KR102017217B1

KR102017217B1 - 중동호흡기증후군 코로나바이러스에 대한 항체 및 이를 이용한 항체역가 측정방법

Info

Publication number: KR102017217B1
Application number: KR1020180123551A
Authority: KR
Inventors: 이재면; 이혜자; 박필구; 박상우; 심두희; 이정은; 박지은; 김혜림
Original assignee: 주식회사 엔케이맥스; 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2017-10-19
Filing date: 2018-10-17
Publication date: 2019-09-02
Also published as: WO2019078600A1; KR20190044006A

Abstract

본 발명은 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)의 재조합 스파이크 단백질 항원에 관한 것이다. 보다 구체적으로 MERS-CoV의 스파이크(S) 단백질의 일부인 수용체 결합 도메인(RBD)을포함한 재조합 발현벡터, 재조합 발현벡터를 배큘로바이러스 DNA와 공감염시켜 제조한 재조합 배큘로바이러스 및 재조합 배큘로바이러스를 숙주세포에 감염시켜 수득한 재조합 스파이크 단백질 단편(RBD), 단일 클론항체 및 이들을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 MERS-CoV 재조합 S-RBD 단백질을 이용하는 면역기법 기반 바이러스 항체 역가 측정기술에 관한 것이다.

Description

중동호흡기증후군 코로나바이러스에 대한 항체 및 이를 이용한 항체역가 측정방법 {An antibody against MERS-CoV and method of determining titration for antibody to MERS-CoV using the same}

본 발명은 중동호흡기증후군 코로나바이러스에 대한 항체 및 이를 이용한 항체역가 측정방법에 관한 것이다.

중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스(MERS-CoV)는 2012년 사우디아라비아 반도에서 처음으로 발견된 뒤 중동 지역에서 집중적으로 발생한 바이러스로, 코로나바이러스(Coroviridae)군에 속하며, 사스 코로나바이러스(SARS-CoV, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스)와 유사한 바이러스로 알려져 있다.

MERS-CoV는 잠복기가 1주일 가량이며, SARS-CoV와 마찬가지로 고열을 동반한 기침, 호흡곤란, 숨가쁨, 가래 등 호흡기 증상을 주로 보이며 그 이외에도 두통, 오한, 콧물 및 근육통뿐만 아니라 식욕부진, 메스꺼움, 구토, 복통 및 설사 등 소화기 증상도 나타날 수 있다. 다만, MERS-CoV는 SARS-CoV와는 달리 급성 신부전증을 동반하며, 연령대에 따라 치사율이 50%가 넘는 등, 치사율이 사스보다 6배 가량 높다는 조사결과가 나오며 매우 치명적인 양상을 보이고 있다. 현재까지 MERS-CoV 치료를 위한 항바이러스제는 아직 개발되지 않았고, 증상에 대한 치료를 위주로 하게 되며 중증의 경우 인공 호흡기나 인공혈액투석을 받아야 되는 경우도 있다.

MERS-CoV의 명확한 감염원과 감염경로는 확인되지 않았으나, 중동 지역의 낙타와의 접촉을 통해 감염될 가능성이 높고, 사람간 밀접 접촉에 의한 전파가 가능하다고 보고되었다. 특히 중동 지역의 감염자로로부터 검출된 바이러스와 감염자가 사육하고 있던 낙타에서 검출된 바이러스가 일치하는 경우도 있다. 그러나 중동 지역에서 낙타 고기를 먹거나 우유를 마시는 관습이 있어 예방은 쉽지 않을 것으로 알려져 있다.

지금까지 MERS-CoV에 대한 백신 개발이 추진되고 있음에도, 백신 투여 후의 정량적인 항체 역가 측정법은 구축되어 있지 않은 상황이다. 따라서 MERS-CoV에 대한 백신 후보 물질의 항체 생성 정도를 확인할 수 있는 정교하고 표준화된 효율적 평가 시스템이 요구된다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여, 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)에 특이적인 결합분자로, 상기 결합분자는 항체 또는 이의 결합 단편인 결합분자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 목적은 상기 결합분자로 목적하는 시료상의 항체 역가를 결정하기 위한 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)의 항원을 결정하는 방법 및 이를 적용한 플레이트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 결합분자를 포함하는 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)의 항원을 결정하기 위한 진단 키트을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 결합분자로 목적하는 시료상의 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)의 항원을 결정하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

본 발명 내 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명의 일 구체예에서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)에 특이적인 결합분자로, 상기 결합분자는 항체 또는 이의 결합 단편인 결합분자를 제공하고, 상기 결합분자는 가변영역의 중쇄의 CDR1은 서열번호 2로 표시되고, 가변영역의 중쇄의 CDR2은 서열번호 3로 표시되고, 가변영역의 중쇄의 CDR3은 서열번호 4로 표시되는 결합분자이며, 상기 결합분자는 가변영역의 경쇄의 CDR1은 서열번호 5로 표시되고, 가변영역의 경쇄의 CDR2은 서열번호 6로 표시되고, 가변영역의 경쇄의 CDR3은 서열번호 7로 표시되는 결합분자를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합분자로 목적하는 시료상의 항체 역가를 결정하기 위한 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)의 항원을 결정하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 상기 방법의 결정하는 단계는 항원의 도포량을 결정하는 방법이며, 상기 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)의 항원은 서열번호 1로 표시되는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합분자로 목적하는 시료상의 항체 역가를 결정하기 위한 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)의 항원을 결정한 플레이트를 제공하고, 상기 플레이트는 1개 이상의 웰을 포함하는 플레이트이고, 웰 당 25 내지 500 ng/well의 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 항원이 도포된 플레이트를 제공하며, 상기 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)의 항원은 서열번호 1로 표시되는 플레이트를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합분자를 포함하는 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)의 항원을 결정하기 위한 진단 키트을 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 진단 키트는 샘플을 상기 단백질과 접촉시킨 후, 상기 항체 또는 키메릭 항체를 표준물질로 이용하여 MERS-CoV에 대한 항체 역가를 정량화하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합분자로 목적하는 시료상의 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)의 항원을 결정하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 서열번호 1로 표시되는 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)의 항원을 포함하는 항체를 결정하기 위한 진단 키트 또는 서열번호 1로 표시되는 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)의 항원을 포함하는 항체를 결정하기 위한 방법을 제공한다.

본 명세서에서, “항체 역가”란 혈청 중에 포함되어 있는 항체의 양을 측정한 값으로, 이에 한정되지는 않지만 예를 들어 특정 항원을 가지는 병균에 노출되기 전에는 항체역가가 낮게 나오지만, 해당 병균에 감염되어 항체가 생성된 후에는 항체역가가 높게 측정됩니다.

본 명세서에서, “가변영역의 CDR”은 Kabat 등에 의해 고안된 시스템에 따라 통상적인 방법으로 결정된다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th), National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)] 참조). 본 발명에 사용된 CDR 결정은 Kabat 방법을 사용했지만, 이외에 IMGT 방법, Chothia 방법, AbM 방법 등 다른 방법에 따라 결정된 CDR을 포함하는 결합 분자도 본 발명에 포함된다.

본 명세서에서, “결합분자”는 항체 또는 이것의 단편일 수 있다. 또한, 상기 결합 분자는 Fab 절편, Fv 절편, 디아바디(diabody), 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있으나, 이것에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예에서는 항원에 결합하는 완전한 인간 항체(fully human antibody)를 제공한다. 본 명세서에서 항체는 최대한 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 무손상(intact) 단일클론 항체, 다클론 항체, 2종 이상의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편을 포함한다. 항체는 특이적인 항원을 인식하고 결합할 수 있는 면역계에 의하여 생성되는 단백질이다. 그 구조적인 면에서, 항체는 통상적으로 4개의 아미노산 쇄(2개의 가변영역의 중쇄 및 2개의 가변영역의 경쇄)로 이루어진 Y-형상의 단백질을 가진다. 각각의 항체는 주로 가변 영역 및 불변 영역의 2개의 영역을 가진다. Y의 팔의 말단 부분에 위치한 가변 영역은 표적 항원에 결합하고 상호작용한다. 상기 가변 영역은 특정 항원 상의 특이적 결합 부위를 인식하고 결합하는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. Y의 꼬리 부분에 위치한 불변 영역은 면역계에 의하여 인식되고 상호작용한다. 표적 항원은 일반적으로 다수의 항체 상의 CDR에 의하여 인식되는, 에피토프라고 하는 다수의 결합 부위를 가지고 있다. 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 각각의 항체는 상이한 구조를 가진다. 그러므로, 한 항원은 하나 이상의 상응하는 항체를 가질 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 항체의 기능적 변이체를 포함한다. 항체들은 변이체들이 항원 또는 이것의 G 단백질에 특이적으로 결합하기 위해 본 발명의 항체와 경쟁할 수 있다면 본 발명의 항체의 기능적 변이체로 간주된다. 기능적 변이체는 1차 구조적 서열이 실질적으로 유사한 유도체를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 예를 들면, 생체외(in-vitro) 또는 생체내(in-vivo) 변형, 화학약품 및/또는 생화학 약품을 포함하며, 이들은 본 발명의 부모 단일클론 항체에서는 발견되지 않는다. 이와 같은 변형으로는 예를 들어 아세틸화, 아실화, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유 결합, 가교, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 수산화, 메틸화, 산화, 페길화, 단백질 분해 및 인산화 등이 포함된다. 기능적 변이체는 선택적으로 부모 항체의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입, 결실 또는 그들의 조합을 함유하는 아미노산 서열을 포함하는 항체일 수 있다. 더욱이 기능적 변이체는 아미노 말단 또는 카르복시 말단 중 하나 또는 모두에서 아미노산 서열의 절단체(truncated form)를 포함할 수 있다. 본 발명의 기능적 변이체는 본 발명의 부모 항체와 비교하여 동일하거나 다르거나, 더 높거나 낮은 결합 친화력을 가질 수 있지만, 여전히 항원 또는 이것의 G 단백질에 결합할 수 있다. 일 예로, 골격구조, 초가변(Hypervariable) 영역, 특히 CDR 3 영역을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 가변 영역의 아미노산 서열이 변형될 수 있다. 일반적으로 가변영역의 경쇄 또는 가변영역의 중쇄 영역은 3개의 CDR 영역을 포함하는, 3개의 초가변 영역 및 더욱 보존된 영역, 즉 골격 영역(FR)을 포함한다. 초가변 영역은 CDR로부터의 아미노산 잔기와 초가변 루프로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 범위에 속하는 기능적 변이체는 본 명세서의 부모 항체와 약 50%~99%, 약 60%~99%, 약 80%~99%, 약 90%~99%, 약 95%~99%, 또는 약 97%~99% 아미노산 서열 동질성을 가질 수 있다. 비교될 아미노산 서열을 최적으로 배열하고 유사하거나 또는 동일한 아미노산 잔기를 정의하기 위해 컴퓨터 알고리즘 중 당업자에게 알려진 Gap 또는 Bestfit 등을 사용할 수 있다. 기능적 변이체는 부모 항체 또는 그것의 일부를 PCR 방법, 올리고머 뉴클레오티드를 이용한 돌연변이 생성 및 부분 돌연변이 생성을 포함하는 공지의 일반 분자생물학적 방법에 의해 변화시키거나 유기합성 방법으로 얻을 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, “MERS-CoV”는 코로나 바이러스 중에서 베타코로나바이러스의 일종으로, 유전자 길이는 다양하지만 약 30kb에 해당하며, 11개의 ORF(open reading frame)를 지닌다. 중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스(MERS-CoV)의 구조 단백질은 S(Spike), E(Envelope), M(Matrix) 및 NP(Nucleocapsid) 단백질이 존재한다. MERS-CoV의 S(Spike) 단백질은 CoV 표면 상의 주요 E(Envelope) 단백질에 해당하는 클래스 Ⅰ막 융합 단백질이다. S 단백질은 수용체 결합 도메인(RBD)을 함유하는 N-말단 S1 도메인 및 바이러스-세포융합에 원인이 되는 S2 도메인으로 이루어진다. MERS-CoV에 대한 수용체는 디펩티딜 펩티다제 3(DPP4, CD26)이 동정 되었고 MERS-CoV RBD는 인간 DPP4 단백질과 공동 결정화된 코어 도메인으로 이루어지며, DPP4의 블레이드 4 및 5와 상호 작용한다. 즉, 서열번호 1의 MERS-RBD 서열은 RBD를 포함하는 것으로 MERS-CoV S 단백질의 358번째-606번째 서열을 포함한다.

본 발명의 일구체예는 MERS-CoV의 스파이크(S) 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 영역을 포함하고, 상기 수용체 결합 도메인 영역의 N-말단에 곤충세포 gp67에 대한 시그널 펩타이드 서열과 C-말단에는 수 개의 히스티딘을 포함하는 아미노산이 결합되어 있는 재조합 MERS-CoV S1-RBD를 제공한다. MERS-CoV의 스파이크(S) 단백질은 전체 1353개의 아미노산으로 이루어진 당단백질로, 재조합 MERS-CoV S1-RBD는 전체 스파이크(S) 단백질 서열 중에서 358번째부터 606번째 아미노산 부분을 포함하고 있으며, N-말단에 곤충세포 gp67에 대한 시그널 펩타이드 서열이 연결되고, C-말단에는 수 개의 히스티틴 서열을 포함하고 있다.

본 발명의 일구체예에서 배큘로바이러스의 다각체 프로모터는 배큘로바이러스의 발현 유전자 중 하나인 다각체 유전자의 발현을 조절하는 것으로, 곤충 세포 내에서 작동되는 강력한 프로모터 중 하나이다. 상기 프로모터의 다운 스트림에 위치하는 시그널 펩타이드는 벡터에 추가적으로 삽입되는 외래 단백질의 유전자에 의해 암호되는 단백질이 숙주 세포의 외부로 다량 발현되도록 한다. 이와 같이 단백질이 세포 외부 외로 다량 발현되는 경우에는 숙주세포의 배양액을 이용하여 단백질의 분리 및 정제를 고수율 및 고정제로 실시할 수 있다. 상기 시그널 펩타이드를 암호화하는 서열은 gp67 시그널 펩타이드 서열이며, 단백질이 세포 외부로 다량 발현되는 과정에서 시그널 펩타이드는 절단되며, 이 과정에서 수 개의 아미노산이 포함될 수 있다. 이는 시그널 펩타이드가 포함되어 있는 발현 벡터를 이용하여 제작된 재조합 단백질에서 일반적으로 볼 수 있는 추가서열이며, 본 발명의 서열번호 1의 N-말단 아미노산 3개가 이에 포함된다.

본 발명의 일구체예는 재조합 MERS-CoV S1-RBD의 용이한 분리 및 정제를 위해 MERS-CoV S1-RBD의 C 말단에 수 개의 히스티틴을 결합시킨다. 히스티틴을 결합한 이유는 유전자 클로닝을 통해 결합하는 과정이 간단할 뿐만 아니라 히스티딘의 크기가 작아서 MERS-CoV S1-RBD와 혈청 내의 항체와의 반응에 영향을 미치지 않고 또한 다른 단백질과의 상호작용을 일으킬 가능성이 낮기 때문이다. 본 발명의 일 실시예에서는 6개의 히스티딘을 프라이머를 이용하여 유전자 연장을 하여, C-말단에 6개의 히스티딘을 포함하는 아미노산 서열이 결합되어 있는 재조합 MERS-CoV S1-RBD를 제조한다. 상기 재조합 MERS-CoV S1-RBD는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일구체예는 MERS-CoV S1-RBD 재조합 단백질을 마이크로 플레이트에 코팅하는 단계를 포함하는, 상기 MERS-CoV S1-RBD에 결합하는 혈청 내 바이러스 항체 역가를 측정하는 측정방법에 관한 것이다. 재조합 MERS-CoV S1-RBD 항원 단백질을 이용하여 생성된 단일 클론 항체의 가변 부위를 사람의 면역글로불린 불변부위와 결합시켜 만든 키메릭 항체를 표준물질로 이용하여 항체 역가를 정량화할 수 있다. 본 발명에서 서열 번호 2,3,4로 표시되는 아미노산 서열은 단일 클론 항체의 가변영역의 중쇄가변영역 CDR1, CDR2, CDR3이며, 서열 번호 5,6,7로 표시되는 아미노산 서열은 단일 클론 항체의 가변영역의 경쇄가변영역 CDR1, CDR2, CDR3이다. 또한 서열 번호 8로 표시되는 아미노산 서열은 단일 클론 항체의 가변영역의 중쇄가변영역 전체 서열이며, 서열 번호 9로 표시되는 아미노산 서열은 단일 클론 항체의 가변영역의 경쇄가변영역 전체 서열이다.

본 발명에 따르면 재조합 MERS-CoV S1-RBD 단백질은 재조합 배큘로바이러스에서 수용성 단백질로 과발현시켜 고순도로 손쉽게 정제하는 것이 가능하다. 이와 같이 얻어진 재조합 MERS-CoV S1-RBD 단백질 항원을 이용하여 혈청 내 바이러스 항체 역가를 간단하고 신속하게 측정할 수 있는 간접효소면역측정법을 구축할 수 있다.

본 발명에 따르면 MERS-CoV S1-RBD 단백질에 결합하는 키메릭 항체를 이용하여 혈청 내 바이러스 항체 역가를 정량적으로 측정할 수 있는 간접효소면역측정법을 구축할 수 있다.

또한, 혈청 내의 MERS 바이러스에 대한 항체 역가를 정략적으로 측정할 수 있으므로, MERS-CoV 백신 후보물질의 효능을 검증할 수 있는 정량적인 검사법을 제공하게 되며, 또한 백신접종시 백신항체 역가를 신속하게 측정할 수 진단키트로 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 재조합 배큘로바이러스 제조를 위한 pFastBac-MERS S1 RBD 벡터에 관한 것이다.
도 2의 (a)는 본 발명의 MERS 재조합 S1-RBD 단백질의 발현을 10% SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2의 (b)는 본 발명의 MERS 재조합 S1-RBD 단백질을 정제한 후 10% SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3의 (a)는 본 발명의 MERS 재조합 S1-RBD 항원 단백질을 이용하여 생산한 단일 클론 항체의 민감도 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 3의 (b)는 본 발명의 MERS 재조합 S1-RBD 항원 단백질을 이용하여 생산한 단일 클론 항체의 교차 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 3의 (c)는 본 발명의 MERS 재조합 S1-RBD 항원 단백질을 이용하여 생산한 단일 클론 항체의 isotype 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 4의 (a)는 본 발명의 MERS 재조합 S1-RBD 항원 단백질과 전장 서열의 MERS 재조합 S1 (1번부터 751번) 단백질과의 결합 차이를 나나타낸 것이다.
도 4의 (b)는 본 발명의 MERS 재조합 S1-RBD 단백질의 항원 도포량 설정 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 MERS 재조합 S1-RBD 단백질을 이용한 간접효소면역측정법의 음성대조군/양성대조군 및 MERS S1 항원으로 면역화된 마우스의 혈청에 대한 MERS 항체 역가 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 MERS 재조합 S1-RBD 단백질을 이용한 간접효소면역측정법에서 도3의 단일 클론 항체의 선형성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

[실시예 1] 재조합 MERS-CoV S1-RBD 단백질 발현 벡터의 제조

중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) EMC/2012 (Gene Bank No.JX869059) 유전자 서열의 수용체 결합 도메인(RBD)을 포함하는 1072번 부터 1818번 염기서열에 해당하는 부위의 유전자를 마크로젠(서울, 대한민국)에서 제작하였다. 유전자 합성을 통해 제작된 유전자를 주형으로 pfu DNA polymerase를 적용하여 유전자를 증폭하였다. S1-RBD 유전자의 순방향 프라이머는 5'CAG GAT CCC TCT GGA GTC TAC TCT GTG TCC TCC T' 3 이고, 역방향 프라이머는 5'GGT GAT GGT GAT GAT GGT ATT CCA CAC AGT TGC C '3이다. 유전자 증폭기를 사용하여 상기의 프라이머에 대한 유전자를 증폭하였고 조건은 다음과 같다. 즉, 94℃에서 5분간 변성을 시키고 나서 94℃30초, 60℃30초, 72℃50초를 기본 사이클로 해서 25회 반복하였다. 마지막에는 72℃에서 10분간 연장 증폭하였다. 증폭된 유전자를 주형으로 C-말단 수개의 히스티딘을 결합하기 위해 유전자의 순방향 프라이머는 5'CAG GAT CCC TCT GGA GTC TAC TCT GTG TCC TCC T'3이고, 역방향 프라이머는 5'GAC TCG AGG GCG GCC GCT CAG TGG TGA TG'3를 이용하여 유전자를 증폭하였다. 증폭한 유전자는 gp67의 시스널펩타이드가 결합되어 있는 배큘로 발현 벡터인 pFastBac 벡터(Invitrogen 사)에 클로닝하여 재조합 배큘로 벡터를 제조하였다. 재조합 배큘로 발현 벡터의 모식도는 도 1에 도시하고 pFastBac/MERS-S1-RBD 라고 명명하였다. 이렇게 제작된 발현벡터는 배큘로 바이러스 유전자 bacmid　DNA를 함유하고 있는 대장균 DH10Bac 세포에 형질 전환 시켰다. 상기 재조합 발현벡터 pFastBac/MERS-S1-RBD에 의해 발현되는 재조합 MERS-CoV S1-RBD 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시된다.

[실시예 2] 재조합 배큘로 바이러스의 제조 및 발현

본 실시예를 위하여 배큘로 바이러스의 일종인 AcNPV의 DNA (백미드, bMON14272)가 들어있는 대장균 DH10Bac (Invitrogen 사, 미국)을 이용하였다. 상기 백미드 (bacmid)는 lacZ 유전자를 가지고 있으며 그 유전자 내부에 전위 (transposition) 부위가 있다. 한편, 상기 실시예 1에서 사용된 이동 벡터 pFastBac에는 트랜스포존이 있고 그 사이에 발현하고자 하는 MERS-CoV S1-RBD 유전자가 삽입되어 있다. 실시예 1에서 제작한 pFastBac/MERS-S1-RBD을 상기 대장균 DH10Bac에 형질전환 시켜 대장균 내에서 백미드와 pFastBac/MERS-S1-RBD의 전위를 유도한 다음, 겐타마이신, 테트라사이클린 및 카나마이신의 항생제와 X-gal과 IPTG가 들어있는 LB 플레이트에서 배양한 다음 무색의 콜로니만을 선별하였다. 이어, 무색의 콜로니를 LB 배지가 들어있는 시험관에서 24시간 동안 배양한 다음, 플라스미드 추출법을 이용하여 재조합 백미드를 분리하였다. 분리한 재조합 백미드 내의 MERS-CoV S1-RBD 유전자의 존재 유무는 PCR로 확인하였다.

한편, 1 × 10⁶ 개의 곤충세포 Sf9 (Invitrogen사, 미국)를 27℃배양조건 하에서 60 mm 배양접시에 1시간 동안 고착 배양시킨 후, 배지를 제거하고 상기 재조합 백미드와 셀펙틴 (Invitrogen사, 미국)의 혼합물을 Sf-900 II SFM(GIBCO, 미국) 배지와 함께 상기 배양 접시에 넣어주었다. 5 시간 후에 배양 접시 내의 배지를 제거하고 새로운 2ml의 Sf-900 II SFM 배지를 넣고 72시간 동안 배양하였다. 이어, 곤충세포를 성장시킨 배지의 2ml을 수확하고 바이러스 농도를 높이기 위해 20ml의 Sf-900 II SFM 배지가 들어있는 플라스크에서 자라고 있는 Sf9 세포에 재조합 배큘로 바이러스를 재감염시켰다. 72시간을 배양한 후에 증폭된 재조합 배큘로 바이러스를 플라스크에서 20 ml을 회수하여 원심분리(1000rpm, 5분)한 후, 상층액을 새로운 50ml 튜브에 다시 회수하여 냉장 보관하였다.

세포 외로 분비되는 단백질의 경우, Sf9 세포보다 하이 파이브 (High Five) 세포에서 발현량이 많은 것으로 알려져 있기 때문에(Biotech. Bioengin., 63:255-262(1999)) 100ml의 Sf-900 II SFM 배지에서 배양 중인 하이 파이브 세포 (Invitrogen사, 미국)를 실시예 2에서 확보된 재조합 배큘로 바이러스로 형질감염시키고, 72시간 동안 배양하여 단백질 발현을 유도하였다. 상기와 같은 바이러스 감염 단계를 거쳐 3일간 배양한 하이 파이브 세포 배양액 200ml을 4℃원심분리(4000rpm, 7분)하였다.

[실시예 3] 재조합 MERS-CoV S1-RBD 단백질의 정제

상기 실시예 2의 하이 파이브 세포를 72 시간동안 배양하고 이어 세포 배양 배지 200ml를 수확한 다음, 세포 외로 분비된 재조합 MERS-CoV S1-RBD를 다음과 같이 정제하였다.

세포 배양액을 농축하기 위해 상층액이 담긴 비커에 자기 막대와 암모늄설페이트 150g을 넣고, s자기 교반기를 이용해 30분 교반하였다. 암모늄설페이트가 더 이상 녹지 않는 포화 상태에 이르면 상층액을 4℃원심분리(4000rpm, 7분)하였다. 원심 분리된 상층액은 500ml 비커에 모아두고 원심 분리병 벽면에 침전된 단백질을 30ml 완충용액으로 녹인 후 50ml 튜브에 담아 두었다. 앞서 500ml 비커에 모아 둔 상층액을 한번 더 4℃에서 원심분리(4000 rpm, 7분)하여 원심 분리한 상층액은 버리고 원심 분리병 갈색으로 침전된 단백질을 앞서 녹인 완충용액으로 다시 녹인 후 50 ml tube에 회수하였다.

그 다음, 니켈 레진 2ml을 10ml의 완충용액을 흘러보내서 레진을 활성화 시켰다. 이렇게 활성화된 레진에 농축한 세포 배양액을 레진의 벽면을 타고 흘러부어 주었다. 농축된 세포 배양액이 레진 전체에 골고루 퍼졌으면 10ml의 완충용액으로 두 번 세척을 진행하여 비특이성 단백질을 제거하였다. 이후 니켈 레진에 결합된 재조합 MERS-CoV S1-RBD 단백질을 분리하기 위해 용충완충액을 컬럼에 넣으면서 용출물을 1ml씩 순서대로 수확하였다. 순서대로 수확된 정제물은 Bradford protein assay(Bio-Rad, 미국)를 이용하여 발색 여부를 확인하여 푸른색을 뛰는 정제물은 SDS-PAGE로 단백질 유무를 확인하였다. 도 2의 (a)에 상기 순서대로 수확된 정제물을 순서대로 SDS-PAGE한 결과를 나타내었다.

SDS-PAGE 상에서 재조합 MERS-CoV S1-RBD단백질이 나타난 정제물만을 취하여 4℃에서 하룻밤 동안 투석하였다. 투석이 끝난 재조합 MERS-CoV S1-RBD 단백질은 센트리콘 (Amicon사, 미국)을 사용하여 농축하였으며, 단백질의 농도는 EPOCH (BioTek, 미국) 기기를 이용하여 정량하였다.

도 2의 (b)는 상기 최종적인 컬럼에서 정제된 재조합 MERS-CoV S1-RBD 단백질을 로딩한 SDS-PAGE한 결과이다. 이처럼 본 발명의 재조합 MERS-CoV S1-RBD 단백질은 간단한 정제 과정을 통해 정제될 수 있음을 확인할 수 있다.

[실시예 4] 재조합 MERS-CoV S1-RBD 단일 클론항체 제작

실시예 3에서 정제된 재조합 MERS-CoV S1-RBD 항원 단백질을 BALB/c 마우스에 발바닥 또는 복강 주사를 통하여 면역 후, 마우스의 눈에서 혈액을 채취하여 면역이 잘된 마우스를 선택하여, 마우스의 고리 정맥에서 부스팅을 실시하였다.

항체 제조는 전통적인 방식인 Kohler와 Milstein의 방법을 이용하여 세포융합을 실시하였고, 구체적인 방법은 다음과 같다:

잘 면역된 BALB/c 마우스로부터 비장 또는 림프노드를 채취하여 B 림프구를 분리하고, 하이포잔틴아닌 포스포리보실트란스페라제(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase: HGPRT)가 결핍된 암세포인 골수종(myeloma) 세포와 마우스로부터 분리된 B 림프구에 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol: PEG)을 처리하여 융합시킨 후, 하이포잔틴 아미노프테린 사이미딘 (hypoxanthine aminopterin thymidine: HAT)이 첨가된 배양액으로 융합에 참여한 세포를 선별하였다. HAT가 첨가된 배양액에서 생존한 well의 배양액을 이용하여 효소분석면역법 (ELISA)를 통하여 재조합 MERS-CoV S1-RBD 항원에 특이적으로 반응하는 융합세포를 선별하여 클로닝을 시행하였다. 선별된 클론을 대량 배양하여, PBS 또는 우혈청 (FBS)가 첨가되지 않은 DMEM 배지를 이용하여 처리한 잡종 세포를 마우스의 복강 내에 주사한 후, 마우스 복강 내에 복수가 형성되면, 복수를 채취하고 채취된 복수를 Protein G 또는 A bead를 이용하여, 복수 내 항체를 정제하였다. 상기 최종 선별한 단일 클론 항체 AT2F7의 민감도, 교차반응성, 아형(isotyping)을 분석하였다(도 3 참조). 또한, 상기 항체는 하기 서열번호 1 내지 9로 정의되었다.

서열번호 1:(Antigen) ADPSGVYSVS SFEAKPSGSV VEQAEGVECD FSPLLSGTPP QVYNFKRLVF TNCNYNLTKL

LSLFSVNDFT CSQISPAAIA SNCYSSLILD YFSYPLSMKS DLSVSSAGPI SQFNYKQSFS

NPTCLILATV PHNLTTITKP LKYSYINKCS RLLSDDRTEV PQLVNANQYS PCVSIVPSTV

WEDGDYYRKQ LSPLEGGGWL VASGSTVAMT EQLQMGFGIT VQYGTDTNSV CPKLEFANDT

KIASQLGNCV EYHHHHHH

서열번호 2 : (VH CDR1) : GFTFSSYT

서열번호 3 : (VH CDR2) : ISSGGSYT

서열번호 4 : (VH CDR3) : TRDLYDGYFYYAMDY

서열번호 5 : (VL CDR1) : QSLLNSSNQKNY

서열번호 6 : (VL CDR2) : FAS

서열번호 7 : (VL CDR3) : QQHYSTPWT

서열번호 8 : (VH full):

EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCTRDLYDGYFYYAMDYWGQGTSVTVSS

서열번호 9 : (VL full):

DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTKYSGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVLAEDLADYFCQQHYSTPWTFGGGTKLEIK

[실시예 5] 재조합 MERS-CoV S1-RBD 단백질의 항원 도포량 설정

실시예 3에서 정제된 재조합 MERS-CoV S1-RBD 단백질 항원과 실시예 4에서 제작된 단일 클론 항체 AT2F7를 이용하여 항원 도포량에 대한 조건을 수립하였다. 즉, 전장 서열의 MERS(1번부터 751번)에 비해서, 서열번호 1의 MERS-RBD 서열(358번째-606번째)에서 보다 적정의 결합을 확인할 수 있었고 (도 4a 참조), 재조합 MERS-CoV S1-RBD 단백질 항원 25-500ng/well에서 항체와 항원의 결합을 확인할 수 있었다 (도 4b 참조). 이에 간접효소면역측정법의 재조합 MERS-CoV S1-RBD 단백질 항원 도포량을 100 ng/well로 결정하였다.

[실시예 6] 재조합 MERS S1-RBD 단백질을 이용한 간접효소면역측정법의 항체 역가 측정

MERS 바이러스의 단백질을 발현하는 백신후보물질(plasmid DNA)로 면역화(immunization) 및 부스팅(boosting)한 마우스의 혈청을 확보하여 본 발명의 간접효소면역측정법을 통해 혈청 내 항 MERS 항체의 생성 여부를 측정하였다. 혈청의 희석 농도에 비례하여 측정값이 유의미하게 감소됨을 확인하였으며(도5 참조), 또한 단일 클론 항체 AT2F7가 농도에 따라 선형성을 나타냄에 따라 본 발명을 통해 확립된 간접효소면역측정법 시스템에서의 표준물질로의 활용이 가능함을 확인하였다(도6 참조). 이는 단일 클론 항체 AT2F7의 키메릭 항체 제작을 통해 MERS 항체 역가에 대한 정량적 분석이 가능함을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Atgen Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> An antibody against MERS-CoV and method of determining titration for antibody to MERS-CoV using the same <130> DPB173846k01 <150> KR 10-2017-0135754 <151> 2017-10-19 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen <400> 1 Ala Asp Pro Ser Gly Val Tyr Ser Val Ser Ser Phe Glu Ala Lys Pro 1 5 10 15 Ser Gly Ser Val Val Glu Gln Ala Glu Gly Val Glu Cys Asp Phe Ser 20 25 30 Pro Leu Leu Ser Gly Thr Pro Pro Gln Val Tyr Asn Phe Lys Arg Leu 35 40 45 Val Phe Thr Asn Cys Asn Tyr Asn Leu Thr Lys Leu Leu Ser Leu Phe 50 55 60 Ser Val Asn Asp Phe Thr Cys Ser Gln Ile Ser Pro Ala Ala Ile Ala 65 70 75 80 Ser Asn Cys Tyr Ser Ser Leu Ile Leu Asp Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Ser Met Lys Ser Asp Leu Ser Val Ser Ser Ala Gly Pro Ile Ser Gln 100 105 110 Phe Asn Tyr Lys Gln Ser Phe Ser Asn Pro Thr Cys Leu Ile Leu Ala 115 120 125 Thr Val Pro His Asn Leu Thr Thr Ile Thr Lys Pro Leu Lys Tyr Ser 130 135 140 Tyr Ile Asn Lys Cys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Asp Arg Thr Glu Val 145 150 155 160 Pro Gln Leu Val Asn Ala Asn Gln Tyr Ser Pro Cys Val Ser Ile Val 165 170 175 Pro Ser Thr Val Trp Glu Asp Gly Asp Tyr Tyr Arg Lys Gln Leu Ser 180 185 190 Pro Leu Glu Gly Gly Gly Trp Leu Val Ala Ser Gly Ser Thr Val Ala 195 200 205 Met Thr Glu Gln Leu Gln Met Gly Phe Gly Ile Thr Val Gln Tyr Gly 210 215 220 Thr Asp Thr Asn Ser Val Cys Pro Lys Leu Glu Phe Ala Asn Asp Thr 225 230 235 240 Lys Ile Ala Ser Gln Leu Gly Asn Cys Val Glu Tyr His His His His 245 250 255 His His <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 <400> 2 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 <400> 3 Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr 1 5 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 <400> 4 Thr Arg Asp Leu Tyr Asp Gly Tyr Phe Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR1 <400> 5 Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR2 <400> 6 Phe Ala Ser 1 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 <400> 7 Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 8 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH full <400> 8 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asp Leu Tyr Asp Gly Tyr Phe Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL full <400> 9 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Lys Tyr Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Leu Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys

Claims

중쇄 가변영역의 CDR1은 서열번호 2로 표시되고,
중쇄 가변영역의 CDR2는 서열번호 3로 표시되고,
중쇄 가변영역의 CDR3은 서열번호 4로 표시되며,
경쇄 가변영역의 CDR1은 서열번호 5로 표시되고,
경쇄 가변영역의 CDR2는 서열번호 6로 표시되고,
경쇄 가변영역의 CDR3은 서열번호 7로 표시되는, 항체 또는 이의 결합 단편인 결합분자.
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제 1항의 결합분자로 목적하는 시료상의 항체 역가를 결정하기 위한 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)의 항원을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
제4항에 있어서,
결정하는 단계는 항원의 도포량을 결정하는 방법.
제4항에 있어서,
중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)의 항원은 서열번호 1로 표시되는 방법.
제 1항의 결합분자로 목적하는 시료상의 항체 역가를 결정하기 위한 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)의 항원이 도포되어 있는 플레이트.
제 7항에 있어서,
플레이트는 1개 이상의 웰을 포함하는 플레이트.
제8항에 있어서,
웰 당 25 내지 500 ng/well의 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 항원이 도포된 플레이트.
제9항에 있어서,
중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)의 항원은 서열번호 1로 표시되는 플레이트.
제 1항의 결합분자를 포함하는 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)의 항원의 존재여부를 확인하기 위한, 중동호흡기증후군의 진단용 키트.
제 1항의 결합분자로 목적하는 시료상의 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)의 항원의 결합 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 항원에 특이적인 항체 또는 결합 단편인 결합분자의 역가를 결정하기 위한 방법.
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