KR102036355B1 - 페북소스타트 또는 토피록소스타트의 암 전이의 예방 및 치료제로서의 용도 - Google Patents

페북소스타트 또는 토피록소스타트의 암 전이의 예방 및 치료제로서의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 페북소스타트(febuxostat) 또는 토피록소스타트(topiroxostat)의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 페북소스타트, 토피록소스타트 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 것을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제, 암의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 대한 것이다. 페북소스타트(febuxostat), 토피록소스타트(topiroxostat)는 암의 전이를 특이적으로 억제하는 효과가 현저하여, 암 예방 및 치료를 위한 새로운 수단을 제공한다.

Description

페북소스타트 또는 토피록소스타트의 암 전이의 예방 및 치료제로서의 용도{Use of Febuxostat or Topiroxostat as therapeutic agents for cancer metastasis}
본 발명은 페북소스타트(febuxostat) 또는 토피록소스타트(topiroxostat)의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 페북소스타트, 토피록소스타트 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 것을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제, 암의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 대한 것이다.
암 전이는 원발성 암에서 암 세포가 타 장기로 퍼져 새로운 암을 형성하는 것이다. 전이는 다양한 암 환자에서 목숨을 위협하는 주요 현상이기에 전이를 예방하거나 조절하는 것은 암 연구분야의 중요 목표이다. 암이 전이된 경우에는 기존에 알려진 항암치료 방법들의 효과가 감소된다. 임상적으로 암 전이의 전 과정은 아직 완벽히 이해되고 있지 못한 상태이지만, 상피 중배엽 이행 (Epithelial-Mesenchymal Transsition, EMT)은 암의 전이에 있어서 중요한 개념으로 인지되고 있다(Sarah Heerboth et al., EMT and tumor metastasis, Clin Transl Med. 2015; 4: 6.). 또한 암 전이에 관여하는 Wnt 신호전달계 인자와 이들의 역할이 규명되고 있다.
한편, 기존의 항암제들은 원발성 암(종양)의 성장을 억제하는데 주로 초점이 맞춰져왔다. 그러나 최근 기존 항암제의 처리에 의해 개체 내에서 발생되는 종양 미세환경(TME)세포-종양세포간 상호작용에 대한 연구들이 이루어지면서, 표적항암제의 처리에 의하여 오히려 암의 전이가 촉진되어 전이성 암의 발발에 기여한다는 연구결과가 나오기도 하였다. Ji-Sun Lee et a., 2015 에 의하면, IGF-1R 표적항암제인 시수투무맙(cixutumumab)을 유방암 등의 암세포를 이식한 마우스모델에 처리하였을 때, 이식한 종양의 성장은 억제되었으나 다른 장기로 전이암이 발생된 것을 발견하였다(Ji-Sun Lee et al, STAT3-mediated IGF-2 secretion in the tumour microenvironment elicits innate resistance to anti-IGF-1R antibody, Nat Commun. 2015 Oct 14;6:8499, PMID: 26465273). 이에 따라 주로 원발성 암의 제거 및 성장 억제에 초점이 맞추어져 있었던 항암제들과는 구분하여, 암세포의 이동성을 억제하고 전이를 억제할 수 있는 새로운 개념의 약물들이 요구되고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 암 전이 억제 화합물을 연구하던 중, 페북소스타트 또는 토피록소스타트가 암 세포의 이동 및 암 전이를 특이적으로 억제하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 암 전이 억제를 통해 암을 예방 및 치료하는, 페북소스타트, 토피록소스타트 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염들의 용도를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 페북소스타트, 토피록소스타트 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 것을 유효성분으로 포함하는 암 전이 저해용, 암의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 페북소스타트, 토피록소스타트 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 것을 유효성분으로 포함하는 암 전이 저해용 식품 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 in vivo 암 전이 모델에 대하여 페북소스타트와 토피록소스타트가 특이적으로 암세포의 전이를 억제하는 효과가 있음을 확인하였으며, 분자 수준에서도 EMT 및 Wnt 신호체계에서 암전이에 관련된 인자들이 보이는 행태를 정상적으로 제어함을 확인하였다. 이러한 페북소스타트와 토피록소스타트의 암전이 억제 용도는 본원 발명에서 최초로 공개하는 것이다.
따라서 본 발명은 페북소스타트 , 토피록소스타트 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염들의 암 전이 저해용; 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 종양 세포(암 세포)의 전이를 억제하므로 다양한 암에 적용할 수 있다. 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어 유방암, 대장암, 폐암, 간암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암, 악성흑색종, 림프종, 재생불량성 빈혈 등일 수 있다.
본 발명의 조성물에서 상기 ‘암 예방 및 치료’는 암 세포의 전이를 억제하는 것에 의해 수행된다.
본 발명에서‘페북소스타트(febuxostat)’는 IUPAC 명칭‘2-[3-cyano-4-(2-methylpropoxy)phenyl]-4-methyl-1,3-thiazole-5-carboxylic acid’으로도 불리며, 하기 화학식 1의 구조를 가진다. 본 발명에서 상기 페북소스타트는 상업적으로 구입하여 사용하거나, 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조하여 사용할 수 있으며, 이의 합성에는 일례로 다음의 문헌을 참조로 할 수 있으나 이에 제한되지 않는다: US2013/0245278A1, 대한민국등록특허 10-1630819 등.
<화학식 1>
Figure 112018005317290-pat00001
본 발명에서‘토피록소스타트(topiroxostat)’는 IUPAC 명칭‘4-(5-pyridin-4-yl-1H-1,2,4-triazol-3-yl)pyridine-2-carbonitrile’으로도 불리며, 하기 화학식 2의 구조를 가진다. 본 발명에서 상기 토피록소스타트는 상업적으로 구입하여 사용하거나, 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조하여 사용할 수 있으며, 이의 합성에는 일례로 다음의 문헌을 참조로 할 수 있으나 이에 제한되지 않는다: CN105348264A, CN105566301A 등
<화학식 2>
Figure 112018005317290-pat00002
본 발명에서 페북소스타트 또는 토피록소스타트 화합물은 그 자체 또는 염, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명에서 '약학적으로 허용가능한'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말하며, 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다. 추가적으로, 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, 하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트 등을 사용가능하며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 페북소스타트, 토피록소스타트 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 것을을 단독으로 함유하거나, 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다. 경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성 성분(본발명에서는, 페북소스타트, 토피록소스타트 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 것)을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다. 비경구 투여용 제제의 바람직한 일례는 주사제일 수 있다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물 중 상기 화합물들의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 조성물 중 상기 화합물들의 바람직한 전체 용량은 1일 투여량 약 0.01 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 화합물들의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 화합물들의 암전이 억제, 암(종양)의 예방 또는 치료제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 상기 화합물들이 포함된 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 액상화하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 상기 화합물들을 항암(anti-cancer, 종양성장 억제), 또는 암전이 저해 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 기능성 식품으로는 이에 한정되지 않지만 음료(알코올성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 상기 화합물들을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 화합물들을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 식품 조성물 중 상기 화합물들의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 50 중량%일 수 있다.
페북소스타트(febuxostat), 토피록소스타트(topiroxostat)는 암의 전이를 특이적으로 억제하는 효과가 현저하여, 암 예방 및 치료를 위한 새로운 수단을 제공한다.
도 1은 정상 식이(ND) 또는 고콜레스테롤 식이(HCD) 유방암 마우스 모델에 대하여, 페북소스타트의 경구투여에 따른 암전이 양상 변화를 관찰한 결과를 나타낸다. 도 1a는 각 실험군에서 실험기간 동안 in vivo 발광이미지 변화(병변부위)를 시간 순으로 나열하여 보여주며, 도 1b는 실험 종료 후 각 실험군의 장기를 적출하여 암 전이 정도를 비교 평가한 결과를 나나타내며, 도 1c는 각 실험군에서 다른 장기에 암이 전이된 정도를 정량화하여 나타내며, 도 1d는 각 실험군에서 폐와 간 조직에서의 암 전이 양상을 H&E 염색하여 비교한 결과를 나타낸다.
도 2는 암 전이에 대한 EMT 관련 인자들인 fibronectin(도 2a), E-cadherin(도 2b) 및 vimentin(도 2c)의 발현 양상을 각 실험군에 대하여 비교적으로 나타낸다.
도 3은 암 세포 이동과 관련된 인자들인 AQP5(도 3a) 및 MMP9(도 3b)의 발현 양상을 각 실험군에 대하여 비교적으로 나타낸다.
도 4는 암 전이에 대한 Wnt 신호 경로 관련 인자들인 Wnt7a(도 4a) 및 β-catenin(도 4b)의 발현 양상을 각 실험군에 대하여 비교적으로 나타낸다.
도 5는 LDL로 전이성 상태를 유도한 유방암 세포에 대하여 페북소스타트 처리 후 암세포 생존률을 MTT assay 방법으로 평가한 결과를 나타낸다(양성대조군으로서 페북소스타트 또는 LDL 단독처리군이 사용됨).
도 6은 LDL로 전이성 상태를 유도한 유방암 세포들에 대하여 페북소스타트 처리에 따른 암세포 이동성 변화를 Wound healing assay 방법(IncuCyte® Scratch Wound Cell Migration System)으로 평가한 결과를 나타내는 것으로, 시간에 따른 Wound density 변화그래프(도 6a) 및 최종 정량결과(도 6b)를 보여준다.
도 7은 LDL로 전이성 상태를 유도한 유방암 세포들에 대하여 페북소스타트 처리에 따른 암세포 이동성 변화를 transwell migration assay 방법으로 평가한 결과를 나타내는 것으로, 이동된 세포들의 염색 결과(도 7a) 및 최종 정량결과(도 7b)를 보여준다.
도 8은 LDL로 전이성 상태를 유도한 유방암 세포들에 대하여 페북소스타트 처리 농도에 따른 암세포 이동성 변화를 Wound healing assay 방법(IncuCyte® Scratch Wound Cell Migration System)으로 평가한 결과를 나타낸다.
도 9는 LDL로 전이성 상태를 유도한 유방암 세포들에 대하여 토피록소스타트 처리에 따른 암세포 이동성 변화를 Wound healing assay 방법(IncuCyte® Scratch Wound Cell Migration System)으로 평가한 결과를 나타내는 것으로, 시간에 따른 Wound density 변화그래프(도 9a) 및 최종 정량결과(도 9b)를 보여준다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실험방법]
1. in vivo 암 전이 실험
4주령의 암컷 BALB/c 마우스를 SAMTACO bioscience CO., LTD, Korea로부터 수득하였다. 상기 마우스들은 정상식이군(정상 사료D10001 control rodent diet, Research Diets Inc.)과 고콜레스테롤 식이군(고콜레스테롤 사료 D12336, Research Diets Inc.)으로 나누어졌으며, 고콜레스테롤 식이는 6주간 수행되었다. 고콜레스테롤 식이 실시 후 4주차에, 각 실험군들에 Luc-4T1 유방암 세포주(BW124087, PerkinElmer, 1×106 cell suspended in100㎕ RPMI)를 BALB/c 마우스의 유방 지방 패드(mammary fat pad)에 주사하여 유방암 마우스 모델을 제작하였다. 또한 Febuxostat(Catalog No. 14127, Cayman chemical, 급여는 식수에 섞어서 급여함)를 10mg/kg/day의 양으로 경구투여 하였다. 실험 기간동안 in vivo 발광측정기(IVIS® Lumina XRMS, PerkinElmer)로 암의 전이 양상을 관찰하였으며, 6주 후 각 실험군의 마우스들을 희생하여 각 장기를 관찰하였다.
2. H&E 염색
채취한 조직(폐, 간, 원발암)을 PFA(paraformaldehyde)에 고정시킨 후 수세, 탈수, 투명 과정을 거쳐 파라핀 침투 후 파라핀에 포매하였다. 파라핀에 포매 되어있는 조직을 3㎛ 크기로 박절하였다. 박절한 조직을 슬라이드에 붙인 후, Harris hematoxyline에 7분 염색 후 10분간 세척, 그리고 eosin을 3분간 염색 하였다.
3. in vitro 암 전이 실험
IncuCyte® Scratch Wound Cell Migration System을 통해 in vitro 상에서 암전이 양상을 관찰하였다. 간략하게, 4T1 유방암 세포주(ATCC®, CRL2539™)는 96well plate에 1.2×104 cell씩 분주(seeding)한 후, 96-pin WounderMaker(IncuCyte)를 이용하여 scratch를 만들었다. PBS로 debris를 제거한 후, 50㎍/㎖ LDL(Merk)과 50μM Febuxostat(Calbiochem) 또는 50μM Toporoxostat(Calbiochem)을 처리하여 48시간 반응 시키는 동안 4시간 간격으로 실시간 세포를 측정하였으며, 측정된 세포의 상대적인 wound density을 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.
4. 암세포 생존률 측정
4T1 유방암 세포주(ATCC®, CRL2539™)를 96 well plate에 7X103 cell/well씩 분주한 후, 50㎍/㎖ LDL(Merk)과 50μM Febuxostat(Calbiochem)을 처리하여 24시간 반응시켰다. 반응 후, 세포를 500㎍/㎖ MTT(Amresco) 용액에 4시간 반응시키고, 염색된 세포는 200㎕ DMSO (Amersco)를 사용하여 녹인 후, 570nm 흡광도로 측정하였다. 그래프는 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.
5. 세포 이동(transwell cell migration) 분석
Corning® 트랜스웰 시스템을 이용하여 세포 이동 양상을 확인하였다. 24시간 동안 50㎍/㎖ LDL(Merk)과 50μM Febuxostat(Calbiochem)에 반응시킨 4T1 유방암 세포주를 8-㎛ pore size의 24-well cell culture Inserts(Corning)에 well당 10,000개씩 분주하였다. 4시간 후, membrance의 바닥은 3.7% formaldehyde에 10분간 고정시켰다. PBS로 세척 후, 이동한 세포는 0.1% crystal violet (Sigma-Aldrich)로 염색하였다. 염색된 세포는 광학현미경에서 100배의 해상도로 무작위적으로 10장 사진을 찍은 후, 대조군에 대하여 염색된 세포수에 대한 백분율로 나타내었다.
6. Real-time PCR
원발암 조직을 TRIzol(Invitrogen)을 이용하여 total RNA를 추출 한 후, PrimeScript™ 1ststrand cDNA Synthesis kit(Takara)를 사용하여 cDNA를 합성시켰다. 합성된 cDNA는 Power SYBR® Green PCR Master Mix (Thermo)와 반응시킨 후, StepOne Plus Real-time PCR system(Applied Biosystems)을 이용하여 qPCR을 수행하였다. qPCR 반응 조건은 95℃에서 30초씩 40 cycles denaturationt시킨 후 60℃ 에서 1 min분간 annealing 및 polymerization시킨다. 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.
target primer sequence
fibronectin ACCACCGGCCACAACTACAA
TCTAACGGCATGAAGCACTCA
E-cadherin CCTCTATTCTCATGCCGTGTCA
TGGGTAAACTCTGGCCTGTTG
vimentin GCTGCAGGCCCAGATTCA
TTCATACTGCTGGCGCACAT
AQP5 GCCTTCCCCCAGGTAGACA
CGCCCCATCTTAACCAGAAA
MMP9 CCAGACGTGGGTCGATTCC
TGTCTCGCGGCAAGTCTTC
Wnt7a GAGCGCACGGAGATGTATACG
TTCTTTCCCTGTGAGCATCCA
β-catenin GGCAACCCTGAGGAAGAAGAT
CCCGTCAATATCAGCTACTTGCT
7. 통계처리
모든 데이터는 mean ± SEM으로 표시하였고, 최소한 4번 이상의 실험을 시행하였다. 모든 통계적 분석은 GraphPad prism 5.01 programs (GraphPad)의 one-way ANOVA Tukey’s Post hos analysis를 사용하였다. P 수치가 0.05이하일 경우 통계적으로 유의한 차이가 있음으로 나타내었다.
<실시예 1>
in vivo 암전이 억제 효과 확인
<1-1> 암 전이 마우스 모델 생체 영상 및 장기 전이 확인
도 1a 내지 도 1d에서 보는 바와 같이 유방암 세포 이식후 정상식이(ND)를 실시한 군보다 HCD(고콜레스테롤 식이)를 수행한 마우스에서 유방암이 현저히 전이된 것을 확인되었다. 특히 폐로 많은 전이가 일어났음이 확인되었으며, 일부 간과 비장으로의 전이암이 관찰되었다. 이에 대하여 페북소스타트를 투여한 군에서는 암의 전이가 현저히 억제된 것을 확인하였다(도 1a 내지 도 1d 참조).
<1-2> 암 전이 관련 인자들의 발현 양상 확인
상기 <1-1>의 각 실험군들로부터 수득한 병변 조직에 대하여, 암 전이와 관련된 인자들의 발현양상을 확인하였다. EMT(epithelial mesenchymal transition)는 암전이 과정에서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 이와 관련하여 암 전이 과정에서 E-cadherin의 감소, vimentin 및 fibronectin의 증가 현상이 나타나는데, 도 2a 내지 도 2c에서 보는 바와 같이 본 연구에서도 유방암 전이 마우스(HCD+cancer)에서 상기 인자들이 동일한 발현 패턴을 보임을 확인하였다. 이에 대하여 페북소스타트의 처리군에서는 E-cadherin의 증가(도 2b), vimentin의 감소(도 2c) 및 fibronectin의 감소(도 2a) 패턴을 보였다. 또한 암 세포 이동(migration)과 관련하여 AQP5 및 MMP9이 증가 현상이 나타나는데, 페북소스타트의 처리에 의하여 상기 인자들의 발현이 감소됨을 확인하였다(도 3a 및 도 3b). 또한 Wnt 신호경로 관련된 인자인 Wnt7 및 β-catenin이 유방암 전이 마우스에서 발현 수준이 높아졌으나, 페북소스타트의 처리에 의하여 상기 인자들의 발현이 감소됨을 확인하였다(도 4a 및 도 4b).
<실시예 2>
in vitro 암세포 전이(이동) 특이적 저해 효과 확인
페북소스타트가 암세포의 전이를 제어하는데 특이적으로 작용하는 것인지 알아보기 위하여, 4T1 유방암 세포주에 페북소스타트를 단독으로 처리하거나, LDL(low density lipoprotein cholesterol)을 처리하여 전이성 상태를 유도한 후 페북소스타트를 처리하고 MTT assay, Wound healing assay 및 migration assay를 수행하였다.
실험 결과, MTT assay를 통한 암세포 생존률 평가결과에서 보는 바와 같이 페북소스타트는 암세포 자체의 생존성에 많은 영향을 주기 보다는(도 5 참조), 암세포의 이동(전이)를 특이적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 6a,도 6b, 도 7a 및 도 7b). 또한 이러한 페북소스타트의 암세포 이동 억제 효과는 농도 의존적으로 상승되는 것을 확인하였다(도 8).
<실시예 3>
토피록소스타트의 in vitro 암세포 전이 특이적 저해 효과
토피록소스타트가 암세포의 전이를 제어하는데 특이적으로 작용하는 것인지 알아보기 위하여, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로, 4T1 유방암 세포주에 토피록소스타트를 단독으로 처리하거나, LDL(low density lipoprotein cholesterol)을 처리하여 전이성 상태를 유도한 후 토피록소스타트를 처리하고 Wound healing assay를 수행하였다.
그 결과 도 9에서 나타난 바와 같이, LDL로 전이성 상태를 유도한 군에서 토피록소스타트를 처리한 경우에 세포의 상대적인 wound density가 낮은 것으로 나타났다(도 9a). 또한 세포의 상대적인 wound density를 정량하였을 때, 토피록소스타트를 처리한 경우에 상대적인 wound density가 농도에 따라 감소하는 것으로 나타났다(도 9b). 이를 통해, 토피록소스타트가 암세포의 이동(전이)을 특이적으로 억제하는 것을 확인하였으며, 이러한 토피록소스타트의 암세포 이동 억제 효과는 농도 의존적으로 상승되는 것을 확인하였다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 페북소스타트(febuxostat) 또는 토피록소스타트(topiroxostat)의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 페북소스타트, 토피록소스타트 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 것을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제, 암의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 대한 것이다.
페북소스타트(febuxostat), 토피록소스타트(topiroxostat)는 암의 전이를 특이적으로 억제하는 효과가 현저하여, 암 예방 및 치료를 위한 새로운 수단을 제공하므로 제약산업 등에 있어서 산업상 이용가능성이 매우 크다.

Claims (5)

  1. 토피록소스타트(topiroxostat) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 전이 저해용 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 간암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암, 악성흑색종 및 림프종으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 삭제
  5. 토피록소스타트(topiroxostat) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 전이 저해용 식품 조성물.
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