MX2014005378A - Uso de anticuerpo anti-alfa-sinucleina para diagnosticar nivel elevado de alfa-sinucleina en el cerebro. - Google Patents

Abstract

La presente descripción se relaciona con el uso de un anticuerpo anti-a-sinucleino para diagnosticar un nivel elevado de a-sinucleino en el cerebro. Específicamente, la descripción se relaciona con el método para valorar los niveles de a-sinucleina en el plasma sanguíneo o CFS después de la administración del sujeto de prueba del anticuerpo anti-a-sinucleíno o fragmento de enlace del antígeno del mismo, el cual puede enlazar la a-sinucleina del cerebro a la sangre o del cerebro a CSF.

Description

USO DE ANTICUERPO ANTI-ALFA-SINUCLEINA PARA DIAGNOSTICAR NIVEL ELEVADO DE ALFA-SINUCLEINA EN EL CEREBRO Campo de la Invención Esta descripción se refiere al uso de anticuerpo anti -a-sinucleína para diagnosticar un nivel elevado de a-sinucleína en el cerebro. Específicamente, la descripción se refiere al método de evaluación de los niveles de a-sinucleína en el plasma sanguíneo o líquido cefalorraquídeo (CSF, por sus siglas en inglés) después de la administración al sujeto de prueba de un anticuerpo anti -a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo, que puede unirse a a-sinucleína con actividad suficiente para alterar la efluencia neta de a-sinucleína del cerebro a la sangre o del cerebro al CSF.

Antecedentes de la Invención El cerebro de los mamíferos se separa de la sangre por la barrera de sangre-cerebro (BBB, por sus siglas en inglés) localizado en los capilares del cerebro y membranas pia-subaracnoidea y la barrera del fluido cefalorraquídeo sanguíneo (CSF) ubicada en el plexo coroideo. La a-sinucleína es relativamente abundante en el cerebro en condiciones no patológicas. Es una proteína nativa desplegada presente principalmente en el citosol . Desempeña un papel esencial en la transmisión sináptica y la plasticidad sináptica mediante el aumento de la liberación del transmisor desde la terminal REF: 248381 presináptica . (Liu et al., EMBO J. 23:4506-4516 (2004)). Las mutaciones en a-sinucleína se asocian a casos familiares poco comunes de la enfermedad de aparición temprana de Parkinson, y la conversión de a-sinucleína de su forma soluble a la forma insoluble agregada, es uno de los eventos clave en la patogénesis de las enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Parkinson, la demencia con cuerpos de Lewy (DLB, por sus siglas en inglés) , y varias otras enfermedades neurodegenerativas. (Dawson et al, Science 302:819-822 (2003), Bennett et al, Pharmacol Ther. 105:311-331 (2005), George, JM., Genome Biol . 3(1): estudios 3002. l-estudios 3002.6 (2002)). Además, tanto la a-sinucleína monomérica y oligomérica se han encontrado en el líquido cefalorraquídeo (CSF) y suero de pacientes con enfermedad de Parkinson, ya que aparentemente la a-sinucleína e incluso sus especies agregadas puede cruzar la barrera sangre-cerebro. (El-Agnaf et al, FASEB J. 20:419-425 (2006), Tokuda et al., Biochem Biophys Res Commun. 349:162-166 (2006), Lee et al, J Neural Transm. 113: 1435-1439 (2006), Mollenhauer et al., Exp Neurol. 213:315-325 (2008), El-Agnaf et al., FASEB J. 17:1945-1947 (2003), Li et al., Exp Neurol 204 : 583-588 (2007) .

Los estudios de inmunización en modelos de ratón con enfermedad de Parkinson muestran que los anticuerpos monoclonales de ratón contra la a-sinucleína pueden reducir la acumulación de agregados intracelulares de a-sinucleína (Masliah et al, Neuron, 46: 857-868 (2005); Masliah et al . , PLoS One, 6 (4) : el9338 (2011) apoyando la idea de que los anticuerpos que neutralizan los agregados neurotóxicos sin interferir con funciones beneficiosas de a-sinucleína monomérica pueden ser terapéuticos útiles. Sin embargo, la utilidad terapéutica y de diagnóstico de los anticuerpos basado en murinos en el humano se ve obstaculizada por la respuesta de anticuerpos de anti-ratón humano (HAMA, por sus siglas en inglés) en vista de su origen no humano.

Por consiguiente, es necesario desarrollar un método para evaluar a los pacientes para los niveles elevados de a-sinucleína en el cerebro.

Breve Descripción de la Invención Una modalidad se refiere a un método para diagnosticar un nivel elevado de a-sinucleína en el cerebro de un sujeto de prueba que comprende: (a) examinar el nivel de OÍ-sinucleína en una muestra de plasma sanguíneo obtenida del sujeto de prueba a un intervalo especificado después de la administración periférica al sujeto de prueba de un anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo pueden unirse a a-sinucleína con una afinidad suficiente para alterar la efluencia neta de a-sinucleína de cerebro a sangre; (b) comparar el nivel examinado de la a-sinucleína en el sujeto de prueba con un estándar de referencia; en el que la diferencia o la similitud entre el nivel de a-sinucleína en la muestra de plasma y el estándar de referencia se correlaciona con el nivel de a-sinucleína en el cerebro del sujeto de prueba.

También se describe un método para diagnosticar un nivel elevado de a-sinucleína en el cerebro de un sujeto de prueba que comprende: (a) proporcionar un anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo puede unir a-sinucleína con una afinidad suficiente para alterar la efluencia neta de a-sinucleína del cerebro a la sangre; (b) dirigir un profesional de la salud para administrar periféricamente el anticuerpo al sujeto de prueba y obtener una muestra de plasma sanguíneo del sujeto en un intervalo de tiempo especificado después de la administración; (c) examinar el nivel de a-sinucleína en la muestra de plasma sanguíneo; (d) comparar el nivel examinado de a-sinucleína en el sujeto de prueba con un estándar de referencia; en el que la diferencia o la similitud entre el nivel de la a-sinucleína en la muestra de plasma y el estándar de referencia se correlaciona con el nivel de a-sinucleína en el cerebro del sujeto de prueba.

También se describe un método para diagnosticar un nivel elevado de a-sinucleína en el cerebro de un sujeto de prueba que comprende: (a) administrar periféricamente un anticuerpo anti -a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo para el sujeto de prueba, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo pueden unirse a a-sinucleína con una afinidad suficiente para alterar la efluencia neta de la a-sinucleína del cerebro a la sangre; (b) obtener una muestra de plasma sanguíneo del sujeto de prueba en un intervalo de tiempo especificado después de la administración, y presentar la muestra para la determinación del nivel de la a-sinucleína ; (c) comparar el nivel de la -sinucleína en muestra de plasma sanguíneo con un nivel de referencia; en el que la diferencia o la similitud entre el nivel de la a-sinucleína en la muestra de plasma y el estándar de referencia se correlaciona con el nivel de la a-sinucleína en el cerebro del sujeto de prueba.

También se describe el método en el presente, que comprende además comparar el nivel de la a-sinucleína en la muestra de plasma de una muestra de plasma obtenida del sujeto de prueba antes de la administración del anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo.

En modalidades específicas, el estándar de referencia en el método anteriormente descrito comprende los niveles medidos de a-sinucleína en uno o más sujetos de control, en el que los sujetos de control incluyen individuos sanos normales e individuos con sinucleinopatías de diversa gravedad.

También se describe un método de seguimiento del nivel de a-sinucleína en el cerebro de un sujeto que está siendo tratado por una enfermedad sinucleinopática , que comprende examinar el nivel de -sinucleína en plasma sanguíneo del sujeto en un tiempo especificado después de la administración periférica de una anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo pueden unirse a a-sinucleína con una afinidad suficiente para alterar la efluencia neta de la a-sinucleína del cerebro a la sangre; y en el que el nivel de -sinucleína en el plasma sanguíneo del sujeto se correlaciona con el nivel en el cerebro del sujeto. En modalidades específicas, el método anteriormente descrito, comprende además examinar el nivel de -sinucleína en plasma sanguíneo del sujeto en un tiempo especificado después de administraciones periféricas adicionales del anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo, trazando con ello el cambio en el nivel a-sinucleína en el cerebro del sujeto con el tiempo.

Algunas modalidades incluyen el método como se describe en el presente documento, en el que el método está dirigido a diagnosticar un nivel elevado de a-sinucleína en el cerebro de un sujeto de prueba mediante el examen del nivel de a-sinucleína en una muestra de CSF obtenida del sujeto de prueba en intervalos de tiempo especificados siguientes a la administración de un anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo pueden unirse a a-sinucleína con una afinidad suficiente para alterar la efluencia neta de la a-sinucleína de cerebro a CSF, y en el que la diferencia o la similitud entre el nivel de la a-sinucleína en la muestra de CSF y el estándar de referencia se correlaciona con el nivel de la a-sinucleína en el cerebro del sujeto de prueba. Algunas modalidades incluyen el método como se describe en el presente, que comprende además comparar el nivel de la a-sinucleína en la muestra de CSF a una muestra de CSF obtenida del sujeto de prueba antes de la administración del anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento del mismo de unión al antígeno.

Algunas modalidades incluyen el método de seguimiento del nivel de a-sinucleína en el cerebro de un sujeto que está siendo tratado por una enfermedad sinucleinopática, que comprende examinar el nivel de -sinucleína en la muestra de CSF del sujeto en un momento determinado después de la administración periférica de una anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo pueden unirse a a-sinucleína con una afinidad suficiente para alterar la efluencia neta de la -sinucleína del cerebro a CSF; y en donde el nivel de a-sinucleína en el CSF del sujeto se correlaciona con el nivel en el cerebro del sujeto.

Algunas modalidades incluyen el método como se describe en el presente documento, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se une específicamente al mismo epítopo de a-sinucleína de un anticuerpo de referencia que comprende VH y VL, en el que la VH comprende la SEQ ID NO: 2 y la VL comprende la SEQ ID NO: 3. En algunas modalidades?, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de los mismos inhibe competitivamente un anticuerpo de referencia que comprende VH y VL, en el que la VH comprende la SEQ ID NO: 2 y la VL comprende la SEQ ID NO: 3 de la unión a a-sinucleína .

También se proporciona el método como se describe en el presente documento, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una cadena pesada de la región variable (VH) y una cadena ligera de la región variable (VL) , en el que la VH comprende una secuencia de aminoácidos de una región determinante de complementariedad-1 (VHCDR1) de la SEQ ID NO: 4.

También se proporciona el método como se describe en el presente documento, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende VH y VL, en el que la VH comprende una secuencia de aminoácidos de una región determinante de la complementariedad-2 (VHCDR2) de la SEQ ID NO : 5.

Algunas modalidades incluyen el método como se describe en el presente documento, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antigeno del mismo comprende VH y VL, en el que la VH comprende una secuencia de aminoácidos de una región determinante de la complementariedad-3 (VHCDR3) de la SEQ ID NO: 6.

También se proporciona el método como se describe en el presente documento, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende VH y VL, en el que la VL comprende una secuencia de aminoácidos de una región determinante de la complementariedad-1 (VLCDR1) de la SEQ ID NO: 7.

Algunas modalidades incluyen el método como se describe en el presente documento, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende VH y VL, en el que la VL comprende una secuencia de aminoácidos de una región determinante de la complementariedad-2 (VLCDR2) de la SEQ ID NO: 8.

También se describe el método como se describe en el presente documento, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende VH y VL, en el que la VL comprende una secuencia de aminoácidos de una región determinante de la complementariedad-3 (VLCDR3) de la SEQ ID NO: 9.

También se proporciona el método como se describe en el presente documento, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende VH y VL, en el que la VH comprende secuencias de aminoácidos VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de la SEQ ID NO: 4, 5, 6.

También se describe el método como se describe en el presente documento, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende VH y VL, en el que la VL comprende secuencias de aminoácidos VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de SEC ID N° : 7, 8, 9.

Algunas modalidades incluyen el método como se describe en el presente documento, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende VH y VL, en el que la VH comprende secuencias de aminoácidos VHCDRl, VHCDR2 y VHCDR3 de la SEQ ID NO : 5, 6, 7, y la VL, comprende secuencias de aminoácidos VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de la SEC ID NO: 7, 8, 9.

Algunas modalidades incluyen el método como se describe en el presente documento, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de VH de la SEC ID NO: 2 y una secuencia de aminoácidos de VL de la SEC ID NO : 3.

También se describe el método como se describe en el presente documento, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo es un fragmento Fv de cadena única (scFv) , un fragmento F (ab1) , un fragmento F (ab) , o un fragmento F (ab1) 2.

Algunas modalidades incluyen el método como se describe en el presente documento, en el que la administración es por inyección intravenosa del anticuerpo. En una modalidad, el anticuerpo es humano.

Otras modalidades incluyen el método como se describe en el presente documento, en el que el intervalo de tiempo especificado es menor de una semana, o menos de o igual a 24 horas, o menos de o igual a 3 horas.

Ciertas modalidades incluyen el método como se describe en el presente documento, en el que la enfermedad sinucleinopática se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Parkinson (PD, por sus siglas en inglés) , demencia de la enfermedad de Parkinson (PDD, por sus siglas en inglés) , la demencia con cuerpos de Lewy (DCB, por sus siglas en inglés) , la variante de cuerpos de Lewy de la enfermedad de Alzheimer enfermedad (LBVAD, por sus siglas en inglés) , atrofia de múltiples sistemas (MSA, por sus siglas en inglés) , insuficiencia autonómica pura (PAF, por sus siglas en inglés) , neurodegeneración con acumulación de tipo-1 (NBIA-I, por sus siglas en inglés) , la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Pick, distrofia neuroaxonal generalizada de aparición temprana (enfermedad de Hallervorden-Spatz) , la esclerosis lateral amiotrófica, lesión cerebral traumática y el síndrome de Down.

Breve Descripción de las Figuras Las figuras 1A-1B: Dosis dependiente pico plasmático oí-sinucleína humana tras la administración del anticuerpo 12F4 en ratones transgénicos que sobreexpresan a-sinucleína humana.

La figura 2 : Evolución temporal de pico plasma a-sinucleína humana y las concentraciones de anticuerpos en plasma 12F4.

Las figuras 3A-3C: alta dosis de tratamiento agudo, el anticuerpo 12F4 de ratones transgénicos que sobreexpresan o¡-sinucleína humana reduce los niveles cerebrales a-sinucleína humanos .

Las figuras 4A-4C: los niveles plasmáticos de a-sinucleína Humanos reflejan de manera significativa los niveles de a-sinucleína cerebrales después de la inyección del anticuerpo 12F4.

Las figuras 5A-5C: plasma a-sinucleína humana (fig. 5A) y los niveles de anticuerpos quiméricos 12F4 (fig. 5B) se determinaron por ELISA, (fig. 5C) Se observó una correlación significativa entre el plasma y el cerebro los niveles de a-sinucleína después del tratamiento crónico durante seis meses con anticuerpo 12F4 quimérica de ratones transgénicos que sobreexpresan a-sinucleína humana.

La figura 6: a-sinucleína líquido cefalorraquídeo (CSF) pico y CSF/suero 124F relación de alrededor del 0.1% tras la administración 12F4 en macacos.

La figura 7: microdiálisis in vivo en ratones-a sinucleína transgénico muestra gota de fluido intersticial cerebral (ISF) a-sinucleína tras la administración 12F4.

Descripción Detallada de la Invención I. DEFINICIONES Es de señalar que el término "un" o "una" entidad se refiere a uno o más de esa entidad. Por ejemplo, "un anticuerpo anti-a-sinucleína" , se entiende para representar uno o más anticuerpos que se unen específicamente a -sinucleína . Como tal, los términos "un" (o "una"), "uno o más", y "al menos uno" pueden utilizarse indistintamente en el presente documento.

Como se usa en el presente, los términos "enfermedades sinucleinopáticas" o "sinucleinopatías" son un grupo diverso de trastornos neurodegenerativos que comparten una lesión patológica común compuesta de agregados insolubles de la proteína a-sinucleína en las poblaciones selectivamente vulnerables de las neuronas y la glía. Estos trastornos incluyen la enfermedad de Parkinson (PD) , demencia de la enfermedad de Parkinson (PDD) , la demencia con cuerpos de Lewy (PLB) , la variante de cuerpos de Lewy de la enfermedad de Alzheimer (LBVAD) , atrofia de sistemas múltiples (MSA) , insuficiencia autonómica pura (PAF) , neurodegeneración con acumulación cerebral de hierro de tipo-1 (NBIA-I) , la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Pick, distrofia neuroaxonal generalizada de aparición temprana (enfermedad de Hallervorden-Spatz) , la esclerosis lateral amiotrófica, lesión cerebral traumática y el síndrome de Down. Clínicamente, se caracterizan por una disminución crónica y progresiva en las funciones motoras, cognitivas, de comportamiento, y autonómicas, dependiendo de la distribución de las lesiones.

A menos que se indique lo contrario, los términos "desorden" , "enfermedad" y "enfermedad" se usan indistintamente en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, los términos "molécula de unión a antígeno" o "molécula de unión" se refiere en su sentido más amplio a una molécula que se une específicamente a un determinante antigénico. Los ejemplos no limitativos de moléculas de unión a antígeno son anticuerpos y fragmentos de los mismos que retienen unión de antígeno específica, así como otras moléculas que no son anticuerpos que se unen a -sinucleína incluyendo, pero no limitado a, hormonas, receptores, ligandos, complejo principal de histocompatibilidad (MHC) moléculas, chaperonas, tales como proteínas de choque térmico (HSPs) , así como moléculas de adhesión célula-célula, tales como miembros de la cadherina, intergrin, (Ig) de tipo C, superfamilias de lectina inmunoglobulina (Ig) de tipo C. Por lo tanto, en aras de claridad solamente y sin restringir el alcance de la descripción de la mayoría de las siguientes modalidades se comentan con respecto a los anticuerpos y moléculas similares a anticuerpos que representan las moléculas de unión para el desarrollo de agentes terapéuticos y de diagnóstico. En otra modalidad, una molécula de unión descrita comprende al menos una cadena pesada o ligera CDR de una molécula de anticuerpo. En otra modalidad, una molécula de unión descrita comprende al menos dos CDR de una o más moléculas de anticuerpos. En otra modalidad, una molécula de unión descrita comprende al menos tres CDRs de una o más moléculas de anticuerpos. En otra modalidad, una molécula de unión como se describe comprende al menos cuatro CDR de una o más moléculas de anticuerpos. En otra modalidad, una molécula de unión como se describe comprende al menos cinco CDR de una o más moléculas de anticuerpos. En otra modalidad, una molécula de unión como se describe comprende al menos seis CDR de una o más moléculas de anticuerpos.

Se describe en el presente un método para diagnosticar un nivel elevado de a-sinucleína en el cerebro de un sujeto de prueba, que comprende administrar al sujeto una molécula de unión anti-a-sinucleína, por ejemplo, un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno, variante, o derivado del mismo. A menos que se haga referencia específicamente a los anticuerpos de tamaño completo como los anticuerpos de origen natural, el término "anticuerpo anti-a-sinucleína" abarca anticuerpos de tamaño completo, así como fragmentos de unión al antígeno, variantes, análogos, o derivados de tales anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos que ocurren de forma natural o moléculas de inmunoglobulina o moléculas de anticuerpo modificado o fragmentos que se unen a antígeno de una manera similar a las moléculas de anticuerpo.

Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se usan indistintamente en el presente documento. Un anticuerpo o inmunoglobulina comprende al menos el dominio variable de una cadena pesada, y normalmente comprende al menos los dominios variables de una cadena pesada y una cadena ligera. Las estructuras básicas de inmunoglobulina en sistemas de vertebrados están relativamente bien comprendidas. Véase por ejemplo, Harlow et al. (1988) Antibodies: Laboratory Manual (2 ed; Cold Spring Harbor Laboratory Press) .

Como se usa en el presente, el término "inmunoglobulina" comprende diversas clases amplias de polipéptidos que se pueden distinguir bioquímicamente. Los expertos en la materia apreciarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta, o épsilon, (?, µ, a, d, e) con algunas subclases entre ellos (por ejemplo, ?1-?4) . Es la naturaleza de esta cadena que determina la "clase" del anticuerpo como IgG, IgM, IgG IgA, o IgE, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulina (isotipos) , por ejemplo, IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4 , IgAl, etc. están bien caracterizadas y son conocidos para conferir la especialización funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas clases e isotipos se desprenden claramente que el técnico en la materia en vista de la descripción y, en consecuencia, están dentro del alcance de la descripción. Todas las clases de inmunoglobulinas están claramente dentro del alcance de la descripción. La siguiente discusión generalmente se dirige a la clase IgG de moléculas de inmunoglobulina. Con respecto a la IgG, una molécula de inmunoglobulina estándar comprende dos polipéptidos idénticos de cadenas ligeras de peso molecular de aproximadamente 23,000 Dalton, y dos polipéptidos de cadena pesada idénticas de peso molecular 53,000-70,000. Las cuatro cadenas están típicamente unidas por enlaces de disulfuro en una configuración en "Y" en la que las cadenas ligeras encuadran a las cadenas pesadas a partir de la boca de la "Y" y continuando a través de la región variable .

Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda (?, ?) . Cada clase de cadena pesada se puede enlazar con cualquiera de una cadena ligera kappa o lambda. En general, las cadenas ligeras y pesadas están unidas covalentemente entre sí, y las porciones de "cola" de las dos cadenas pesadas están unidas entre sí por enlaces disulfuro covalentes o no covalentes cuando las inmunoglobulinas se generan ya sea por hibridomas, células B o células hospederas manipuladas genéticamente. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos van desde una N-terminal en los extremos bifurcados de la configuración de Y hasta la C-terminal en la parte inferior de cada cadena.

Tanto las cadenas ligeras como las pesadas se dividen en regiones de homología estructural y funcional. Los términos "constante" y "variable" se utilizan funcionalmente . A este respecto, se apreciará que los dominios variables tanto de las porciones de cadena ligeras (VL o VK) como pesadas y (VH) determinan el reconocimiento y la especificidad del antígeno. Por el contrario, los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (CHl, CH2 o CH3) confieren propiedades biológicas importantes tales como la secreción, movilidad transplacentaria, unión al receptor Fe, unión del complemento, y similares. Por convención, la numeración de la región constante de dominios aumenta a medida que se vuelven más distales del sitio de unión de antígeno o amino -terminal del anticuerpo. La porción N-terminal es una región variable y en la porción C-terminal es una región constante; los dominios CH3 y CL en realidad comprenden el carboxi-terminal de la cadena pesada y ligera, respectivamente.

Como se indicó anteriormente, la región variable permite al anticuerpo reconocer selectivamente y unirse específicamente a epítopos en antígenos. Es decir, el dominio VL y dominio VH, o un subconjunto de las regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) dentro de estos dominios variables, de un anticuerpo se combinan para formar la región variable que define un sitio de unión de antígeno de tres dimensiones. Esta estructura de anticuerpo cuaternario forma el sitio de unión de antígeno presente en el extremo de cada brazo de la Y. Más específicamente, el sitio de unión de antígeno se define por tres CDR en cada una de las cadenas VH y VL. En algunos casos, por ejemplo, ciertas moléculas de inmunoglobulina derivadas de especies de camélidos o modificadas basadas en inmunoglobulinas de camélidos, una molécula de inmunoglobulina completa puede consistir en sólo cadenas pesadas, sin cadenas ligeras. Véase, por ejemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993).

En los anticuerpos que ocurren de forma natural, las seis "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR" presentes en cada dominio de unión al antígeno son secuencias de aminoácidos cortas, no-contiguos que se colocan específicamente para formar el dominio de unión al antígeno conforme el anticuerpo asume su configuración tridimensional en un ambiente acuoso. El resto de los aminoácidos en los dominios de unión al antígeno, referido como regiones "estructurales", muestra menos variabilidad inter-molecular . Las regiones estructurales adoptan en gran medida una conformación ß-hoja y las CDR forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de ß-hoja. Por lo tanto, las regiones estructurales actúan para formar un andamio que ayude al posicionamiento de las CDR en la orientación correcta de interacciones inter-cadena no covalentes. El dominio de unión a antígeno formado por las CDR posicionado define una superficie complementaria para el epítopo en el antígeno inmunorreactivo . Esta superficie complementaria promueve la unión no covalente del anticuerpo a su epítopo análogo. Los aminoácidos que comprenden las CDR y las regiones estructurales, respectivamente, pueden ser identificados fácilmente para cualquier dominio variable de cadena pesada o ligera dado por uno de habilidad normal en la técnica, ya que se han definido con precisión (véase más adelante) .

En el caso donde hay dos o más definiciones de un término que se utiliza y/o acepta dentro de la técnica, la definición del término Como se utiliza en el presente se pretende que incluya todos estos significados a menos que se indique explícitamente lo contrario. Un ejemplo específico es el uso de la expresión "región determinante de la complementariedad" ("CDR") para describirlos de un sitio de combinación que de antígeno no contiguos que se encuentran dentro de la región variable de los polipéptidos de cadena pesada y ligera. Esta región particular ha sido descrita por Kabat et al. (1983) U.S. Departament of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" y por J. Mol. Biol . 196:901-917 (1987), que se incorporan en el presente por referencia, en donde las definiciones incluyen solapamientos o subconj untos de residuos de aminoácidos cuando se comparan una contra la otra. Sin embargo, la aplicación de cualquiera de las definiciones para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes de los mismos se pretende que estén dentro del alcance del término tal como se define y se utiliza en el presente documento. Los residuos de aminoácidos apropiados que abarcan las CDR según lo definido por cada una de las referencias citadas anteriormente se exponen a continuación en la Tabla 1 como comparación. Los números de residuo exactos que abarcan una CDR particular variará dependiendo de la secuencia y el tamaño de la CDR. Los técnicos en la materia pueden determinar rutinariamente que comprenden residuos de una CDR particular, dada la secuencia de aminoácidos de la región variable de anticuerpo.

Tabla 1. Definiciones1 CDR 1 La numeración de todas las definiciones CDR en la Tabla 1 es de acuerdo con las convenciones de numeración establecidas por abat et al. (véase la parte inferior) Kabat et al. también define un sistema de numeración para las secuencias de dominio variable aplicable a cualquier anticuerpo. Un técnico normal en la materia puede asignar de forma inequívoca este sistema de "numeración Kabat" a cualquier secuencia de dominio variable, sin depender de ningún dato experimental más allá de la propia secuencia. Como se usa en el presente, la "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración establecido por Kabat et al. (1983) U.S. Department of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" . A menos que se especifique lo contrario, las referencias a la numeración de las posiciones de residuos de aminoácidos específicos en un anticuerpo anti-a-sinucleína un fragmento de unión al antígeno, variante, o derivado del mismo de la presente descripción son de acuerdo al sistema de numeración de Kabat .

Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes, o derivados de los mismos de la descripción incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales , monoclonales, multiespecífieos , humanos, humanizados, primatizados, o anticuerpos quiméricos, anticuerpos de cadena única, fragmentos de unión al epítopo, por ejemplo Fab, Fab1 y F(ab' )2, Fd, Fv, Fv de cadena sencilla (scFv) , Fv unido por disulfuro- (sdFv) , fragmentos que comprenden ya sea una VL o dominio VH, fragmentos producidos por una Fab la genoteca de expresión, y anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) . Moléculas ScFv son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. N° 5,892,019. Las moléculas de inmunoglobulina o anticuerpo de la descripción pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) , clase (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3 , IgG4, IgAl, e IgA2 , etc.), o subclase de molécula de inmunoglobulina.

Como se usa en el presente, el término "porción de cadena pesada" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena pesada de inmunoglobulina. En ciertas modalidades, un polipéptido que comprende una porción de cadena pesada comprende al menos uno de: un dominio VH, un dominio CH1, un dominio (por ejemplo, superior, medio, y/o región de bisagra inferior) de bisagra, un dominio CH2, un dominio CH3, o una variante o fragmento del mismo. Por ejemplo, un polipéptido de unión para su uso en la descripción puede comprender una cadena de polipéptido que comprende un dominio CH1 ; una cadena de polipéptido que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio de bisagra, y un dominio CH2; una cadena de polipéptido que comprende un dominio CH1 y un dominio CH3 ; una cadena de polipéptido que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio de bisagra, y un dominio CH3 , o una cadena de polipéptido que comprende un dominio CH1 , al menos una porción de un dominio de bisagra, un dominio CH2 , y un dominio CH3. En otra modalidad, un polipéptido de la descripción comprende una cadena de polipéptido que comprende un dominio CH3. Además, un polipéptido de unión para su uso en la descripción puede carecer de al menos una parte de un dominio CH2 (por ejemplo, la totalidad o parte de un dominio CH2) . Como se expuso anteriormente, se entenderá por un técnico normal en la materia que estos dominios (por ejemplo, las porciones de cadena pesada) pueden ser modificados de tal manera que varían en secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina natural .

En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-a-sinucleína, o fragmentos de unión a antígeno, variantes, o derivados de los mismos descritos en el presente, las porciones de cadena pesada de una cadena de polipéptido de un multímero son idénticas a los de una segunda cadena de polipéptido del multímero. Alternativamente, monómeros que contienen las porciones de cadena pesada de la descripción no son idénticos. Por ejemplo, cada monómero puede comprender un sitio de unión al objetivo diferente, formando, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico .

Las porciones de cadena pesada de una molécula de unión para su uso en los métodos descritos en el presente pueden ser derivadas de diferentes moléculas de inmunoglobulin . Por ejemplo, una porción de la cadena pesada de un polipéptido puede comprender un dominio Cm derivado de una molécula de IgGl y una región de bisagra derivada de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una porción de la cadena pesada puede comprender una región de pivote derivada, en parte, de una molécula de IgGl y, en parte, de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una porción de la cadena pesada puede comprender una bisagra quimérica derivada, en parte, de una molécula de IgGl y, en parte, de una molécula de IgG4.

Como se utiliza en el presente, el término "porción de cadena ligera" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena ligera de inmunoglobulina, por ejemplo, una cadena ligera kappa o lambda. Preferiblemente, la porción de cadena ligera comprende al menos uno de un dominio VL o CL.

Como se ha indicado anteriormente, las estructuras de las subunidades y configuración tridimensional de las regiones constantes de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Como se usa en el presente, el término "dominio VH" incluye el extremo amino terminal de dominio variable de una cadena pesada de inmunoglobulina y el término "dominio CH1" incluye el primer más amino terminal dominio de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina. El dominio CH1 es adyacente al dominio VH y es amino terminal a la región de bisagra de una molécula de cadena pesada de inmunoglobulina.

Como se utiliza en el presente, el término "dominio CH2" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que se extiende, por ejemplo, desde aproximadamente el residuo 244 hasta el residuo 360 de un anticuerpo utilizando los esquemas de numeración convencionales (residuos 244 a 360, el sistema de numeración de Kabat; y los residuos 231 a 340, sistema de numeración de la UE; véase Kabat EA et al. El dominio CH2 es único en que no está estrechamente emparejado con otro dominio. Más bien, dos cadenas de carbohidratos ramificadas ligada en N están interpuestas entre los dos dominios CH2 de una molécula de IgG nativa intacta. Es también bien documentado que el dominio CH3 se extiende desde el dominio CH2 de la C -terminal de la molécula de IgG y consta de aproximadamente 108 residuos.

Como se usa en el presente, el término "región de bisagra" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que se une al dominio CH1 con el dominio CH2. Esta región de bisagra comprende aproximadamente 25 residuos y es flexible, permitiendo así que las dos regiones de unión de antígeno N-terminales se muevan independientemente las regiones de bisagra se puede subdividir en tres dominios distintos: superior, medio inferior y dominios de bisagra (Roux et al, J. Immunol 161:4083 (1998) ) .

Como se usa en el presente, el término "enlace disulfuro" incluye el enlace covalente formado entre dos átomos de azufre. El aminoácido cisteína comprende un grupo tiol que puede formar un enlace disulfuro o un puente con un segundo grupo tiol. En la mayoría de las moléculas de IgG que ocurren de forma natural, las regiones CH1 y CL están unidas por un enlace disulfuro y las dos cadenas pesadas están unidas por dos enlaces disulfuro en posiciones correspondientes a 239 y 242 utilizando el sistema de numeración de Kabat (posición 226 o 229, el sistema de numeración de la UE) .

Los anticuerpos anti -OÍ- sinucleína , o fragmentos de unión a antígeno, variantes, o derivados de los mismos descritos en el presente pueden describirse o especificarse en términos del (de los) epítopo(s) o parte (s) de un antígeno, por ejemplo, un polipéptido objetivo descrito en el presente documento (por ejemplo, -sinucleína) que reconocen o se unen específicamente. La porción de un polipéptido objetivo que interactúa específicamente con el dominio de unión a antígeno de un anticuerpo es un "epítopo" , o un "determinante antigénico" . Un polipéptido objetivo puede comprender un único epítopo, pero normalmente comprende al menos dos epítopos, y puede incluir cualquier número de epítopos, dependiendo del tamaño, conformación, y el tipo de antígeno. Además, cabe señalar que un "epítopo" en un polipéptido objetivo puede ser o puede incluir elementos no polipéptido, por ejemplo, un epítopo puede incluir una cadena lateral de carbohidrato.

El tamaño mínimo de un péptido o epítopo de polipéptido para un anticuerpo se cree que es alrededor de cuatro a cinco aminoácidos. El péptido o los polipéptido epítopos contienen preferiblemente al menos siete, más preferiblemente al menos nueve y más preferiblemente entre al menos aproximadamente 15 a aproximadamente 30 aminoácidos. Desde una CDR puede reconocer un péptido o polipéptido antigénico en su forma terciaria, los aminoácidos que comprenden un epítopo no necesitan ser contiguos, y en algunos casos, no pueden estar incluso en la misma cadena peptídica. Un péptido o epítopo de polipéptido reconocido por anticuerpos anti-a-sinucleína de la descripción pueden contener una secuencia de al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, más preferiblemente al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, o entre aproximadamente 15 a aproximadamente 30 aminoácidos contiguos o no contiguos de a-sinucleína .

Por "se une específicamente", por lo general, se entiende que un anticuerpo se une a un epítopo través de su dominio de unión al antígeno, y que la unión implica alguna complementariedad entre el dominio de unión a antígeno y el epítopo. De acuerdo con esta definición, se dice que un anticuerpo "se une específicamente" a un epítopo cuando se une a ese epítopo, a través de su dominio de unión a antígeno más fácilmente de lo que sería unirse a un epítopo sin relación al azar. El término "especificidad" se usa en el presente para calificar la afinidad relativa por el cual un anticuerpo determinado se une a un determinado epítopo. Por ejemplo, el anticuerpo "A" se considerará que tienen una mayor especificidad para un epítopo dado que el anticuerpo "B" , o el anticuerpo "A" se puede decir que se unen al epítopo "C" con una mayor especificidad que lo ha hecho por un epítopo "D" relacionado .

Por "se une preferentemente" , se entiende que el anticuerpo se une específicamente a un epítopo más fácilmente de lo que se unen a un epítopo relacionado, de forma similar, homólogo o análogo. Por lo tanto, un anticuerpo que "se une preferentemente" a un epítopo determinado se unirá más probablemente a ese epítopo que a un epítopo relacionado, a pesar de que tal anticuerpo puede reaccionar de forma cruzada con el epítopo relacionado.

A modo de ejemplo no limitativo, un anticuerpo puede ser considerado para unirse a un primer epítopo preferentemente si se une al primer epítopo con una constante de disociación (KD) que es menor que la KD del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitativo, un anticuerpo puede ser considerado para unirse a un primer antígeno preferentemente si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos de un orden de magnitud menor que la KD del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitativo, un anticuerpo puede ser considerado para unirse a un primer epítopo preferentemente si se une al primera epítopo con una afinidad que es al menos de dos órdenes de magnitud menos de KD del anticuerpo para el segundo epítopo.

En otro ejemplo no limitativo, un anticuerpo puede ser considerado para unirse a un primer epítopo preferentemente si se une al primer epítopo con una velocidad de disociación (k(off)) que es menor que la k(off) del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitativo, un anticuerpo puede ser considerado para unirse a un primer epítopo preferentemente si une al primer epítopo con una afinidad que es al menos de una orden de magnitud menor que el k(off) del anticuerpo para el segundo epítopo.

En otro ejemplo no limitativo, un anticuerpo puede ser considerado para unirse a un primer epítopo preferentemente si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos de dos órdenes de magnitud menor que k(off) del anticuerpo para el segundo epítopo.

Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante, o derivado descrito en el presente se puede decir que se une a un polipéptido objetivo descrito en el presente (por ejemplo, a-sinucleína humana) o un fragmento o variante del mismo con una velocidad de disociación (K (off ) ) de menos de o igual a 5 X 10"2 s"1, 10"2 s"1, 5 X 10"3 seg"1 o 10"3 seg-1. Más preferiblemente, un anticuerpo de la descripción se puede decir que se une a un polipéptido objetivo descrito en la presente (por ejemplo, -sinucleína humana) o un fragmento o variante de la misma con una velocidad de disociación (K (off) ) menor o igual a 5 X 10 "4 seg"1, 10"4 seg"1, 5 X 10"5 s"1, o 10"5 seg"1, 5 X 10"6 s"1, 10"6 seg"1, 5 X 10"7 seg -1 o lO"7 seg"1.

Un anticuerpo o fragmento de unión al antigeno, variante, o derivado descrito en el presente se puede decir que se une a un polipéptido objetivo descrito en el presente (por ejemplo, a- sinucleína humana) o un fragmento o variante del mismo con una velocidad de asociación (k(on)) de mayor que o igual a 103 M"1 seg"1, 5 X 103 M"1 s"1, 104 M"1 s"1 o 5 X 104 M_1 s"1. Más preferiblemente, un anticuerpo de la descripción se puede decir que se une a un polipéptido objetivo descrito en el presente (por ejemplo, a-sinucleína humana) o un fragmento o variante de la misma con una velocidad de asociación (k(on)) mayor que o igual a 105 M_1 seg-1, 5 X 105 M"1 s-1, 106 M"1 seg"1, o 5 X 106 M"1 S"1 o 107 M"1 S"1.

Se dice que un anticuerpo inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo de referencia a un determinado epítopo si se une preferentemente a ese epítopo en la medida en que bloquea, en algún grado, la unión del anticuerpo de referencia para el epítopo. La inhibición competitiva puede ser determinada por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, ensayos de ELISA de competencia. Se puede decir que un anticuerpo inhibe competitivamente la unión del anticuerpo de referencia a un epítopo dado por al menos 90%, al menos 80%, al menos 70%, al menos 60%, o al menos 50%.

Como se usa en el presente, el término "afinidad" se refiere a una medida de la fuerza de la unión de un epítopo individual con el CDR de una molécula de inmunoglobulin . Véase, por ejemplo, Harlow y col. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.) páginas 27-28. El término "afinidad suficiente" como se usa en el presente, se refiere a una fuerza suficiente de la unión de un anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión de antígeno del mismo a la a-sinucleína o un epítopo del mismo, para alterar la efluencia neta de sinucleína alfa del cerebro a la sangre, o de cerebro a CSF. Como se usa en el presente, el término "efluencia neta" se refiere al flujo total de a-sinucleína del cerebro a la sangre o del cerebro a CSF.

Como se usa en el presente, el término "avidez" se refiere a la estabilidad global del complejo entre una población de inmunoglobulinas y un antígeno, es decir, la combinación de la fuerza funcional de una mezcla de inmunoglobulina con el antígeno. Ver, por ejemplo, Harlow en las páginas 29-34. La avidez se relaciona tanto con la afinidad de las moléculas de inmunoglobulina individuales en la población con epítopos específicos, y también las valencias de las inmunoglobulinas y el antígeno. Por ejemplo, la interacción entre un anticuerpo monoclonal bivalente y un antígeno con una estructura de epítopo altamente repetitiva, tal como un polímero, sería uno de alta avidez.

Los anticuerpos anti-a-sinucleína o fragmentos de unión a antígeno, variantes, o derivados de los mismos como se describe en el presente documento también se pueden describir o especificar en términos de su reactividad cruzada. Como se usa en el presente, el término "reactividad cruzada" se refiere a la capacidad de un anticuerpo, específico para un antígeno, para reaccionar con un segundo antígeno; una medida de la relación entre dos sustancias antigénicas diferentes. Por lo tanto, un anticuerpo es reactivo en forma cruzada si se une a un epítopo distinto del que indujo su formación. El epítopo de reacción cruzada generalmente contiene muchas de las mismas características estructurales complementarias como el epítope que induce, y en algunos casos, puede ajustarse realmente mejor que la original .

Por ejemplo, ciertos anticuerpos tienen algún grado de reactividad cruzada, en la que se unen epitopos relacionados, pero no idénticos, por ejemplo, los epitopos con al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 65%, al menos 60%, al menos 55%, y al menos 50% de identidad (según se calcula usando métodos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento) a un epítopo de referencia. Un anticuerpo se puede decir que tiene poca o ninguna reactividad cruzada si no se une a epitopos con menos de 95%, menos de 90%, menos de 85%, menos de 80%, menos de 75%, menos de 70%, menos de 65%, menos de 60%, menos de 55%, y menos de 50% de identidad (según se calcula usando métodos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento) a un epítopo de referencia. Un anticuerpo puede ser considerado "muy específico" para un determinado epítopo, si no se une ningún otro análogo, ortólogo u homólogo de ese epítopo.

Las moléculas de unión anti-a-sinucleína, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos, como se describe en el presente documento también se pueden describir o especificar en términos de su afinidad de unión a un polipéptido de la descripción, por ejemplo, humana a-sinucleína . Afinidades de unión preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd inferior a 5 x 10'2 M, 10'2 M, 5 x 10~3 M, 10~3 M, 5 x 10"4 M, 10"4 M, 5 x 10"5 M, 10"5 M, 5 x 10"6 M, 10"6 M, 5 x 10"7 M, 10"7 M, 5 X 10"8 M, 10"8 M, 5 x 10"9 M, 10"9 M, 5 x 10"10 M, 10"10 M, 5 x 10"11 M, 10"11 M, 5 X 10"12 M, 10"12 M, 5 X 10"13 M, 10-13 M, 5 x 10"14 M, 10"14 M, 5 x 10"15 M, o 10"15 M.

Los fragmentos de anticuerpos, incluyendo anticuerpos de cadena sencilla pueden comprender la(s) región (es) variable (s) sola(s) o en combinación con la totalidad o una porción de los siguientes: región bisagra y dominios, CH1, CH2 , y CH3. También se incluyen fragmentos de unión al antígeno que también comprenden cualquier combinación de región (es) variable (s) con una región bisagra y dominios, CH1, CH2, CH3. Moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en el presente puede ser de cualquier origen animal incluyendo aves y mamíferos. Los anticuerpos pueden ser humanos, murinos, burro, conejo, cabra, cuy, camello, llama, caballo, o los anticuerpos de pollo. En otra modalidad, la región variable se puede comparar en origen (por ejemplo, a partir de los tiburones) .

Como se utiliza en el presente, el término "anticuerpo quimérico" se emplea para referirse a cualquier anticuerpo en el que la región inmunoreactiva o sitio se obtiene o deriva de una primera especie y la región constante (que puede estar intacta, parcial o modificada de acuerdo con la presente descripción) se obtiene a partir de una segunda especie. Por ejemplo, la región o sitio de unión objetivo puede ser de una fuente no humana (por ejemplo, ratón o primate) y la región constante puede ser humana. Alternativamente, una región de unión completamente humana se puede combinar con una región constante no humana (por ejemplo, ratón) .

Como se usa en el presente, el término "anticuerpo murinizado" o "inmunoglobulina murinizada" se refiere a un anticuerpo que comprende una o más CDR de un anticuerpo humano de la presente descripción; y una región de entramado humana que contiene sustituciones y/o deleciones y/o inserciones de aminoácidos que se basan en una secuencia de anticuerpo de ratón. La inmunoglobulina humana que proporciona los CDR se llama "padre" o "aceptador" y el anticuerpo de ratón que proporciona los cambios del marco se llama "donante" . Las regiones constantes no necesitan estar presentes, pero si lo están, por lo general son considerablemente idénticas a las regiones constantes de anticuerpos de ratón, es decir, al menos aproximadamente 85-90%, preferiblemente de aproximadamente 95% o más idénticos. Por lo tanto, en algunas modalidades, una longitud total murinizada de inmunoglobulina de cadena pesada o ligera humana contiene una región constante de ratón, CDR humanos, y un marco considerablemente humano que tiene un número de sustituciones de aminoácidos "murinizantes" . Típicamente, un "anticuerpo murinizado" es un anticuerpo que comprende una cadena ligera variable murinizada y/o una cadena pesada variable murinizada. Por ejemplo, un anticuerpo murinizado no abarcaría un anticuerpo quimérico típico, por ejemplo, debido a que toda la región variable de un anticuerpo quimérico no es ratón. Un anticuerpo modificado que ha sido "murinizado" por el proceso de "murinización" se une al mismo antígeno que el anticuerpo parental que proporciona las CDR y por lo general es menos inmunogénico en ratones, en comparación con el anticuerpo parental.

Como se usa en el presente, el término "anticuerpo modificado" se refiere a un anticuerpo en el que el dominio variable ya sea en la cadena pesada o ligera o ambas se ve alterado por al menos la sustitución parcial de una o más CDR de un anticuerpo de especificidad conocida y, si es necesario, por sustitución parcial de región marco y la secuencia de cambio. Aunque las CDR se pueden derivar de un anticuerpo de la misma clase o incluso subclase como el anticuerpo del que se derivan las regiones marco, se prevé que las CDR se derivan de un anticuerpo de diferente clase y preferiblemente de un anticuerpo a partir de una especie diferente. Un anticuerpo modificado en el que uno o más "donantes" CDR de un anticuerpo no humana de especificidad conocida se injerta en una región marco de la cadena pesada o ligera humano se denomina en el presente como un "anticuerpo humanizado" . No puede ser necesario para reemplazar la totalidad de las CDRs con las CDRs completas desde el dominio variable de donantes para la transferencia de la capacidad de unión al antígeno de un dominio variable a otro. Más bien, solamente puede ser necesario transferir los residuos que son necesarios para mantener la actividad del sitio de unión objetivo.

Como se usa en el presente documento, anticuerpos "humanos" o "completamente humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, como se describen infra y, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. N° 5,939,598 por Kucherlapati et al. Anticuerpos "completamente humanos", "humano" o también incluyen anticuerpos que comprenden al menos el dominio variable de una cadena pesada, o al menos los dominios variables de una cadena pesada y una cadena ligera, donde el (los) dominio (s) variable (s) tiene (n) la secuencia de aminoácidos de (los dominio (s) variable (s) de inmunoglobulina humana .

Los anticuerpos "completamente humanos" o "humanos" también incluyen anticuerpos "humanos" o "totalmente humanos", como se describe en el presente, que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en, variantes (incluyendo derivados) de las moléculas de anticuerpo (por ejemplo, las regiones VH y/o regiones VL) descritas en el presente, cuyos anticuerpos o fragmentos de los mismos se unen inmunoespecíficamente a un polipéptido de a-sinucleína o fragmento o variante del mismo. Las técnicas estándar conocidas por los técnicos en la materia se pueden usar para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti- -sinucleína humana, incluyendo, pero no limitado a, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR que resulta en sustituciones de aminoácidos. Preferiblemente, las variantes (incluyendo derivados) codifican menos de 50 sustituciones de aminoácidos, menos de 40 sustituciones de aminoácidos, menos de 30 sustituciones de aminoácidos, menos de 25 sustituciones de aminoácidos, menos de 20 sustituciones de aminoácidos, menos de 15 sustituciones de aminoácidos, menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoácidos, o menos de 2 sustituciones de aminoácidos con relación a la región VH, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 , VL región, VLCDR1, VLCDR2 , o VLCDR3 , de referencia.

En un aspecto, el anticuerpo de la descripción es un anticuerpo monoclonal humano aislado a partir de un ser humano. Opcionalmente , la región marco del anticuerpo humano se alinea y se adopta de acuerdo con las secuencias de la región variable de la línea germinal humanas pertinentes en la base de datos; véase, por ejemplo, Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) organizada por el MRC Centre for Protein Engineering (Cambridge, Reino Unido) . Por ejemplo, los aminoácidos que se consideran potencialmente desviados de la verdadera secuencia de la línea germinal podrían ser debido a las secuencias de cebadores de PCR incorporados durante el proceso de clonación. En comparación con los anticuerpos tipo humano generados artificialmente como fragmentos de anticuerpo de cadena única (scFv) a partir de una biblioteca de anticuerpos que muestra fago o ratones xenogénicos, el anticuerpo monoclonal humano de la presente descripción se caracteriza por (i) ser obtenido usando la respuesta inmune humana en lugar de los sustitutos de los animales, es decir, el anticuerpo ha sido generado en respuesta a la a-sinucleína natural en su conformación relevante en el cuerpo humano, (ii) habiendo protegido el individuo o es al menos significativa para la presencia de a-sinucleína, y (iii) ya que el anticuerpo es de origen humano los riesgos de reactividad cruzada contra antígenos propios se reduce al mínimo. Por lo tanto, de acuerdo con la descripción, los términos "anticuerpo monoclonal humano", "autoanticuerpo monoclonal humano" , "anticuerpo humano" y similares se utilizan para denotar una molécula de unión oí-sinucleína, que es de origen humano, es decir, que ha sido aislado a partir una célula humana tal como una célula B o hibridoma de los mismos o el ADNc de los cuales se ha clonado directamente a partir de ARNm de una célula humana, por ejemplo una célula B de memoria humana. Un anticuerpo humano todavía es "humano", incluso si las sustituciones de aminoácidos se realizan en el anticuerpo, por ejemplo, para mejorar las características de unión.

Los anticuerpos derivados de bibliotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, como se describen infra y, por ejemplo, en la patente de E.U.A. N° 5,939,598 por Kucherlapati et al., Se denotan anticuerpos tipo humano para distinguirlos de los anticuerpos verdaderamente humanos de la presente descripción.

Como se usa en el presente, el término "muestra" se refiere a cualquier material biológico obtenido de un sujeto o paciente. En un aspecto, una muestra puede comprender sangre, líquido cefalorraquídeo ("CSF"), u orina. En otros aspectos, una muestra puede comprender sangre completa, plasma, células B enriquecidas a partir de muestras de sangre, y células cultivadas (por ejemplo, células B de un sujeto) . Una muestra también puede incluir una biopsia o una muestra de tejido, incluyendo el tejido neural . En todavía otros aspectos, una muestra puede comprender células enteras y/o un lisado de las células. Las muestras de sangre se pueden recoger por métodos conocidos en la técnica. En un aspecto, la pelotilla puede ser resuspendida por agitación con vórtex a 4°C en 200 1 de amortiguador (Tris 20 mM, pH 7.5, 0.5% de Nonidet, EDTA 1 m , PMSF 1 mM, NaCl 0.1 M, IX Sigma inhibidor de la proteasa, y IX Sigma fosfatasa Inhibidores 1 y 2) . La suspensión puede ser mantenida en hielo durante 20 minutos con agitación con vórtex intermitente. Después de centrifugar a 15,000 xg durante 5 minutos a aproximadamente 4°C, partes alícuotas de sobrenadante se pueden almacenar a aproximadamente -70 °C.

Como se usa en el presente, los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, en donde el objeto es prevenir o ralentizar (disminuir) un cambio fisiológico no deseado, infección, o trastorno. Resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de los síntomas, disminución de la extensión de la enfermedad, estabilizar (es decir, no empeoramiento) de la enfermedad, el aclaramiento o la reducción de un agente infeccioso en un sujeto, un retraso o ralentización de progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad, y la remisión (ya sea parcial o total) , ya sea detectable o indetectable . El "tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Los que están en necesidad de tratamiento incluyen aquellos que ya presentan la infección, afección o trastorno así como los propensos a tener la afección o trastorno o aquellos en los que la condición o trastorno debe prevenirse.

Por "sujeto de prueba" o "individuo" o "animal" o "paciente" o "mamífero" se entiende cualquier sujeto, particularmente un mamífero, para quien se desea diagnóstico, pronóstico o tratamiento. Los sujetos mamíferos incluyen humanos, animales domésticos, animales de granja y zoológico, deportivos o de los animales de compañía tales como perros, gatos, cobayas, cuyos, ratas, ratones, caballos, ganado, vacas, osos, etc.

II. DESCRIPCIÓN DEL POLIPÉPTIDO OBJETIVO Como se usa en el presente, los términos "a-sinucleína" , "alfa-sinucleína" , "a-sinucleína" y "Asin" se utilizan indistintamente para referirse específicamente a la forma nativa monómero de a-sinucleína. El término "a-sinucleína" también se utiliza para identificar generalmente otros confórmeros de a-sinucleína, por ejemplo, a-sinucleína unido a la dopamina -quinona (DAQ) y oligómeros o agregados de a-sinucleína. El término "a-sinucleína" también se utiliza para referirse colectivamente a todos los tipos y formas de a-sinucleína. La secuencia de la proteína para la a-sinucleína humana es : MDVFMKGLSKAKEGWAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGWHGVATVAEKTKE QVTNVGGAWTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDN EAYEMPSEEGYQDYEPEA (SEQ ID NO : 1) .

La secuencia de aminoácidos de a-sinucleína se puede recuperar de la literatura y de las bases de datos pertinentes; véase, por ejemplo, Ueda et al, PNAS 90: 1282-11286 (1993); GenBank Swissprot: locus SYUA_HUMAN, número de acceso P37840. a-sinucleína fue inicialmente identificada en cerebros humanos como la proteína precursora del componente no- ß-amiloide de (NAC) de las placas de la enfermedad de Alzheimer (AD) ; véase, por ejemplo, Ueda et al., ibid. -sinucleína, es una proteína de 140 aminoácidos y existe en su forma nativa como una espiral al azar. Sin embargo, los cambios en el pH, el hacinamiento molecular, contenido de metales pesados, y todos los niveles de dopamina afectan la conformación de proteínas. Los cambios en la conformación a oligomérica, proto-fibrilar, fibrilar, y fracciones de agregados se cree para regular la toxicidad de la proteína. El aumento de la evidencia indica que la o¡-sinucleína con dopamina aducida tiene un curso de tiempo más rápido para la formación de fibrillas en comparación con la proteína no aducida. Además, la dopamina en el fondo de la sobreexpresión de a-sinucleína es tóxica.

NAC, un dominio altamente hidrofóbico dentro de a-sinucleína, es un péptido que consiste de al menos 28 residuos de aminoácidos (residuos 60-87) y, opcionalmente , 35 residuos de aminoácidos (residuos 61-95) . NAC muestra una tendencia a formar una estructura de lámina beta (Iwai et al, Biochemistry, 34: 10139-10145 (1995)). Las secuencias de aminoácidos de la NAC se describen en Jensen et al., Biochem. J. 310: 91-94 (1995); Número de acceso GenBank S56746 y Ueda et al., Ibid.

La a-sinucleína o los fragmentos desagregados de los mismos, incluyendo NAC, significa unidades peptídicas monoméricas . La a-sinucleína o fragmentos desagregados de los mismos son generalmente solubles, y son capaces de autoagregarse para formar oligómeros solubles. Los oligómeros de a-sinucleína y fragmentos de los mismos son generalmente solubles y existen predominantemente como a-hélices. La o¡-sinucleína monomérica se puede preparar in vitro mediante la disolución de péptido liofilizado en DMSO puro con sonicación. La solución resultante se centrifuga para retirar cualquier partícula insoluble. a-sinucleína agregada o fragmentos de los mismos, incluyendo NAC, significa oligómeros de a-sinucleína o fragmentos de los mismos que han asociado en ensamblados ß-hoja insolubles. a-sinucleína agregadas o fragmentos de los mismos, incluyendo NAC, también significa polímeros fibrilares. Las fibrillas son generalmente insolubles. Algunos anticuerpos se unen ya sea a-sinucleína o fragmentos solubles de los mismos o a-sinucleína agregada o fragmentos de los mismos. Algunos anticuerpos se unen a oligómeros de a-sinucleína más fuertemente que a las formas monoméricas o formas fibrilares. Algunos anticuerpos se unen tanto a-sinucleína soluble y agregada o fragmentos de los mismos, y también formas opcionalmente oligoméricas .

III. ANTICUERPOS DE ANTI -a-SINUCLEÍNA Los anticuerpos que se unen a a-sinucleína se han descrito en la técnica. Véase, por ejemplo, la Publicación de Patente Internacional O 2010/069603, que se incorpora en el presente en su totalidad por referencia.

Los anticuerpos anti -a-sinucleína humanos descritos en el presente documento se unen específicamente a a-sinucleína y epítopos de los mismos y a diferentes conformaciones de a-sinucleína y epítopos de los mismos. Por ejemplo, descritos en el presente son anticuerpos que se unen específicamente a-sinucleína, a-sinucleína en su forma monomérica nativa, de longitud completa y a-sinucleína truncada y agregados de a-sinucleína. Por ejemplo, el anticuerpo 12F4, como se describe en el presente documento, se une a la a-sinucleína de longitud completa y a truncamientos de a-sinucleína que contienen aminoácidos (aa) 1-60 como se probaron por ELISA directo, apuntando a un epítopo de 12F4 en la región de repetició anfipatica N-terminal de alfa-sinucleína . (Véase el documento WO 2010/069603) .

Como se usa en el presente, la referencia a un anticuerpo que "se une específicamente", "se une selectivamente", o "se une preferentemente" a-sinucleína se refiere a un anticuerpo que no se une a otras proteínas no relacionadas. En un ejemplo, un anticuerpo a-sinucleína descrito en el presente puede unirse a a-sinucleína o un epítopo de la misma y no mostrar la unión por encima de aproximadamente 1.5 veces el fondo para otras proteínas. Un anticuerpo que "se une específicamente" o "se une selectivamente" a un confórmero de a-sinucleína se refiere a un anticuerpo que no se une a todas las conformaciones de -sinucleína, es decir, no se une al menos otro confórmero de a-sinucleína. Por ejemplo, se describe en el presente, anticuerpos que pueden distinguir entre las formas monoméricas y agregadas de -sinucleína, oí-sinucleína humana y de ratón; cx-sinucleína de longitud completa y formas truncadas, así como oí-sinucleína humana contra- ß y ? -sinucleína. Dado que los anticuerpos anti -a- sinucleína humana de la presente descripción se han aislado de un grupo de sujetos de edad avanzada sin signos de parkinsonismo y que exhiben una respuesta inmune-a-sinucleína específica, los anticuerpos anti-a-sinucleína descritos en el presente también pueden ser llamados "auto-anticuerpos humanos" a fin de hacer hincapié en que esos anticuerpos se expresan de hecho por los sujetos y no se han aislado a partir de, por ejemplo, una inmunoglobulina humana que expresa una biblioteca de fagos, que hasta ahora representaba un método común para tratar de proporcionar anticuerpos tipo humano.

La descripción se refiere generalmente a un método para diagnosticar un nivel elevado de a-sinucleína en el cerebro de un sujeto de prueba, que comprende la administración de un anticuerpo que se une específicamente a a-sinucleína, o un fragmento de unión al antígeno, variante, o derivado de la misma. Los anticuerpos anti-a-sinucleína pueden utilizarse en los métodos proporcionados en el presente. Los anticuerpos que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a anticuerpos recombinantes humanos a-sinucleína NI-202.3G12, 12F4, o NI-202.3D8 y fragmentos de unión a antígeno, variantes, o derivados de los mismos que se describen íntegramente en la publicación de patente internacional WO 2010/069603.

En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno, variante, o derivado de los mismos útiles en los métodos proporcionados en el presente tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 88%, aproximadamente el 89%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 91%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 93%, aproximadamente el 94%, o aproximadamente 95% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos para una molécula de anticuerpo anti-a-sinucleína de referencia, por ejemplo las descritas en el presente documento. En una modalidad adicional, la molécula de unión comparte al menos aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99%, o 100% de identidad de secuencia a un anticuerpo de referencia. En ciertas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se une específicamente al mismo epítopo a-sinucleína como un anticuerpo de referencia que comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (VH) y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL) , en donde la VH comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, 85%, 90% 95% o 100% idéntica a la SEC ID NO: 2 y la VL comprende la secuencia de aminoácidos al menos 80%, 85%, 90% 95% o 100% idéntica a la SEC ID NO: 3, como se muestra en la Tabla 2.

También se describe el anticuerpo o fragmento unión al antígeno, variante, o derivado de los mismos útiles en los métodos proporcionados en el presente que se une específicamente al mismo epítopo de a-sinucleína como un anticuerpo de referencia que comprende VH y VL, en donde la VH comprende una secuencia de aminoácido idéntica a, o idéntica a excepción de uno, dos, tres, cuatro, cinco, o más sustituciones de aminoácidos a la SEQ ID NO: 2, y la VL comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a, o idéntica a excepción de uno, dos, tres, cuatro, cinco, o más sustituciones de aminoácidos con SEQ ID NO: 3, como se muestra en la Tabla 2.

Algunas modalidades incluyen un anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno, variante, o derivado de los mismos útiles en los métodos proporcionados en el presente que comprende una VH, donde una o más de las regiones VHCDR1, VHCDR2 o VHCDR3 de la VH son al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idénticas a una o más referencias de la cadena pesada de aminoácidos VHCDR1, VHCDR2 y/o VHCDR3 de uno o más de: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 5, SEC ID NO : 6, como se muestra en la Tabla 3.

También se describe un anticuerpo anti -a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno, variante, o derivado de los mismos útiles en los métodos proporcionados en el presente que comprende una VH, donde una o más de las regiones VHCDRl, VHCDR2 o VHCDR3 de la VH son idénticas a, o idénticas a excepción de cuatro, tres, dos, o una o sustituciones de aminoácidos, a una o más referencias de la cadena pesada de las secuencias de aminoácidos VHCDRl, VHCDR2 o VHCDR3 de uno o más de: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEC ID NO : 6, como se muestra en la Tabla 3.

También se describe un anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno, variante, o derivado de los mismos útiles en los métodos proporcionados en el presente que comprende una VL, donde una o más de las regiones VLCDR1, VLCDR2, o VLCDR3 de la VL son al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idénticas a una o más referencias de la cadena pesada de aminoácidos VLCDR1, VLCDR2 , o VLCDR3 de uno o más de: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 9, como se muestra en la Tabla 3.

Algunas modalidades describen un anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno, variante, o derivado de los mismos útiles en los métodos proporcionados en el presente que comprende una VL, donde una o más de las regiones VLCDR1, VLCDR2 , o VLCDR3 de la VL son idénticas a, o idénticas a excepción de cuatro, tres, dos, o una o sustituciones de aminoácidos, a uno o más referencias de la cadena pesada de las secuencias de aminoácidos VLCDRl, VLCDR2 , o VLCDR3 de uno o más de: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEC ID NO: 9, como se muestra en la Tabla 3.

En otras modalidades, un anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno, variante, o derivado del mismo útil en los métodos proporcionados en el presente comprende, consiste esencialmente en, o consiste en secuencias de aminoácidos de VH y VL al menos 80%, 85%, 90% 95% o 100% idénticas a: SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO : 3, como se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2: Secuencias de aminoácidos de VH y VL de referencia *. * las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de VH y VL se subrayan.

Tabla 3: Secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de VH y VL de referencia*.

También se incluyen para su uso en los métodos descritos en el presente los polipéptidos que codifican anticuerpos anti- -sinucleína, o fragmentos de unión a antígeno, variantes, o derivados de los mismos como se describe en el presente documento, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos, vectores que comprenden los polinucleótidos, y células hospedadoras que comprende los vectores o polinucleótidos, todo para la producción de anticuerpos anti-a-sinucleína, o fragmentos de unión a antígeno, variantes, o derivados de los mismos para su uso en los métodos descritos en el presente documento.

Las variantes biológicamente activas adecuadas de anticuerpos anti-a-sinucleína como se describen en el presente se pueden utilizar en los métodos de la descripción. Tales variantes retendrán las propiedades de unión deseadas del anticuerpo anti-a-sinucleína parental . Los métodos para preparar variantes de anticuerpos están generalmente disponibles en la técnica.

Los métodos para mutagénesis y alteraciones de secuencias de nucleótidos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Walker y Gaastra, eds . (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York); Kunkel, Proc . Nati. Acad. Sci. E.U.A. 82:488-492 (1985); Kunkel et al., Methods Enzymol . 154:367-382 (1987); Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, Nueva York); La Patente de E.U.A. N° 4,873,192; y las referencias citadas en el mismo; incorporadas a la presente por referencia. Orientación en cuanto a las sustituciones de aminoácidos apropiados que no afectan a la actividad biológica del polipéptido de interés se puede encontrar en el modelo de Dayhoff et al. en el Atlas of Protein Sequence and Structure (Nati. Biomed. Res. Found, Washington, DC) , páginas 345-352 (1978) , que se incorpora en el presente como referencia en su totalidad. El modelo de Dayhoff et al. utiliza la matriz de similitud (PAM 250 matrix) de aminoácidos del punto de mutación aceptado (PAM por sus siglas en inglés) para determinar sustituciones conservadoras adecuadas de aminoácidos. Las sustituciones conservadoras, tales como el intercambio de un aminoácido con otro que tiene propiedades similares, pueden ser preferidas. Los ejemplos de sustituciones conservadoras de aminoácidos como se enseña en la matriz PAM 250 del modelo Dayhoff et al. incluyen, pero no se limitan a, Gly <? Ala, Val<? lie <? Leu, Asp <-> Glu, Lys Arg, Asn <-> Gln, y Fe <? Trp <? Tyr.

Los métodos para la medición de un anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno, variante, o derivado del mismo, que unen específicamente incluyen, pero no se limitan a, ensayos de unión competitiva estándar, ensayos para el control de la secreción de inmunoglobulinas por las células T o células B, ensayos de proliferación de células T, ensayos de apoptosis, ensayos ELISA, y similares. Ver, por ejemplo, tales ensayos descritos en el documento WO 93/14125; Shi et al, Immunity 13:633-642 (2000); Kumanogoh et al, J Immunol. 169:1175-1181 (2002); Watanabe et al, J Immunol . 167:4321-4328 (2001); Wang et al., Blood 97:3498-3504 (2001); y Giraudon et al., J Inmunol 172 (2 ): 1246 - 1255 (2004), todos los cuales se incorporan en el presente por referencia.

Cuando se comenta en el presente si cualquier polipéptido particular, incluyendo las regiones constantes, COR, dominio VH o dominios VL descritos en el presente, es al menos aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99%, o incluso aproximadamente 100% idéntico a otro polipéptido, el % de identidad puede determinarse usando métodos y programas de computadora/software conocidos en la técnica tales como, pero no limitado a, el programa BESTFIT (Paquete de Análisis de Secuencia de Wisconsin, Versión 8 para Unix, Grupo de Computadora de Genética, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) . BESTFIT usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl . Math. 2:482-489, para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se usa BESTFIT o cualquier otro programa de alineación de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente descripción, los parámetros se establecen, por supuesto, de tal manera que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa de la secuencia de polipéptido de referencia y que se permiten huecos en la homología de hasta 5% del número total de aminoácidos en la secuencia de referencia.

Para los propósitos de la descripción, el porcentaje de identidad de secuencia puede determinarse usando el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman usando una búsqueda de huecos afines con una penalización por apertura de hueco de 12 y una penalización de extensión de hueco de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se enseña en Smith y Waterman (1981) Adv. Appl . Mat . 2:482-489. Una variante puede, por ejemplo, diferir de un anticuerpo anti-a-sinucleína de referencia por tan pocos como 1 a 15 residuos de aminoácidos, tan poco como 1 a 10 residuos de aminoácidos, tal como 6-10, tan poco como 5, tan pocos como 4, 3, 2, o incluso 1 residuo de aminoácido. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es una en la que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral con una carga similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con cargas similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) , cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) . Alternativamente, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de la totalidad o parte de la secuencia codificante, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes se pueden seleccionar para la actividad biológica para identificar mutantes que retienen la actividad (por ejemplo, la capacidad de unirse a un polipéptido a-sinucleína) .

Por ejemplo, es posible introducir mutaciones sólo en regiones estructurales o sólo en regiones CDR de una molécula de anticuerpo. Mutaciones introducidas pueden ser mutaciones de sentido erróneo silenciosas o neutras, es decir, no tienen ningún o poco efecto sobre la capacidad de un anticuerpo para unirse al antígeno. Estos tipos de mutaciones pueden ser útiles para optimizar el uso de codones, o mejorar la producción de anticuerpos de un hibridoma. Alternativamente, las mutaciones sin sentido no neutrales pueden alterar la capacidad de un anticuerpo para unirse al antígeno. Un experto en la técnica sería capaz de diseñar y probar moléculas mutantes con propiedades deseadas tales como no alteración en la actividad de unión a antígeno o alteración en la actividad de unión (por ejemplo, mejoras en la actividad de unión al antígeno o cambio en la especificidad de anticuerpos) . Después de la mutagénesis, la proteína codificada puede expresarse rutinariamente y la actividad funcional y/o biológica de la proteína codificada, (por ejemplo, capacidad para unirse inmunoespecíficamente al menos a un epítopo de un polipéptido de a-sinucleína) se puede determinar utilizando técnicas descritas en el presente documento o modificando rutinariamente técnicas conocidas en la técnica.

IV. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO O RASTREO UTILIZANDO ANTICUERPOS DE ANTI- -SINUCLEíNA La presente descripción se refiere al uso de una molécula de unión anti-a-sinucleína, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, para el diagnóstico de un nivel elevado de a-sinucleína en el cerebro de un sujeto de prueba (por ejemplo, determinar el riesgo de un sujeto de desarrollar una enfermedad sinucleinopática) , o para el control de la progresión de una enfermedad sinucleinopática o una respuesta a un tratamiento de la enfermedad sinucleinopática en un sujeto de prueba.

En ciertas modalidades, los métodos como se describen en el presente documento están dirigidos al uso de anticuerpos anti-a-sinucleína, incluyendo fragmentos de unión al antígeno, variantes, y derivados de los mismos, descritos en el presente documento, para diagnosticar un nivel elevado de a-sinucleína en el cerebro de un sujeto de prueba al: (a) examinar el nivel de -sinucleína en un plasma sanguíneo, o una muestra de CSF obtenida del sujeto de prueba en un intervalo especificado después de la administración periférica al sujeto de prueba de un anticuerpo anti-oí-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que el anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento del mismo pueden unirse a a-sinucleína con una afinidad suficiente para alterar la efluencia neta de a-sinucleína del cerebro a la sangre, o de cerebro a CSF; (b) comparar el nivel examinado de la a-sinucleína en el sujeto de prueba con un estándar de referencia; en el que la diferencia o la similitud entre el nivel de a-sinucleína en la muestra de plasma, o la muestra de CSF y el estándar de referencia se correlaciona con el nivel de a-sinucleína en el cerebro del sujeto de prueba.

En otras modalidades, los métodos como se describe en el presente documento están dirigidos al uso de anticuerpos anti-a-sinucleína, incluyendo fragmentos de unión al antígeno, variantes, y derivados de los mismos, descritos en el presente documento, para diagnosticar un nivel elevado de -sinucleína en el cerebro de un sujeto de prueba al: (a) examinar el nivel de a-sinucleína en plasma sanguíneo, o una muestra de CSF obtenida del sujeto de prueba en un intervalo especificado después de la administración periférica al sujeto de prueba de un anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que el anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento del mismo se estabiliza o recluye a-sinucleína en la sangre o CSF; (b) comparar el nivel examinado de la a-sinucleína en el sujeto de prueba con un estándar de referencia; en el que la diferencia o la similitud entre el nivel de a-sinucleína en la muestra de plasma, o la muestra de CSF y el estándar de referencia se correlaciona con el nivel de a-sinucleína en el cerebro del sujeto de prueba.

En algunas modalidades, los métodos como se describe en el presente documento están dirigidos al uso de anticuerpos anti-a-sinucleína, incluyendo fragmentos de unión al antígeno, variantes, y derivados de los mismos, descritos en el presente documento, para diagnosticar un nivel elevado de a-sinucleína en el cerebro de un sujeto de prueba al: (a) proporcionar un anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno de los mismos, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo pueden unirse a a-sinucleína con una afinidad suficiente para alterar la efluencia neta de a-sinucleína del cerebro a la sangre o del cerebro a CSF; (b) dirigir un profesional de la salud para administrar periféricamente el anticuerpo al sujeto de prueba y obtener una muestra de plasma sanguíneo, o una muestra de CSF del sujeto en un intervalo de tiempo especificado después de la administración; (c) examinar el nivel de a-sinucleína en la muestra de plasma sanguíneo, o la muestra de CSF; (d) comparar el nivel examinado de a-sinucleína en el sujeto de prueba con un estándar de referencia; en el que la diferencia o la similitud entre el nivel de la a-sinucleína en la muestra de plasma, o la muestra de CSF y el estándar de referencia se correlaciona con el nivel de a-sinucleína en el cerebro del sujeto de prueba.

En otras modalidades, los métodos como se describen en el presente documento están dirigidos al uso de anticuerpos anti-a-sinucleína, incluyendo fragmentos de unión al antígeno, variantes, y derivados de los mismos, descritos en el presente documento, para diagnosticar un nivel elevado de a-sinucleína en el cerebro de un sujeto de prueba al: (a) proporcionar un anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno de los mismos, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo, en el que el anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento del mismo estabiliza o recluye a-sinucleína en la sangre o el CSF; (b) dirigir un profesional de la salud para administrar periféricamente el anticuerpo al sujeto de prueba y obtener una muestra de plasma sanguíneo, o una muestra de CSF del sujeto en un intervalo de tiempo especificado después de la administración; (c) examinar el nivel de a-sinucleína en la muestra de plasma sanguíneo, o la muestra de CSF; (d) comparar el nivel examinado de -sinucleína en el sujeto de prueba con un estándar de referencia; en el que la diferencia o la similitud entre el nivel de la a-sinucleína en la muestra de plasma, o la muestra de CSF y el estándar de referencia se correlaciona con el nivel de a-sinucleína en el cerebro del sujeto de prueba.

Con el fin de aplicar los métodos y sistemas de la descripción, las muestras de un paciente se pueden obtener antes o después de la administración de un anticuerpo anti-cx-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo. Las muestras se pueden, por ejemplo, ser solicitadas por un profesional de la salud (por ejemplo, un médico) o proveedor de beneficios de salud, obtenidos y/o procesados por el mismo o un profesional de la salud diferente (por ejemplo, una enfermera, un hospital) o un laboratorio clínico, y después del procesamiento, los resultados pueden ser enviados a otro proveedor de atención médica, proveedor de beneficios de salud o al paciente. Del mismo modo, analizando el nivel de a-sinucleína en la muestra, comparando el nivel ensayado de la a-sinucleína en el sujeto de prueba al estándar de referencia, la evaluación de los resultados puede ser realizada por uno o más profesionales de la salud, proveedores de beneficios de salud, y/o laboratorios clínicos.

Como se utiliza en el presente, el término "profesional de la salud" se refiere a personas o instituciones que interactúan directamente y administran a sujetos vivos, por ejemplo, pacientes humanos. Los ejemplos no limitativos de los profesionales de la salud incluyen médicos, enfermeras, técnicos, terapeuta, farmacéuticos, asesores, profesionales de la medicina alternativa, centros médicos, consultorios médicos, hospitales, salas de emergencia, clínicas, centros de atención de urgencia, clínicas /instalaciones de medicina alternativa, y cualquier otra entidad que proporciona tratamiento general y/o especializado, evaluación, mantenimiento, terapia, medicamentos y/o asesoramiento en relación con la totalidad o cualquier parte de, el estado de salud de un paciente, incluyendo, pero no limitado a, la medicina general, medicina especializada, quirúrgica y/o cualquier otro tipo de tratamiento, evaluación, mantenimiento, terapia, medicamentos y/o asesoramiento.

Como se usa en el presente, el término "laboratorio clínico" se refiere a una instalación para el examen o el procesamiento de materiales derivados de un sujeto vivo, por ejemplo, un ser humano. Los ejemplos no limitativos de procesamiento incluyen biológico, bioquímico, serológico, químico, inmunohematológico, hematológico, biofísico, citológico, patológico, genético, u otra examinación de los materiales procedentes del cuerpo · humano para el propósito de proporcionar información, por ejemplo, para el diagnóstico, la prevención o el tratamiento de cualquier enfermedad o alteración de, o la evaluación de la salud de los sujetos vivos, por ejemplo, seres humanos. Estos exámenes también pueden incluir procedimientos para recolectar o de otro modo obtener una muestra, preparar, determinar, medir, o de otra manera de describir la presencia o ausencia de diversas sustancias en el cuerpo de un sujeto vivo, por ejemplo, un ser humano, o de una muestra obtenida del cuerpo de un sujeto vivo, por ejemplo, un ser humano. En ciertos aspectos un laboratorio clínico puede ser "centralizado" o "local", lo que significa que un número pequeño o un solo laboratorio hacen que todas las mediciones de muestras presentadas a partir de todas las fuentes externas. En otros aspectos, varios laboratorios clínicos, también conocidos como "satélite" o laboratorios "globales", se puede validar para que todos proporcionen estándares, resultados fiables que se pueden comparar fácilmente .

Como se utiliza en el presente, el término "proveedor de beneficios de salud" abarca los partidos individuales, organizaciones o grupos que proporcionan, presentan, ofertan, pagan en su totalidad o en parte, o están de otra manera asociados con dar acceso de los pacientes a uno o más de los beneficios de la salud, planes de beneficios, seguro médico, y/o programas de la cuenta de gastos de atención médica.

En algunos aspectos, un profesional de la salud puede administrar o dar instrucciones a otro profesional de la salud para administrar un anticuerpo anti-a-sinucleína o su fragmento de unión al antígeno del mismo. Un profesional de la salud puede implementar o dar instrucciones a otro profesional de la salud o paciente para realizar las siguientes acciones: obtener una muestra, procesar una muestra, presentar una muestra, recibir una muestra, transferir una muestra, analizar o medir una muestra, cuantificar una muestra, entregar los resultados obtenidos después de analizar/medir/cuantificar una muestra, recibir los resultados obtenidos después de analizar/medir/cuantificar una muestra, comparar/anotar los resultados obtenidos después analizar/medir/cuantificar una o más muestras, proporcionar la comparación/puntuación de uno o más muestras, obtener la comparación/puntuación de una o más muestras, administrar una terapia o agente terapéutico (por ejemplo, un anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo) , iniciar la administración de una terapia, cesar la administración de una terapia, continuar la administración de una terapia, interrumpir temporalmente la administración de una terapia, aumentar la cantidad de un agente terapéutico administrado, disminuir la cantidad de un agente terapéutico administrado, continuar la administración de una cantidad de un agente terapéutico, aumentar la frecuencia de administración de un agente terapéutico, disminuir la frecuencia de administración de un agente terapéutico, mantener la misma frecuencia de dosificación en un agente terapéutico, reemplazar una terapia o agente terapéutico por al menos otra terapia o agente terapéutico, combinar una terapia o agente terapéutico con al menos otra terapia o agente terapéutico adicional.

En algunos aspectos, un proveedor de beneficios de salud puede autorizar o negar, por ejemplo, recolectar una muestra, procesar una muestra, presentar una muestra, recibir una muestra, transferir una muestra, analizar o medir una muestra, cuantificar una muestra, suministrar los resultados obtenidos después de analizar/medir/cuantificar una muestra, transferir los resultados obtenidos después de analizar/medir/cuantificar una muestra, comparar/puntuar los resultados obtenidos después de analizar/medir/cuantificar una o más muestras, transferir la comparación/puntuación de una o más muestras, administrar una terapia o agente terapéutico, iniciar la administración de una terapia o agente terapéutico, cesar la administración de una terapia o agente terapéutico, continuar la administración de una terapia o agente terapéutico, interrumpir temporalmente la administración de una terapia o agente terapéutico, aumentar la cantidad de agente terapéutico administrado, disminuir la cantidad de agente terapéutico administrado, continuar la administración de una cantidad de un agente terapéutico, aumentar en la frecuencia de administración de un agente terapéutico, disminuir en la frecuencia de administración de un agente terapéutico, mantener la misma frecuencia de dosificación en un agente terapéutico, reemplazar una terapia o agente terapéutico por al menos otra terapia o agente terapéutico, o combinar una terapia o agente terapéutico con al menos otra terapia o agente terapéutico adicional.

Además los proveedores de beneficios de salud pueden, por ejemplo, autorizar o negar la prescripción de una terapia, autorizar o negar la cobertura de la terapia, autorizar o negar el reembolso por el costo de la terapia, determinar o negar la elegibilidad para la terapia, etc.

En algunos aspectos, un laboratorio clínico puede, por ejemplo, recolectar u obtener una muestra, procesar una muestra, presentar una muestra, recibir una muestra, transferir una muestra, analizar o medir una muestra, cuantificar de una muestra, entregar los resultados obtenidos después de analizar/medir/cuantificar una muestra, recibir los resultados obtenidos después de analizar/medir/cuantificar una muestra, comparar/anotar los resultados obtenidos después de analizar/medir/cuantificar una o más muestras, proporcionar la comparación/puntuación de una o varias muestras, obtener la comparación/puntuación de una o más muestras.

Las acciones enumeradas anteriormente pueden ser realizadas por un profesional de la salud, el proveedor de beneficios de salud, o el paciente automáticamente utilizando un método implementado por computadora (por ejemplo, a través de un servicio web o un sistema informático independiente) .

Tal como se usa en el presente, el término "dirección de un profesional de la salud" incluye dirigir verbalmente un profesional de la salud, o dirigir un profesional de la salud mediante una orden por escrito, o ambas.

En algunas modalidades, los métodos como se describen en el presente documento están dirigidos al uso de anticuerpos anti-a-sinucleína, incluyendo fragmentos de unión al antígeno, variantes, y derivados de los mismos, se describe en el presente documento, para diagnosticar un nivel elevado de ot-sinucleína en el cerebro de un sujeto de prueba al: (a) administrar periféricamente un anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo al sujeto de prueba, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo pueden unirse a a-sinucleína con una afinidad suficiente para alterar la efluencia neta de la a-sinucleína del cerebro a la sangre o del cerebro al CSF; (b) obtener una muestra de plasma sanguíneo, o una muestra de CSF del sujeto de prueba en un intervalo de tiempo especificado después de la administración, y la presentación de la muestra de plasma, o la muestra de CSF para la determinación del nivel de la a-sinucleína ; (c) comparar el nivel de la a-sinucleína en una muestra de plasma sanguíneo a un nivel de referencia; en el que la diferencia o la similitud entre el nivel de la a-sinucleína en la muestra de plasma, o la muestra de CSF y el estándar de referencia se correlaciona con el nivel de la a-sinucleína en el cerebro del sujeto de prueba.

En otras modalidades, los métodos como se describen en el presente documento están dirigidos al uso de anticuerpos anti-a-sinucleína, incluyendo fragmentos de unión al antígeno, variantes, y derivados de los mismos, se describe en el presente documento, para diagnosticar un nivel elevado de a-sinucleína en el cerebro de un sujeto de prueba al: (a) administrar periféricamente un anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo al sujeto de prueba, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo se estabiliza o recluye a-sinucleína en la sangre o en el CSF; (b) obtener una muestra de plasma sanguíneo, o una muestra de CSF del sujeto de prueba en un intervalo de tiempo especificado después de la administración, y la presentación de la muestra de plasma, o la muestra de CSF para la determinación del nivel de la a-sinucleína; (c) comparar el nivel de la a-sinucleína en una muestra de plasma sanguíneo a un nivel de referencia; en el que la diferencia o la similitud entre el nivel de la a-sinucleína en la muestra de plasma, o la muestra de CSF y el estándar de referencia se correlaciona con el nivel de la a-sinucleína en el cerebro del sujeto de prueba. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-a-sinucleína, incluyendo fragmentos de unión al antígeno, variantes, y derivados de los mismos, descritos en el presente documento, pueden unirse a a-sinucleína con una afinidad suficiente para alterar la efluencia neta de la a-sinucleína del cerebro a la sangre, o del cerebro al CSF y estabilizar o recluir a-sinucleína en la sangre o en el CSF.

El sujeto de prueba a ser diagnosticado puede ser asintomático o preclínico para la enfermedad. En modalidades específicas los sujetos de prueba incluyen individuos que son pre-sintomáticos o tienen una enfermedad sinucleopática preclínica .

En modalidades específicas, el "estándar de referencia" en el método descrito en el presente documento comprende los niveles medidos de a-sinucleína en uno o más sujetos de control, en el que los sujetos de control incluyen individuos sanos e individuos con sinucleinopatías de diversa gravedad. Por ejemplo, el sujeto de control tiene una enfermedad sinucleinopática, por ejemplo la enfermedad de Parkinson (PD) , la demencia con cuerpos de Lewy (DLB) o la variante de cuerpo de Lewy de la enfermedad de Alzheimer (LBVAD) , en el que la similitud entre el nivel de a-sinucleína y el estándar de referencia indica que el sujeto a ser diagnosticado tiene una enfermedad sinucleinopática. Alternativamente, o además como un segundo control del sujeto de control no tiene una enfermedad sinucleinopática, en el que la diferencia entre el nivel de a-sinucleína y el estándar de referencia indica que el sujeto a ser diagnosticados tiene una enfermedad sinucleinopática . Preferiblemente, el sujeto a ser diagnosticado y el (los) sujeto (s) de control son de la misma edad .

En algunas modalidades, los métodos como se describen en el presente documento, comprenden además comparar el nivel de la a-sinucleína en la muestra de plasma (es decir, la muestra de ensayo) con una muestra de plasma (es decir, muestra de la línea de base) obtenida del sujeto de prueba antes de la administración del anticuerpo anti-a-sinucleína incluyendo fragmentos de unión al antígeno, variantes, y derivados de los mismos. En otras modalidades, los métodos descritos en el presente documento, comprender, además, comparar el nivel de la a-sinucleína en la muestra de CSF (es decir, la muestra de ensayo) con una muestra de CSF (es decir, muestra de la línea de base) obtenida del sujeto de prueba antes de la administración de los anticuerpos anti-a-sinucleína incluyendo fragmentos de unión al antígeno, variantes, y derivados de los mismos. Por ejemplo, la comparación se puede hacer a una muestra de la línea de base en lugar de o además de la comparación con un estándar de referencia. A este respecto, la muestra de la línea de base se puede utilizar para calibrar las muestras de prueba al estándar de referencia (por ejemplo, la medición de una diferencia o una relación en lugar de un valor absoluto) .

Por una modalidad adicional, las moléculas de unión anti-o¡-sinucleína, en particular, anticuerpos anti-a-sinucleína, como se describe en el presente documento, también se pueden utilizar en un método para el diagnóstico de un trastorno en un individuo mediante la obtención de una muestra de fluido corporal del individuo sometido a pruebas que puede ser una muestra de sangre, una muestra de linfa, una muestra de CSF o cualquier otra muestra de fluido corporal, y poner en contacto la muestra de fluido corporal con un anticuerpo anti-oí-sinucleína como se describe en el presente documento, en condiciones que permitan la formación de complejos anticuerpo-antígeno. El nivel de tales complejos se determina entonces por métodos conocidos en la técnica, un nivel significativamente más alto que el formado en una muestra de control que indica la enfermedad en el individuo sometido a pruebas. De la misma manera, el antígeno específico unido por los anticuerpos anti-a-sinucleína como se describe en el presente documento también se puede utilizar. Por lo tanto, la descripción se refiere a un inmunoensayo in vitro que comprende una molécula de unión anti-a-sinucleína, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de la descripción .

El nivel de a-sinucleína puede ser evaluada por cualquier método adecuado conocido en la técnica que comprende, por ejemplo, analizar la a-sinucleína por medio de una o más técnicas elegidas de Western blot, inmunoprecipitación, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) , radioinmunoensayo (RIA) , células activadas por fluorescente (FACS) , electroforesis bidimensional en gel, espectroscopia de masas (MS) , deserción láser asistida por matriz/ionización de tiempo de vuelo-MS (MALDI-TOF, por sus siglas en inglés) , deserción por láser de superficie mayor de ionización-tiempo de vuelo (SELDI-TOF, por sus siglas en inglés) , cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) , cromatografía líquida de proteína rápida (FPLC, por sus siglas en inglés) , cromatografía líquida multidimensional (LC) seguido por espectrometría de masas tándem (MS/MS) , y densitometría láser. Preferiblemente, la imágen in vivo de -sinucleína comprende la tomografía por emisión de positrones (PET, por sus siglas en inglés) , tomografía por emisión de fotón único (SPECT, por sus siglas en inglés) , infrarrojo cercano (NIR) de imágenes ópticas o de imágenes por resonancia magnética (MRI, por sus siglas en inglés) .

Como es bien conocido en el ámbito médico, las dosis para cualquier paciente depende de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, área de superficie corporal, la edad, el compuesto particular a administrar, el sexo, tiempo y vía de administración, la salud general, y otros fármacos que se administran de forma concurrente. Generalmente, la dosificación puede variar, por ejemplo, de aproximadamente 0.0001 a 100 mg/kg, y más habitualmente de 0.01 a 5 mg/kg (por ejemplo, 0.02 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, etc.), del peso corporal del huésped. Por ejemplo, las dosis pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg. Las dosis intermedio en los intervalos anteriores también tienen la intención de estar dentro del alcance de la descripción. El término "administración periférica" se describe en el presente.

En ciertas modalidades, un conjunto a base de anticuerpos se puede utilizar, por ejemplo, que se carga con los anticuerpos anti-oí-sinucleína o moléculas de unión al antígeno equivalente de la descripción que reconocen específicamente a-sinucleína . Diseño de inmunoensayos de microarreglos se resume en Kusnezow et al., Mol. Cell Proteomics 5:1681-1696 (2006) . Por consiguiente, la descripción también se refiere a microarreglos cargados con moléculas de unión ant i - -sinucleína identificadas de conformidad con la presente descripción.

En algunas modalidades, los métodos como se describen en el presente documento también están dirigidos al uso de anticuerpos anti-a-sinucleína, incluyendo fragmentos de unión al antígeno, variantes, y derivados de los mismos, para seguir el nivel de a-sinucleína en el cerebro de un sujeto que está siendo tratado por una enfermedad sinucleinopática, que comprende examinar el nivel de a-sinucleína en el plasma sanguíneo del sujeto, o el CSF del sujeto en un momento determinado después de la administración periférica de un anticuerpo anti- -sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo pueden unirse a a-sinucleína con una afinidad suficiente para alterar la efluencia neta de la a-sinucleína del cerebro a la sangre, o del cerebro al CSF; y en el que el nivel de a-sinucleína en el plasma sanguíneo del sujeto, o el CSF del sujeto se correlaciona con el nivel en el cerebro del sujeto. En modalidades específicas, el método como se describe en el presente documento, comprende además examinar el nivel de a-sinucleína en el plasma sanguíneo del sujeto, o el CSF del sujeto en un momento determinado después de las administraciones periféricas adicionales del anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo, trazando con ello el cambio en el nivel de a-sinucleína en el cerebro del sujeto con el tiempo.

En algunas modalidades, los métodos como se describen en el presente documento también se dirigen al uso de anticuerpos anti-a-sinucleína, incluyendo fragmentos de unión al antígeno, variantes, y derivados de los mismos, para seguir el nivel de a-sinucleína en el cerebro de un sujeto que está siendo tratado por una enfermedad sinucleinopática, que comprende examinar el nivel de a-sinucleína en el plasma sanguíneo del sujeto, o el CSF del sujeto en un momento determinado después de la administración periférica de un anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo se estabiliza o recluye a-sinucleína en la sangre o en el CSF; y en el que el nivel de -sinucleína en el plasma sanguíneo del su eto, o el CSF del sujeto se correlaciona con el nivel en el cerebro del sujeto. En modalidades específicas, el método como se describe en el presente documento, comprende además examinar el nivel de a-sinucleína en el plasma sanguíneo del sujeto, o el CSF del sujeto en un momento determinado después de la administración periférica adicionales del anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo, trazando con ello el cambio en el nivel de a-sinucleína en el cerebro del sujeto con el tiempo.

Algunas modalidades incluyen métodos como los descritos en el presente documento, en el que el intervalo de tiempo especificado es menos de 12 meses, menos de 11 meses, menos de 10 meses, menos de 9 meses, menos de 8 meses, menos de 7 meses, menos de 6 mes, menos de 5 meses, menos de 4 meses, menos de 3 meses, menos de 2 meses, menos de un mes, menos de una semana, o menos o igual a 24 horas, o menos o igual a 3 horas .

V. COMPOSICIONES Y MÉTODOS DE ADMINISTRACIÓN Los métodos de preparación y administración de anticuerpos anti-oí-sinucleína, o fragmentos de unión al antígeno, variantes, o derivados de los mismos a un sujeto en necesidad del mismo son bien conocidos o se determinan fácilmente por los técnicos en la materia. La vía de administración de un anticuerpo anti-a-sinucleína, o fragmento de unión al antígeno, variante, o derivado del mismo, puede ser, por ejemplo, oral, parenteral, por inhalación o tópica. El término "administración periférica" como se utiliza en el presente incluye, por ejemplo, intravenosa, intraarterial , intraperitoneal , intramuscular, subcutánea, rectal, o administración vaginal. Mientras que todas estas formas de administración están claramente contempladas dentro del alcance de la descripción, un ejemplo de una forma para la administración sería una solución para inyección, en particular, para inyección o infusión intravenosa o intraarterial. Una composición farmacéutica adecuada para inyección puede comprender un amortiguador (por ejemplo, acetato, fosfato o amortiguador de citrato) , un tensioactivo (por ejemplo, polisorbato) , opcionalmente un agente estabilizante (por ejemplo, albúmina humana) , etc.

Como se comenta en el presente, los anticuerpos anti-a-sinucleína, o fragmentos de unión al antígeno, variantes, o derivados de los mismos pueden formularse para facilitar la administración y promover la estabilidad del agente activo. En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente descripción comprenden un vehículo armacéuticamente aceptable no tóxico, estéril, tal como solución salina fisiológica, amortiguadores no tóxicos, conservadores y similares. Para los fines de la presente solicitud, una cantidad farmacéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-a-sinucleína, o fragmento de unión al antígeno, variante, o derivado del mismo, se emplea para referirse a una cantidad suficiente para lograr la unión eficaz a un objetivo y para lograr un beneficio, por ejemplo, para alterar la efluencia neta de -sinucleína del cerebro a la sangre, o para alterar la efluencia neta de a-sinucleína del cerebro al CSF.

Las composiciones farmacéuticas utilizadas en esta descripción comprenden portadores farmacéuticamente aceptables, incluyendo, por ejemplo, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como albúmina de suero humano, sustancias amortiguador tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, fosfato hidrógeno disódico, fosfato hidrógeno de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa, polietilenglicol , carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos , ceras, polímeros de bloque polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol , y grasa de lana.

Las preparaciones para administración periférica incluyen soluciones estériles acuosas o no acuosas, suspensiones, y emulsiones. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol , polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen, por ejemplo, agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medios amortiguados. En la presente descripción, los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, 0.01-0.1 M de amortiguador de fosfato o 0.8% de solución salina. Otros vehículos parenterales comunes incluyen soluciones de fosfato de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, Ringer lactato, o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos, tales como los basados en dextrosa de Ringer, y similares. Los conservadores y otros aditivos también pueden estar presentes, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, y gases inertes y similares.

Más particularmente, las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (donde soluble en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En tales casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil inyectabilidad . Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se conserva preferiblemente contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol , y polietilenglicol líquido, y similares) , y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos . Las formulaciones adecuadas para uso en los métodos terapéuticos descritos en el presente documento se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16a ed. (1980).

La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos , por ejemplo, parabenos, clorobutanol , fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes , tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

En cualquier caso, las soluciones inyectables estériles pueden prepararse mediante la incorporación de un compuesto activo (por ejemplo, un anti - -anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno, variante, o derivado del mismo, por sí mismo o en combinación con otros agentes activos) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados en el presente documento, como se requiere, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril, que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secados al vacío y liofilización, que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente filtrada estéril del mismo. Las preparaciones para inyecciones se procesan, envasan en recipientes tales como ampolletas, bolsas, botellas, jeringas o viales, y se sellan en condiciones asépticas de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Además, las preparaciones pueden ser empaquetadas y vendidas en forma de un kit . Tales artículos de fabricación pueden tener etiquetas o los prospectos que indican que las composiciones asociadas son útiles para el tratamiento de un sujeto que sufre o está predispuesto a una enfermedad o trastorno.

Las formulaciones parenterales pueden ser una sola dosis de bolo, una infusión o una dosis de bolo de carga seguida de una dosis de mantenimiento. Estas composiciones pueden administrarse a intervalos fijos o variables específicos, por ejemplo, una vez al día, o en una base de "según sea necesario" .

Ciertas composiciones farmacéuticas, como se describe en el presente documento, se pueden administrar por vía oral en una forma de dosificación aceptable, incluyendo, por ejemplo, cápsulas, comprimidos, suspensiones o soluciones acuosas. Ciertas composiciones farmacéuticas pueden administrarse también por aerosol nasal o inhalación. Tales composiciones se pueden preparar como soluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservadores adecuados, promotores de absorción para potenciar la biodisponibilidad, y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes convencionales.

La cantidad de un anticuerpo anti-a-sinucleína, o fragmento, variante, o derivado del mismo, para ser combinada con los materiales portadores para producir una forma de dosificación única variará dependiendo del hospedero tratado y del modo particular de administración. La composición se puede administrar como una dosis única, múltiples dosis o durante un período de tiempo establecido en una infusión. Los regímenes de dosificación también se pueden ajustar para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica) .

La práctica de la descripción empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante, e inmunología, que están dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed. , Sambrook et al., ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989) ; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al, ed, Cold Springs Harbor Laboratory, Nueva York (1992) , DNA Cloning, D.N. Glover ed. , Volúmenes I y II (1985); Oligonucleotide Synthesis, M.J. Gait ed. , (1984); Mullís et al. La Patente de E.U.A. N° : 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization, B.D. Hames & S.J. Higgins eds . (1984); Transcription And Translation, B.D. Hames y S.J. Higgins eds. (1984); Culture Of Animal Cells, R.I. Freshney, Alan R. Liss, Inc. , (1987) ; Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, (1986) ; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); el tratado, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc., Nueva York; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller y M.P. Calos eds . , Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods In Enzymology, Vols. 154 y 155 (Wu et al. Eds.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, Caner y Walker, eds., Academic Press, Londres (1987); Handbook Of Experimental Immunology, volúmenes I -IV, D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds., (1986); Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, (1986); y en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989) .

Los principios generales de la modificación de anticuerpos se exponen en Antibody Engineering, segunda edición, CAK Borrebaeck, Ed. , Oxford Univ. Press (1995). Los principios generales de la modificación de proteínas se expone en Protein Engineering, A Practical Approach, Rickwood, D., et al., Eds., IRL Press at Oxford Univ. Impresiones, Oxford, Ing. (1995) . Los principios generales de anticuerpos y anticuerpo-hapteno de unión se exponen en: Nisonoff, A., Molecular Immunology, 2a ed, Sinauer Associates, Sunderland, MA (1984); y Steward, MW, Antibodies, Their Structure and Function, Chapman y Hall, Nueva York, Nueva York (1984) . Además, los métodos estándar en inmunología conocidos en la técnica y no se descritos específicamente son en general seguidos como en Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York; Stites et al. (eds), Basic and Clinical- Immunology (8a ed.), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) y Mishell y Shiigi (eds.), Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Co., Nueva York (1980) .

Las obras de referencia estándar que exponen los principios generales de la inmunología incluyen Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York; Klein, J. , Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, Nueva York (1982); Kennett, R. , et al, eds, Monoclonal Antibodies, Hybridoma : A New Dimensión in Biological Analyses, Plenum Press, Nueva York (1980); Campbell, A., "Monoclonal Antibody Technology" en Burden, R. , et al., Eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol . 13, Elsevere, Amsterdam (1984), Kuby Immunnology 4a ed. Ed. Richard A. Goldsby, Tomas J. Kindt y Barbara A. Osborne, H. Freemand & Co . (2000); Roitt, I., Brostoff, J. y Male D., Immunnology 6a ed. Londres: Mosby (2001); Abbas A., Abul, A. y Lichtman, A., Cellular and Molecular Immunology Ed. 5, División de Ciencias de la Salud de Elsevier (2005) ; Kontermann y Dubel, Antibody Engineering, Springer Verían (2001) ; Sambrook y Russell, Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press (2001); Lewin, Genes VIII, Prentice Hall (2003); Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); Dieffenbach y Dveksler, PCR Primer Cold Spring Harbor Press (2003) .

EJEMPLOS Las descripciones detalladas de métodos convencionales, tales como los empleados en el presente documento se pueden encontrar en la literatura citada. A menos que se indique lo contrario más abajo, la identificación de las células ?-a-sinucleína específica y la clonación molecular de anticuerpos a-sinucleína que exhiben especificidad de interés, así como su expresión recombinante y caracterización funcional ha sido o puede ser realizado como se describe en las secciones de Ejemplos y Métodos Complementarios de las solicitudes internacionales PCT/EP2008/000053 publicada como WO2008/081008 y PCT/EP2009/009186 publicada como WO2010/069603 , el contenido de la descripción de las cuales se incorporan en el presente como referencia en su totalidad. Ejemplo 1: Pico del plasma de a-sinucleína humana dependiente de dosis en la administración 12F4 en ratones transgénicos que sobreexpresan a-sinucleína humana Este ejemplo describe la determinación de los niveles de a-sinucleína humanas en plasma de ratón en ratones transgénicos que sobreexpresan a-sinucleína humana después de la inyección de anticuerpo 12F4. Ratones transgénicos de tres meses y medio de edad que sobreexpresan a-sinucleína humana de tipo salvaje (peso) (PDGF -h [peso] a-sinucleína), es decir, la línea D; . Masliah et al, Science, 287 (5456) : 1265-9 (2000) fueron inyectados intraperitonealmente con una dosis única de O, 0.3, 1, 3, 10 o 30 mg/kg de anticuerpo 12F . Los anticuerpos monoclonales recombinantes funcionales 12F4 y 12F4 quimérico se obtuvieron con co-transíección en células CHO (o cualquier otra línea celular de receptor adecuada de origen humano o de ratón) de un vector de expresión de cadena pesada de Ig y un vector de expresión de cadena ligera Ig Kappa o lambda. El anticuerpo monoclonal recombinante se purificó posteriormente a partir del medio acondicionado utilizando una purificación en columna de proteína A estándar una como se describe en WO2008/081008. El anticuerpo monoclonal humano recombinante se puede producir en cantidades ilimitadas utilizando ya sea transitoria o establemente las células transíectadas . El anticuerpo quimérico 12F4 tuvo mutaciones inducidas iniciales en el extremo N-terminal de las regiones variables de Ig que se están ajustando a la línea germinal (GL) secuencias de cadenas pesadas y ligeras variables humanas (ver WO2010/069603) , y se expresó como una molécula quimérica donde los dominios variables humanos ajustados se fusionaron a regiones constantes de ratón IgG2a.

Los ratones transgénicos -sinucleína de línea D se mantuvieron en condiciones de alojamiento estándar en un ciclo invertido luz/oscuridad 12h:12h con acceso libre a comida y agua. Los grupos de tratamiento fueron equilibrados por edad y sexo. 24 horas después de la inyección, se prepararon muestras de plasma y las concentraciones plasmáticas de a-sinucleína humana se determinaron mediante un sándwich ELISA (Invitrogen, E.U.A.). Las muestras de plasma se diluyeron a 1:4 y los estándares se prepararon en amortiguador de dilución 1:4 con el plasma de los ratones WT. Los resultados fueron controlados por la influencia del anticuerpo 12F4 en las lecturas de ELISA. Los niveles plasmáticos de anticuerpo 12F4 se determinaron por un ELISA de captura Fcg humana usando 12F4 recombinante de concentración conocida como estándar. Los estándares se prepararon en PBS que contenía plasma diluido a partir de los ratones de tipo salvaje.

Los niveles plasmáticos de a-sinucleína humana se incrementaron significativamente después de una sola dosis de 1, 3, 10 o 30 mg/kg de anticuerpo 12F4 en comparación con el control del vehículo. El aumento de la a-sinucleína humana plasmática en dosis significativamente dependiente (Figuras 1A y IB) . No se detectaron niveles significativos de a-sinucleína humana en los ratones que fueron tratados sólo con vehículo (Figura IB) .

Ejemplo 2: Duración del pico de a-sinucleína plasmática y concentración plasmática 12F4 Este ejemplo describe la duración de los cambios en los niveles de a-sinucleína humanas y los niveles de anticuerpos 12F4 en plasma de ratón en ratones transgénicos que sobreexpresan a-sinucleína humana, medido a través del tiempo. Ratones transgénicos de ocho meses de edad que sobreexpresan a-sinucleína humana A53T (PRP-h [A53T] a-sinucleína) (Giasson et al, Neuron, 34: 521-533 (2001)) fueron inyectados intraperitonealmente con una dosis única de 5 mg/Kg de anticuerpos 12F4 y se recolectaron muestras de plasma en los puntos de tiempo 0, 1, 24, 72 y 168 horas después de la inyección. La a-sinucleína humana plasmática se cuantificó por ELISA como se describe en el Ejemplo 1. La Figura 2 muestra que la a-sinucleína plasmática humana ya sube en lhr y luego disminuye con el tiempo. Por otro lado, niveles más altos de anticuerpo 12F4 se encontraron en el punto de tiempo de 24 horas y los niveles plasmáticos 12F4 parece que disminuyen más lentamente que los niveles de a-sinucleína humanas.

Ejemplo 3: tratamiento 12F4 de dosis alta aguda de ratones transgénicos que sobreexpresan a-sinucleína humana reduce los niveles cerebrales de a-sinucleína humana que se correlacionan con los niveles plasmáticos de -sinucleína humana Este ejemplo describe la determinación de los niveles de a-sinucleína humana en muestras de cerebro después de la inyección de anticuerpo 12F4. Ratones transgénicos de tres meses y medio de edad que sobreexpresan a-sinucleína humana de tipo salvaje (PDGF -h [peso] a-sinucleína, linea D] fueron inyectados intraperitonealmente con cuatro de 50 mg/kg dosis de anticuerpo 12F4 plazo de 8 días (72, 144 y 192 horas después de la primera inyección) . 24 horas después de la última inyección se sacrificó o perfundió a los animales con PBS . La corteza y el hipocampo se homogeneizaron en PBS y soluble (PBS-soluble) e insolubles (PBS- insolubles) fracciones de cerebro se prepararon por centrifugación diferencial. Específicamente, el cerebro se eliminó, se diseccionó y se congeló a -80 °C. Los tejidos cerebrales congelados se homogeneizaron en 10 volúmenes (v/p) de PBS utilizando un homogeneizador Dounce (500 rpm, 30 golpes) y sonificación durante 1 min. Los restos celulares se removieron por centrifugación a 5000 g durante 5 min (4°C) . El sobrenadante (SN) se centrifugó durante 1 hora (4°C) a 35,000 rpm (rotor Ti51; Beckman-Coulter) . El SN resultante fue la fracción soluble designada. El pelotilla se resuspendió en 1% Tritón PBS y se sonificó (3xlmin) . Esta fracción se designa fracción insoluble.

Los niveles de a-sinucleína humanas en ambas fracciones se cuantificaron mediante un sándwich ELISA (Invitrogen, E.U.A.) y se normalizaron al contenido de proteína. Como se muestra en la Figura 3A solubles niveles de a-sinucleína humana corticales solubles de ratones tratados con 12F4 se redujeron significativamente en un 34% (190 ± 29 yg/g para 12F4 vs 288 ± 36 pg/g para el control del vehículo, n = 10, p<0.05, Prueba del Estudiante). Del mismo modo, se observó una reducción del 33% de a-sinucleína humana soluble del hipocampo (Figura 3B)-(119 ± 22 pg/g para 12F4 vs 178 ± 30 pg/g para el control del vehículo, n = 9-10, p = 0.14, la prueba de Student) y una reducción del 26% de a-sinucleína humana insoluble del hipocampo (Figura 3C)-(23 ± 3 yg/g para 12F4 vs 31 + 6 yg/g para el control del vehículo, n = 9-10, p = 0.29, la prueba de Student) después del tratamiento agudo de 12F4. Estos resultados muestran que un tratamiento corto con 12F4 conduce a una reducción de la patología cerebral a-sinucleína en ratones transgénicos que sobreexpresan a-sinucleína humana.

Con el fin de ver si el aumento de plasma a-sinucleína humana observada estaba relacionada con la patología cerebral a-sinucleína, los niveles de a-sinucleína humana plasmática se representaron frente a los niveles cerebrales de a-sinucleína humana. Hubo una correlación altamente significativa entre los niveles de a-sinucleína humana plasmática y los niveles de a-sinucleína humana solubles corticales (Figura 4A) , con los niveles de a-sinucleína humana soluble del hipocampo (Figura 4B) , y los niveles de a-sinucleína humana insoluble del hipocampo (Figura 4C) después del tratamiento agudo de 12F . No se observó correlación entre el plasma y la a-sinucleína cerebral en el tratamiento con vehículo.

Ejemplo 4: Correlación entre el plasma y los niveles cerebrales de a-sinucleína humana después del tratamiento crónico de 12F4 de ratones transgénicos que sobreexpresan a-sinucleína humana Este ejemplo describe la determinación de los niveles de a-sinucleína humana en muestras de cerebro después de inyecciones semanales con anticuerpo 12F4 durante seis meses.

Ratones transgénicos de seis meses de edad que sobreexpresan a-sinucleína de peso humano A30P (Thyl -h [A30P] -a-sinucleína) (Kahle et al, Am J Pathol, 159 (6) : 2215-2225 (2001) ) se inyectaron por vía intraperitoneal semanalmente con 10 mg/kg de 12F4 quimérico durante 6 meses. Las muestras de plasma y cerebro se prepararon 24 horas después de la última inyección. Cortex/hipocampo se homogeneizaron juntos en PBS y soluble (soluble en PBS) e insolubles (PBS-insolubles) fracciones de cerebro se prepararon por centrifugación diferencial como se describe en el Ejemplo 3. Los niveles de a-sinucleína humana en ambas fracciones se cuantificaron por ELISA y se normalizaron a contenido de proteína como se describe en el Ejemplo 3. Los niveles de a-sinucleína humana plasmática (Figura 5A) y los niveles de 12F4 quiméricos (Figura 5B) se determinaron por ELISA. Los niveles a-sinucleína humana plasmática se determinaron como se describe en el Ejemplo 1, y los niveles plasmáticos 12F4 quiméricos se determinaron utilizando a-sinucleína directa ELISA utilizando 12F4 quimérico recombinante de concentración conocida como estándar .

Con el fin de ver si el plasma y cerebro a-sinucleína correlacionan en tratamiento crónico con 12F4 quimérico, los niveles de a-sinucleína humana plasmática se representan frente a los niveles de a-sinucleína humana cerebral. Hubo una correlación significativa entre los niveles de a-sinucleína en plasma y en el cerebro después del tratamiento crónico durante seis meses con 12F4 quimérico de ratones transgénicos que sobreexpresan a-sinucleína humana. (Figura 5C) .

Ejemplo 5: Pico del líquido cefalorraquídeo (CSF) de a-sinucleína en la administración de 12F4 en monos cinomolgus .

Este ejemplo describe la determinación de los niveles de 12F4 en el suero y el líquido cefalorraquídeo (CSF) , así como los niveles de a-sinucleína endógenos en el CSF de monos cinomolgos tras la administración de 12F4. Tres monos cinomolgos machos ingenuos fueron inyectados por vía intravenosa con una dosis única de 10 mg/kg de 12F4. Los animales se mantuvieron en ayunas de 1 a 12 minutos antes de la administración de 12F4 y 2 horas después de la recolección de muestras de CSF. Las muestras de sangre (aproximadamente 0.5 ml/muestra) se obtuvieron de la vena/arteria femoral en 0.5, 2, 5, 24, 48, 72, 96, 168, 240, 336, 408, 504, 672 y 840 horas después de la dosis. Las muestras se dejaron coagular durante al menos 30 minutos y se centrifugaron en condiciones ambientales después de la finalización de la recolección de la muestra en cada intervalo. El suero resultante se separó y se almacenó o congeló de -50 a -90° hasta su envío en hielo seco para su análisis. Los niveles séricos de 12F4 se determinaron por un sandwich ELISA (Covance) .

Las concentraciones de a-sinucleína endógenas y 12F4 también se determinaron por ELISA (Covance) en las muestras recolectadas de CSF de la cisterna magna en diversos puntos temporales después de la dosis. Antes de la recolección de muestras de CSF, los animales fueron sedados con una inyección intramuscular (IM) de inyección de 0.1 mg/kg de acepromazina maleato, con dosis de mantenimiento adicionales según sea necesario. La anestesia fue inducida con una inyección IM de 20 mg/kg de ketamina. La parte posterior de la cabeza se afeitó para el acceso a la cisterna magna y el sitio de acceso se preparó con líquido clorhexidina y solución de clorhexidina dentro de un campo estéril. El animal se colocó en una posición de decúbito lateral y la cabeza fue traída hacia adelante hasta la barbilla descansada sobre el pecho. Utilizando una técnica aséptica, un catéter sobre la aguja fue utilizado para acceder a la cisterna magna. A los animales se les administró 0.01 mg/kg de buprenorfina IM tres veces al día, aproximadamente cada 6 a 9 horas (comenzando antes de la recolección de CSF) en cada día de la recogida de muestras. Después de la anestesia y la toma de muestras de CSF, los animales fueron monitoreados de cerca durante la recuperación de alteraciones fisiológicas incluyendo la depresión cardiovascular/respiratoria, hipotermia y sangrado excesivo de la zona quirúrgica. Las muestras de CSF (aproximadamente 0.2 ml/muestra) se recolectaron a las 2, 24, 72, 168, 336, 504 y 672 horas después de la dosis de la cisterna magna y se colocan en hielo. Las muestras se almacenaron congelados de -50 a -90°C hasta su envío en hielo seco para su análisis.

La relación 12F4 CSF/suero fue de alrededor de 0.1% como se esperaba para un anticuerpo IgG humano. La a-sinucleína de CSF aumentó aproximadamente 5 veces por tratamiento de 12F4. (Figura 6) .

Ejemplo 6: Microdiálisis in vivo en ratones a-sinucleína transgénicos Este ejemplo describe la determinación de los niveles de a-sinucleína en el plasma y en el cerebro el líquido intersticial (ISF) tras la administración de 12F4 en ratones transgénicos A53T a-sinucleína. La microdiálisis in vivo en ratón transgénico ISF a-sinucleína se llevó a cabo tras la administración de 12F4 o control del vehículo (anticuerpo IgG control) . En concreto, las cánulas de guía se implantaron estereotáxicamente en el cuerpo estriado de ratones transgénicos A53T de 6-9 meses de edad a-sinucleína (B6; C3-Tg (PrP-SNCA * A53T) 83Vle/J) bajo anestesia con isoflurano (4-2,5%) . La cabeza se afeitó y la piel se cortó con un escalpelo estéril para exponer el cráneo. Las perforaciones se hicieron sobre el cuerpo estriado derecho de acuerdo con el atlas de Paxinos y Franklin (The Mouse Brain in stereotoxic Coordinates, segunda edición (2004)) (coordenadas, AP = +0.5 mm, ML = -2.2 mm, DV = -2.4 mm) . Se insertaron CMA- 12 cánulas de guía (CMA Microdiálisis AB, Suecia) y se fijaron al cráneo con tornillos de acero inoxidable y cemento dent l. Los ratones se retiran del dispositivo estereotáxico y se dejaron recuperar en jaulas individuales. Cinco días después de la cirugía, los ratones fueron retirados a la(s) jaula (s) de microdiálisis . Se insertaron y se conectan a una bomba de CMA con un caudal constante de 0.6 µ 1/min CMA- 12 sondas por encargo (2 mm, 100 kDa de corte) . La perfusión se realizó en el CSF artificial que contiene BSA como un agente osmótico. Antes de la recolección de la muestra, la sonda se dejó equilibrar durante 4-20 horas con la misma velocidad de flujo. Las muestras de línea de base fueron recolectadas principalmente cada dos horas durante 2 horas. 12F4 o control del vehículo, se inyectaron por vía intraperitoneal en una dosis única de 30 mg/kg. Después de la inyección se recogieron muestras cada hora durante aproximadamente 24 horas. Todas las muestras fueron recolectados a través de un recolector de fracciones refrigerada y se almacenaron a -80°C hasta su análisis por en sándwich ELISA de ultrasensible a-sinucleína (Emmanouilidou et al, PLoS ONE 6 (7): e22225 (2011)). Las muestras de plasma también se recogieron antes de la dosis y a las 2 y 24 horas después de la dosis, y luego se analizaron mediante un sándwich ELISA específica a-sinucleína humana (Invitrogen, Carlsbad CA) .

Hubo una reducción de aproximadamente 60% en el extracelular, ISF -sinucleína, 2-3 horas después de la administración de 12F4. El control del vehículo no alteró los niveles de a-sinucleína ISF en el microdializado . (Figura 7) . Ejemplo 7: Efecto de anticuerpo anti-a-sinucleína en concentración de -sinucleína de líquido cefalorraquídeo (CSF) en un modelo de rata de AAV-a-sinucleína El efecto de los anticuerpos anti-a-sinucleína en la concentración de a-sinucleína CSF se evaluará en un viral adeno-asociado (AAV) -a- sinucleína modelo de rata. Los vectores de AAV se crearán para expresar ya sea la oí-sinucleína humana de tipo salvaje o una de las variantes de secuencia de o¡ -sinucleína humana que están asociados con la enfermedad de Parkinson familiar (por ejemplo, A53T o A30P) . El vector de AAV-a-sinucleína se inyecta en una región específica del cerebro de rata adulta (por ejemplo, cuerpo estriado, la corteza o el hipocampo) o en el ventrículo lateral de una rata neonatal. Se permitirá un período de uno a varios meses para que la concentración de a- sinucleína humana se acumule en el cerebro. En ese momento, las ratas se trataron con un anticuerpo anti-a-sinucleína por la administración intraperitoneal o intravenosa y las muestras de CSF se tomarán en varios momentos. La concentración de a-sinucleína se medirá en las muestras de CSF por ELISA.

La descripción no está limitada en su alcance por las modalidades específicas descritas que están destinadas como ilustraciones de aspectos individuales de la descripción, y cualquier composiciones o métodos que son funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de esta descripción. De hecho, diversas modificaciones de la descripción, además de las mostradas y descritas en el presente documento serán evidentes para los técnicos en la materia a partir de la descripción anterior y las figuras adjuntas. Tales modificaciones están destinadas a caer dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en esta descripción se incorporan en el presente por referencia en la misma medida como si cada publicación individual o solicitud de patente fue específica e individualmente indicada para ser incorporada por referencia.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (32)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para diagnosticar un nivel elevado de a-sinucleína en el cerebro de un sujeto de prueba caracterizado porque comprende : (a) examinar el nivel de a-sinucleína en una muestra de plasma sanguíneo obtenida del sujeto de prueba en un intervalo especificado después de la administración periférica al sujeto de prueba de un anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse a a-sinucleína con una afinidad suficiente para alterar la efluencia neta de o¡-sinucleína del cerebro a la sangre; (b) comparar el nivel examinado de la a-sinucleína en el sujeto de prueba con un estándar de referencia; en donde la diferencia o la similitud entre el nivel de a-sinucleína en la muestra de plasma y el estándar de referencia se correlaciona con el nivel de a-sinucleína en el cerebro del sujeto de prueba.

2. Un método para diagnosticar un nivel elevado de a-sinucleína en el cerebro de un sujeto de prueba caracterizado porque comprende: (a) proporcionar un anticuerpo anti- -sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo pueden unirse a a-sinucleína con una afinidad suficiente para alterar la efluencia neta de a-sinucleína del cerebro a la sangre ; (b) dirigir un profesional de la salud para administrar periféricamente el anticuerpo al sujeto de prueba y obtener una muestra de plasma sanguíneo del sujeto en un intervalo de tiempo especificado después de la administración; (c) examinar el nivel de -sinucleína en la muestra de plasma sanguíneo; (d) comparar el nivel examinado de oí-sinucleína en el sujeto de prueba con un estándar de referencia; en donde la diferencia o la similitud entre el nivel de la a-sinucleína en la muestra de plasma y el estándar de referencia se correlaciona con el nivel de a-sinucleína en el cerebro del sujeto de prueba.

3. Un método para diagnosticar un nivel elevado de a-sinucleína en el cerebro de un sujeto de prueba caracterizado porque comprende: (a) administrar periféricamente un anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo al sujeto de prueba, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo pueden unirse a a-sinucleína con una afinidad suficiente para alterar la efluencia neta de la a-sinucleína del cerebro a la sangre ; (b) obtener una muestra de plasma sanguíneo del sujeto de prueba en un intervalo de tiempo especificado después de la administración, y presentar la muestra para la determinación del nivel de la a- sinucleína; (c) comparar el nivel de la oí-sinucleína en la muestra de plasma sanguíneo con un estándar de referencia; en donde la diferencia o la similitud entre el nivel de la c¡ -sinucleína en la muestra de plasma y el estándar de referencia se correlaciona con el nivel de la a-sinucleína en el cerebro del sujeto de prueba.

4. Un método para diagnosticar un nivel elevado de -sinucleína en el cerebro de un sujeto de prueba caracterizado porque comprende : (a) examinar el nivel de oí-sinucleína en una muestra de CSF obtenida del sujeto de prueba en un intervalo especificado después de la administración periférica al sujeto de prueba de un anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de los mismos puede unirse a a- sinucleína con una afinidad suficiente para alterar la efluencia neta de a-sinucleína del cerebro al CSF; (b) comparar el nivel examinado de a-sinucleína en el sujeto de prueba con un estándar de referencia; en donde la diferencia o la similitud entre el nivel de a-sinucleína en la muestra de CSF y el estándar de referencia se correlaciona con el nivel de a-sinucleína en el cerebro del sujeto de prueba.

5. Un método para diagnosticar un nivel elevado de a-sinucleína en el cerebro de un sujeto de prueba caracterizado porque comprende : (a) proporcionar un anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo pueden unirse a a-sinucleína con una afinidad suficiente para alterar la efluencia neta de a-sinucleína del cerebro a CSF; (b) dirigir un profesional de la salud para administrar periféricamente el anticuerpo al sujeto de prueba y obtener una muestra de CSF del sujeto en un intervalo de tiempo especificado después de la administración; (c) examinar el nivel de a-sinucleína en el CSF; (d) comparar el nivel examinado de a-sinucleína en el sujeto de prueba con un estándar de referencia; en donde la diferencia o la similitud entre el nivel de la a-sinucleína en la muestra de CSF y el estándar de referencia se correlaciona con el nivel de a-sinucleína en el cerebro del sujeto de prueba.

6. Un método para diagnosticar un nivel elevado de a-sinucleína en el cerebro de un sujeto de prueba caracterizado porque comprende : (a) administrar periféricamente un anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo al sujeto de prueba, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo pueden unirse a a-sinucleína con una afinidad suficiente para alterar la efluencia neta de la a-sinucleína de cerebro a CSF; (b) obtener una muestra de CSF del sujeto de prueba en un intervalo de tiempo especificado después de la administración, y presentar la muestra para la determinación del nivel de la a-sinucleína; (c) comparar el nivel de la a-sinucleína en la muestra de CSF con un estándar de referencia; en donde la diferencia o la similitud entre el nivel de la a-sinucleína en la muestra de CSF y el estándar de referencia se correlaciona con el nivel de la a-sinucleína en el cerebro del sujeto de prueba .

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende además comparar el nivel de la a-sinucleína en la muestra de plasma a una muestra de plasma obtenida del sujeto de prueba antes de la administración del anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque comprende además comparar el nivel de la a-sinucleína en la muestra de CSF a una muestra de CSF obtenida del sujeto de prueba antes de la administración del anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el estándar de referencia comprende niveles medidos de a-sinucleína en uno o más sujetos de control, en donde los sujetos de control incluyen individuos sanos normales, y los individuos con sinucleinopatías de gravedad variable.

10. Un método de seguimiento del nivel de a-sinucleína en el cerebro de un sujeto que está siendo tratado por una enfermedad sinucleinopática, caracterizado porque comprende examinar al nivel de a-sinucleína en plasma sanguíneo del sujeto en un momento determinado después de la administración periférica de un anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo pueden unirse a a-sinucleína con una afinidad suficiente para alterar la efluencia neta de la a-sinucleína del cerebro a la sangre; y donde el nivel de a-sinucleína en el plasma sanguíneo del sujeto se correlaciona con el nivel en el cerebro del sujeto.

11. Un método de seguimiento de nivel de a-sinucleína en el cerebro de un sujeto que está siendo tratado por una enfermedad sinucleinopática, caracterizado porque comprende examinar el nivel de a-sinucleína en el CSF del sujeto en un momento determinado después de la administración periférica de un anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo pueden unirse a -sinucleína con una afinidad suficiente para alterar la efluencia neta de la oí-sinucleína del cerebro a CSF; y en donde el nivel de a-sinucleína en el CSF del sujeto se correlaciona con el nivel en el cerebro del sujeto.

12. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque comprende además examinar el nivel de a-sinucleína en plasma sanguíneo del sujeto en un tiempo especificado después de administraciones periféricas adicionales del anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo, trazando de esta manera el cambio en el nivel de -sinucleína en el cerebro del sujeto con el tiempo .

13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque comprende además examinar el nivel de a-sinucleína en el CSF del sujeto en un momento determinado después de las administraciones periféricas adicionales del anticuerpo anti-a-sinucleína o fragmento de unión al antígeno del mismo, trazando con ello el cambio en el nivel a-sinucleína en el cerebro del sujeto con el tiempo.

1 . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 , caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se une específicamente al mismo epítopo de a-sinucleína como anticuerpo de referencia que comprende VH y VL, en donde VH comprende la SEQ ID NO : 2 y VL comprende la SEQ ID NO: 3.

15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo inhibe competitivamente el anticuerpo de referencia que comprende VH y VL, en donde VH comprende la SEQ ID NO: 2 y VL comprende la SEQ ID NO: 3 de la unión a oc- sinucleína .

16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de la cadena ligera (VL) , en donde VH comprende una secuencia de aminoácidos de región- 1 determinante de complementariedad (VHCDR1) de la SEQ ID NO : 4.

17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende VH y VL, en donde VH comprende una secuencia de aminoácidos de la región- 2 determinante de complementariedad (VHCDR2) de SEQ ID NO: 5.

18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende VH y VL, en donde VH comprende una secuencia de aminoácidos de la región- 3 determinante de complementariedad (VHCDR3) de SEQ ID NO: 6.

19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende VH y VL, en donde VL comprende una secuencia de aminoácidos de la región- 1 determinante de complementariedad (VLCDRl) de SEQ ID NO: 7.

20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende VH y VL, en donde VL comprende una secuencia de aminoácidos de la región- 2 determinante de complementariedad (VLCDR2) de SEQ ID NO: 8.

21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende VH y VL, en donde VL comprende una secuencia de aminoácidos de la región- 3 determinante de complementariedad (VLCDR3) de SEQ ID NO: 9.

22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende VH y VL, en donde VH comprende Secuencias de aminoácidos VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de la SEC ID NO: 4, 5, 6.

23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende VH y VL, en donde VL comprende secuencias de aminoácidos VLCDRl, VLCDR2 , y VLCDR3 de la SEC ID NO: 7, 8, 9.

24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende VH y VL, en donde VH comprende Secuencias de aminoácidos VHCDRl, VHCDR2 y VHCDR3 de la SEC ID NO: 4, 5, 6, y VL, comprende secuencias de aminoácidos VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de la SEC ID NO : 7 8, 9.

25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de VH de la SEC ID NO: 2 y una secuencia de aminoácidos de VL de la SEC ID NO: 3.

26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo es un fragmento Fv de cadena única (scFv) , un fragmento F (ab1) , un fragmento F(ab) , o un fragmento F(ab')2.

27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, caracterizado porque la administración es por inyección intravenosa del anticuerpo.

28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, caracterizado porque el anticuerpo es humano .

29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 ó 14-28, caracterizado porque el intervalo de tiempo especificado es menor de una semana.

30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el intervalo de tiempo especificado es menor o igual a 24 horas .

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el intervalo de tiempo especificado es menor o igual a 3 horas .

32. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-13, caracterizado porque la enfermedad sinucleinopática se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Parkinson (EP) , demencia de la enfermedad de Parkinson (DEP) , la demencia con cuerpos de Lewy (DCL) , la variante de cuerpos de Lewy de la enfermedad de Alzheimer (LBVAD) , atrofia de sistemas múltiples (ASM) , insuficiencia autonómica pura (IAP) , neurodegeneración con acumulación de hierro del cerebro tipo-1 (NAHC-I) , la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Pick, distrofia neuroaxonal generalizada de aparición juvenil (enfermedad Hallervorden-Spatz) , esclerosis lateral amiotrófica, lesión cerebral traumática y el síndrome Down.