KR102036938B1 - 뇌에서 상승된 수준의 α-시누클레인을 진단하기 위한 항-α-시누클레인 항체의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 뇌에서 상승된 수준의 α-시누클레인을 진단하기 위한 항-α-시누클레인 항체의 용도에 관계한다. 구체적으로, 본 발명은 검사 개체에 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 투여 이후에 혈장 또는 CSF에서 α-시누클레인의 수준을 사정하는 방법에 관계하고, 상기 항체는 뇌에서 혈액으로, 또는 뇌에서 CSF로 α-시누클레인의 순 유출을 변경할 만큼 충분한 활성으로 α-시누클레인에 결합할 수 있다.

Description

뇌에서 상승된 수준의 α-시누클레인을 진단하기 위한 항-α-시누클레인 항체의 용도{USE OF AN ANTI-α-SYNUCLEIN ANTIBODY TO DIAGNOSE AN ELEVATED LEVEL OF α-SYNUCLEIN IN THE BRAIN}

전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조

본 출원과 함께 제출된 ASCII 텍스트 파일 (명칭: sequencelistingPCT_ascii.txt; 크기: 5,199 바이트; 그리고 작성 일자: 2012년 10월 18일)에서 전자적으로 제출된 서열 목록의 내용은 본원에 전체로서 참조로서 편입된다.

배경

발명의 분야

본 발명은 뇌에서 상승된 수준의 α-시누클레인을 진단하기 위한 항-α-시누클레인 항체의 용도에 관계한다. 구체적으로, 본 발명은 검사 개체에 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 투여 이후에 혈장 또는 뇌척수액 (CSF)에서 α-시누클레인의 수준을 사정하는 방법에 관계하고, 상기 항체는 뇌에서 혈액으로, 또는 뇌에서 CSF로 α-시누클레인의 순 유출을 변경할 만큼 충분한 활성으로 α-시누클레인에 결합할 수 있다.

발명의 배경기술

포유류 뇌는 뇌 모세혈관과 피아-지주막하 막에 국부적인 혈액-뇌 장벽 (BBB) 및 맥락막망에 국부적인 혈액-뇌척수액 (CSF) 장벽에 의해 혈액으로부터 분리된다. α-시누클레인은 비-병리학적 조건 하에 뇌에서 상대적으로 풍부하다. 이것은 주로 시토졸 내에 존재하는 자연적으로 비접힘된 단백질이다. 이것은 시냅스 전 종말 (presynaptic terminal)로부터 전달물질 방출을 증가시킴으로써 시냅스 전달 (synaptic transmission) 및 시냅스 가소성 (synaptic plasticity)에서 핵심적인 역할을 수행한다. (Liu et al., EMBO J 23:4506-4516 (2004)). α-시누클레인에서 돌연변이는 조기-발병 파킨슨병의 희귀한 가족성 증례와 연관되고, 그리고 α-시누클레인의 가용성 형태에서 집합된 불용성 형태로의 전환은 신경변성 질환, 예를 들면, 파킨슨병, 루이소체 치매 (DLB), 그리고 여러 다른 신경변성 질환의 병인에서 핵심적인 사건 중의 하나이다. (Dawson et al., Science 302:819-822 (2003), Bennett et al., Pharmacol Ther. 105:311-331 (2005), George, JM., Genome Biol. 3(1): reviews3002.1-reviews3002.6 (2002)). 부가적으로, 단위체와 소중합체 α-시누클레인 둘 모두 파킨슨병 환자의 뇌척수액 (CSF)과 혈청에서 발견되었는데, 그 이유는 명백하게, α-시누클레인 및 심지어 이의 집합된 종류가 혈액-뇌 장벽을 가로지를 수 있기 때문이다. (El-Agnaf et al ., FASEB J. 20:419-425 (2006), Tokuda et al ., Biochem Biophys Res Commun. 349:162-166 (2006), Lee et al., J Neural Transm. 113:1435-1439 (2006), Mollenhauer et al., Exp Neurol. 213:315-325 (2008), El-Agnaf et al., FASEB J. 17:1945-1947 (2003), Li et al., Exp Neurol 204: 583-588 (2007).

파킨슨병의 생쥐 모델에서 면역화 연구는 α-시누클레인에 대한 생쥐 단일클론 항체가 세포내 α-시누클레인 집합체의 축적을 감소시킬 수 있다는 것을 증명하고 (Masliah et al., Neuron, 46: 857-868 (2005); Masliah et al., PLoS One, 6(4): e19338 (2011), 단위체 α-시누클레인의 유익한 기능을 간섭하지 않으면서 신경독성 집합체를 중화시키는 항체가 유용한 치료제일 수 있다는 개념을 뒷받침한다. 하지만, 인간에서 뮤린 기초된 항체의 치료적 및 진단적 유용성은 그들의 비-인간 기원에 비추어 인간 항-생쥐 항체 (HAMA) 반응에 의해 방해된다.

따라서 뇌에서 상승된 수준의 α-시누클레인에 대해 환자를 사정하기 위한 방법을 개발하는 것이 필요하다.

간단한 요약

한 구체예는 검사 개체의 뇌에서 상승된 수준의 α-시누클레인을 진단하는 방법에 관계하고, 상기 방법은 하기를 포함한다: (a) 검사 개체에 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 말초 투여 이후에 특정된 간격에서 검사 개체로부터 획득된 혈장 시료에서 α-시누클레인의 수준을 검정하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 단편은 뇌에서 혈액으로 α-시누클레인의 순 유출을 변경할 만큼 충분한 친화성으로 α-시누클레인에 결합할 수 있고; (b) 검사 개체에서 α-시누클레인의 검정된 수준을 참고 기준에 비교하고; 여기서 혈장 시료에서 α-시누클레인의 수준 및 참고 기준 사이에 차이 또는 유사성은 검사 개체의 뇌에서 α-시누클레인의 수준과 상관한다.

또한, 검사 개체의 뇌에서 상승된 수준의 α-시누클레인을 진단하는 방법이 제시되고, 상기 방법은 하기를 포함한다: (a) 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 단편은 뇌에서 혈액으로 α-시누클레인의 순 유출을 변경할 만큼 충분한 친화성으로 α-시누클레인에 결합할 수 있고; (b) 건강관리 제공자가 항체를 검사 개체에 말초 투여하고, 그리고 투여 이후에 특정된 시간 간격에서 개체로부터 혈장 시료를 획득하도록 지도하고; (c) 혈장 시료에서 α-시누클레인의 수준을 검정하고; (d) 검사 개체에서 α-시누클레인의 검정된 수준을 참고 기준에 비교하고; 여기서 혈장 시료에서 α-시누클레인의 수준 및 참고 기준 사이에 차이 또는 유사성은 검사 개체의 뇌에서 α-시누클레인의 수준과 상관한다.

검사 개체의 뇌에서 상승된 수준의 α-시누클레인을 진단하는 방법이 더욱 제시되고, 상기 방법은 하기를 포함한다: (a) 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 검사 개체에 말초 투여하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 단편은 뇌에서 혈액으로 α-시누클레인의 순 유출을 변경할 만큼 충분한 친화성으로 α-시누클레인에 결합할 수 있고; (b) 투여 이후에 특정된 시간 간격에서 검사 개체로부터 혈장 시료를 획득하고, 그리고 α-시누클레인의 수준의 결정을 위해 시료를 제출하고; (c) 혈장 시료에서 α-시누클레인의 수준을 참고 기준에 비교하고; 여기서 혈장 시료에서 α-시누클레인의 수준 및 참고 기준 사이에 차이 또는 유사성은 검사 개체의 뇌에서 α-시누클레인의 수준과 상관한다.

혈장 시료에서 α-시누클레인의 수준을 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 투여에 앞서 검사 개체로부터 획득된 혈장 시료와 비교하는 것을 더욱 포함하는, 본원에서 설명된 바와 같은 방법이 더욱 제시된다.

특정 구체예에서, 전술한 방법에서 참고 기준은 1명 또는 그 이상의 대조 개체에서 α-시누클레인의 측정된 수준을 포함하고, 여기서 대조 개체에는 정상적인 건강한 개인, 그리고 다양한 심각도의 시누클레인병증을 앓는 개인이 포함된다.

시누클레인병증성 질환에 대해 치료되는 개체의 뇌에서 α-시누클레인 수준을 추적하는 방법이 더욱 제시되고, 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 말초 투여 이후에 특정된 시점에서 개체의 혈장에서 α-시누클레인의 수준을 검정하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 단편은 뇌에서 혈액으로 α-시누클레인의 순 유출을 변경할 만큼 충분한 친화성으로 α-시누클레인에 결합할 수 있고; 그리고 여기서 개체의 혈장에서 α-시누클레인 수준은 개체의 뇌에서 수준과 상관한다. 특정 구체예에서, 전술한 방법은 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 추가의 말초 투여 이후에 특정된 시점에서 개체의 혈장에서 α-시누클레인의 수준을 검정하고, 따라서 개체의 뇌에서 α-시누클레인 수준에서 변화를 시간의 흐름에서 플롯팅하는 것을 더욱 포함한다.

일부 구체예는 본원에서 설명된 바와 같은 방법을 포함하고, 여기서 상기 방법은 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 투여 이후에 특정된 시간 간격에서 검사 개체로부터 획득된 CSF 시료에서 α-시누클레인의 수준을 검정함으로써 검사 개체의 뇌에서 상승된 수준의 α-시누클레인을 진단하는 것에 관계하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 단편은 뇌에서 CSF로 α-시누클레인의 순 유출을 변경할 만큼 충분한 친화성으로 α-시누클레인에 결합할 수 있고, 그리고 여기서 CSF 시료에서 α-시누클레인의 수준 및 참고 기준 사이에 차이 또는 유사성은 검사 개체의 뇌에서 α-시누클레인의 수준과 상관한다. 일부 구체예는 본원에서 설명된 바와 같은 방법을 포함하고, 상기 방법은 CSF 시료에서 α-시누클레인의 수준을 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 투여에 앞서 검사 개체로부터 획득된 CSF 시료와 비교하는 것을 더욱 포함한다.

일부 구체예는 시누클레인병증성 질환에 대해 치료되는 개체의 뇌에서 α-시누클레인 수준을 추적하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 말초 투여 이후에 특정된 시점에서 개체의 CSF 시료에서 α-시누클레인의 수준을 검정하는 것을 포함하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 단편은 뇌에서 CSF로 α-시누클레인의 순 유출을 변경할 만큼 충분한 친화성으로 α-시누클레인에 결합할 수 있고; 그리고 여기서 개체의 CSF에서 α-시누클레인 수준은 개체의 뇌에서 수준과 상관한다.

일부 구체예는 본원에서 설명된 바와 같은 방법을 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL를 포함하는 참고 항체와 동일한 α-시누클레인 에피토프에 특이적으로 결합하고, 여기서 VH는 서열 번호: 2를 포함하고, 그리고 VL는 서열 번호: 3을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL를 포함하는 참고 항체가 α-시누클레인에 결합하는 것을 경쟁적으로 저해하고, 여기서 VH는 서열 번호: 2를 포함하고, 그리고 VL은 서열 번호: 3을 포함한다.

본원에서 설명된 바와 같은 방법이 더욱 제시되고, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고, 여기서 VH는 서열 번호: 4의 상보성 결정 영역-1 (VHCDR1) 아미노산 서열을 포함한다.

또한, 본원에서 설명된 바와 같은 방법이 제시되고, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL을 포함하고, 여기서 VH는 서열 번호: 5의 상보성 결정 영역-2 (VHCDR2) 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구체예는 본원에서 설명된 바와 같은 방법을 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL을 포함하고, 여기서 VH는 서열 번호: 6의 상보성 결정 영역-3 (VHCDR3) 아미노산 서열을 포함한다.

또한, 본원에서 설명된 바와 같은 방법이 제시되고, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL을 포함하고, 여기서 VL은 서열 번호: 7의 상보성 결정 영역-1 (VLCDR1) 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구체예는 본원에서 설명된 바와 같은 방법을 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL을 포함하고, 여기서 VL은 서열 번호: 8의 상보성 결정 영역-2 (VLCDR2) 아미노산 서열을 포함한다.

또한, 본원에서 설명된 바와 같은 방법이 제시되고, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL을 포함하고, 여기서 VL은 서열 번호: 9의 상보성 결정 영역-3 (VLCDR3) 아미노산 서열을 포함한다.

본원에서 설명된 바와 같은 방법이 더욱 제시되고, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL을 포함하고, 여기서 VH는 서열 번호: 4, 5, 6의 VHCDR1, VHCDR2, 그리고 VHCDR3 아미노산 서열을 포함한다.

또한, 본원에서 설명된 바와 같은 방법이 제시되고, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL을 포함하고, 여기서 VL은 서열 번호: 7, 8, 9의 VLCDR1, VLCDR2, 그리고 VLCDR3 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구체예는 본원에서 설명된 바와 같은 방법을 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL을 포함하고, 여기서 VH는 서열 번호: 5, 6, 7의 VHCDR1, VHCDR2, 그리고 VHCDR3 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VL은 서열 번호: 7, 8, 9의 VLCDR1, VLCDR2, 그리고 VLCDR3 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구체예는 본원에서 설명된 바와 같은 방법을 포함하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 2의 VH 아미노산 서열 및 서열 번호: 3의 VL 아미노산 서열을 포함한다.

또한, 본원에서 설명된 바와 같은 방법이 제시되고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일 사슬 Fv 단편 (scFv), F(ab') 단편, F(ab) 단편, 또는 F(ab')₂ 단편이다.

일부 구체예는 본원에서 설명된 바와 같은 방법을 포함하고, 여기서 투여는 항체의 정맥내 주사에 의한다. 한 구체예에서, 항체는 인간 항체이다.

다른 구체예는 본원에서 설명된 바와 같은 방법을 포함하고, 여기서 특정된 시간 간격은 1주보다 적고, 또는 24시간보다 적거나 24시간과 동등하고, 또는 3시간보다 적거나 3시간과 동등하다.

일정한 구체예는 본원에서 설명된 바와 같은 방법을 포함하고, 여기서 시누클레인병증성 질환은 파킨슨병 (PD), 파킨슨병 치매 (PDD), 루이소체 치매 (DLB), 알츠하이머병의 루이소체 변형체 (LBVAD), 다계통 위축증 (MSA), 순수 자율신경 실조 (PAF), 뇌 철분 축적을 가진 신경변성 1형 (NBIA-I), 알츠하이머병, 픽병, 유년-발병 전반적 축삭퇴행위축 (할러포르덴-스파츠병), 근위축성 측삭 경화증, 외상성 뇌 손상 및 다운 증후군으로 구성된 군에서 선택된다.

도면의 간단한 설명
도 1 (A-B): 12F4 항체 투여 시에, 인간 α-시누클레인을 과다발현하는 유전자도입 생쥐에서 용량 의존성 인간 α-시누클레인 혈장 스파이크.
도 2: 인간 α-시누클레인 혈장 스파이크 및 혈장 12F4 항체 농도의 시간 경과.
도 3 (A-C): 인간 α-시누클레인을 과다발현하는 유전자도입 생쥐의 단기, 고용량 12F4 항체 치료는 뇌 인간 α-시누클레인 수준을 감소시킨다.
도 4 (A-C): 12F4 항체 주사 후, 인간 α-시누클레인 혈장 수준은 뇌 α-시누클레인 수준을 유의미하게 반영한다.
도 5 (A-C): 혈장 인간 α-시누클레인 (A) 및 키메라 12F4 항체 수준 (B)은 ELISA에 의해 측정되었다. (C) 키메라 12F4 항체로 6개월 동안 장기 치료 후, 인간 α-시누클레인을 과다발현하는 유전자도입 생쥐의 혈장과 뇌 α-시누클레인 수준 사이에 유의미한 상관이 있었다.
도 6: 12F4 투여 시에, 시노몰구스 원숭이에서 α-시누클레인 뇌척수액 (CSF) 스파이크 및 대략 0.1%에서 CSF/혈청 124F 비율.
도 7: 12F4 투여 시에, 유전자도입 α-시누클레인 생쥐에서 생체내 미소투석은 뇌 간질액 (ISF) α-시누클레인의 하락을 보여준다.

상세한 설명

I. 정의

용어 "단수 부정관사 (a 또는 an)" 실체는 상기 실체의 하나 또는 그 이상을 지칭하는 것으로 주목된다; 가령, "항-α-시누클레인 항체"는 α-시누클레인에 특이적으로 결합하는 하나 또는 그 이상의 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 따라서 용어 "단수 부정 관사 (a 또는 an)", "하나 또는 그 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 교체가능하게 이용될 수 있다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "시누클레인병증성 질환" 또는 "시누클레인병증"은 뉴런과 신경교의 선별적으로 취약한 집단에서 불용성 α-시누클레인 단백질의 집합체로 구성되는 공통의 병리학적 병소를 공유하는 다양한 군의 신경변성 질환이다. 이들 질환에는 파킨슨병 (PD), 파킨슨병 치매 (PDD), 루이소체 치매 (DLB), 알츠하이머병의 루이소체 변형체 (LBVAD), 다계통 위축증 (MSA), 순수 자율신경 실조 (PAF), 뇌 철분 축적을 가진 신경변성 1형 (NBIA-I), 알츠하이머병, 픽병, 유년-발병 전반적 축삭퇴행위축 (할러포르덴-스파츠병), 근위축성 측삭 경화증, 외상성 뇌 손상 및 다운 증후군이 포함된다. 임상적으로, 이들은 병소의 분포에 따라, 운동, 인지, 행동, 그리고 자율 기능에서 만성적이고 진행하는 감퇴에 의해 특징된다.

달리 명시되지 않으면, 용어 "질환", "질병" 및 "병"은 본원에서 교체가능하게 이용된다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "결합 분자" 또는 "항원 결합 분자"는 가장 넓은 의미에서, 항원 결정기에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 항원 결합 분자의 무제한적 실례는 항원-특이적 결합을 유지하는 항체 및 이들의 단편뿐만 아니라 호르몬, 수용체, 리간드, 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자, 샤프론, 예를 들면, 열 쇼크 단백질 (HSP), 그리고 세포-세포 유착 분자, 예를 들면, 카데린, 인테그린, C-형 레시틴 및 면역글로불린 (Ig) 대과의 구성원이 포함되지만 이들에 국한되지 않는, α-시누클레인에 결합하는 다른 비-항체 분자이다. 따라서 단지 명료함을 위해, 그리고 본 발명의 범위를 제한하지 않으면서, 하기 구체예 중에서 대부분은 치료적 및 진단적 작용제의 개발을 결합 분자를 대표하는 항체 및 항체-유사 분자에 대하여 논의된다. 다른 구체예에서, 개시된 결합 분자는 항체 분자의 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함한다. 다른 구체예에서, 개시된 결합 분자는 하나 또는 그 이상의 항체 분자로부터 적어도 2개의 CDR을 포함한다. 다른 구체예에서, 개시된 결합 분자는 하나 또는 그 이상의 항체 분자로부터 적어도 3개의 CDR을 포함한다. 다른 구체예에서, 개시된 결합 분자는 하나 또는 그 이상의 항체 분자로부터 적어도 4개의 CDR을 포함한다. 다른 구체예에서, 개시된 결합 분자는 하나 또는 그 이상의 항체 분자로부터 적어도 5개의 CDR을 포함한다. 다른 구체예에서, 개시된 결합 분자는 하나 또는 그 이상의 항체 분자로부터 적어도 6개의 CDR을 포함한다.

검사 개체의 뇌에서 상승된 수준의 α-시누클레인을 진단하는 방법이 본원에서 개시되고, 상기 방법은 개체에 항-α-시누클레인 결합 분자, 예를 들면, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 투여하는 것을 포함한다. 전장 항체, 예를 들면, 자연 발생 항체를 구체적으로 지칭하지 않으면, 용어 "항-α-시누클레인 항체"는 전장 항체뿐만 아니라 이런 항체의 항원-결합 단편, 변이체, 유사체, 또는 유도체, 예를 들면, 자연 발생 항체 또는 면역글로불린 분자 또는 항체 분자와 유사한 방식으로 항원에 결합하는 조작된 항체 분자 또는 단편을 포괄한다.

용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본원에서 교체가능하게 이용된다. 항체 또는 면역글로불린은 중쇄의 가변 도메인을 적어도 포함하고, 그리고 통상적으로, 중쇄와 경쇄의 가변 도메인을 적어도 포함한다. 척추동물 계에서 기본 면역글로불린 구조는 상대적으로 충분히 이해된다. 예로서, Harlow et al. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press)을 참조한다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "면역글로불린"은 생화학적으로 식별될 수 있는 다양한 넓은 부류의 폴리펩티드를 포함한다. 당업자는 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론 (γ, μ, α, δ, ε)으로서 분류되고, 이들 사이에 일부 하위부류 (가령, γ1-γ4)가 있다는 것을 인식할 것이다. 항체의 "부류"를 각각, IgG, IgM, IgA, IgG, 또는 IgE로서 결정하는 것은 이러한 사슬의 성격이다. 면역글로불린 하위부류 (아이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 등은 충분히 특징화되고 기능적 전문화 (functional specialization)를 공여하는 것으로 알려져 있다. 이들 부류와 아이소타입 각각의 변형된 이형은 본 발명에 비추어 당업자에게 쉽게 식별가능하고, 따라서 본 발명의 범위 내에 있다. 모든 면역글로불린 부류는 명백하게, 본 발명의 범위 내에 있다. 하기 논의는 전반적으로, 면역글로불린 분자의 IgG 부류에 관계될 것이다. IgG의 경우에, 기준 면역글로불린 분자는 대략 23,000 달톤 분자량의 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드, 그리고 53,000-70,000 분자량의 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 이들 4개 사슬은 전형적으로, "Y" 입체배열에서 이황화 결합에 의해 연결되고, 여기서 경쇄는 "Y"의 입구에서 시작하여 중쇄를 일괄하고 가변 영역 전체에서 연속한다.

경쇄는 카파 또는 람다 (κ, λ)로서 분류된다. 각 중쇄 부류는 카파 또는 람다 경쇄와 결합될 수 있다. 일반적으로, 경쇄와 중쇄는 서로에 공유 결합되고, 그리고 두 중쇄의 "꼬리" 부분은 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포 또는 유전자 조작된 숙주 세포에 의해 산출될 때 공유 이황화 연쇄 또는 비-공유 연쇄에 의해 서로에 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 입체배열의 갈래진 단부에서 N-말단에서부터 각 사슬의 하부에서 C-말단까지 이어진다.

경쇄와 중쇄 둘 모두 구조적 및 기능적 상동성의 영역으로 분할된다. 용어 "불변" 및 "가변"은 기능적으로 이용된다. 이와 관련하여, 경쇄 (VL 또는 VK)와 중쇄 (VH) 부분 둘 모두의 가변 도메인이 항원 인식과 특이성을 결정하는 것으로 인식될 것이다. 역으로, 경쇄 (CL)와 중쇄 (CH1, CH2 또는 CH3)의 불변 도메인은 중요한 생물학적 성질, 예를 들면, 분비, 경태반 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등을 공여한다. 관례에 의해, 불변 영역 도메인의 넘버링은 항체의 항원 결합 부위 또는 아미노-말단으로부터 더욱 멀어질수록 증가한다. N-말단 부분은 가변 영역이고, 그리고 C-말단 부분은 불변 영역이다; CH3과 CL 도메인은 각각, 중쇄와 경쇄의 카르복시-말단을 실제로 포함한다.

전술한 바와 같이, 가변 영역은 항체가 항원 상에서 에피토프를 선별적으로 인식하고 특이적으로 결합할 수 있도록 한다. 다시 말하면, 항체의 VL 도메인과 VH 도메인, 또는 이들 가변 도메인 내에서 상보성 결정 영역 (CDRs)의 부분집합은 합동하여 3차원 항원 결합 부위를 규정하는 가변 영역을 형성한다. 이러한 4차 항체 구조는 Y의 각 팔의 단부에 존재하는 항원 결합 부위를 형성한다. 더욱 구체적으로, 항원 결합 부위는 VH와 VL 사슬 각각에서 3개의 CDR에 의해 규정된다. 일부 경우에, 예를 들면, 카멜리드 종으로부터 유래되거나 또는 카멜리드 면역글로불린에 기초하여 조작된 일정한 면역글로불린 분자의 경우에, 완전한 면역글로불린 분자는 경쇄 없이 중쇄로만 구성될 수 있다. 예로서, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)을 참조한다.

자연 발생 항체에서, 각 항원 결합 도메인 내에 존재하는 6개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDRs"은 항체가 수성 환경에서 3차원 입체배열을 취할 때, 항원 결합 도메인을 형성하기 위해 특정적으로 위치되는 아미노산의 짧은, 비-접경 서열이다. "뼈대" 영역으로 지칭되는, 항원 결합 도메인 내에 나머지 아미노산은 더욱 적은 분자간 가변성을 보인다. 이들 뼈대 영역은 거의 β-시트 입체형태를 취하고, 그리고 이들 CDR은 β-시트 구조를 연결하고, 그리고 일부 경우에 이의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 따라서 뼈대 영역은 CDR을 사슬간, 비-공유 상호작용에 의해 정확한 방향에서 위치시키는 것을 제공하는 비계를 형성하는 역할을 한다. 위치된 CDR에 의해 형성된 항원 결합 도메인은 면역반응성 항원 상에서 에피토프에 상보적인 표면을 규정한다. 이러한 상보적인 표면은 동계 에피토프에 대한 항체의 비-공유 결합을 촉진한다. CDR과 뼈대 영역을 각각, 포함하는 아미노산은 당업자에 의해 임의의 소정의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인에 대해 쉽게 확인될 수 있는데, 그 이유는 이들이 정확하게 규정되었기 때문이다 (하기 참조).

당분야에서 이용되고 및/또는 인정되는 용어의 2가지 또는 그 이상의 정의가 있는 경우에, 본원에서 이용된 바와 같은 용어의 정의는 반대로 명시되지 않으면, 이와 같은 모든 의미를 포함하는 것으로 의도된다. 특정한 실례는 중쇄와 경쇄 폴리펩티드 둘 모두의 가변 영역 내에서 발견되는 비-접경 항원 결합 부위를 설명하기 위한 용어 "상보성 결정 영역" ("CDR")의 이용이다. 이러한 특정 영역은 Kabat et al. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" 및 Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)에 의해 설명되었고, 이들은 본원에서 참조로서 편입되는데, 여기서 이들 정의는 서로에 대하여 비교될 때, 아미노산 잔기의 중복 또는 부분집합을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이의 변이체의 CDR을 지칭하기 위한 어느 한쪽 정의의 적용은 본원에서 규정되고 이용된 바와 같은 용어의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 상기 언급된 참고문헌 각각에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 포괄하는 적절한 아미노산 잔기는 비교로서 하기 표 1에서 열거된다. 특정 CDR을 포괄하는 정확한 잔기 번호는 CDR의 서열과 크기에 따라 변할 것이다. 당업자는 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 고려하여, 어떤 잔기가 특정 CDR을 포함하는 지를 일과적으로 결정할 수 있다.

CDR 정의¹

	Kabat	Chothia
VH CDR1	31-35	26-32
VH CDR2	50-65	52-58
VH CDR3	95-102	95-102
VL CDR1	24-34	26-32
VL CDR2	50-56	50-52
VL CDR3	89-97	91-96

¹표 1에서 모든 CDR 정의의 넘버링은 Kabat et al. (하기 참조)에 의해 진술된 넘버링 관례에 따른다.

Kabat et al.은 또한, 임의의 항체에 적용가능한 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 시스템을 규정하였다. 당업자는 서열 자체를 넘어서는 임의의 실험 데이터에 대한 의존 없이, "Kabat 넘버링"의 이러한 시스템을 임의의 가변 도메인 서열에 명백하게 지정할 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, "Kabat 넘버링"은 Kabat et al. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest."에 의해 진술된 넘버링 시스템을 지칭한다. 달리 특정되지 않으면, 본 발명의 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체에서 특정 아미노산 잔기 위치의 넘버링에 대한 참조는 Kabat 넘버링 시스템에 따른다.

본 발명의 항체 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체에는 다중클론, 단일클론, 다중특이적, 인간, 인간화, 영장류화, 또는 키메라 항체, 단일-사슬 항체, 에피토프-결합 단편, 예를 들면, Fab, Fab'와 F(ab')₂, Fd, Fvs, 단일-사슬 Fvs (scFv), 이황화-연쇄된 Fvs (sdFv), VL 또는 VH 도메인 중에서 어느 한쪽을 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, 그리고 항-이디오타입 (항-Id) 항체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. ScFv 분자는 당분야에 알려져 있고, 그리고 예로서, U.S. Pat. No. 5,892,019에서 설명된다. 본 발명의 면역글로불린 또는 항체 분자는 임의의 유형 (가령, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 그리고 IgY), 부류 (가령, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 그리고 IgA2 등), 또는 하위부류의 면역글로불린 분자일 수 있다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "중쇄 부분"은 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, 중쇄 부분을 포함하는 폴리펩티드는 VH 도메인, CH1 도메인, 힌지 (가령, 위쪽, 중간, 및/또는 아래쪽 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이의 변이체 또는 단편 중에서 적어도 하나를 포함한다. 가령, 본 발명에서 이용을 위한 결합 폴리펩티드는 CH1 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부분, 그리고 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부분, 그리고 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬, 또는 CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부분, CH2 도메인, 그리고 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 게다가, 본 발명에서 이용을 위한 결합 폴리펩티드는 CH2 도메인의 적어도 일부분 (가령, CH2 도메인의 전부 또는 일부)을 결여할 수 있다. 전술한 바와 같이, 이들 도메인 (가령, 중쇄 부분)은 그들이 자연 발생 면역글로불린 분자로부터 아미노산 서열에서 변화하도록 변형될 수 있는 것으로 당업자에게 이해될 것이다.

일정한 구체예에서, 본원에서 제시된 항-α-시누클레인 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체에서 다합체의 한 폴리펩티드 사슬의 중쇄 부분은 다합체의 두 번째 폴리펩티드 사슬 상에서 중쇄 부분과 동일하다. 대안으로, 본 발명의 중쇄 부분-내포 단위체는 동일하지 않다. 가령, 각 단위체는 상이한 표적 결합 부위를 포함하고, 예로서 이중특이적 항체를 형성할 수 있다.

본원에서 제시된 방법에서 이용을 위한 결합 분자의 중쇄 부분은 상이한 면역글로불린 분자로부터 유래될 수 있다. 가령, 폴리펩티드의 중쇄 부분은 IgG1 분자로부터 유래된 C_H1 도메인 및 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 실례에서, 중쇄 부분은 IgG1 분자로부터 부분적으로 및 IgG3 분자로부터 부분적으로 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 실례에서, 중쇄 부분은 IgG1 분자로부터 부분적으로 및 IgG4 분자로부터 부분적으로 유래된 키메라 힌지를 포함할 수 있다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "경쇄 부분"은 면역글로불린 경쇄, 예를 들면, 카파 또는 람다 경쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 경쇄 부분은 VL 또는 CL 도메인 중에서 적어도 하나를 포함한다.

전술한 바와 같이, 다양한 면역글로불린 부류의 불변 영역의 아단위 구조와 3차원 입체배열은 널리 알려져 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "VH 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 도메인을 포함하고, 그리고 용어 "CH1 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 첫 번째 (가장 아미노 말단) 불변 영역 도메인을 포함한다. CH1 도메인은 VH 도메인에 인접하고, 그리고 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 아미노 말단이다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "CH2 도메인"은 관례적인 넘버링 설계를 이용하여, 예로서 항체의 대략 잔기 244에서부터 잔기 360까지 뻗어 있는 중쇄 분자의 부분 (잔기 244 내지 360, Kabat 넘버링 시스템; 그리고 잔기 231-340, EU 넘버링 시스템)을 포함한다; Kabat EA et al. op. cit를 참조한다. CH2 도메인은 다른 도메인과 접근하여 쌍을 이루지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려, 2개의 N-연쇄된 가지형 탄수화물 사슬이 본래 고유 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 개재된다. 또한, CH3 도메인은 IgG 분자의 CH2 도메인에서부터 C-말단까지 뻗어 있는 대략 108개 잔기를 포함하는 것으로 충분히 증명되었다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "힌지 영역"은 CH1 도메인을 CH2 도메인에 연결하는 중쇄 분자의 부분을 포함한다. 이러한 힌지 영역은 대략 25개 잔기를 포함하고 유연하고, 따라서 2개의 N-말단 항원 결합 영역이 독립적으로 이동할 수 있도록 한다. 힌지 영역은 3개의 상이한 도메인으로 세분될 수 있다: 위쪽, 중간, 그리고 아래쪽 힌지 도메인 (Roux et al., J. Immunol. 161:4083 (1998)).

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "이황화 결합"은 2개의 황 원자 사이에 형성된 공유 결합을 포함한다. 아미노산 시스테인은 두 번째 티올 기와 이황화 결합 또는 가교를 형성할 수 있는 티올 기를 포함한다. 대부분의 자연 발생 IgG 분자에서, CH1과 CL 영역은 이황화 결합에 의해 연쇄되고, 그리고 2개의 중쇄는 Kabat 넘버링 시스템을 이용하여 239와 242에 해당하는 위치 (위치 226 또는 229, EU 넘버링 시스템)에서 2개의 이황화 결합에 의해 연쇄된다.

본원에서 제시된 항-α-시누클레인 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 그들이 인식하거나 또는 특이적으로 결합하는 항원, 예를 들면, 본원에서 제시된 표적 폴리펩티드 (가령, α-시누클레인)의 에피토프(들) 또는 부분(들)의 측면에서 설명되거나 특정될 수 있다. 항체의 항원 결합 도메인과 특이적으로 상호작용하는 표적 폴리펩티드의 부분은 "에피토프" 또는 "항원 결정기"이다. 표적 폴리펩티드는 단일 에피토프를 포함할 수 있지만, 전형적으로 적어도 2개의 에피토프를 포함하고, 그리고 항원의 크기, 입체형태, 그리고 유형에 따라 임의의 숫자의 에피토프를 포함할 수 있다. 게다가, 표적 폴리펩티드 상에서 "에피토프"는 비-폴리펩티드 요소이거나 또는 이들 요소를 포함할 수 있다, 가령, 에피토프는 탄수화물 측쇄를 포함할 수 있다.

항체에 대한 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프의 최소 크기는 약 4개 내지 5개 아미노산인 것으로 생각된다. 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프는 바람직하게는, 적어도 7개, 더욱 바람직하게는 적어도 9개, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 약 15 내지 약 30개 아미노산을 내포한다. CDR이 3차 형태에서 항원성 펩티드 또는 폴리펩티드를 인식할 수 있기 때문에, 에피토프를 포함하는 아미노산은 접경할 필요가 없고, 그리고 일부 경우에, 심지어 동일한 펩티드 사슬 상에 있지 않을 수도 있다. 항-α-시누클레인에 의해 인식되는 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프. 본 발명의 항체는 α-시누클레인의 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 더욱 바람직하게는 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 또는 약 15 내지 약 30개의 접경 또는 비-접경 아미노산의 서열을 내포할 수 있다.

"특이적으로 결합한다"는 일반적으로, 항체가 항원 결합 도메인을 거쳐 에피토프에 결합하고, 그리고 상기 결합이 항원 결합 도메인 및 에피토프 사이에 상당한 상보성을 필요로 한다는 것을 의미한다. 이러한 정의에 따라서, 항체는 임의의 무관한 에피토프보다 상기 에피토프에 더욱 쉽게, 항원 결합 도메인을 거쳐 결합할 때, 에피토프에 "특이적으로 결합한다"라고 일컬어진다. 용어 "특이성"은 일정한 항체가 일정한 에피토프에 결합하는 상대적 친화성에 자격을 부여하기 위해 본원에서 이용된다. 가령, 항체 "A"는 항체 "B"보다 소정의 에피토프에 대해 더욱 높은 특이성을 갖는 것으로 간주될 수 있고, 또는 항체 "A"는 관련된 에피토프 "D"보다 에피토프 "C"에 대해 더욱 높은 특이성으로 결합하는 것으로 일컬어질 수 있다.

"우선적으로 결합한다"는 항체가 관련된, 유사한, 상동한, 또는 상사한 에피토프보다 에피토프에 더욱 쉽게 특이적으로 결합한다는 것을 의미한다. 따라서 소정의 에피토프에 "우선적으로 결합하는" 항체는 비록 이런 항체가 관련된 에피토프와 교차 반응할 수 있긴 하지만, 관련된 에피토프보다 상기 에피토프에 결합할 가능성이 더욱 높다.

무제한적 실례로서, 항체는 두 번째 에피토프에 대한 항체의 해리 상수 (K_D)보다 작은 K_D로 첫 번째 에피토프에 결합하면, 첫 번째 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 다른 무제한적 실례에서, 항체는 두 번째 에피토프에 대한 항체의 K_D보다 적어도 1 크기 자릿수 작은 친화성으로 첫 번째 에피토프에 결합하면, 첫 번째 항원에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 다른 무제한적 실례에서, 항체는 두 번째 에피토프에 대한 항체의 K_D보다 적어도 2 크기 자릿수 작은 친화성으로 첫 번째 에피토프에 결합하면, 첫 번째 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다.

다른 무제한적 실례에서, 항체는 두 번째 에피토프에 대한 항체의 k(오프)보다 작은 오프 속도 (k(오프))로 첫 번째 에피토프에 결합하면, 첫 번째 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 다른 무제한적 실례에서, 항체는 두 번째 에피토프에 대한 항체의 k(오프)보다 적어도 1 크기 자릿수 작은 친화성으로 첫 번째 에피토프에 결합하면, 첫 번째 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 다른 무제한적 실례에서, 항체는 두 번째 에피토프에 대한 항체의 k(오프)보다 적어도 2 크기 자릿수 작은 친화성으로 첫 번째 에피토프에 결합하면, 첫 번째 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다.

본원에서 제시된 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 5 X 10^-2 sec^-1, 10^-2 sec^-1, 5 X 10^-3 sec^-1 또는 10^-3 sec^-1보다 작거나 또는 이와 동등한 오프 속도 (k(오프))로 본원에서 제시된 표적 폴리펩티드 (가령, 인간 α-시누클레인) 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합하는 것으로 일컬어질 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 항체는 5 X 10^-4 sec^-1, 10^-4 sec^-1, 5 X 10^-5 sec^-1, 또는 10^-5 sec^-1, 5 X 10^-6 sec^-1, 10^-6 sec^-1, 5 X 10^-7 sec^-1 또는 10^-7 sec^-1보다 작거나 또는 이와 동등한 오프 속도 (k(오프))로 본원에서 제시된 표적 폴리펩티드 (가령, 인간 α-시누클레인) 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합하는 것으로 일컬어질 수 있다.

본원에서 제시된 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 10³ M^-1 sec^-1, 5 X 10³ M^-1 sec^-1, 10⁴ M^-1 sec^-1 또는 5 X 10⁴ M^-1 sec^-1보다 크거나 또는 이와 동등한 온 속도 (k(온))로 본원에서 제시된 표적 폴리펩티드 (가령, 인간 α-시누클레인) 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합하는 것으로 일컬어질 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 항체는 10⁵ M^-1 sec^-1, 5 X 10⁵ M^-1 sec^-1, 10⁶ M^-1 sec^-1, 또는 5 X 10⁶ M^-1 sec^-1 또는 10⁷ M^-1 sec^-1보다 크거나 또는 이와 동등한 온 속도 (k(온))로 본원에서 제시된 표적 폴리펩티드 (가령, 인간 α-시누클레인) 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합하는 것으로 일컬어질 수 있다.

항체는 에피토프에 대한 참고 항체의 결합을 상당히 차단할 정도까지 상기 에피토프에 우선적으로 결합하면, 소정의 에피토프에 대한 참고 항체의 결합을 경쟁적으로 저해하는 것으로 일컬어진다. 경쟁적 저해는 당분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 경쟁 ELISA 검정에 의해 측정될 수 있다. 항체는 소정의 에피토프에 대한 참고 항체의 결합을 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50% 경쟁적으로 저해하는 것으로 일컬어질 수 있다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "친화성 (affinity)"은 개별 에피토프와 면역글로불린 분자의 CDR의 결합 강도의 적도를 지칭한다. 예로서, Harlow et al. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.) 페이지 27-28을 참조한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "충분한 친화성"은 뇌에서 혈액으로, 또는 뇌에서 CSF로 알파 시누클레인의 순 유출을 변경할 만큼, α-시누클레인 또는 이의 에피토프에 대한 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 충분한 결합 강도를 지칭한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "순 유출 (net efflux)"은 뇌에서 혈액으로, 또는 뇌에서 CSF로 α-시누클레인의 전체 흐름을 지칭한다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "결합능 (avidity)"은 면역글로불린 집단과 항원 사이에 복합체의 전반적인 안정성을 지칭한다, 다시 말하면, 면역글로불린 혼합물과 항원의 기능적 통합 강도를 지칭한다. 예로서, Harlow의 페이지 29-34를 참조한다. 결합능은 집단 내에 개별 면역글로불린 분자와 특이적 에피토프의 친화성, 그리고 면역글로불린과 항원의 결합가 (valency) 둘 모두와 관련된다. 가령, 이가 단일클론 항체 및 고도 반복성 에피토프 구조를 갖는 항원, 예를 들면, 중합체 사이에 상호작용은 높은 결합능 중에서 한 가지일 것이다.

본원에서 제시된 바와 같은 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 또한, 교차-반응성의 측면에서 설명되거나 특정될 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "교차-반응성"은 한 항원에 특이적인 항체가 두 번째 항원과 반응하는 능력; 2개의 상이한 항원성 물질 사이에 관련성의 적도를 지칭한다. 따라서 항체는 그의 형성을 유도한 에피토프와 상이한 에피토프에 결합하면, 교차 반응성이다. 교차 반응성 에피토프는 일반적으로, 유도 에피토프와 동일한 상보적인 구조적 특질을 다수 내포하고, 그리고 일부 경우에, 원물보다 실제로 더욱 적합할 수 있다.

가령, 일정한 항체는 관련되지만 동일하지 않은 에피토프, 예를 들면, 참고 에피토프에 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55%, 그리고 적어도 50% 동일성 (당분야에서 공지되고 본원에서 설명된 방법을 이용하여 계산됨)을 갖는 에피토프에 결합한다는 점에서, 상당한 교차-반응성을 갖는다. 항체는 참고 에피토프에 95%보다 작은, 90%보다 작은, 85%보다 작은, 80%보다 작은, 75%보다 작은, 70%보다 작은, 65%보다 작은, 60%보다 작은, 55%보다 작은, 그리고 50%보다 작은 동일성 (당분야에서 공지되고 본원에서 설명된 방법을 이용하여 계산됨)을 갖는 에피토프에 결합하지 않으면, 교차-반응성을 거의 또는 전혀 갖지 않는 것으로 일컬어질 수 있다. 항체는 일정한 에피토프의 임의의 다른 유사체, 오르토로그 (ortholog), 또는 동족체에 결합하지 않으면, 상기 에피토프에 "고도로 특이적"인 것으로 간주될 수 있다.

항-α-시누클레인 결합 분자, 예를 들면, 본원에서 설명된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 또한, 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들면, 인간 α-시누클레인에 대한 결합 친화성의 측면에서 설명되거나 특정될 수 있다. 바람직한 결합 친화성에는 5 x 10^-2 M, 10^-2 M, 5 x 10^-3 M, 10^-3 M, 5 x 10^-4 M, 10^-4 M, 5 x 10^-5 M, 10^-5 M, 5 x 10^-6 M, 10^-6 M, 5 x 10^-7 M, 10^-7 M, 5 x 10^-8 M, 10^-8 M, 5 x 10^-9 M, 10^-9 M, 5 x 10^-10 M, 10^-10 M, 5 x 10^-11 M, 10^-11 M, 5 x 10^-12 M, 10^-12 M, 5 x 10^-13 M, 10^-13 M, 5 x 10^-14 M, 10^-14 M, 5 x 10^-15 M, 또는 10^-15 M보다 작은 해리 상수 또는 Kd를 갖는 친화성이 포함된다.

단일-사슬 항체를 비롯한 항체 단편은 단독으로 또는 하기의 전체 또는 부분: 힌지 영역, CH1, CH2, 그리고 CH3 도메인과 공동으로 가변 영역(들)을 포함할 수 있다. 또한, 가변 영역(들)의 힌지 영역, CH1, CH2, 그리고 CH3 도메인과의 임의의 조합을 포함하는 항원-결합 단편 역시 포함된다. 결합 분자, 예를 들면, 본원에서 제시된 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편은 조류와 포유류를 비롯한 임의의 동물 기원으로부터 유래될 수 있다. 항체는 인간, 뮤린, 당나귀, 토끼, 염소, 기니 피그, 낙타, 야마, 말, 또는 닭 항체일 수 있다. 다른 구체예에서, 가변 영역은 기원에서 콘드릭토이드 (condricthoid)일 수 있다 (가령, 상어로부터).

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "키메라 항체"는 면역반응성 영역 또는 부위가 첫 번째 종으로부터 획득되거나 유래되고, 그리고 불변 영역 (이것은 본 발명에 따라서 본래대로이거나, 부분적이거나 또는 변형될 수 있다)이 두 번째 종으로부터 획득되는 임의의 항체를 의미할 것이다. 가령, 표적 결합 영역 또는 부위는 비-인간 공급원 (가령, 생쥐 또는 영장류)으로부터 유래될 수 있고, 그리고 불변 영역은 인간일 수 있다. 대안으로, 완전 인간 결합 영역이 비-인간 (가령, 생쥐) 불변 영역과 합동될 수 있다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "뮤린화 항체" 또는 "뮤린화 면역글로불린"은 본 발명의 인간 항체로부터 하나 또는 그 이상의 CDR; 그리고 생쥐 항체 서열에 기초된 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입을 내포하는 인간 뼈대 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. CDR을 제공하는 인간 면역글로불린은 "부모" 또는 "수용자"로 불리고, 그리고 뼈대 변화를 제공하는 생쥐 항체는 "공여자"로 불린다. 불변 영역은 존재할 필요가 없지만, 만약 존재하면, 통상적으로 생쥐 항체 불변 영역에 실질적으로, 다시 말하면, 적어도 약 85-90%, 바람직하게는 약 95% 또는 그 이상 동일하다. 따라서 일부 구체예에서, 전장 뮤린화 인간 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린은 생쥐 불변 영역, 인간 CDR, 그리고 다수의 "뮤린화" 아미노산 치환을 갖는 실질적으로 인간 뼈대를 내포한다. 전형적으로, "뮤린화 항체"는 뮤린화 가변 경쇄 및/또는 뮤린화 가변 중쇄를 포함하는 항체이다. 가령, 뮤린화 항체는 전형적인 키메라 항체를 포괄하지 않는데, 예로서 그 이유는 키메라 항체의 전체 가변 영역이 비-생쥐이기 때문이다. "뮤린화 (murinization)"의 과정에 의해 "뮤린화"된 변형된 항체는 CDR을 제공하는 부모 항체와 동일한 항원에 결합하고, 그리고 통상적으로 부모 항체와 비교하여 생쥐에서 면역원성이 덜하다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "조작된 항체"는 중쇄 또는 경쇄 또는 둘 모두에서 가변 도메인이 공지된 특이성의 항체로부터 하나 또는 그 이상의 CDR의 적어도 부분적인 대체에 의해, 그리고 필요하면, 부분적인 뼈대 영역 대체 및 서열 변화에 의해 변형되는 항체를 지칭한다. 비록 CDR이 뼈대 영역이 유래되는 항체와 동일한 부류 또는 심지어 하위부류의 항체로부터 유래될 수 있긴 하지만, 이들 CDR은 상이한 부류의 항체, 바람직하게는 상이한 종의 항체로부터 유래될 것으로 예견된다. 공지된 특이성의 비-인간 항체로부터 하나 또는 그 이상의 "공여자" CDR이 인간 중쇄 또는 경쇄 뼈대 영역 내로 이식되는 조작된 항체는 본원에서 "인간화 항체"로 지칭된다. 한 가변 도메인의 항원 결합 능력을 다른 가변 도메인으로 이전하기 위해 모든 CDR을 공여자 가변 도메인으로부터 완전한 CDR로 대체하는 것이 불필요할 수 있다. 오히려, 단지 표적 결합 부위의 활성을 유지하는데 필요한 잔기만을 이전하는 것이 필요할 수 있다.

본원에서 이용된 바와 같이, "인간" 또는 "완전 인간" 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하고, 그리고 하기 및 예로서, U.S. Pat. No. 5,939,598 (Kucherlapati et al)에서 설명된 바와 같이, 인간 면역글로불린 라이브러리로부터, 또는 내인성 면역글로불린을 발현하지 않는 하나 또는 그 이상의 인간 면역글로불린에 대해 유전자도입 동물로부터 단리된 항체를 포함한다. "인간" 또는 "완전 인간" 항체는 또한, 적어도 중쇄의 가변 도메인, 또는 적어도 중쇄와 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체를 포함하고, 여기서 가변 도메인(들)은 인간 면역글로불린 가변 도메인(들)의 아미노산 서열을 갖는다.

"인간" 또는 "완전 인간" 항체는 또한, 본원에서 설명된 항체 분자 (가령, VH 영역 및/또는 VL 영역)의 변이체 (유도체 포함)를 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 이들로 구성되는, 본원에서 설명된 바와 같은 "인간" 또는 "완전 인간" 항체를 포함하고, 상기 항체 또는 이들의 단편은 α-시누클레인 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 변이체에 면역특이적으로 결합한다. 아미노산 치환을 유발하는 특정 부위 돌연변이유발과 PCR-매개된 돌연변이유발이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 당업자에게 공지된 기준 기술이 인간 항-α-시누클레인 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에 돌연변이를 도입하는데 이용될 수 있다. 바람직하게는, 변이체 (유도체 포함)는 참고 VH 영역, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VL 영역, VLCDR1, VLCDR2, 또는 VLCDR3에 비하여 50개보다 적은 아미노산 치환, 40개보다 적은 아미노산 치환, 30개보다 적은 아미노산 치환, 25개보다 적은 아미노산 치환, 20개보다 적은 아미노산 치환, 15개보다 적은 아미노산 치환, 10개보다 적은 아미노산 치환, 5개보다 적은 아미노산 치환, 4개보다 적은 아미노산 치환, 3개보다 적은 아미노산 치환, 또는 2개보다 적은 아미노산 치환을 인코딩한다.

한 양상에서, 본 발명의 항체는 인간으로부터 단리된 인간 단일클론 항체이다. 선택적으로, 인간 항체의 뼈대 영역은 데이터베이스 내에 적절한 인간 생식 계열 가변 영역 서열에 따라서 정렬되고 채택된다; 예로서, MRC Centre for Protein Engineering (Cambridge, UK)에 의해 제공되는 Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)를 참조한다. 가령, 진성 생식 계열 서열로부터 잠재적으로 일탈하는 것으로 간주되는 아미노산은 클로닝 과정 동안 함입된 PCR 프라이머 서열에 기인할 수 있다. 인공적으로 산출된 인간-유사 항체, 예를 들면, 파지 전시된 항체 라이브러리 또는 이종 생쥐로부터 단일 사슬 항체 단편 (scFvs)과 비교하여, 본 발명의 인간 단일클론 항체는 (i) 동물 대리의 면역 반응보다는 인간 면역 반응을 이용하여 획득되고, 다시 말하면, 항체가 인체 내에 유관한 입체형태에서 자연 α-시누클레인에 응하여 산출되고, (ii) 개체를 보호하거나 또는 α-시누클레인의 존재에 대해 적어도 유의미하고, 그리고 (iii) 항체가 인간 기원이기 때문에, 자기-항원에 대한 교차-반응성의 위험이 최소화되는 것으로 특징된다. 따라서 본 발명에 따라서, 용어 "인간 단일클론 항체", "인간 단일클론 자기항체", "인간 항체" 등은 인간 기원인, 다시 말하면, 인간 세포, 예를 들면, B 세포 또는 이의 하이브리도마로부터 단리된 α-시누클레인 결합 분자, 또는 인간 세포, 예를 들면, 인간 기억 B 세포의 mRNA로부터 직접적으로 클로닝된 이의 cDNA를 표시하는데 이용된다. 인간 항체는 예로서, 결합 특징을 향상시키기 위해 항체 내에 아미노산 치환이 만들어지는 경우에도, 여전히 "인간"이다.

하기 및 예로서, U.S. Pat. No. 5,939,598 (Kucherlapati et al)에서 설명된 바와 같이, 인간 면역글로불린 라이브러리로부터, 또는 내인성 면역글로불린을 발현하지 않는 하나 또는 그 이상의 인간 면역글로불린에 대해 유전자도입 동물로부터 유래된 항체는 본 발명의 진성 인간 항체로부터 이들을 구별하기 위해 인간-유사 항체로 표시된다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "시료"는 개체 또는 환자로부터 획득된 임의의 생물학적 재료를 지칭한다. 한 양상에서, 시료는 혈액, 뇌척수액 ("CSF"), 또는 소변을 포함할 수 있다. 다른 양상에서, 시료는 전혈, 혈장, 혈액 시료로부터 농축된 B 세포, 그리고 배양된 세포 (가령, 개체로부터 B 세포)를 포함할 수 있다. 시료는 또한, 신경 조직을 비롯한 생검 또는 조직 시료를 포함할 수 있다. 또 다른 양상에서, 시료는 전체 세포 및/또는 세포의 용해물을 포함할 수 있다. 혈액 시료는 당분야에 공지된 방법에 의해 수집될 수 있다. 한 양상에서, 펠릿은 200 μl 완충액 (20 mM Tris, pH. 7.5, 0.5% Nonidet, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0.1M NaCl, IX Sigma 프로테아제 저해제, 그리고 IX Sigma 포스파타아제 저해제 1과 2)에서 4℃에서 와동함으로써 재현탁될 수 있다. 현탁액은 간헐적으로 와동하면서, 얼음 위에서 20분 동안 유지될 수 있다. 약 4℃에서 5분 동안 15,000 x g에서 회전한 후, 상층액의 분취량은 약 -70℃에서 보관될 수 있다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "치료한다" 또는 "치료"는 치료적 처치 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 모두를 지칭하고, 여기서 목적은 바람직하지 않은 생리학적 변화, 감염, 또는 질환을 예방하거나 또는 둔화 (감소)시키는 것이다. 유익한 또는 바람직한 임상적 결과에는 검출되는지 또는 검출되지 않는지에 상관없이, 증상의 경감, 질병의 정도의 감소, 질병의 안정된 (즉, 악화되지 않은) 상태, 개체에서 감염성 병원체의 제거 또는 감소, 질병 진행의 지연 또는 늦춤, 질병 상태의 개선 또는 완화, 그리고 관해 (부분적인지 또는 전체적인지에 상관없이)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. "치료"는 또한, 치료를 받지 못할 때 예상된 생존과 비교하여 생존을 연장하는 것을 의미할 수 있다. 치료가 필요한 개체에는 감염, 장애, 또는 질환을 이미 앓고 있는 개체뿐만 아니라 장애 또는 질환에 걸리기 쉬운 개체 또는 장애 또는 질환이 예방되어야 하는 개체가 포함된다.

"검사 개체" 또는 "개인" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예측, 또는 치료가 요망되는 임의의 개체, 특히 포유류 개체를 의미한다. 포유류 개체에는 인간, 가축, 농장 동물, 그리고 동물원, 스포츠, 또는 반려 동물, 예를 들면, 개, 고양이, 기니 피그, 토끼, 쥐, 생쥐, 말, 소, 젖소, 곰 등이 포함된다.

II. 표적 폴리펩티드 설명

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "α-시누클레인", "알파-시누클레인", "a-시누클레인" 및 "aSyn"는 교체가능하게 이용되고 α-시누클레인의 고유 단위체 형태를 특정적으로 지칭한다. 용어 "α-시누클레인"은 또한, 일반적으로 α-시누클레인의 다른 이형태체, 예를 들면, 도파민-퀴논 (DAQ)에 결합된 α-시누클레인 및 α-시누클레인의 소중합체 또는 집합체를 식별하는데 이용된다. 용어 "α-시누클레인"은 또한, α-시누클레인의 모든 유형과 형태를 집합적으로 지칭하는데 이용된다. 인간 α-시누클레인에 대한 단백질 서열은 하기와 같다: MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA (서열 번호: 1).

α-시누클레인의 아미노산 서열은 기존 문헌 및 적절한 데이터베이스로부터 획득될 수 있다; 예로서, Ueda et al., PNAS 90: 1282-11286 (1993); GenBank swissprot: locus SYUA_HUMAN, accession number P37840을 참조한다. α-시누클레인은 인간 뇌에서, 알츠하이머병 (AD) 플라크의 비-β-아밀로이드 성분 (NAC)의 전구체 단백질로서 최초 확인되었다; 예로서, Ueda et al., ibid를 참조한다. α-시누클레인은 140개 아미노산의 단백질이고, 그리고 고유 형태에서 무작위 코일로서 존재한다. 하지만, pH에서 변화, 분자 군집, 중금속 함량, 그리고 도파민 수준 모두 단백질 입체형태에 영향을 준다. 입체형태에서 소중합성, 프로토-섬유성, 섬유성, 그리고 집합체 모이어티로의 변화는 단백질 독성을 조절하는 것으로 생각된다. 증가하는 증거는 도파민-내전된 α-시누클레인이 비-내전된 단백질과 비교하여 원섬유 형성까지 더욱 빠른 시간 경과를 갖는다는 것을 지시한다. 게다가, α-시누클레인 과다발현의 배경에서 도파민은 독성이다. α-시누클레인 내에서 고도 소수성 도메인인 NAC는 적어도 28개의 아미노산 잔기 (잔기 60-87) 및 선택적으로 35개의 아미노산 잔기 (잔기 61-95)로 구성되는 펩티드이다. NAC는 베타-시트 구조를 형성하는 경향을 보인다 (Iwai et al., Biochemistry, 34: 10139-10145 (1995)). NAC의 아미노산 서열은 Jensen et al., Biochem. J. 310: 91-94 (1995); GenBank accession number S56746 및 Ueda et al., ibid에서 설명된다.

NAC를 포함하는 분해된 α-시누클레인 또는 이의 단편은 단위체 펩티드 단위를 의미한다. 분해된 α-시누클레인 또는 이의 단편은 일반적으로 가용성이고, 그리고 자기-집합하여 가용성 소중합체를 형성할 수 있다. α-시누클레인 및 이의 단편의 소중합체는 통상적으로 가용성이고 주로 α-나선으로 존재한다. 단위체 α-시누클레인은 냉동 건조된 펩티드를 순수한 DMSO에서 초음파처리로 용해함으로써 시험관내에서 제조될 수 있다. 결과의 용액은 임의의 불용성 미립자를 제거하기 위해 원심분리된다. NAC를 포함하는 집합된 α-시누클레인 또는 이의 단편은 불용성 β-시트 어셈블리로 연합하는 α-시누클레인 또는 이의 단편의 소중합체를 의미한다. NAC를 포함하는 집합된 α-시누클레인 또는 이의 단편은 또한, 섬유성 중합체를 의미한다. 원섬유는 통상적으로 불용성이다. 일부 항체는 가용성 α-시누클레인 또는 이의 단편, 또는 집합된 α-시누클레인 또는 이의 단편 중에서 어느 한쪽에 결합한다. 일부 항체는 단위체 형태 또는 섬유성 형태보다 α-시누클레인의 소중합체에 더욱 강하게 결합한다. 일부 항체는 가용성 및 집합된 α-시누클레인 또는 이의 단편 둘 모두에 결합하고, 그리고 선택적으로 소중합체 형태에도 결합한다.

III. 항-α-시누클레인 항체

α-시누클레인에 결합하는 항체는 당분야에서 보고되었다. 예로서, International Patent Publication WO 2010/069603을 참조하고, 이것은 본원에서 전체로서 참조로서 편입된다.

본원에서 설명된 인간 항-α-시누클레인 항체는 α-시누클레인 및 이의 에피토프에, 그리고 α-시누클레인 및 이의 에피토프의 다양한 입체형태에 특이적으로 결합한다. 가령, α-시누클레인, 고유 단위체 형태에서 α-시누클레인, 전장과 절두된 α-시누클레인, 그리고 α-시누클레인 집합체에 특이적으로 결합하는 항체가 본원에서 제시된다. 가령, 본원에서 설명된 바와 같은 12F4 항체는 직접 ELISA에 의해 검사될 때, 전장 α-시누클레인 및 아미노산 (aa) 1-60을 내포하는 α-시누클레인 절두체에 결합하고, 알파 시누클레인의 N-말단 양친매성 반복 영역 내에서 12F4의 에피토프를 암시한다. (WO 2010/069603 참조).

본원에서 이용된 바와 같이, α-시누클레인에 "특이적으로 결합", "선별적으로 결합", 또는 "우선적으로 결합"하는 항체에 대한 참조는 다른 무관한 단백질에 결합하지 않는 항체를 지칭한다. 한 실례에서, 본원에서 제시된 α-시누클레인 항체는 α-시누클레인 또는 이의 에피토프에 결합할 수 있고, 그리고 다른 단백질에 대한 배경을 약 1.5배 초과하는 결합을 보이지 않는다. α-시누클레인 이형태체에 "특이적으로 결합" 또는 "선별적으로 결합"하는 항체는 α-시누클레인의 모든 입체형태에 결합하는 것은 아닌, 다시 말하면, 적어도 하나의 다른 α-시누클레인 이형태체에 결합하지 않는 항체를 지칭한다. 가령, α-시누클레인의 단위체 형태와 집합된 형태 중에서, 인간과 생쥐 α-시누클레인; 전장 α-시누클레인과 절두된 형태, 그리고 인간 α-시누클레인 대 β-와 γ-시누클레인을 구별할 수 있는 항체가 본원에서 제시된다. 본 발명의 인간 항-α-시누클레인 항체가 파킨슨병의 징후가 없고 α-시누클레인-특이적 면역 반응을 나타내는 노인 개체의 풀로부터 단리되었기 때문에, 본원에서 제시된 항-α-시누클레인 항체는 또한, 이들 항체가 이들 개체에 의해 실제로 발현되고, 그리고 예로서, 지금까지 인간-유사 항체를 제공하려고 노력하기 위한 한 가지 통상의 방법을 대표하는 인간 면역글로불린 발현 파지 라이브러리로부터 단리되지 않았음을 강조하기 위해, "인간 자기항체"로 불릴 수 있다.

본 발명은 전반적으로, 검사 개체의 뇌에서 상승된 수준의 α-시누클레인을 진단하는 방법에 관계하고, 상기 방법은 α-시누클레인, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체에 특이적으로 결합하는 항체의 투여를 포함한다. 항-α-시누클레인 항체는 본원에서 제시된 방법에서 이용될 수 있다. 이용될 수 있는 항체에는 재조합 인간 α-시누클레인 항체 NI-202.3G12, 12F4, 또는 NI-202.3D8 및 이들의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는데, 이들은 International Patent Publication WO 2010/069603에서 완전하게 설명된다.

일정한 구체예에서, 본원에서 제시된 방법에서 유용한 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 참고 항-α-시누클레인 항체 분자, 예를 들면, 본원에서 설명된 것들에 대한 아미노산 서열에 적어도 약 80%, 약 85%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 또는 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 추가의 구체예에서, 결합 분자는 참고 항체에 적어도 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 공유한다. 일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 면역글로불린 중쇄 가변 영역 (VH) 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 참고 항체와 동일한 α-시누클레인 에피토프에 특이적으로 결합하고, 여기서 VH는 서열 번호: 2에 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VL은 서열 번호: 3에 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다 (표 2에 제시됨).

본원에서 제시된 방법에서 유용한 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체가 더욱 제시되고, 상기 항체는 VH와 VL을 포함하는 참고 항체와 동일한 α-시누클레인 에피토프에 특이적으로 결합하고, 여기서 VH는 서열 번호: 2에 동일하거나, 또는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상의 아미노산 치환을 제외하고 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VL은 서열 번호: 3에 동일하거나, 또는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상의 아미노산 치환을 제외하고 동일한 아미노산 서열을 포함한다 (표 2에서 제시됨).

일부 구체예는 본원에서 제시된 방법에서 유용하고 VH를 포함하는 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하고, 여기서 VH의 VHCDR1, VHCDR2 또는 VHCDR3 영역 중에서 하나 또는 그 이상은 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 중에서 하나 또는 그 이상의 하나 또는 그 이상 참고 중쇄 VHCDR1, VHCDR2 및/또는 VHCDR3 아미노산 서열에 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일하다 (표 3에 제시됨).

본원에서 제시된 방법에서 유용하고 VH를 포함하는 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체가 더욱 제시되고, 여기서 VH의 VHCDR1, VHCDR2 또는 VHCDR3 영역 중에서 하나 또는 그 이상은 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 중에서 하나 또는 그 이상의 하나 또는 그 이상 참고 중쇄 VHCDR1, VHCDR2 또는 VHCDR3 아미노산 서열에 동일하거나, 또는 4개, 3개, 2개, 또는 1개 아미노산 치환을 제외하고 동일하다 (표 3에 제시됨).

또한, 본원에서 제시된 방법에서 유용하고 VL을 포함하는 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체가 제시되고, 여기서 VL의 VLCDR1, VLCDR2 또는 VLCDR3 영역 중에서 하나 또는 그 이상은 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9 중에서 하나 또는 그 이상의 하나 또는 그 이상 참고 중쇄 VLCDR1, VLCDR2 또는 VLCDR3 아미노산 서열에 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일하다 (표 3에 제시됨).

일부 구체예는 본원에서 제시된 방법에서 유용하고 VL을 포함하는 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 제시하고, 여기서 VL의 VLCDR1, VLCDR2 또는 VLCDR3 영역 중에서 하나 또는 그 이상은 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9 중에서 하나 또는 그 이상의 하나 또는 그 이상 참고 중쇄 VLCDR1, VLCDR2 또는 VLCDR3 아미노산 서열에 동일하거나, 또는 4개, 3개, 2개, 또는 1개 아미노산 치환을 제외하고 동일하다 (표 3에 제시됨).

다른 구체예에서, 본원에서 제시된 방법에서 유용한 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3에 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 VH와 VL 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 이들로 구성된다 (표 2에 제시됨).

참고 VH와 VL 아미노산 서열^*

VH	VL
EVQLVQSGGGLVEPGGSLRLSCAVSGFDFE KAWMS WVRQAPGQGLQWVA RIKSTADGGTTSYAAPVEG RFIISRDDSRNMLYLQMNSLKTEDTAVYYCTS AH WGQGTLVTVSS 서열 번호: 2	QSVLTQPPSVSVSPGQTARITC SGEALPMQFAH WYQQRPGKAPVIVVY KDSERPS GVPERFSGSSSGTTATLTITGVQAEDEADYYC QSPDSTNTYEV FGGGTKLTVL 서열 번호: 3

^*VH와 VL CDR1, CDR2, 그리고 CDR3 아미노산 서열은 밑줄로 표시된다

참고 VH와 VL CDR1, CDR2, 그리고 CDR3 아미노산 서열

VHCDR1	VHCDR2	VHCDR3	VLCDR1	VLCDR2	VLCDR3
KAWMS 서열 번호: 4	RIKSTADGGTTSYAAPVEG 서열 번호: 5	AH 서열 번호: 6	SGEALPMQFAH 서열 번호: 7	KDSERPS 서열 번호: 8	QSPDSTNTYEV 서열 번호: 9

또한, 본원에서 설명된 방법에서 이용을 위해 본원에서 설명된 바와 같은 항-α-시누클레인 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 인코딩하는 폴리펩티드, 이런 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이런 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 그리고 이런 벡터 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 포함되고, 이들 모두 본원에서 설명된 방법에서 이용을 위해 항-α-시누클레인 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 생산하기 위한 것이다.

본원에서 설명된 바와 같은 항-α-시누클레인 항체의 적절한 생물학적 활성 변이체가 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다. 이런 변이체는 부모 항-α-시누클레인 항체의 결합 성질을 유지할 것이다. 항체 변이체를 만들기 위한 방법은 당분야에서 일반적으로 가용하다.

돌연변이유발 및 뉴클레오티드 서열 변경을 위한 방법은 당분야에서 널리 알려져 있다. 예로서, Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985); Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987); Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.Y.); U.S. Pat. No. 4,873,192; 그리고 이들 내에서 인용된 참고문헌을 참조한다; 본원에서 참조로서 편입됨. 목적되는 폴리펩티드의 생물학적 활성에 영향을 주지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 보도는 본원에서 전체로서 참조로서 편입되는 Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington,D.C.),pp.345-352(1978)에서 Dayhoff 등의 모델에서 찾아볼 수 있다. Dayhoff 등의 모델은 적절한 보존성 아미노산 치환을 결정하기 위해, 점 용인된 돌연변이 (Point Accepted Mutation, PAM) 아미노산 유사성 매트릭스 (PAM 250 매트릭스)를 이용한다. 보존성 치환, 예를 들면, 한 아미노산을 유사한 성질을 갖는 다른 아미노산으로 교체하는 것이 바람직할 수 있다. Dayhoff 등 모델의 PAM 250 매트릭스에 의해 교시된 바와 같은 보존성 아미노산 치환의 실례에는 Gly↔Ala, Val↔Ile↔Leu, Asp↔Glu, Lys↔Arg, Asn↔Gln, 그리고 Phe↔Trp↔Tyr가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체 결합 특이성을 측정하기 위한 방법에는 기준 경쟁적 결합 검정, T 세포 또는 B 세포에 의한 면역글로불린 분비를 모니터링하기 위한 검정, T 세포 증식 검정, 아폽토시스 검정, ELISA 검정 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 예로서, WO 93/14125; Shi et al., Immunity 13:633-642 (2000); Kumanogoh et al., J Immunol 169:1175-1181 (2002); Watanabe et al., J Immunol 167:4321-4328 (2001); Wang et al., Blood 97:3498-3504 (2001); 그리고 Giraudon et al., J Immunol 172(2):1246-1255 (2004)에서 개시된 이런 검정을 참조하고, 이들 모두 본원에서 참조로서 편입된다.

본원에서 제시된 불변 영역, CDR, VH 도메인 또는 VL 도메인을 포함하는 임의의 특정 폴리펩티드가 다른 폴리펩티드에 적어도 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 심지어 약 100% 동일한 지에 관해 본원에서 논의될 때, % 동일성은 당분야에 공지된 방법 및 컴퓨터 프로그램/소프트웨어, 예를 들면, 하지만 제한 없이, BESTFIT 프로그램 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711)을 이용하여 결정될 수 있다. BESTFIT는 두 서열 사이에 상동성의 최적 구획을 찾기 위해, Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489의 국부 상동성 알고리즘을 이용한다. 특정 서열이 예로서, 본 발명에 따른 참고 서열에 95% 동일한 지를 결정하기 위해 BESTFIT 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 이용할 때, 파라미터는 당연히, 동일성의 백분율이 참고 폴리펩티드 서열의 전장에 걸쳐 계산되고, 그리고 참고 서열 내에 아미노산의 총수의 5%까지의 상동성에서 갭이 허용되도록 설정된다.

본 발명을 위하여, 퍼센트 서열 동일성은 12의 갭 개방 페널티 (gap open penalty) 및 2의 갭 신장 페널티 (gap extension penalty), 62의 BLOSUM 매트릭스에서 아핀 갭 검색을 이용한 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘은 Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489에서 교시된다. 변이체는 예로서, 적게는 1 내지 15개의 아미노산 잔기, 적게는 1 내지 10개, 예를 들면, 6-10개의 아미노산 잔기, 적게는 5개, 적게는 4, 3, 2, 또는 심지어 1개의 아미노산 잔기에 의해 참고 항-α-시누클레인 항체와 상이할 수 있다. "보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 전하를 갖는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 전하를 갖는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당분야에서 규정되었다. 이들 패밀리에는 염기성 측쇄 (가령, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (가령, 아스파르트산, 글루타민산), 하전되지 않은 극성 측쇄 (가령, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (가령, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-가지형 측쇄 (가령, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (가령, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산이 포함된다. 대안으로, 돌연변이는 예로서, 포화 돌연변이유발에 의해 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라서 무작위로 도입될 수 있고, 그리고 결과의 돌연변이체는 활성 (가령, α-시누클레인 폴리펩티드에 결합하는 능력)을 유지하는 돌연변이체를 확인하기 위해 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.

가령, 항체 분자의 단지 뼈대 영역에서만 또는 단지 CDR 영역에서만 돌연변이를 도입하는 것이 가능하다. 도입된 돌연변이는 침묵 돌연변이 또는 중립 미스센스 돌연변이일 수 있다, 다시 말하면, 항원에 결합하는 항체의 능력에 거의 또는 전혀 영향을 주지 않는다. 이들 유형의 돌연변이는 코돈 사용빈도 (codon usage)를 최적화하거나, 또는 하이브리도마의 항체 생산을 향상시키는데 유용할 수 있다. 대안으로, 비-중립 미스센스 돌연변이는 항원에 결합하는 항체의 능력을 변화시킬 수 있다. 당업자는 원하는 성질, 예를 들면, 항원 결합 활성에서 변화 없음 또는 결합 활성에서 변화 (가령, 항원 결합 활성에서 향상 또는 항체 특이성에서 변화)를 갖는 돌연변이 분자를 설계하고 검사할 수 있을 것이다. 돌연변이유발 이후에, 인코딩된 단백질은 일과적으로 발현될 수 있고, 그리고 인코딩된 단백질의 기능적 및/또는 생물학적 활성 (가령, α-시누클레인 폴리펩티드의 적어도 하나의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 능력)은 본원에서 설명된 기술을 이용하여 또는 당분야에 공지된 기술을 일과적으로 변형함으로써 측정될 수 있다.

IV. 항-α-시누클레인 항체를 이용한 진단 또는 추적 방법

본 발명은 검사 개체의 뇌에서 상승된 수준의 α-시누클레인을 진단하기 위한 (가령, 시누클레인병증성 질환이 발병하는 개체의 위험을 결정하기 위한), 또는 검사 개체에서 시누클레인병증성 질환의 진행 또는 시누클레인병증성 질환 치료에 대한 반응을 모니터링하기 위한 항-α-시누클레인 결합 분자, 예를 들면, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도에 관계한다.

일정한 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 방법은 검사 개체의 뇌에서 상승된 수준의 α-시누클레인을 하기에 의해 진단하기 위한 본원에서 설명된 항-α-시누클레인 항체 및 이의 항원-결합 단편, 변이체와 유도체의 용도에 관계한다: (a) 검사 개체에 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 말초 투여 이후에 특정된 간격에서 검사 개체로부터 획득된 혈장, 또는 CSF 시료에서 α-시누클레인의 수준을 검정하고, 여기서 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 단편은 뇌에서 혈액으로, 또는 뇌에서 CSF로 α-시누클레인의 순 유출을 변경할 만큼 충분한 친화성으로 α-시누클레인에 결합할 수 있고; (b) 검사 개체에서 α-시누클레인의 검정된 수준을 참고 기준에 비교하고; 여기서 혈장 시료, 또는 CSF 시료에서 α-시누클레인의 수준 및 참고 기준 사이에 차이 또는 유사성은 검사 개체의 뇌에서 α-시누클레인의 수준과 상관한다.

다른 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 방법은 검사 개체의 뇌에서 상승된 수준의 α-시누클레인을 하기에 의해 진단하기 위한 본원에서 설명된 항-α-시누클레인 항체 및 이의 항원-결합 단편, 변이체와 유도체의 용도에 관계한다: (a) 검사 개체에 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 말초 투여 이후에 특정된 간격에서 검사 개체로부터 획득된 혈장, 또는 CSF 시료에서 α-시누클레인의 수준을 검정하고, 여기서 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 단편은 혈액 또는 CSF에서 α-시누클레인을 안정시키거나 격리하고; (b) 검사 개체에서 α-시누클레인의 검정된 수준을 참고 기준에 비교하고; 여기서 혈장 시료, 또는 CSF 시료에서 α-시누클레인의 수준 및 참고 기준 사이에 차이 또는 유사성은 검사 개체의 뇌에서 α-시누클레인의 수준과 상관한다.

일부 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 방법은 검사 개체의 뇌에서 상승된 수준의 α-시누클레인을 하기에 의해 진단하기 위한 본원에서 설명된 항-α-시누클레인 항체 및 이의 항원-결합 단편, 변이체와 유도체의 용도에 관계한다: (a) 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 단편은 뇌에서 혈액으로, 또는 뇌에서 CSF로 α-시누클레인의 순 유출을 변경할 만큼 충분한 친화성으로 α-시누클레인에 결합할 수 있고; (b) 건강관리 제공자가 항체를 검사 개체에 말초 투여하고, 그리고 투여 이후에 특정된 시간 간격에서 개체로부터 혈장 시료 또는 CSF 시료를 획득하도록 지도하고; (c) 혈장 시료, 또는 CSF 시료에서 α-시누클레인의 수준을 검정하고; (d) 검사 개체에서 α-시누클레인의 검정된 수준을 참고 기준에 비교하고; 여기서 혈장 시료, 또는 CSF 시료에서 α-시누클레인의 수준 및 참고 기준 사이에 차이 또는 유사성은 검사 개체의 뇌에서 α-시누클레인의 수준과 상관한다.

다른 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 방법은 검사 개체의 뇌에서 상승된 수준의 α-시누클레인을 하기에 의해 진단하기 위한 본원에서 설명된 항-α-시누클레인 항체 및 이의 항원-결합 단편, 변이체와 유도체의 용도에 관계한다: (a) 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 여기서 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 단편은 혈액 또는 CSF에서 α-시누클레인을 안정시키거나 격리하고; (b) 건강관리 제공자가 항체를 검사 개체에 말초 투여하고, 그리고 투여 이후에 특정된 시간 간격에서 개체로부터 혈장 시료 또는 CSF 시료를 획득하도록 지도하고; (c) 혈장 시료, 또는 CSF 시료에서 α-시누클레인의 수준을 검정하고; (d) 검사 개체에서 α-시누클레인의 검정된 수준을 참고 기준에 비교하고; 여기서 혈장 시료, 또는 CSF 시료에서 α-시누클레인의 수준 및 참고 기준 사이에 차이 또는 유사성은 검사 개체의 뇌에서 α-시누클레인의 수준과 상관한다.

본 발명의 방법과 시스템을 적용하기 위해, 환자로부터 시료는 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 투여 이전에 또는 이후에 획득될 수 있다. 시료는 예로서, 건강관리 제공자 (가령, 의사) 또는 건강관리 편익 제공자에 의해 요구되고, 동일한 또는 상이한 건강관리 제공자 (가령, 간호사, 병원) 또는 임상 실험실에 의해 획득되고 및/또는 처리되고, 그리고 처리 후, 결과는 또 다른 건강관리 제공자, 건강관리 편익 제공자 또는 환자에게 전송될 수 있다. 유사하게, 시료에서 α-시누클레인의 수준을 검정하고, 검사 개체에서 α-시누클레인의 검정된 수준을 참고 기준에 비교하고, 결과를 평가하는 것은 하나 또는 그 이상의 건강관리 제공자, 건강관리 편익 제공자, 및/또는 임상 실험실에 의해 수행될 수 있다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "건강관리 제공자"는 생존 개체, 예를 들면, 인간 환자와 직접적으로 상호작용하고 이들을 관리하는 개인 또는 기관을 지칭한다. 건강관리 제공자의 무제한적 실례에는 의사, 간호사, 기술자, 테라피스트, 약사, 카운슬러, 대체 의약 의사, 의료 시설, 의원, 병원, 응급실, 클리닉, 응급 치료 센터, 대체 의약 클리닉/시설, 그리고 일반 의료, 특수 의료, 수술 및/또는 임의의 다른 유형의 치료, 사정, 유지, 요법, 약물치료 및/또는 권고가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 환자의 건강 상태의 전부 또는 임의의 일부에 관련된 일반 및/또는 특수 치료, 사정, 유지, 요법, 약물치료, 및/또는 권고를 제공하는 임의의 다른 실체가 포함된다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "임상 실험실"은 생존 개체, 예를 들면, 인간으로부터 유래된 재료의 시험 또는 처리를 위한 시설을 지칭한다. 처리의 무제한적 실례에는 예로서, 생존 개체, 예를 들면, 인간의 임의의 질병 또는 손상의 진단, 예방, 또는 치료, 또는 건강의 사정을 위한 정보를 제공하는 목적으로, 인체로부터 유래된 재료의 생물학적, 생화학적, 혈청학적, 화학적, 면역혈액학적, 혈액학적, 생물물리학적, 세포학적, 병리학적, 유전적, 또는 기타 시험이 포함된다. 이들 시험은 또한, 시료를 수집하거나 달리 획득하고, 생존 개체, 예를 들면, 인간의 신체, 또는 생존 개체, 예를 들면, 인간의 신체로부터 획득된 시료에서 다양한 물질의 존재 또는 부재를 준비하거나, 결정하거나, 측정하거나, 또는 달리 설명하는 절차를 포함한다. 일정한 양상에서, 임상 실험실은 "중심" 또는 "지역"일 수 있는데, 이것은 모든 외부 출처로부터 제출된 시료의 모든 측정을 소수의 또는 하나의 실험실이 수행한다는 것을 의미한다. 다른 양상에서, "위성" 또는 "글로벌" 실험실로 지칭되는 복수의 임상 실험실이 쉽게 비교될 수 있는 기준, 신뢰성 있는 결과를 제공하기 위해 인증될 수 있다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "건강관리 편익 제공자"는 하나 또는 그 이상의 건강관리 편익, 편익 계획, 건강 보험, 및/또는 건강관리 비용 계정 프로그램에 대한 환자 접근을 제공하거나, 부여하거나, 제안하거나, 전체적으로 또는 부분적으로 비용을 지불하거나, 또는 이러한 접근을 제공하는 것과 달리 연관되는 개인 당사자, 조직, 또는 그룹을 포괄한다.

일부 양상에서, 건강관리 제공자는 다른 건강관리 제공자가 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하도록 관리하거나 지시할 수 있다. 건강관리 제공자는 다른 건강관리 제공자 또는 환자가 하기 행위를 수행하도록 권한을 주거나 지시할 수 있다: 시료를 획득하고, 시료를 처리하고, 시료를 제출하고, 시료를 접수하고, 시료를 이전하고, 시료를 분석하거나 측정하고, 시료를 정량하고, 시료를 분석/측정/정량한 후 획득된 결과를 제공하고, 시료를 분석/측정/정량한 후 획득된 결과를 접수하고, 하나 또는 그 이상의 시료를 분석/측정/정량한 후 획득된 결과를 비교/채점하고, 하나 또는 그 이상의 시료로부터 비교/스코어를 제공하고, 하나 또는 그 이상의 시료로부터 비교/스코어를 획득하고, 요법 또는 치료제 (가령, 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편)을 투여하고, 요법의 투여를 시작하고, 요법의 투여를 중지하고, 요법의 투여를 지속하고, 요법의 투여를 일시적으로 중단하고, 투여된 치료제의 양을 증가시키고, 투여된 치료제의 양을 감소시키고, 치료제의 양의 투여를 지속하고, 치료제의 투여 빈도를 증가시키고, 치료제의 투여 빈도를 감소시키고, 치료제에서 동일한 투약 빈도를 유지하고, 요법 또는 치료제를 적어도 다른 요법 또는 치료제로 대체하고, 요법 또는 치료제를 적어도 다른 요법 또는 추가의 치료제와 복합한다.

일부 양상에서, 건강관리 편익 제공자는 예로서, 시료의 수집, 시료의 처리, 시료의 제출, 시료의 접수, 시료의 이전, 시료의 분석 또는 측정, 시료의 정량, 시료를 분석/측정/정량한 후 획득된 결과의 제공, 시료를 분석/측정/정량한 후 획득된 결과의 이전, 하나 또는 그 이상의 시료를 분석/측정/정량한 후 획득된 결과의 비교/채점, 하나 또는 그 이상의 시료로부터 비교/스코어의 이전, 요법 또는 치료제의 투여, 요법 또는 치료제의 투여의 시작, 요법 또는 치료제의 투여의 중지, 요법 또는 치료제의 투여의 지속, 요법 또는 치료제의 투여의 일시적인 중단, 투여된 치료제의 양의 증가, 투여된 치료제의 양의 감소, 치료제의 양의 투여의 지속, 치료제의 투여 빈도에서 증가, 치료제의 투여 빈도에서 감소, 치료제에서 동일한 투약 빈도의 유지, 적어도 다른 요법 또는 치료제에 의한 요법 또는 치료제의 대체, 또는 요법 또는 치료제와 적어도 다른 요법 또는 추가의 치료제의 복합을 인가하거나 또는 거부할 수 있다.

이에 더하여, 건강관리 편익 제공자는 예로서, 요법의 처방을 인가하거나 거부하고, 요법에 대한 보상 범위를 인가하거나 거부하고, 요법의 비용에 대한 상환을 인가하거나 거부하고, 요법에 대한 적격성을 결정하거나 거부하고, 기타 등등일 수 있다.

일부 양상에서, 임상 실험실은 예로서, 시료를 수집하거나 획득하고, 시료를 처리하고, 시료를 제출하고, 시료를 접수하고, 시료를 이전하고, 시료를 분석하거나 측정하고, 시료를 정량하고, 시료를 분석/측정/정량한 후 획득된 결과를 제공하고, 시료를 분석/측정/정량한 후 획득된 결과를 접수하고, 하나 또는 그 이상의 시료를 분석/측정/정량한 후 획득된 결과를 비교/채점하고, 하나 또는 그 이상의 시료로부터 비교/스코어를 제공하고, 하나 또는 그 이상의 시료로부터 비교/스코어를 획득할 수 있다.

전술한 행위는 컴퓨터-실행된 방법 (가령, 웹 서비스 또는 독립형 컴퓨터 시스템에 의해)을 이용하여 자동적으로, 건강관리 제공자, 건강관리 편익 제공자, 또는 환자에 의해 수행될 수 있다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "건강관리 제공자를 지도하고"는 건강관리 제공자를 구두로 지도하거나, 또는 건강관리 제공자를 지령서를 이용하여 지도하거나, 또는 둘 모두를 포함한다.

일부 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 방법은 검사 개체의 뇌에서 상승된 수준의 α-시누클레인을 하기에 의해 진단하기 위한 본원에서 설명된 항-α-시누클레인 항체 및 이의 항원-결합 단편, 변이체와 유도체의 용도에 관계한다: (a) 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 검사 개체에 말초 투여하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 단편은 뇌에서 혈액으로, 또는 뇌에서 CSF로 α-시누클레인의 순 유출을 변경할 만큼 충분한 친화성으로 α-시누클레인에 결합할 수 있고; (b) 투여 이후에 특정된 시간 간격에서 검사 개체로부터 혈장 시료, 또는 CSF 시료를 획득하고, 그리고 α-시누클레인의 수준의 결정을 위해 혈장 시료, 또는 CSF 시료를 제출하고; (c) 혈장 시료에서 α-시누클레인의 수준을 참고 기준에 비교하고; 여기서 혈장 시료, 또는 CSF 시료에서 α-시누클레인의 수준 및 참고 기준 사이에 차이 또는 유사성은 검사 개체의 뇌에서 α-시누클레인의 수준과 상관한다.

다른 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 방법은 검사 개체의 뇌에서 상승된 수준의 α-시누클레인을 하기에 의해 진단하기 위한 본원에서 설명된 항-α-시누클레인 항체 및 이의 항원-결합 단편, 변이체와 유도체의 용도에 관계한다: (a) 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 검사 개체에 말초 투여하고, 여기서 항체 또는 이의 단편은 혈액 또는 CSF에서 α-시누클레인을 안정시키거나 격리하고; (b) 투여 이후에 특정된 시간 간격에서 검사 개체로부터 혈장 시료, 또는 CSF 시료를 획득하고, 그리고 α-시누클레인의 수준의 결정을 위해 혈장 시료, 또는 CSF 시료를 제출하고; (c) 혈장 시료에서 α-시누클레인의 수준을 참고 기준에 비교하고; 여기서 혈장 시료, 또는 CSF 시료에서 α-시누클레인의 수준 및 참고 기준 사이에 차이 또는 유사성은 검사 개체의 뇌에서 α-시누클레인의 수준과 상관한다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 항-α-시누클레인 항체 및 이의 항원-결합 단편, 변이체와 유도체는 뇌에서 혈액으로, 또는 뇌에서 CSF로 α-시누클레인의 순 유출을 변경하고 혈액 또는 CSF에서 α-시누클레인을 안정시키거나 격리할 만큼 충분한 친화성으로 α-시누클레인에 결합할 수 있다.

진단되는 검사 개체는 질병에 대해 무증상 또는 임상전일 수 있다. 특정 구체예에서, 검사 개체에는 증상을 보이기 전이거나 또는 임상전 시누클레인병증성 질환을 앓는 개인이 포함된다.

특정 구체예에서, 본원에서 설명된 방법에서 "참고 기준"은 1명 또는 그 이상의 대조 개체에서 α-시누클레인의 측정된 수준을 포함하고, 여기서 대조 개체에는 정상적인 건강한 개인, 그리고 다양한 심각도의 시누클레인병증을 앓는 개인이 포함된다. 가령, 대조 개체는 시누클레인병증성 질환, 예를 들면, 파킨슨병 (PD), 루이소체 치매 (DLB) 또는 알츠하이머병의 루이소체 변형체 (LBVAD)를 앓고, 여기서 α-시누클레인의 수준 및 참고 기준 사이에 유사성은 진단되는 개체가 시누클레인병증성 질환을 앓는다는 것을 지시한다. 대안으로, 또는 부가적으로 두 번째 대조로서 대조 개체는 시누클레인병증성 질환을 앓지 않고, 여기서 α-시누클레인의 수준 및 참고 기준 사이에 차이는 진단되는 개체가 시누클레인병증성 질환을 앓는다는 것을 지시한다. 바람직하게는, 진단되는 개체 및 대조 개체(들)는 연령-정합된다.

일부 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 방법은 혈장 시료 (즉, 검사 시료)에서 α-시누클레인의 수준을 항-α-시누클레인 항체 및 이의 항원-결합 단편, 변이체와 유도체의 투여에 앞서 검사 개체로부터 획득된 혈장 시료 (즉, 기준선 시료)와 비교하는 것을 더욱 포함한다. 다른 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 방법은 CSF 시료 (즉, 검사 시료)에서 α-시누클레인의 수준을 항-α-시누클레인 항체 및 이의 항원-결합 단편, 변이체와 유도체의 투여에 앞서 검사 개체로부터 획득된 CSF 시료 (즉, 기준선 시료)와 비교하는 것을 더욱 포함한다. 가령, 비교는 참고 기준과의 비교 대신에 또는 참고 기준과의 비교에 추가하여 기준선 시료에 대해 이루어질 수 있다. 이 점에 있어서, 기준선 시료는 검사 시료를 참고 기준에 보정하는데 이용될 수 있다 (가령, 상기 치수는 절대 값이라기보다는 차이 또는 비율이다).

추가의 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 항-α-시누클레인 결합 분자, 특히 항-α-시누클레인 항체는 또한, 검사된 개인으로부터, 혈액 시료, 림프 시료, CSF 시료, 또는 임의의 다른 체액 시료일 수 있는 체액 시료를 획득하고, 그리고 항체-항원 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건 하에 체액 시료를 본원에서 설명된 바와 같은 항-α-시누클레인 항체와 접촉시킴으로써, 개인에서 질환의 진단을 위한 방법에서 이용될 수 있다. 이런 복합체의 수준은 이후, 공지된 방법에 의해 측정되는데, 대조 시료에서 형성된 것보다 훨씬 높은 수준은 검사된 개인에서 상기 질환을 지시한다. 동일한 방식에서, 본원에서 설명된 바와 같은 항-α-시누클레인 항체에 의해 결합되는 특이적 항원 역시 이용될 수 있다. 따라서 본 발명은 본 발명의 항-α-시누클레인 결합 분자, 예를 들면, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 시험관내 면역검정에 관계한다.

α-시누클레인의 수준은 예로서, α-시누클레인을 웨스턴 블롯, 면역침강, 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 방사성면역검정 (RIA), 형광 활성화된 세포 분류 (FACS), 2-차원 겔 전기영동, 질량 분석법 (MS), 매트릭스 지원된 레이저 탈흡수/이온화 비행 시간-MS (MALDI-TOF), 표면-증강된 레이저 탈흡수 이온화 비행 시간 (SELDI-TOF), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 고속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC), 다차원 액체 크로마토그래피 (LC), 그 이후에 직렬 질량 분석법 (MS/MS), 그리고 레이저 밀도계측에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 기술에 의해 분석하는 것을 포함하는, 당분야에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 사정될 수 있다. 바람직하게는, α-시누클레인의 상기 생체내 이미지화는 양전자 방사 단층촬영 (PET), 단일 광전자 방출 단층촬영 (SPECT), 근적외선 (NIR) 광학 영상 또는 자기 공명 영상 (MRI)을 포함한다.

의료 분야에서 널리 알려진 바와 같이, 임의의 환자에 대한 용량은 환자의 크기, 신체 표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 기간과 루트, 일반 건강, 그리고 동시에 투여되는 다른 약물을 비롯한 많은 인자에 좌우된다. 일반적으로, 용량은 예로서, 대상 체중의 약 0.0001 내지 100 mg/kg 범위, 그리고 더욱 일반적으로 0.01 내지 5 mg/kg (가령, 0.02 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg 등) 범위일 수 있다. 가령, 용량은 1 mg/체중 kg 또는 10 mg/체중 kg이거나 또는 1-10 mg/kg의 범위 내에 있을 수 있다. 상기 범위 내에 중간 용량 역시 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 용어 "말초 투여"는 본원의 다른 곳에서 설명된다.

일정한 구체예에서, 항체-기초된 어레이가 이용될 수 있는데, 이것은 예로서, α-시누클레인을 특이적으로 인식하는 본 발명의 항-α-시누클레인 항체 또는 등가의 항원-결합 분자로 부하된다. 마이크로어레이 면역검정의 설계는 Kusnezow et al., Mol. Cell Proteomics 5:1681-1696 (2006)에서 요약된다. 따라서 본 발명은 또한, 본 발명에 따라서 확인된 항-α-시누클레인 결합 분자로 부하된 마이크로어레이에 관계한다.

일부 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 방법은 또한, 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 말초 투여 이후에 특정된 시점에서 개체의 혈장, 또는 개체의 CSF에서 α-시누클레인의 수준을 검정하는 것을 포함하는, 시누클레인병증성 질환에 대해 치료되는 개체의 뇌에서 α-시누클레인 수준을 추적하기 위한 항-α-시누클레인 항체 및 이의 항원-결합 단편, 변이체와 유도체의 용도에 관계하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 단편은 뇌에서 혈액으로, 또는 뇌에서 CSF로 α-시누클레인의 순 유출을 변경할 만큼 충분한 친화성으로 α-시누클레인에 결합할 수 있고; 그리고 여기서 개체의 혈장, 또는 개체의 CSF에서 α-시누클레인 수준은 개체의 뇌에서 수준과 상관한다. 특정 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 방법은 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 추가의 말초 투여 이후에 특정된 시점에서 개체의 혈장, 또는 개체의 CSF에서 α-시누클레인의 수준을 검정하여 개체의 뇌에서 α-시누클레인 수준에서 변화를 시간의 흐름에서 플롯팅하는 것을 더욱 포함한다.

일부 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 방법은 또한, 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 말초 투여 이후에 특정된 시점에서 개체의 혈장, 또는 개체의 CSF에서 α-시누클레인의 수준을 검정하는 것을 포함하는, 시누클레인병증성 질환에 대해 치료되는 개체의 뇌에서 α-시누클레인 수준을 추적하기 위한 항-α-시누클레인 항체 및 이의 항원-결합 단편, 변이체와 유도체의 용도에 관계하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 단편은 혈액 또는 CSF에서 α-시누클레인을 안정시키거나 격리하고; 그리고 여기서 개체의 혈장, 또는 개체의 CSF에서 α-시누클레인 수준은 개체의 뇌에서 수준과 상관한다. 특정 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 방법은 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 추가의 말초 투여 이후에 특정된 시점에서 개체의 혈장, 또는 개체의 CSF에서 α-시누클레인의 수준을 검정하여 개체의 뇌에서 α-시누클레인 수준에서 변화를 시간의 흐름에서 플롯팅하는 것을 더욱 포함한다.

일부 구체예는 본원에서 설명된 바와 같은 방법을 포함하고, 여기서 특정된 시간 간격은 12개월보다 적고, 11개월보다 적고, 10개월보다 적고, 9개월보다 적고, 8개월보다 적고, 7개월보다 적고, 6개월보다 적고, 5개월보다 적고, 4개월보다 적고, 3개월보다 적고, 2개월보다 적고, 1개월보다 적고, 1주보다 적고, 또는 24시간보다 적거나 24시간과 동등하고, 또는 3시간보다 적거나 3시간과 동등하다.

V. 조성물 및 투여 방법

항-α-시누클레인 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 제조하고 필요 개체에 투여하는 방법은 당업자에게 널리 알려져 있거나 또는 당업자에 의해 쉽게 결정된다. 항-α-시누클레인 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 투여 루트는 예로서, 경구, 비경구, 흡입에 의해 또는 국소일 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "말초 투여"는 예로서, 정맥내, 동맥내, 복막내, 근육내, 피하, 직장, 또는 질 투여를 포함한다. 이들 모든 투여 형태가 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 명백히 예기되긴 하지만, 투여를 위한 형태의 한 가지 실례는 주사용 용액, 특히 정맥내 또는 동맥내 주사 또는 점적용 용액일 것이다. 주사에 적합한 제약학적 조성물은 완충액 (가령, 아세트산염, 인산염 또는 구연산염 완충액), 계면활성제 (가령, 폴리소르베이트), 선택적으로 안정제 (가령, 인간 알부민) 등을 포함할 수 있다.

본원에서 논의된 바와 같이, 항-α-시누클레인 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 투여를 용이하게 하고 활성 작용제의 안정성을 증진하도록 조제될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명에 따른 제약학적 조성물은 제약학적으로 허용되는, 비-독성, 무균 담체, 예를 들면, 생리 식염수, 비-독성 완충액, 보존제 등을 포함한다. 본 출원을 위하여, 항-α-시누클레인 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 제약학적 효과량은 표적에 대한 효과적인 결합을 달성하고, 그리고 편익을 성취하는데, 예를 들면, 뇌에서 혈액으로 α-시누클레인의 순 유출을 변경하거나, 또는 뇌에서 CSF로 α-시누클레인의 순 유출을 변경하는데 충분한 양을 의미하는 것으로 판단될 것이다.

본 발명에서 이용된 제약학적 조성물은 예로서, 이온 교환기, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴을 비롯한 제약학적으로 허용되는 담체, 혈청 단백질, 예를 들면, 인간 혈청 알부민, 완충액 물질, 예를 들면, 인산염, 글리신, 소르브산, 소르브산칼륨, 포화된 식물성 지방산의 부분적인 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예를 들면, 프로타민 황산염, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 규산염, 삼규산마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로오스-기초된 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜, 그리고 양모지를 포함한다.

말초 투여용 제조물은 무균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 그리고 유화액을 포함한다. 비-수성 용매의 실례는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예를 들면, 올리브 오일, 그리고 주사가능 유기 에스테르, 예를 들면, 에틸 올리에이트이다. 수성 담체에는 예로서, 식염수 및 완충된 매체를 비롯하여, 물, 알코올성/수성 용액, 유화액 또는 현탁액이 포함된다. 본 발명에서, 제약학적으로 허용되는 담체에는 0.01-0.1 M 인산염 완충액 또는 0.8% 식염수가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 다른 통상의 비경구 운반제에는 인산나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스와 염화나트륨, 락테이티드 링거, 또는 고정유가 포함된다. 정맥내 운반제에는 유체와 영양소 보충물, 전해질 보충물, 예를 들면, 링거 덱스트로스에 기초된 것들 등이 포함된다. 또한, 보존제 및 기타 첨가제, 예를 들면, 항균제, 항산화제, 킬레이트화제, 그리고 비활성 가스 등이 존재할 수 있다.

더욱 구체적으로, 주사가능 용도에 적합한 제약학적 조성물에는 무균 수성 용액 (여기서 물 용해성) 또는 분산액, 그리고 무균 주사가능 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 무균 분말이 포함된다. 이런 경우에, 조성물은 무균이어야 하고, 그리고 쉬운 주사가능성 (syringability)이 존재할 만큼 유체이어야 한다. 이것은 제조와 보관의 조건 하에 안정되어야 하고, 그리고 바람직하게는, 세균과 균류와 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보호될 것이다. 담체는 예로써, 물, 에탄올, 폴리올 (가령, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 그리고 이들의 적절한 혼합물을 내포하는 용매 또는 분산 매체일 수 있다. 적절한 유동성은 예로써, 레시틴과 같은 코팅의 이용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다. 본원에서 제시된 치료적 방법에서 이용하기 적합한 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16th ed. (1980)에서 설명된다.

미생물의 작용의 예방은 다양한 항생제와 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 치메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장성제 (isotonic agent), 예를 들면, 당류, 다가알코올, 예를 들면, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물 내에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물 내에 포함시킴에 의해 달성될 수 있다.

어떤 경우든, 무균 주사가능 용액은 적절한 용매에서 필요한 양의 활성 화합물 (가령, 그 자체로 또는 다른 활성 작용제와 공동으로 항-α-항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체)을 본원에서 열거된 한 가지 성분 또는 성분의 조합과 통합하고, 그 이후에 필요에 따라 멸균 여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매체 및 앞서 열거된 것들로부터 필요한 다른 성분을 내포하는 무균 운반제 내로 활성 화합물을 통합함으로써 제조된다. 무균 주사가능 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조와 동결 건조인데, 이것은 미리 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 + 원하는 임의의 추가 성분의 분말을 산출한다. 주사용 제조물은 당분야에 공지된 방법에 따라 처리되고, 앰플, 백, 병, 주사기 또는 바이알과 같은 용기 내로 채워지고, 그리고 무균 조건하에 밀봉된다. 게다가, 이들 제조물은 키트의 형태로 포장되고 판매될 수 있다. 이런 제조 물품은 연관된 조성물이 질환 또는 장애를 앓거나, 또는 질환 또는 장애의 소인이 있는 개체를 치료하는데 유용하다는 것을 지시하는 라벨 또는 포장 삽입물을 가질 것이다.

비경구 제제는 단일 볼러스 분량, 주입 또는 부하 볼러스 분량, 그 이후에 유지 분량일 수 있다. 이들 조성물은 특정한 고정된 또는 가변 간격에서, 예를 들면, 하루 1회, 또는 "필요에 따른" 기초에서 투여될 수 있다.

본원에서 제시된 바와 같이, 일정한 제약학적 조성물은 예로서, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 비롯한 허용되는 제형에서 경구 투여될 수 있다. 일정한 제약학적 조성물은 또한, 비강 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 이런 조성물은 벤질 알코올 또는 기타 적절한 보존제, 생물학적이용효율을 증강하기 위한 흡수 촉진제, 및/또는 기타 전통적인 용해 또는 분산 작용제를 이용하여, 식염수에서 용액으로서 제조될 수 있다.

단일 제형을 생산하기 위해 담체 재료와 합동되는 항-α-시누클레인 항체, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체의 양은 치료되는 대상 및 특정 투여 방식에 따라 변할 것이다. 조성물은 단일 분량으로, 복수 분량으로 또는 주입의 경우에 확립된 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 투약 섭생은 또한, 최적의 요망된 반응 (가령, 치료적 또는 예방적 반응)을 제공하기 위해 조정될 수 있다.

***

본 발명의 실시는 달리 지시되지 않으면, 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 유전자도입 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 그리고 면역학의 전통적인 기술을 이용할 것이고, 이들은 당분야의 지식 범위 내에 있다. 이런 기술은 기존 문헌에서 상세하게 설명된다. 예로서, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., ed., Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1992), DNA Cloning, D. N. Glover ed., Volumes I and II (1985); Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait ed., (1984); Mullis et al. U.S. Pat. No: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Transcription And Translation, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Culture Of Animal Cells, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., (1987); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, (1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc., N.Y.; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, Caner and Walker, eds., Academic Press, London (1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV, D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., (1986); Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); 그리고 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)를 참조한다.

항체 조작의 일반적인 원리는 Antibody Engineering, 2nd edition, C.A.K. Borrebaeck, Ed., Oxford Univ. Press (1995)에서 진술된다. 단백질 조작의 일반적인 원리는 Protein Engineering, A Practical Approach, Rickwood, D., et al., Eds., IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng. (1995)에서 진술된다. 항체 및 항체-합텐 결합의 일반적인 원리는 Nisonoff, A., Molecular Immunology, 2nd ed., Sinauer Associates, Sunderland, MA (1984); 그리고 Steward, M.W., Antibodies, Their Structure and Function, Chapman and Hall, New York, NY (1984)에서 열거된다. 부가적으로, 당분야에서 공지되고 구체적으로 설명되지 않은 면역학에서 기준 방법은 전반적으로, Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites et al. (eds) , Basic and Clinical -Immunology (8th ed.), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994), 그리고 Mishell and Shiigi (eds), Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Co., New York (1980)에서와 같이 수행된다.

면역학의 일반 원리를 진술하는 기준 참고문헌에는 Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein, J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, New York (1982); Kennett, R., et al., eds., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, New York (1980); Campbell, A., "Monoclonal Antibody Technology" in Burden, R., et al., eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Elsevere, Amsterdam (1984), Kuby Immunnology 4^th ed. Ed. Richard A. Goldsby, Thomas J. Kindt and Barbara A. Osborne, H. Freemand&Co.(2000); Roitt, I., Brostoff, J. and Male D., Immunology 6^th ed. London: Mosby (2001); Abbas A., Abul, A. and Lichtman, A., Cellular and Molecular Immunology Ed. 5, Elsevier Health Sciences Division (2005); Kontermann and Dubel, Antibody Engineering, Springer Verlan (2001); Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press (2001); Lewin, Genes VIII, Prentice Hall (2003); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); Dieffenbach and Dveksler, PCR Primer Cold Spring Harbor Press (2003)가 포함된다.

실시예

전통적인 방법, 예를 들면, 본원에서 이용된 것들의 상세한 설명은 인용된 기존 문헌에서 찾아볼 수 있다. 하기에 달리 지시되지 않으면, α-시누클레인-특이적 B 세포의 확인, 그리고 관심되는 특이성을 보이는 α-시누클레인 항체의 분자 클로닝뿐만 아니라 이들의 재조합 발현과 기능적 특징화는 WO2008/081008로서 공개된 국제 출원 PCT/EP2008/000053, 그리고 WO2010/069603로서 공개된 국제 출원 PCT/EP2009/009186의 실시예와 보충 방법 섹션에서 설명되었거나 또는 설명된 바와 같이 수행될 수 있고, 이들의 개시 내용은 본원에 전체로서 참조로서 편입된다.

실시예 1:

12F4 투여 시에, 인간 α-시누클레인을 과다발현하는 유전자도입 생쥐에서 용량 의존성 인간 α-시누클레인 혈장 스파이크

본 실시예는 12F4 항체의 주사 후, 인간 α-시누클레인을 과다발현하는 유전자도입 생쥐에서 생쥐 혈장 내에 인간 α-시누클레인 수준의 결정을 설명한다. 인간 야생형 (wt) α-시누클레인을 과다발현하는 3과 1/2월령 유전자도입 생쥐 (PDGFβ-h[wt] α-시누클레인; 즉, D-라인; Masliah et al., Science, 287(5456):1265-9 (2000))는 0, 0.3, 1, 3, 10 또는 30 mg/kg 12F4 항체의 단일 분량이 복막내 주사되었다. 기능적 재조합 단일클론 항체 12F4와 키메라 12F4는 CHO 세포 (또는 인간 또는 생쥐 기원의 임의의 다른 적절한 수용자 세포주) 내로 Ig-중쇄 발현 벡터 및 카파 또는 람다 Ig-경쇄 발현 벡터의 공동-형질감염 시에 획득되었다. 재조합 단일클론 항체는 WO2008/081008에서 설명된 바와 같이 기준 단백질 A 칼럼 정제를 이용하여 조건 배지로부터 차후 정제되었다. 재조합 인간 단일클론 항체는 일시적으로 또는 안정적으로 형질감염된 세포를 이용하여 무제한된 양으로 생산될 수 있다. 키메라 12F4 항체는 인간 가변 중쇄와 경쇄의 생식 계열 (GL) 서열로 조정되는, Ig-가변 영역의 N-말단에서 프라이머 유도된 돌연변이를 갖고 (WO2010/069603 참조), 그리고 조정된 인간 가변 도메인이 생쥐 IgG2a 불변 영역에 융합된 키메라 분자로서 발현되었다.

D-라인 유전자도입 α-시누클레인 생쥐는 기준 사육 조건 하에, 뒤바뀌는 12시간:12시간 명/암 주기에서 유지되고, 사료와 물에 자유롭게 접근하였다. 치료 군은 연령과 성별에 대해 균형되었다. 주사 후 24시간 시점에, 혈장 시료가 준비되고, 그리고 인간 α-시누클레인의 혈장 농도가 샌드위치 ELISA (Invitrogen, USA)에 의해 측정되었다. 혈장 시료는 1:4 희석되고, 그리고 기준은 wt 생쥐의 1:4 혈장으로 희석 완충액에서 준비되었다. 결과는 ELISA 판독 시에 12F4 항체의 영향에 대해 제어되었다. 12F4 항체 혈장 수준은 공지된 농도의 재조합 12F4를 기준으로서 이용한 인간 Fcg 포획 ELISA에 의해 측정되었다. 기준은 야생형 생쥐로부터 희석된 혈장을 내포하는 PBS에서 준비되었다.

인간 α-시누클레인의 혈장 수준은 운반제 대조와 비교할 때, 1, 3, 10 또는 30 mg/kg 12F4 항체의 단일 분량 후 유의미하게 증가하였다. 혈장 인간 α-시누클레인에서 증가는 유의미하게 용량 의존성이다 (도 1A-B). 인간 α-시누클레인의 유의미한 수준은 운반제 단독으로 치료된 생쥐에서 전혀 검출되지 않았다 (도 1B).

실시예 2: α-시누클레인 혈장 스파이크와 12F4 혈장 농도의 시간 경과

본 실시예는 시간의 흐름에서 측정된, 인간 α-시누클레인을 과다발현하는 유전자도입 생쥐에서 생쥐 혈장 내에 인간 α-시누클레인 수준과 12F4 항체 수준에서 변화의 시간 경과를 설명한다. 인간 α-시누클레인 A53T를 과다발현하는 8월령 유전자도입 생쥐 (Prp-h[A53T] α-시누클레인] (Giasson et al., Neuron, 34: 521-533 (2001))는 5 mg/kg 12F4 항체의 단일 분량이 복막내 주사되고, 그리고 혈장 시료가 주사 후 0, 1, 24, 72와 168시간 시점에서 수집되었다. 혈장 인간 α-시누클레인은 실시예 1에서 설명된 바와 같이 ELISA에 의해 정량되었다. 도 2는 혈장 인간 α-시누클레인이 1시간 시점에 이미 최고점에 도달하고, 이후 시간의 흐름에서 감소한다는 것을 보여준다. 다른 한편, 12F4 항체의 최고 수준은 24시간 시점에서 관찰되었고, 그리고 12F4 혈장 수준은 인간 α-시누클레인 수준보다 더욱 느리게 감소하는 것으로 나타났다.

실시예 3: 인간 α-시누클레인을 과다발현하는 유전자도입 생쥐의 단기 고용량 12F4 치료는 혈장 인간 α-시누클레인 수준과 상관하는 뇌 인간 α-시누클레인 수준을 감소시킨다.

본 실시예는 12F4 항체로 주사 후, 뇌 시료에서 인간 α-시누클레인 수준의 결정을 설명한다. 인간 야생형 α-시누클레인을 과다발현하는 3과 1/2월령 유전자도입 생쥐 (PDGFβ-h[wt] α-시누클레인; D-라인]는 8일 이내에 (첫 주사 후 72, 144와 192시간) 12F4 항체의 4회 50 mg/kg 분량이 복막내 주사되었다. 최종 주사 후 24시간 시점에, 동물은 희생되고 PBS로 관류되었다. 피질과 해마는 PBS에서 균질화되고, 그리고 가용성 (PBS-가용성)과 불용성 (PBS-불용성) 뇌 분획물이 분별 원심분리에 의해 준비되었다. 구체적으로, 뇌는 이전되고, 절개되고, 그리고 -80℃에서 동결되었다. 동결된 뇌 조직은 다운스 균질화기 (500 rpm, 30 스트로크) 및 1분 동안 초음파처리를 이용하여, 10 볼륨 (v/w)의 PBS에서 균질화되었다. 세포 잔해는 5분 (4℃) 동안 5000 g에서 원심분리에 의해 제거되었다. 상층액 (SN)은 1시간 (4℃) 동안 35000 rpm (Ti51 rotor; Beckman-Coulter)에서 원심분리되었다. 결과의 SN은 가용성 분획물로 명명되었다. 펠릿은 1% Trition PBS에서 재현탁되고 초음파처리 (3x 1분)되었다. 이러한 분획물은 불용성 분획물로 명명되었다.

양쪽 분획물에서 인간 α-시누클레인 수준은 샌드위치 ELISA (Invitrogen, USA)에 의해 정량되고 단백질 함량에 정규화되었다. 도 3A에서 도시된 바와 같이, 12F4 치료된 생쥐의 피질 가용성 인간 α-시누클레인 수준은 유의미하게 34% 감소하였다 (12F4의 경우에 190 ± 29 μg/g 대 운반제 대조의 경우에 288 ± 36 μg/g, n=10, p<0.05, 스튜던트 검증). 유사하게, 단기 12F4 치료 후, 가용성 해마 인간 α-시누클레인의 33% 감소 (도 3B)-(12F4의 경우에 119 ± 22 μg/g 대 운반제 대조의 경우에 178 ± 30 μg/g, n=9-10, p=0.14, 스튜던트 검증), 그리고 불용성 해마 인간 α-시누클레인의 26% 감소 (도 3C)-(12F4의 경우에 23 ± 3 μg/g 대 운반제 대조의 경우에 31 ± 6 μg/g, n=9-10, p=0.29, 스튜던트 검증)가 관찰되었다. 이들 결과는 12F4로 단기 치료가 인간 α-시누클레인을 과다발현하는 유전자도입 생쥐에서 뇌 α-시누클레인 병리의 감소를 유발한다는 것을 증명한다.

관찰된 인간 α-시누클레인 혈장 상승이 뇌 α-시누클레인 병리에 연계되는 지를 확인하기 위해, 혈장 인간 α-시누클레인 수준은 뇌 인간 α-시누클레인 수준에 대비하여 플롯팅되었다. 단기 12F4 치료 후, 혈장 인간 α-시누클레인 수준 및 가용성 피질 인간 α-시누클레인 수준 (도 4A), 가용성 해마 인간 α-시누클레인 수준 (도 4B), 그리고 불용성 해마 인간 α-시누클레인 수준 (도 4C) 사이에 고도로 유의미한 상관이 존재하였다. 운반제 치료 시에 혈장과 뇌 α-시누클레인 사이에 상관이 관찰되지 않았다.

실시예 4: 인간 α-시누클레인을 과다발현하는 유전자도입 생쥐의 장기 12F4 치료 후 혈장과 뇌 인간 α-시누클레인 수준 사이에 상관

본 실시예는 6개월 동안 12F4 항체로 주1회 주사 후 뇌 시료에서 인간 α-시누클레인 수준의 결정을 설명한다.

인간 wt α-시누클레인 A30P를 과다발현하는 6월령 유전자도입 생쥐 (Thy1-h[A30P]-α-시누클레인) (Kahle et al., Am J Pathol., 159(6): 2215-2225 (2001))는 6개월 동안 10 mg/kg 키메라 12F4가 주1회 복막내 주사되었다. 혈장과 뇌 시료는 최종 주사 후 24시간 시점에 준비되었다. 피질/해마는 PBS에서 함께 균질화되고, 그리고 가용성 (PBS-가용성)과 불용성 (PBS-불용성) 뇌 분획물은 실시예 3에서 설명된 바와 같이 분별 원심분리에 의해 준비되었다. 양쪽 분획물에서 인간 α-시누클레인 수준은 실시예 3에서 설명된 바와 같이 ELISA에 의해 정량되고 단백질 함량에 정규화되었다. 혈장 인간 α-시누클레인 수준 (도 5A) 및 키메라 12F4 수준 (도 5B)은 ELISA에 의해 측정되었다. 혈장 인간 α-시누클레인 수준은 실시예 1에서 설명된 바와 같이 측정되고, 그리고 키메라 12F4 혈장 수준은 공지된 농도의 재조합 키메라 12F4를 기준으로서 이용한 직접 α-시누클레인 ELISA에 의해 측정되었다.

혈장과 뇌 α-시누클레인이 키메라 12F4로 장기 치료 시에 상관하는 지를 확인하기 위해, 혈장 인간 α-시누클레인 수준은 인간 뇌 α-시누클레인 수준에 대비하여 플롯팅되었다. 키메라 12F4로 6개월 동안 장기 치료 후, 인간 α-시누클레인을 과다발현하는 유전자도입 생쥐의 혈장과 뇌 a-시누클레인 수준 사이에 유의미한 상관이 존재하였다. (도 5C).

실시예 5: 12F4 투여 시에, 시노몰구스 원숭이에서 α-시누클레인 뇌척수액 (CSF) 스파이크

본 실시예는 12F4 투여 시에, 시노몰구스 원숭이에서 혈청과 뇌척수액 (CSF) 내에 12F4 수준뿐만 아니라 CSF 내에 내인성 α-시누클레인 수준의 결정을 설명한다. 3마리 수컷 미경험 시노몰구스 원숭이는 10 mg/kg 12F4의 단일 분량이 정맥내 주사되었다. 동물은 12F4 투여에 앞서 1 내지 12분, 그리고 투약후 2시간 CSF 시료 수집 동안 굶겨졌다. 혈액 시료 (대략 0.5 ml/시료)는 투약후 0.5, 2, 5, 24, 48, 72, 96, 168, 240, 336, 408, 504, 672와 840시간 시점에서 대퇴 정맥/동맥으로부터 수집되었다. 시료는 적어도 30분 동안 응고하도록 허용되고, 그리고 각 간격에서 시료 수집의 완결 이후에, 대기조건 하에 원심분리되었다. 결과의 혈청은 분리되고, 그리고 분석을 위해 드라이아이스 위에 놓여 수송될 때까지 -50 내지 -90°에서 동결 보관되었다. 12F4 혈청 수준은 샌드위치 ELISA (Covance)에 의해 측정되었다.

12F4와 내인성 α-시누클레인 농도 역시 투약후 다양한 시점에서 거대수조로부터 수집된 CSF 시료에서 ELISA (Covance)에 의해 측정되었다. CSF 시료 수집에 앞서, 동물은 0.1 mg/kg 아세프로마진 말리에이트의 근육내 (IM) 주사, 필요하면 추가의 유지 분량으로 진정되었다. 마취는 20 mg/kg 케타민의 IM 주사로 유도되었다. 머리의 뒷부분은 거대수조에 접근을 위해 제모되고, 그리고 접근 부위는 무균 필드 내에 클로르헥시딘 스크럽 및 클로르헥시딘 용액으로 준비되었다. 동물은 외측횡와위 (lateral recumbent position)에 놓이고, 그리고 머리는 턱이 흉부에 얹힐 때까지 앞으로 당겨졌다. 무균 기술을 이용하여, 오버 더 니들 카테터 (over the needle catheter)가 거대수조에 접근하는데 이용되었다. 동물은 0.01 mg/kg 부프레노르핀이 각 시료 수집 일에 대략 6 내지 9시간 마다 (CSF 수집에 앞서 시작됨), 하루 3회 IM 투여되었다. 마취 및 CSF 시료 추출 이후에, 동물은 회복 동안, 심혈관/호흡 억제, 저체온, 그리고 수술 부위로부터 과도한 출혈을 비롯한 생리적 교란에 대해 면밀하게 모니터링되었다. CSF 시료 (대략 0.2 mL/시료)는 투약후 2, 24, 72, 168, 336, 504와 672시간 시점에서, 거대수조로부터 수집되고 얼음 위에 놓였다. 시료는 분석을 위해 드라이아이스 위에 놓여 수송될 때까지 -50 내지 -90℃에서 동결 보관되었다.

CSF/혈청 12F4 비율은 인간 IgG 항체에 대해 예상된 바와 같이 약 0.1 %이었다. CSF α-시누클레인은 12F4 치료 시에 약 5-배 증가하였다. (도 6).

실시예 6: 유전자도입 α-시누클레인 생쥐에서 생체내 미소투석

본 실시예는 12F4 투여 시에, 유전자도입 α-시누클레인 A53T 생쥐에서 혈장과 뇌 간질액 (ISF) 내에 α-시누클레인 수준의 결정을 설명한다. 유전자도입 α-시누클레인 생쥐 ISF에서 생체내 미소투석은 12F4 또는 운반제 대조 (대조 IgG 항체)의 투여 시에 수행되었다. 구체적으로, 가이드 캐뉼러가 이소플루란 마취 (4-2.5%) 하에 6-9월령 A53T α-시누클레인 유전자도입 생쥐 (B6;C3-Tg(PrP-SNCA*A53T)83Vle/J)의 줄무늬체 내에 뇌정위 이식되었다. 머리는 제모되고, 그리고 피부는 두개골을 노출하기 위해 무균 외과용 메스로 절단되었다. Paxinos와 Franklin의 지도책 (The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Second Edition (2004))에 따라 오른쪽 줄무늬체 위에 보링 구멍이 만들어졌다 (좌표, AP = +0.5 mm, ML = -2.2 mm, DV = -2.4 mm). CMA-12 가이드 캐뉼러 (CMA Microdialysis AB, Sweden)가 삽입되고 스테인리스강 나사 및 치과용 시멘트로 두개골에 고정되었다. 생쥐는 뇌정위 장치로부터 이전되고 개별 우리에서 회복하도록 허용되었다. 수술 후 5일 시점에, 생쥐는 미소투석 우리(들)로 이전되었다. CMA-12 맞춤 제작된 프로브 (2 mm, 100 kDa 컷-오프)가 삽입되고 0.6 μl/분의 불변 유속에서 CMA 펌프에 연결되었다. 관류가 BSA를 삼투 작용제로서 내포하는 인공 CSF에서 수행되었다. 시료 수집에 앞서, 프로브는 동일한 유속에서 4-20시간 동안 평형하도록 허용되었다. 기준선 시료는 2시간 동안 거의 2시간 마다 수집되었다. 12F4 또는 운반제 대조는 30 mg/kg의 단일 분량에서 복막내 주사되었다. 주사 이후에, 시료는 대략 24시간 동안 1시간 마다 수집되었다. 모든 시료는 냉동된 분획물 수집기를 이용하여 수집되고, 그리고 사내 초-민감성 α-시누클레인 샌드위치 ELISA (Emmanouilidou et al., PLoS ONE 6(7): e22225 (2011))에 의해 분석될 때까지 -80℃에서 보관되었다. 혈장 시료는 또한, 투약전 및 투약후 2와 24시간 시점에 수집되고, 그리고 이후, 인간 α-시누클레인 특이적 샌드위치 ELISA (Invitrogen, Carlsbad CA)에 의해 분석되었다.

12F4 투여 후 2-3시간 시점에, 세포외, ISF α-시누클레인에서 대략 60% 감소가 있었다. 운반제 대조는 미소투석물에서 ISF α-시누클레인 수준을 변화시키지 못하였다. (도 7).

실시예 7: AAV-α-시누클레인 쥐 모델에서 뇌척수액 (CSF) α-시누클레인 농도에 대한 항-α-시누클레인 항체의 효과

CSF α-시누클레인 농도에 대한 항-α-시누클레인 항체의 효과는 아데노-연관된 바이러스 (AAV)-α-시누클레인 쥐 모델에서 평가될 것이다. 야생형 인간 α-시누클레인, 또는 가족성 파킨슨병과 연관되는 인간 α-시누클레인 서열 변이체 (가령, A53T 또는 A30P) 중에서 한 가지를 발현하는 AAV 벡터가 창출될 것이다. AAV-α-시누클레인 벡터는 성체 쥐 뇌의 특정 영역 (가령, 줄무늬체, 피질 또는 해마) 내로 또는 신생아 쥐의 측뇌실 내로 주입될 것이다. 인간 α-시누클레인의 농도가 뇌에서 축적하도록 1개월 내지 수개월의 기간이 허용될 것이다. 그 시점에서, 쥐는 복막내 또는 정맥내 투여에 의해 항-α-시누클레인 항체로 치료되고, 그리고 다양한 시점에서 CSF의 시료가 채취될 것이다. α-시누클레인의 농도는 CSF 시료에서 ELISA에 의해 측정될 것이다.

***

본 발명은 발명의 개별 양상의 단순한 예시로서 의도되는 설명된 특정 구체예에 의해 범위에서 한정되지 않고, 그리고 기능적으로 등가인 임의의 조성물 또는 방법은 본 발명의 범위 내에 있다. 실제로, 본원에서 도시되고 설명된 것들 이외에 본 발명의 다양한 변형은 상기 상세한 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이런 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.

본 명세서에서 언급된 모든 간행물과 특허 출원은 마치 각 개별 간행물 또는 특허 출원이 참조로서 편입되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시되는 것과 동일한 정도로 본원에서 참조로서 편입된다.

SEQUENCE LISTING <110> BIOGEN IDEC INTERNATIONAL NEUROSCIENCE GMBH WEIHOFEN, Andreas ENGBER, Thomas GRIMM, Jan <120> USE OF AN ANTI-ALPHA-SYNUCLEIN ANTIBODY TO DIAGNOSE AN ELEVATED LEVEL OF ALPHA-SYNUCLEIN IN THE BRAIN <130> 2159.356PC01 <140> To be assigned <141> Herewith <150> 61/554,924 <151> 11-02-2011 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Alpha-synuclein <400> 1 Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys 20 25 30 Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val 35 40 45 Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr 50 55 60 Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 70 75 80 Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys 85 90 95 Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile 100 105 110 Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro 115 120 125 Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala 130 135 140 <210> 2 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region (VH) <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Glu Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Asp Phe Glu Lys Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Lys Ser Thr Ala Asp Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Ala 50 55 60 Pro Val Glu Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asp Ser Arg Asn Met 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Ser Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 3 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region (VL) <400> 3 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Glu Ala Leu Pro Met Gln Phe Ala 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Val Ile Val Val Tyr 35 40 45 Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Pro Asp Ser Thr Asn Thr Tyr 85 90 95 Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> complementarity determining region-1 (VHCDR1) <400> 4 Lys Ala Trp Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> complementarity determining region-2 (VHCDR2) <400> 5 Arg Ile Lys Ser Thr Ala Asp Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Ala Pro 1 5 10 15 Val Glu Gly <210> 6 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> complementarity determining region-3 (VHCDR3) <400> 6 Ala His 1 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> complementarity determining region-1 (VLCDR1) <400> 7 Ser Gly Glu Ala Leu Pro Met Gln Phe Ala His 1 5 10 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> complementarity determining region-2 (VLCDR2) <400> 8 Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser 1 5 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> complementarity determining region-3 (VLCDR3) <400> 9 Gln Ser Pro Asp Ser Thr Asn Thr Tyr Glu Val 1 5 10

Claims (32)

1. 검사 개체의 뇌에서 상승된 수준의 α-시누클레인을 진단을 위한 정보를 수집하는 방법에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
   (a) 혈장 시료에서 α-시누클레인의 수준을 검정하고, 여기서 혈장 시료는 검사 개체에 각각 서열번호: 4, 서열번호: 5, 및 서열 번호: 6 의 아미노산 서열을 갖는 VH 의 상보성 결정 영역(CDRs)인, VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3 을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열번호: 7, 서열번호: 8, 및 서열 번호: 9 의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3 을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 말초 투여 이후에 특정된 시간 간격에서 검사 개체로부터 이전에 획득된 것이고;
   (b) 혈장 시료에서 α-시누클레인의 검정된 수준을 참고 기준에 비교하고; 여기서 혈장 시료에서 α-시누클레인의 수준 및 참고 기준 사이에 차이 또는 유사성은 검사 개체의 뇌에서 α-시누클레인의 수준과 상관한다.
2. 검사 개체의 뇌에서 상승된 수준의 α-시누클레인을 진단을 위한 정보를 수집하는 방법에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
   (a) CSF 시료에서 α-시누클레인의 수준을 검정하고, 여기서 CSF 시료는 검사 개체에 각각 서열번호: 4, 서열번호: 5, 및 서열 번호: 6 의 아미노산 서열을 갖는 VH 의 상보성 결정 영역(CDRs)인, VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3 을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열번호: 7, 서열번호: 8, 및 서열 번호: 9 의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3 을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 말초 투여 이후에 특정된 시간 간격에서 검사 개체로부터 이전에 획득된 것이고;
   (b) CSF 시료에서 α-시누클레인의 검정된 수준을 참고 기준에 비교하고; 여기서 CSF 시료에서 α-시누클레인의 수준 및 참고 기준 사이에 차이 또는 유사성은 검사 개체의 뇌에서 α-시누클레인의 수준과 상관한다.
3. 청구항 1에 있어서, 혈장 시료에서 α-시누클레인의 수준을 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 투여에 앞서 검사 개체로부터 획득된 혈장 시료와 비교하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 청구항 2에 있어서, CSF 시료에서 α-시누클레인의 수준을 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 투여에 앞서 검사 개체로부터 획득된 CSF 시료와 비교하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 청구항 1 내지 4중 어느 한 항에 있어서, 참고 기준은 1명 또는 그 이상의 대조 개체에서 α-시누클레인의 측정된 수준을 포함하고, 여기서 대조 개체에는 정상적인 건강한 개인, 그리고 다양한 심각도의 시누클레인병증을 앓는 개인이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 시누클레인병증성 질환에 대해 치료되는 개체의 뇌에서 α-시누클레인 수준을 추적하는 방법에 있어서, 개체의 혈장에서 α-시누클레인의 수준을 검정하는 것을 포함하고, 상기 혈장은 각각 서열번호: 4, 서열번호: 5, 및 서열 번호: 6 의 아미노산 서열을 갖는 VH 의 상보성 결정 영역(CDRs)인, VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3 을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열번호: 7, 서열번호: 8, 및 서열 번호: 9 의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3 을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 말초 투여 이후에 특정된 시점에서 이전에 획득된 혈장이고; 그리고 여기서 개체의 혈장에서 α-시누클레인 수준은 개체의 뇌에서 수준과 상관하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 시누클레인병증성 질환에 대해 치료되는 개체의 뇌에서 α-시누클레인 수준을 추적하는 방법에 있어서, 개체의 CSF에서 α-시누클레인의 수준을 검정하는 것을 포함하고, 상기 CSF는 각각 서열번호: 4, 서열번호: 5, 및 서열 번호: 6 의 아미노산 서열을 갖는 VH 의 상보성 결정 영역(CDRs)인, VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3 을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열번호: 7, 서열번호: 8, 및 서열 번호: 9 의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3 을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 말초 투여 이후에 특정된 시점에서 이전에 획득된 CSF이고; 그리고 여기서 개체의 CSF에서 α-시누클레인 수준은 개체의 뇌에서 수준과 상관하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 청구항 6에 있어서, 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 추가의 말초 투여 이후에 특정된 시점에서 개체의 혈장에서 α-시누클레인의 수준을 검정하고, 따라서 개체의 뇌에서 α-시누클레인 수준에서 변화를 시간의 흐름에서 플롯팅하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 청구항 7에 있어서, 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 추가의 말초 투여 이후에 특정된 시점에서 개체의 CSF에서 α-시누클레인의 수준을 검정하고, 따라서 개체의 뇌에서 α-시누클레인 수준에서 변화를 시간의 흐름에서 플롯팅하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 청구항 1 내지 4 및 6 내지 9중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL를 포함하는 참고 항체와 동일한 α-시누클레인 에피토프에 특이적으로 결합하고, 여기서 VH는 서열 번호: 2를 포함하고, 그리고 VL는 서열 번호: 3을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 청구항 1 내지 4 및 6 내지 9중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH와 VL를 포함하는 참고 항체가 α-시누클레인에 결합하는 것을 경쟁적으로 저해하고, 여기서 VH는 서열 번호: 2를 포함하고, 그리고 VL은 서열 번호: 3을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 청구항 1 내지 4 및 6 내지 9중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 2의 VH 아미노산 서열 및 서열 번호: 3의 VL 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 청구항 1 내지 4 및 6 내지 9중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일 사슬 Fv 단편 (scFv), F(ab') 단편, F(ab) 단편, 또는 F(ab')₂ 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 청구항 1 내지 4 및 6 내지 9중 어느 한 항에 있어서, 투여는 항체의 정맥내 주사에 의한 것을 특징으로 하는 방법.
15. 청구항 1 내지 4 및 6 내지 9중 어느 한 항에 있어서, 항체는 인간 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
16. 청구항 1 내지 4 및 6 내지 9중 어느 한 항에 있어서, 특정된 시간 간격은 1주보다 적은 것을 특징으로 하는 방법.
17. 청구항 16에 있어서, 특정된 시간 간격은 24시간보다 적거나 또는 24시간과 동등한 것을 특징으로 하는 방법.
18. 청구항 17에 있어서, 특정된 시간 간격은 3시간보다 적거나 또는 3시간과 동등한 것을 특징으로 하는 방법.
19. 청구항 6 내지 9중 어느 한 항에 있어서, 시누클레인병증성 질환은 파킨슨병 (PD), 파킨슨병 치매 (PDD), 루이소체 치매 (DLB), 알츠하이머병의 루이소체 변형체 (LBVAD), 다계통 위축증 (MSA), 순수 자율신경 실조 (PAF), 뇌 철분 축적을 가진 신경변성 1형 (NBIA-I), 알츠하이머병, 픽병, 유년-발병 전반적 축삭퇴행위축 (할러포르덴-스파츠병), 근위축성 측삭 경화증, 외상성 뇌 손상 및 다운 증후군으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 삭제
27. 삭제
28. 삭제
29. 삭제
30. 삭제
31. 삭제
32. 삭제

Images