ficoll梯度(淋巴细胞分离培养基，密度1.077g/ml)上分离且通过磁性免疫筛选(MiltenyiBiotec)纯化；LC分化在细胞因子混合物（cocktail）(GM-CSF/IL-4/TGFβ)存在下进行6天。分布在24孔板的RPMI-5%FCS培养基中的LC是以提取物ES0培养24小时。
通过流式细胞仪(FACSCalibur,BDBiosciences)以三或四重染色分析表面分子：CD1a/CD54/CD80/CD83/CD86/FcεRI；分泌在培养基上清液中的细胞因子以流式细胞仪中的细胞仪颗粒阵列(CytometryBeadArray)(cat.no.550749,BD)分析：IL-6、IL-8、TNF、IL-4、IL-10、IL-12。
3.1供Th1极化的关键细胞因子的诱导
提取物E0依据剂量依赖方式的效果诱导兰格汉氏细胞的细胞因子IL-10及IL-12的表达(图4)。这些细胞因子促进未活化T淋巴细胞的TH1极性的诱导。
3.2兰格汉氏细胞成熟及IgE受体(FcεRI)抑制
提取物E0诱导兰格汉氏细胞的成熟，观察到剂量依赖式的诱导表面分子CD80、CD86、CD83及CD54(图5)。类似地，提取物E0依据剂量依赖式的效果抑制IgE受体(FcεRI)的表达(图6)。
3.3Toll样受体(TLRs)的活化
ES0的TLR活性是使用共转染有TLR2、TLR4或TLR5基因以及报告基因NFκB-sAP(分泌性碱性磷酸酶)的HEK293细胞模式而对TLR2、TLR4及TLR5评估。配体对其TLR的结合导致转录因子NFκB的活化；sAP基因被置于可被NFκB诱导的启动子的控制下。此报告基因使得能够通过TLRs监控细胞信息：由ES0所诱导以及由比色试验所测得的sAP的释放使得能够决定此活性成分的活性为TLR2、TLR4或TLR5激动剂。
此研究是在下列人类胚胎肾脏(HEK293)细胞株上进行：
HEK-BlueTM-2细胞供TLR2，
HEK-BlueTM-4细胞供TLR4，
HEK-BlueTM-5细胞供TLR5，
这些细胞系维持在HEK-BlueTM筛选10%FCS培养基中且之后分布于96孔板的HEK-BlueTM检测培养基中，在ES0存在下历时18小时。该平板使用比色计在620nm下读取。
3.3.1TLR2的活化
提取物ES0依据剂量依赖的效果诱导TLR2的活化，最大活性在100ng/ml(图7)。
3.3.2TLR4的活化
提取物ES0诱导TLR4的活化，最大活性在10ng/ml(图8)。
3.3.3TLR5的活化
提取物ES0于剂量依赖的方式诱导TLR5的活化，此活性在抗-TLR5抗体存在下被抑制，显示提取物ES0对TLR5的活化特异性(图9)。
3.4蛋白酶活化受体2(PAR2)的抑制
提取物ES0对蛋白酶活化受体的抑制是在来自细胞系(HaCaT)的人类角质细胞上，通过测量以角质层胰酶(stratumcorneumtrypticenzyme)(SCTE)特异性刺激PAR2后所诱导的胞内钙内流来评估。使用萤光探针Fluo-4/AM：其酯化形式促进其通过被动扩散穿透入细胞中；惟有去酯化形式连接到钙离子才可在485nm萤光下激发并在535nm下发射。
萤光探针在接种于96孔平板中的细胞中并入30分钟，且接着温育提取物ES0历时30分钟。根据注射SCTE之前及之后的动力学实时地逐孔测量钙流。该平板使用MithrasLB940TM读取机(Berthold)读取。
提取物ES0以剂量依赖的方式抑制由人类SCTE所诱导的PAR2活化(图10)。
3.5角质细胞上特应性皮肤炎靶标的调节作用
该研究在正常人类表皮角质细胞(NHEK,K-SFM培养基)上以诱导特应性皮肤炎表现型的方式进行。ES0的活性是在以PolyI:C+IL-4+IL-13+TNF-α刺激24小时后具有特应性皮肤炎表现型的角质细胞上研究的，并且通过PCR阵列分析32个选择的基因群的表达。
在角质细胞上，提取物ES0依据剂量依赖的效果抑制涉及特应性皮肤炎病理学的介导子中的15个目标基因，如可清楚地于下表7中所见(结果显示所获得的各目标基因的抑制百分比)。
表7
3.6抗菌肽的诱导
提取物ES0对抗菌肽及蛋白的表达的活性是在HaCaT角质细胞系上研究的：在ES0存在下处理3小时后，回收细胞以供由定量RT-PCR分析抗菌目标的表达；提取总RNA并分析；在反转录mRNA为cDNA后，在iCycler定量PCR系统(Bio-Rad)上在96孔平板中进行定量PCR扩增步骤。所获得的结果以由ES0处理后mRNA相对于不具活性成分的对照组的相对数量(RQ)表示。IL-1β作为抗菌肽表达的参照阳性诱导剂平行使用。当RQ≥2(诱导)或RQ≤0.5(抑制)时，感兴趣基因的表达被认为受到调节。
提取物ES0诱导抗菌肽及蛋白hBD2、hBD3、S1007A、LL37、PI3、RNase7及NOD2的表达(图11)。
实施例4：包含细菌提取物ES0的“身体及面部”乳霜的制剂
提取物ES0：0.1-5%
月见草油：1-3%
甘氨酸：0.1-0.4%
神经酰胺：0.1-0.3%
保湿剂：5-20%
乳化剂：2-7%
羊脂酸/辛酸三酸甘油酯：1-10%
防腐剂
水qsp100%
实施例5：包含细菌提取物ES0的“身体及面部”清洁凝胶的制剂
提取物ES0：0.1-5%
月见草油：0.5-2%
甘氨酸：0.1-0.4%
神经酰胺：0.1-0.4%
表面活性剂：10-20%于活性态样
保湿剂：5-15%
防腐剂
水qsp100%。
PCT/RO/134表（中译文）
仅供受理局使用
仅供国际局使用

Claims (17)

1.一种非致病性革兰氏阴性细菌，其于2010年4月8日保藏于CNCM，保藏号为I-4290。
2.一种细菌提取物，其获自如权利要求1所述的非致病性革兰氏阴性细菌的悬浮液。
3.如权利要求2所述的细菌提取物，其特征在于其在以除去细胞内组份的方式处理该细菌悬浮液后而获得。
4.如权利要求3所述的细菌提取物，其特征在于该细胞内组份至少包括核酸。
5.如权利要求3或4所述的细菌提取物，其特征在于其包括E0级分，该E0级分至少包含膜蛋白、周质蛋白及来自鞭毛的蛋白质。
6.如权利要求5所述的细菌提取物，其特征在于该膜蛋白由孔蛋白、OmpA、脂多醣和/或脂蛋白组成。
7.如权利要求3或4所述的细菌提取物，其特征在于其包括S0级分，该S0级分至少包含经分泌的肽与蛋白质以及二次代谢物。
8.如权利要求3或4所述的细菌提取物，其特征在于其包括ES0级分，该ES0级分至少包含E0级分及S0级分。
9.如权利要求8所述的细菌提取物，其特征在于其包括具有由SDS-PAGE所获得的蛋白质谱的ES0级分，所述蛋白质谱包括分别对应于分子量范围介于30kDa与36kDa、41kDa与45kDa以及47kDa与51kDa之间的三个主要条带。
10.一种如权利要求1所述的非致病性革兰氏阴性细菌和/或如权利要求2至6及9任一项所述的细菌提取物在制备组合物中的用途，该组合物旨在活化TLR2、TLR4及TLR5。
11.一种如权利要求1所述的非致病性革兰氏阴性细菌和/或如权利要求7或9任一项的细菌提取物用于制备PAR2拮抗剂组合物中的用途。
12.一种如权利要求1所述的细菌和/或如权利要求2至9任一项所述的细菌提取物在制备组合物中的用途，该组合物旨在皮肤科炎性疾病的治疗和/或预防。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于所述皮肤科炎性疾病由特应性皮肤炎、搔痒病、湿疹及牛皮癣组成。
14.一种组合物，其包含至少一种如权利要求1所述的非致病性革兰氏阴性细菌和/或如权利要求2至9任一项所述的细菌提取物作为活性成分。
15.如权利要求14所述的组合物，其用于皮肤科炎性疾病的治疗。
16.如权利要求15项所述的组合物，其特征在于所述皮肤科炎性疾病由特应性皮肤炎、搔痒病、湿疹及牛皮癣组成。
17.如权利要求14至16项任一项所述的组合物，其特征在于其进一步包括一种或多种典型的皮肤科相容的赋形剂。
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