KR102006790B1 - 효소로 기능화된 고상의 광결정 ipn 복합체 제조방법, 이에 따라 제조된 광결정 ipn 복합체 및 이를 이용한 바이오센서 - Google Patents

효소로 기능화된 고상의 광결정 ipn 복합체 제조방법, 이에 따라 제조된 광결정 ipn 복합체 및 이를 이용한 바이오센서 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고체 상태의 나선형 광결정 구조체에 PAA 하이드로겔을 침투시키고, 효소를 고정시킴으로써, 효소 반응에 의한 pH 변화를 통해 PAA 하이드로겔의 수축 및 팽창을 유도하여 색 변화를 나타내는, 효소로 기능화된 고상의 광결정 IPN 복합체 제조방법, 이에 따라 제조된 IPN 복합체 및 이를 이용한 바이오센서에 관한 것이다.
이러한 본 발명은 (1) 비반응성 키랄 도판트와 반응성 네마틱 메조겐을 혼합 및 경화한 후, 나선형 구조를 유지하면서 키랄 도판트를 제거하여 고상의 나선형 광결정 구조체를 제조하는 단계; (2) 상기 광결정 구조체의 내부 공간에 PAA 하이드로겔을 침투시킨 후, 경화하여 IPN 구조의 복합체를 형성하는 단계; 및 (3) 상기 IPN 구조의 복합체에 효소를 고정화시키는 단계;를 포함하는 것을 기술적 특징으로 한다.

Description

효소로 기능화된 고상의 광결정 IPN 복합체 제조방법, 이에 따라 제조된 광결정 IPN 복합체 및 이를 이용한 바이오센서 {A method for producing a solid-state photonic crystal IPN complex functionalized with an enzyme, an IPN complex produced thereby, and a biosensor using the same}
본 발명은 효소로 기능화된 고상의 광결정 IPN 복합체 제조방법, 이에 따라 제조된 광결정 IPN 복합체 및 이를 이용한 바이오센서에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고체 상태의 나선형 광결정 구조체에 PAA 하이드로겔을 침투시키고, 효소를 고정시킴으로써, 효소 반응에 의한 pH 변화를 통해 PAA 하이드로겔의 수축 및 팽창을 유도하여 색 변화를 나타내는, 효소로 기능화된 고상의 광결정 IPN 복합체 제조방법에 관한 것이다.
바이오센서는 의료용도, 환경적 용도, 식품용도, 군사적 용도, 산업적 용도 등 다양한 분야에 응용이 가능하다. 하지만 현재까지 적용하고 있는 바이오센서 기술은 검출하고자 하는 바이오 물질 인식을 위해서 다량의 샘플이 요구된다. 또한, 샘플을 분석하기 위하여, 분석물 투입단계, 신호 발생 단계, 신호 증폭 단계, 복잡한 분석 결과 해석 단계 등 매우 복잡한 과정을 거쳐야만 하는 번거로움이 있고, 실생활에 적용하기에 매우 고가의 비용이 든다.
이에 따라, 소량의 분석물질을 정밀하게 측정하기 위해 전기 화학적, 광학적 및 질량 검출 방법으로 작동하는 변환기를 이용한 여러 센서 기술이 사용되고 있으나, 분석하고자 하는 샘플의 준비가 복잡하고, 고가의 전문적인 장비들이 필요한 문제점이 있다.
이러한 관점에서 생체물질 또는 화학물질의 검출이 용이하고, 특정한 파장에서 빛을 반사하는 광 결정체를 이용하여 배터리 없이 색상(또는 강도) 변화로 시각적인 감지가 가능한 광센서가 많은 주목을 받고 있다.
광 결정체 중에서 콜레스테릭 액정(Cholesteric Liquid Crystal, CLC)은 특정 광학 성질을 부여하는 나선형으로 비틀린 분자 배향을 나타내며, 일차원 광자 구조의 제작이 용이한 장점이 있다.
상기 콜레스테릭 액정의 반사 파장은 하기 식 (1)로 나타낼 수 있다.
λ=n×P×cosθ ---(1)
콜레스테릭 액정이 비편광으로 조사되는 경우는, 선택된 파장의 입사광과 나선 구조의 상호 작용으로 인해 주어진 핸디니스(handiness)의 환형 편광(나선의 핸디니스에 따라 왼손 방향으로 감기거나 오른손 방향으로 감김)으로서 이의 강도의 50%가 반사되고, 나머니 50%는 반대 핸디니스의 환형 편광으로서 전달된다.
또한, 콜레스테릭 액정 물질의 평균 굴절 지수(n)가 일정하면, 상기 콜레스테릭 액정의 반사 파장(λ)은 나선의 피치(P)에 의존하게 된다. 즉, 콜레스테릭 광학 물질은 나선의 피치에 의해 선택적인 광 반사를 나타냄에 따라 독특한 반사 패턴을 나타내기 때문에 상기 CLC는 외부 자극에 변화되는 피치를 이용하여 센서로서 사용될 수 있다.
그러나 종래 CLC는 액체 상태의 액적으로 제조됨에 따라, 오랜기간 동안 안정도를 유지하는데 한계가 있었다.
이를 해결하기 위하여 CLC 액적을 캡슐화 하는 방법이 개발되었으며, 이 경우 고분자 상에서 액정을 캡슐화시킴에 따라 고분자가 액정에 대하여 유화제 또는 바인더 역할을 겸함에 따라 제조방법은 간단한 장점이 있으나 여전히 액체 상태임은 물론이고, 액정적(LC droplet)의 크기나 분포를 조절하기 어려운 단점이 있었다.
이에 본 발명자들은 이러한 점에 착안하여 제조방법이 간단하고, 정교한 기구없이 색 변화를 통해 육안으로 생체물질을 검출할 수 있으며, 장기간 보관이 가능한 고상의 광결정 복합체의 제조방법을 제공하고자 노력하여 본 발명을 완성하게 되었다.
KR 10-2013-0101326 A KR 10-2013-0126322 A
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 효소로 기능화된 고상의 광결정 IPN 복합체 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 상기 광결정 IPN 복합체 제조방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는, 효소로 기능화된 고상의 광결정 IPN 복합체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 상기 광결정 IPN 복합체를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는, 바이오센서를 제공하는 것을 목적으로 한다.
한편, 본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 효소로 기능화된 고상의 광결정 IPN 복합체 제조방법은, (1) 비반응성 키랄 도판트와 반응성 네마틱 메조겐을 혼합 및 경화한 후, 나선형 구조를 유지하면서 키랄 도판트를 제거하여 고상의 나선형 광결정 구조체를 제조하는 단계; (2) 상기 광결정 구조체의 내부 공간에 PAA 하이드로겔을 침투시킨 후, 경화하여 IPN 구조의 복합체를 형성하는 단계; 및 (3) 상기 IPN 구조의 복합체에 효소를 고정화시키는 단계;를 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 효소로 기능화된 고상의 광결정 IPN 복합체는, 상기 광결정 IPN 구조 복합체 제조방법으로 제조되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 효소로 기능화된 고상의 광결정 IPN 복합체를 이용한 바이오센서는, 상기 광결정 IPN 복합체를 이용하여 제조되는 것을 특징으로 한다.
상기 과제의 해결 수단에 의해, 본 발명의 효소로 기능화된 고상의 광결정 IPN 복합체 제조방법은 콜레스테릭 액정으로부터 키랄 도판트를 제거하면서도 콜레스테릭 액정이 갖는 독특한 나선 구조가 그대로 유지되도록 하며, 제조방법이 간단하고, 제조 비용이 저렴한 효과가 있다.
또한, 본 발명의 광결정 IPN 복합체 제조방법에 따라 제조된 IPN 복합체는 고정된 효소에 따라 높은 선택성을 가지는 것은 물론 다중 생체물질을 감지하여 다중 감지능력이 있는 바이오센서로 활용할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 광결정 IPN 복합체를 이용한 바이오센서는 효소 반응으로 변화하는 pH에 의해 PAA 하이드로겔의 팽창 및 수축을 유도하여 색 변화를 나타내어, 육안으로도 쉽게 감지할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 ICLCHPNurease의 제조방법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 2×3 ICLCHPNurease에 7.5mM의 요소 수용액을 떨어뜨린 후 경과시간에 따른 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 PAA 하이드로겔 액적의 제조를 나타낸 사진으로, (a)는 PAA 하이드로겔 액적의 제조를 위한 실험장비 세팅을 나타낸 사진이고, (b)는 제조된 PAA 하이드로겔 액적을 나타낸 사진이다.
도 4는 PAA 하이드로겔 액적의 팽창비를 나타낸 그래프로서, (a)는 가교제의 양, (b)는 pH에 따른 팽창비를 나타낸 것이다.
도 5는 요소 수용액의 농도에 따른 PAAurease 액적을 나타낸 사진이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 건식 CLC 필름, 건식 ICLCHPN 필름 및 습윤 ICLCHPN 필름의 UV-Vis 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 건식 CLC 필름, 건식 ICLCHPN 필름 및 습윤 ICLCHPN 필름의 반사 파장을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 건식 CLC 필름, 건식 ICLCHPN 필름 및 습윤 ICLCHPN 필름의 도판트 제거 전후를 나타낸 사진이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 CLC 필름 및 ICLCHPN 필름의 절단된 표면을 나타낸 SEM 이미지이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 CLC 필름, ICLCHPN 필름 및 ICLCHPNurease 필름의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 ICLCHPN 필름의 pH별 UV-Vis 스펙트럼 및 광 밴드갭의 중간 파장을 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 ICLCHPNurease 필름을 나타낸 사진으로서, (a)는 기울어진 5×4 ICLCHPNurease 필름에 요소 수용액을 떨어뜨린 직후의 사진이고, (b)는 3×3 ICLCHPNurease 필름에 서로 다른 농도의 요소 수용액을 떨어뜨린 후의 색상변화를 나타낸 사진이다.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 ICLCHPNurease 필름의 선택성 및 민감성을 나타낸 것으로서, (a)는 2×3 ICLCHPNurease 필름에 다양한 혈액 내 성분들을 떨어뜨린 후의 색상변화를 나타낸 사진이고, (b)는 2×4 ICLCHPNurease 필름에 서로 다른 요소 농도를 가지는 사람 혈청을 떨어뜨린 후의 색상변화를 나타낸 사진이다.
도 14는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 ICLCHPN 필름과 ICLCHPNurease 필름의 pH 및 요소 수용액에 대한 가역성을 나타낸 것으로서, (a)는 2×2 ICLCHPN 필름에 pH 2 및 12인 수용액을 교대로 떨어뜨린 후의 색상변화를 나타낸 사진이고, (b)는 2×2 ICLCHPNurease 필름에 교대로 물로 세척하고, 요소 수용액을 떨어뜨린 후의 색상변화를 나타낸 사진이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다. 그리고 본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다. 본 명세서에서 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다.
이하, 첨부된 도면들을 참조하면서 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 상세히 설명하기로 한다. 한편, 해당 기술분야의 통상적인 지식을 가진자로부터 용이하게 알 수 있는 구성과 그에 대한 작용 및 효과에 대한 도시 및 상세한 설명은 간략히 하거나 생략하고 본 발명과 관련된 부분들을 중심으로 상세히 설명하도록 한다.
본 발명의 일측면에 따르면, (1) 비반응성 키랄 도판트와 반응성 네마틱 메조겐을 혼합 및 경화한 후, 나선형 구조를 유지하면서 키랄 도판트를 제거하여 고상의 나선형 광결정 구조체를 제조하는 단계; (2) 상기 광결정 구조체의 내부 공간에 PAA 하이드로겔을 침투시킨 후, 경화하여 IPN 구조의 복합체를 형성하는 단계; 및 (3) 상기 IPN 구조의 복합체에 효소를 고정화시키는 단계;를 포함하는, 효소로 기능화된 고상의 광결정 IPN 복합체 제조방법을 제공한다.
한편, 상기 제조방법에 따라 제조된 광결정 IPN 복합체는, 나선형 광결정 구조체에 부분적으로 형성되어 있는 형태 또는 유리 기판 상에 개별적으로 분포된 형태로 제조될 수 있다.
상세하게는 (1) 평행하게 쌓인 두 개의 기판 사이에 비반응성 키랄 도판트와 반응성 네마틱 메조겐을 혼합한 혼합물을 주입 및 경화한 후, 상부 기판을 제거하고 나선형 구조를 유지하면서 키랄 도판트를 제거하여, 고상의 나선형 광결정 필름을 제조하는 단계; (2) 상기 광결정 필름 상에 PAA 하이드로겔 혼합물을 코팅함으로써, 상기 광결정 필름의 내부 공간에 PAA 하이드로겔을 침투시키고 경화하여 IPN 구조의 복합체를 형성하는 단계; 및 (3) 효소 수용액에 상기 IPN 구조의 복합체를 침지하고 경화함으로써, 상기 복합체에 효소를 고정화시키는 단계;를 포함하여 필름 형태로 제조되는 것을 특징으로 한다.
이때, 상기 효소는 우레아제(Urease), 글루코스 산화효소(Glucose oxidase), 콜레스테롤 산화효소(Cholesterol oxidase), 홍당무 과산화효소(Horseradish peroxidase) 또는 크레아티닌 탈이민효소(Creatinine deiminase) 인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 비반응성 키랄 도판트는 C15, CB15, CM21, R/S-811, CM44, CM45, CM47, R/S-2011, R/S-3011, R/S-4011, R/S-5011 및 R/S-1011로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 도판트인 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 CB15 ((S)-4-cyano-4'-(2-methylbutyl)biphenyl)을 사용할 수 있다.
또한, 상기 반응성 네마틱 메조겐은 RM 82, RM 257, RM308 및 RMM727로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 메조겐인 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 RMM727을 사용할 수 있다.
상기 RMM727은 acryloyloxy기, 1,6-hexamethylenediol diacrylate, 2-methyl-1-(4-methylthiophenyl)-2-morpholinopropan-1-one을 포함하는 혼합물이며, 상기 acryloyloxy기를 포함하는 물질로 reactive acryloyloxy mesogen APBMP, reactive acryloyloxymesogen AHBCP, reactive acryloyloxy mesogen AHBMP 및 reactive acryloyloxy mesogen AHBPCHP을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 광결정 IPN 복합체 제조방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는, 효소로 기능화된 고상의 광결정 IPN 복합체를 제공한다.
상기 광결정 IPN 복합체 제조방법으로 제조된 복합체는 광결정 구조체로부터 키랄 도판트가 제거되었음에도 불구하고 나선 구조형태를 그대로 유지함에 따라 콜레스테릭 액정과 같은 빛 반사 특성을 나타낸다.
이에, 외부 자극에 의해 피치가 변화되어 육안으로도 쉽게 확인할 수 있도록 변화된 반사색을 나타내는, 본 발명의 효소로 기능화된 고상의 광결정 IPN 복합체는 바이오센서로 활용할 수 있다.
상기 바이오센서는 효소의 반응에 의한 pH 변화로 PAA 하이드로겔의 카르복시기가 이온화되고, 상기 이온화된 카르복시기가 사슬간 척력을 야기하며, 척력으로 인해 수축 및 팽창된 PAA 하이드로겔이 상기 광결정 구조체의 수축 및 팽창을 유도하여 광 밴드갭의 파장 범위가 변화함으로써, 생체 고분자를 감지한다.
이때, 상기 파장 범위의 변화는 pH 2 내지 12에서 수행되는 것을 특징으로 한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
<실시예>
(1) 재료
RMM727 (Reactive LC mixture, Merck, UK), (S)-4-cyano-4ㅄ-(2-methylbutyl)biphenyl (CB15, Synthon, Germany), 아크릴산 (AA, Junsei, Japan), Tri(propylene glycol)diacrylate (TPGDA, Sigma -Aldrich, USA), Irgacure 500 (Photoinitiator, Ciba Inc., Swizerland), 3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA, 98%, Sigma Aldrich, USA), poly(dimethylsiloxane) (PDMS, Sylgardⓒ 184 Silicone elastomer kit, Dow Corning, USA)을 이용하였다.
그리고, Chloroform (Duksan, South Korea), Acetone (Duksan, South Korea), Polyimide (PI, Lixon Aligner, Chisso, Japan), NOA65 (Norland Products, USA), Micro-pearl (Sekisui, Japan), N-hydroxysuccinimide (NHS, Sigma-Aldrich, USA)을 이용하였다.
또한, N-(3-dimethylaminopropyl)-Nㅄ-ethylcarbodiimide (EDC·HCl, Sigma-Aldrich, USA), pH buffer solutions (Samchunⓒ, Korea), Urea (Sigma-Aldrich, USA), Urease (Sigma-Aldrich, USA), Glucose (Sigma-Aldrich, USA), Cholesterol (Sigma-Aldrich, USA), L-ascorbic acid (Sigma-Aldrich, USA), Bbiotin (Sigma-Aldrich, USA), Uric acid (Sigma-Aldrich, USA), Human serum (Sigma-Aldrich, USA)을 이용하였으며, 탈이온수(Deionized water, DI)는 역삼투 시스템(PureFO, Romax)으로 정제한 것을 사용하였다.
(2) CLC 혼합 용액의 제조
일정량의 RMM 727와 CB15를 60℃에서 12시간 동안 자기교반(Magnetic stirring)을 통해 혼합하였다. 이때, RM727과 CB의 비율은 파이(Φ)로 나타내었다.
상기 투명한 CLC 혼합 용액을 완전히 교반하고 25℃에서 냉각시켜, 유백색의 CLC 혼합 용액을 제조하였다.
(3) 효소로 기능화된 IPN 구조의 어레이 필름(ICLCHPN urease ) 제조
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 ICLCHPNurease의 제조방법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 1을 참조하여 설명하면, 유리 기판(Marienfeld, Germany)을 메탄올 및 탈이온수로 순차적으로 세척하고, 상기 유리 기판에 스핀 코터(SPIN-1200D, Midas, Korea)를 이용하여 2000 rpm에서 60초 동안 PI 정렬기(PI aligner)로 PI를 스핀 코팅한 후, 마찰기(Namil Optical Components, South korea)로 문질러 상부 기판을 형성하였다. 이때 PI를 문지른 상부 기판은 평면 앵커링에 의해 CLC 필름을 전체적으로 배향시킬 수 있으며, UV 경화 후에 쉽게 제거될 수 있다.
또 다른 유리 기판에 스핀 코터를 이용하여 3000 rpm에서 45초 동안 TMSPMA를 스핀 코팅한 후, 65℃의 오븐에서 건조시킴으로써, CLC 혼합 용액과 반응할 수 있는 하부 기판을 형성하였다.
상기 상부 기판 및 하부 기판을 NOA65로 접착된 Micro-pearl을 이용하여 평행한 배향으로 6㎛ 두께로 샌드위치 시킨 다음, 상기 CLC 혼합 용액을 모세관힘에 의해 삽입시키고, UV 경화기(Innocure 100N, Lichtzen, South korea)를 이용하여 365nm에서 20분 동안 5초 켜기 및 끄기를 반복하여 경화시켰다.
UV 경화 후, 샌드위치된 유리 중 상기 상부 기판을 제거하고, 하부 기판 상의 경화된 CLC 필름을 아세톤으로 10회 세척하여 키랄 도판트를 추출하였다.
AA/TPGDA/Irgacure 500(98.5wt%/0.5wt%/1.0wt%) 혼합 용액을 CLC 필름에 30분 동안 코팅하여 필름의 내부 공간에 PAA 하이드로겔을 침투시킨 후, 상기 필름을 6cm의 거리에서 10분 동안 포토 마스크(Photo mask)로 UV 경화하여 IPN 구조의 복합체 필름(이하 "ICLCHPN 필름"이라 함)을 형성하였다. 이때 포토 마스크에는 직경 2mm의 도트가 포함되어 있으며, 도트의 중심에서 4mm 정도 사각형으로 분리되어 있다.
그 다음, ICLCHPN 필름을 pH 12에서 EDC/NHS 수용액(0.2M/0.2M)에 1시간 동안 침지하여 활성화시켰다. EDC 커플링된 ICLCHPN 필름을 우레아제 수용액(1wt%)에 침지하여 우레아제를 결합시킨 후, 대기 중에서 건조하여 우레아제로 기능화된 IPN 구조의 복합체 필름(이하 "ICLCHPNurease 필름"이라 함)을 제조하였다. 상기 ICLCHPNurease 필름의 색은 2×3 필름의 도트에 7.5mM의 요소 수용액을 떨어뜨리고 75분 이상 경과된 후에 포화되었다(도 2 참고).
(4) PAA 하이드로겔 액적의 제조
후술할 실험예 (1)에서 PAA 하이드로겔 액적의 부피변화를 확인하기 위하여, TPGDA 및 AA 단량체를 혼합한 AA/TPGDA 혼합 용액을 주사기로 PDMS(Polydimethylsiloxane) 전구체가 들어있는 바이알에 투입하여 액적을 제조하였다. 이때 PDMS 미세유체(또는 유리 모세관)를 사용할 경우 in-situ UV 경화되면 액적이 서로 합쳐지는데, 이는 증가된 밀도로 인해서 튜브 내의 액적 간 거리가 가까워지므로, 가교 결합 후에 이동이 느려지기 때문이다.
도 3은 PAA 하이드로겔 액적의 제조를 나타낸 사진으로, (a)는 PAA 하이드로겔 액적의 제조를 위한 실험장비 세팅을 나타낸 사진이고, (b)는 제조된 PAA 하이드로겔 액적을 나타낸 사진이다.
도 3의 (a)를 참조하여 설명하면, 1mm 직경의 AA/TPGDA 용액은 0.3mm 직경의 주사기 팁에 형성되었으며, 시린지 펌프(LEGATO 100, kdScientific, USA)에 의해 제어된 0.1μl/s의 속도로 PDMS 바이알에 투입되었다. 이때 주사기는 PDMS에서 일련의 액적을 만들기 위해 수직으로 이동하였으며, 생성된 PAA 하이드로겔 액적은 PDMS의 높은 점도(51 poise)로 인해 거의 고정되어 있다.
도 3의 (b)와 같이 바이알 내 고정된 액적은 병합하지 않고 UV 램프(Innocure 100M, Lichtzen, South korea)를 이용하여 6cm 거리에서 10분 동안 경화시켰으며, 그 후 PAA 하이드로겔 액적을 추출하고 클로로포름으로 씻어낸 다음 65℃의 오븐에서 건조시켰다. 건조된 PAA 하이드로겔 액적을 EDC/NHS 수용액(0.2M/0.2M)에 1시간 동안 침지하여 활성화시키고, EDC로 커플링된 PAA 하이드로겔 액적을 우레아제 수용액(1wt%)에 침지하여 우레아제를 결합시킨 후, 대기 중에서 건조하여 우레아제로 기능화된 PAA 액적(이하 "PAAurease 액적"이라 함)을 제조하였다.
(5) 분석장치
ICLCHPN 필름의 단면 영상은 15 kV의 가속 전압에서 작동되는 전계 방출 주사 전자 현미경(FE-SEM, SU8220, Hitachi, Japan)을 사용하여 측정하였다. 구체적으로 백금이 단면에 코팅된 ICLCHPN 필름을 샘플로 하여 FE-SEM을 분석하였다.
푸리에 변환 적외선 스펙트럼 (Fourier-transform infrared spectra, FTIR spectra)은 FTIR 분광기 (FT/IR-4100, Jasco, Japan)을 통해 600 ~ 4,000cm-1의 범위에서 4cm-1의 분해능으로 64 scan의 평균을 수집하여 측정하였다.
CLC 필름에 대한 300 ~ 900nm 범위의 UV-Vis 스펙트럼은 UV-Vis Spectrometer (UV-2401PC, Shimadzu, Japan)으로 UV-Vis 광선에 수직으로 배향된 필름을 사용하여 측정하였다.
<실험예>
(1) PAA 하이드로겔 액적의 부피변화 확인
본 발명에 따른 PAA 하이드로겔 액적의 부피변화를 확인하기 위하여, 습윤/건조한 PAA 하이드로겔 액적의 팽창거동을 가교제의 양 및 pH에 따른 팽창거동을 분석하였다.
관련하여 도 4는 PAA 하이드로겔 액적의 팽창비를 나타낸 그래프로서, (a)는 가교제의 양, (b)는 pH에 따른 팽창비를 나타낸 것이다. 이때 (a)는 pH 9에서 가교제인 TPGDA의 양(ζ)에 따른 팽창비(Swelling ratio, Sr)를 나타내었다, (b)는 PAA 하이드로겔 액적(ζ=0.5wt%)을 함유한 바이알 내 pH에 따른 팽창비를 나타내었고, pH 별 PAA 하이드로겔 액적의 사진을 삽입하였으며, 상기 사진의 좌측 상단에 기재된 숫자는 pH를 의미한다. 팽창비(Sr)는 V/V0로 정의되며, V 및 V0는 각각 습윤 및 건조 상태에서의 PAA 하이드로겔 액적의 부피를 의미한다.
도 4의 (a)를 참조하면, ζ가 0.5wt%에 도달할 때까지 팽창비는 증가하는 경향을 나타내고, 0.5wt%일 때 약 18.2로 최대값을 나타내었으나, 그 이후 ζ가 증가함에 따라 팽창비는 큰 폭으로 감소하였다. ζ가 0 ~ 0.5wt%인 경우에는 불완전한 가교구조로 인해 팽창비가 다소 낮게 측정되었고, 0.5wt%를 초과한 경우에는 가교 밀도가 증가하여 팽창비가 감소한 것으로 판단된다.
도 4의 (b)를 참고하면, PAA 하이드로겔 액적이 함유된 바이알 내부의 pH가 2일 때 팽창비는 2.6으로 측정되었고 pH가 7에 도달할 때까지 큰 폭으로 증가하였으며, 이후 pH가 12에 도달할 때까지도 꾸준히 증가하여 pH가 12일 때 팽창비는 21.7인 것을 확인하였다.
이에 따라, 본 발명에서 PAA 하이드로겔 액적의 최대 팽창을 유도하는 가교 결합제인 TPGDA에 대한 최적의 농도는 0.5wt%이고, pH가 증가함에 따라 팽창비가 증가하는 것으로 나타났으나, pH 7에서 가장 높게 나타났다.
한편, EDC 커플링에 의한 효소의 고정화는 효소와 PAA 하이드로겔 액적 사이의 공유 결합을 제공한다. 효소 반응이 ζ가 0.5wt%에서 제조된 PAA 하이드로겔 액적의 pH와 부피를 변화시킬 수 있는지 확인하였다.
관련하여 도 5는 요소 수용액의 농도에 따른 PAAurease 액적을 나타낸 사진이다.
도 5를 참조하면, 0mM, 6.6mM, 17mM 및 50mM의 농도인 요소 수용액에서 PAAurease 액적의 크기는 각각 2.15mm, 2.37mm, 2.63mm 및 2.65mm로 측정되었다. 이는 요소 수용액의 농도가 증가함에 따라 우레아제 및 요소의 효소 반응으로 인해 암모니아가 생성되고, 암모니아는 물에서 NH4+ 및 OH-로 분해되어 PAAurease 액적의 부피 팽창이 증가하는 것으로 판단된다. 이에 따라, PAAurease 액적은 분석물의 효소 반응에 반응한다는 것을 확인할 수 있다.
(2) ICLCHPN 필름의 구조 확인
본 발명의 일실시예에 따라 제조된 ICLCHPN 필름의 구조를 확인하기 위하여, UV-Vis 스펙트럼, 사진 및 SEM 이미지를 분석하였다.
관련하여 도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 건식 CLC 필름, 건식 ICLCHPN 필름 및 습윤 ICLCHPN 필름의 UV-Vis 스펙트럼을 나타낸 것으로서, (a)는 건식 CLC 필름, (b)는 건식 ICLCHPN 필름, (c)는 습윤 ICLCHPN 필름의 Φ에 따른 UV-Vis 스펙트럼이다. 이때, 습윤 ICLCHPN 필름은 pH 7의 PBS 버퍼 용액에 함유되어 있다.
그리고 도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 건식 CLC 필름, 건식 ICLCHPN 필름 및 습윤 ICLCHPN 필름의 반사 파장을 나타낸 것으로서, (a)는 건식 CLC 필름, (b)는 건식 ICLCHPN 필름, (c)는 습윤 ICLCHPN 필름의 Φ에 따른 반사 파장을 나타낸 것이다. 이때, 습윤 ICLCHPN 필름은 pH 7의 PBS 버퍼 용액에 함유되어 있다.
도 6 및 도 7을 참조하면, 광 밴드갭의 피크는 명확하게 결정되었는데, 이는 CLC 필름에서 AA/TPGDA 혼합 용액의 침투 및 경화 전후에도 광 구조가 잘 발달되어 있음을 나타낸다. CLC 필름에서 AA/TPGDA 혼합 용액을 침투시키고 경화시킨 후에, ICLCHPN 필름의 반사 파장은 PAA에 의하여 증가된 광 밴드갭으로 인해 증가하는 것으로 판단된다.
또한, 건식 ICLCHPN 필름의 AA/TPGDA 혼합 용액 침투 및 경화 전후의 반사 파장비(r1)는 Φ = 20, 22, 24, 26, 28wt%일 때 각각 1.17, 1.19, 1.22, 1.29, 1.34로 측정되었으며, 도판트의 부피%(Φv)는 Φ = 20, 22, 24, 26, 28wt%일 때 각각 22, 24, 26, 28, 30, 32%로 계산되었다. Φv는 (r1-1)×100의 값보다 조금 높게 나타나, CLC 필름으로부터 CB15가 추출된 공간이 AA/TPGDA 혼합 용액으로 거의 채워진 것으로 나타낸다. 이때 PAA 하이드로겔은 친수성이어서 물을 통해 팽윤될 수 있으므로, 초기 상태는 습윤 상태인 것이 바람직하다.
습윤 ICLCHPN 필름의 광 밴드 갭은 건식 ICLCHPN 필름의 광 밴드갭과 비교하여 증가한 것으로 나타났다. 이를 참고하면, 녹색에서 황색 및 적색으로의 변화가 다른 색상의 변화보다 더 민감하기 때문에 이후의 실험에서 Φ=29.6wt%에서 녹색(λ=550nm)을 기준색으로 선택하였다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 건식 CLC 필름, 건식 ICLCHPN 필름 및 습윤 ICLCHPN 필름의 도판트 제거 전후를 나타낸 사진이다.
도 8의 (a)에서는 CB15를 제거하기 전의 건식 CLC 필름(Φ=29.6wt%)의 이미지로 밝은 녹색, (b)에서는 CB15를 제거한 후의 건식 CLC 필름(Φ=29.6wt%)의 이미지로 진한 파란색, (c)에서는 건식 ICLCHPN 필름의 이미지로 밝은 파란색이 관찰되었다.
이에 따라, UV 경화, 도판트 추출 및 AA/TPGDA 혼합 용액의 침투 후에도 균일한 광 구조가 필름 전체에 유지되고 있는 것을 확인할 수 있고, 도판트 추출 전 후의 CLC 필름에서 관찰된 밝은 녹색(λ=550nm) 및 파란색(λ=380nm)은 보고된 나선형의 연사력(Helical twist power)인 9.86㎛-1의 밝은 녹색(λ=555nm) 및 파란색(λ=365nm)과 일치하는 것을 확인할 수 있다.
그리고, (d)는 포토마스크로 UV 경화한 후 미반응 AA를 제거한 건식 ICLCHPN 어레이 필름의 이미지로서 파란색 배경에 하늘색 도트가 관찰되었다. 이러한 하늘색 도트는 UV 경화 후 가교 결합된 PAA로 인해 미반응 AA를 세척하여도 유지되었다. 그러나 도트 이외의 영역은 청색 배경으로 돌아가는데, 이는 AA/TPGDA 혼합 용액의 추출에 의해서 AA/TPGDA 혼합 용액이 침투되기 전과 동일한 광 구조로 되돌아 가는 것을 의미한다. (e)는 포토마스크로 UV 경화한 후 미반응 AA를 제거한 습윤 ICLCHPN 어레이 필름의 이미지로서, ICLCHPN 필름이 pH 7의 PBS 완충액에 함유되어 있을 때 반사색이 녹색으로 변하는 것으로 관찰되었다.
상기의 결과로부터, CLC 필름을 이용한 ICLCHPN 어레이 필름이 성공적으로 제조되었음을 확인할 수 있다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 CLC 필름 및 ICLCHPN 필름의 절단된 표면을 나타낸 SEM 이미지로서, (a)는 CLC 필름, (b)는 ICLCHPN 필름을 수직으로 절단한 단면을 나타내는 SEM 이미지이고, (c)는 CLC 필름과 ICLCHPN 필름의 UV-Vis 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 9의 (a)를 참조하면, AA/TPGDA 혼합 용액이 침투되지 않은 CLC 필름의 단면에서는 간격이 190±5nm인 규칙적인 층상 구조가 관찰되었고, UV 경화 및 도판트 추출에 의해 고체 상태의 광 구조가 생성된 것을 확인할 수 있다. 이때 관찰된 간격은 p/2로 나타내며, p는 나선의 피치이다.
도 9의 (b)를 참조하면, AA/TPGDA 혼합 용액이 침투되어 경화된 ICLCHPN 필름의 단면에서는 광 구조의 규칙성이 그대로 유지되면서 균일한 라멜라(Homogeneous lamellar)와 같은 구조가 관찰되었으며, 상호 침투된 PAA 네트워크로 인해 간격이 220±6nm로 증가하였다. 그리고 도판트가 추출된 공간에 AA/TPGDA 혼합 용액이 균일하게 침투되어 결함 및 상분리된 영역이 관찰되지 않았다. 이는 AA의 용해도 변수는 가교 결합된 RMM727(22MPa1/2)와 유사한 24MPa1/2이므로, AA는 RMM727에 적합한 용매임을 나타내어 AA가 상호 연결된 RMM727에 용이하게 침투되었기 때문이다.
도 9의 (c)를 참조하면, AA/TPGDA 혼합 용액이 침투되어 경화되기 전(i)과 후(ii)의 ICLCHPN 필름으로부터 각각 432nm 및 517nm(피크의 중심)에서 완벽한 광 밴드 갭이 관찰되었다. 또한 AA/TPGDA 혼합 용액이 침투되기 전의 경우에는 UV 경화후에 평탄도가 약간 저하되지만, 광 밴드 갭의 바닥과 위 가장자리 사이의 평평한 영역은 광 구조가 매우 규칙적인 것을 나타낸다.
상기의 결과로부터, CLC 필름에 PAA 하이드로겔을 침투시켜 양호한 광 구조를 갖는 ICLCHPN 어레이 필름을 성공적으로 제조하였음을 확인할 수 있다.
(3) ICLCHPN urease 필름의 구조 확인
본 발명의 일실시예에 따라 제조된 ICLCHPNurease 필름의 구조를 확인하기 위하여, FT-IR 스펙트럼을 분석하였다.
관련하여 도 10은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 CLC 필름, ICLCHPN 필름 및 ICLCHPNurease 필름의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것으로서, (a)는 CLC 필름, (b)는 ICLCHPN 필름, (c)는 ICLCHPNurease 필름을 나타낸 것이다.
도 10을 참조하면, CLC 필름의 스펙트럼(a)은 2856cm-1, 2226cm-1, 1727cm-1, 1246cm-1 및 836cm-1의 파장에서 각각 -CH2, -CN, -C, =O, -Ar-O- 및 -Ar-의 신장 밴드가 관찰되었다. 이러한 피크는 RMM의 메소제닉기(Mesogenic group) 및 스페이서기(Spacer group)에 기인함을 알 수 있다.
또한, ICLCHPN 필름의 스펙트럼(b)은 PAA의 새로운 피크가 존재하면서 CLC 필름과 동일한 피크를 보인다. 구체적으로 3400cm-1, 1408cm-1 및 1565cm-1의 파장에서 각각 카르복실산 그룹에서 비수소결합된 -OH 신장 밴드, COO- 이온의 대칭 및 반대칭 스트레칭 밴드가 관찰되었다. 그리고 1158cm-1 파장에서의 카르복실기의 -C-O- 연신의 강도는 상호 침투된 PAA 때문에 CLC 필름 스펙트럼보다 더 강해진 것을 알 수 있고, 1010cm-1 파장에서의 TPGDA의 C-O-C 스트레칭 피크는 CLC 필름에 IPN 구조의 PAA가 존재하는 것을 의미한다.
또한, ICLCHPNurease 필름의 스펙트럼(c)은 1109cm-1, 1635cm-1 및 3290cm-1의 파장에서 각각 우레아제의 -C-N, C=O(아미드 Ⅰ) 및 -N-H 변형(아미드 Ⅱ) 신장 밴드가 관찰되었다.
상기의 결과로부터, 우레아제가 고정된 ICLCHPNurease 필름이 성공적으로 제조되었음을 확인할 수 있다.
(4) ICLCHPN 필름의 pH 반응성 확인
본 발명의 일실시예에 따라 제조된 ICLCHPN 필름의 pH 반응성을 확인하기 위하여, 서로 다른 pH에서의 UV-Vis 스펙트럼을 분석하였다.
ICLCHPN 필름의 pH 반응성을 확인하기 앞서, ICLCHPN 필름을 효소로 기능화된 바이오센서로 사용하기 위해서는 광 밴드 갭의 pH 반응성을 확인하는 것이 중요하다. 도 4에서 살펴본 바와 같이, PAA 액적은 pH가 증가할수록 부피가 지속적으로 팽창하였다. ICLCHPN 필름의 내부에서 PAA의 팽창이 비슷한 방식으로 발생한다면, 광 밴드 갭의 파장도 그에 따라 증가할 것으로 예상된다.
관련하여 도 11은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 ICLCHPN 필름의 pH별 UV-Vis 스펙트럼 및 광 밴드갭의 중간 파장을 나타낸 것이다.
도 11의 (a)는 그래프의 왼쪽에서부터 오른쪽 방향으로 pH 2, 4, 6, 8, 10 및 12에서 ICLCHPN 필름의 UV-Vis 스펙트럼을 나타낸 것으로, pH에 따라 광 밴드 갭의 변화가 명확하게 관찰되었다.
도 12의 (b)는 pH 함수로서 밴드 갭의 중간 파장을 나타낸 그래프와 pH 별 ICLCHPN 어레이 도트의 사진을 나타낸 것으로, 각 도트의 상단에 기재된 숫자는 pH이다. 광 밴드 갭의 파장은 pH가 증가함에 따라 증가하였고, 큰 변화는 pH 8 이상에서 관찰되었다. 즉 높은 pH에서의 탈 양성자화는 PAA 사슬을 팽창시키고, 이는 CLC 필름의 나선 피치를 증가시킨다.
이때 PAA 액적의 최대 팽창은 pH 7 이상에서 관찰되었고(도 4의 (b) 참고), ICLCHPN 필름에 침투된 PAA의 최대 팽창은 pH 8 이상에서 관찰되었는데, 이는 ICLCHPN 필름이 CLC 필름의 내부 공간에 PAA가 침투된 구조이므로, PAA의 팽창 증가에 방해를 받아 최대 팽창이 불일치한 것으로 판단된다.
상기의 결과로부터, ICLCHPN 필름은 pH의 변화에 따라 광 밴드 갭이 변화하므로, 국소의 pH 변화를 야기하는 효소 반응에 적합하여 정교한 기구없이 육안으로 효소를 검출할 수 있는 바이오센서에 응용할 수 있음을 확인할 수 있다.
(5) ICLCHPN urease 필름의 효소 반응성 확인
본 발명의 일실시예에 따라 제조된 ICLCHPNurease 필름의 효소 반응성을 확인하기 위하여, 효소의 수용액을 떨어뜨린 후의 색상변화를 관찰하였다.
앞서 진행한 실험예 (1)의 결과로부터 PAAurease 액적이 요소의 효소 반응에 반응한다는 것을 확인하였으므로, ICLCHPNurease 필름의 효소 반응은 pH를 증가시킬 수 있고, ICLCHPN 어레이의 도트에 분석물 용액을 떨어뜨려 PAA의 부피를 팽창시킬 수 있으므로, ICLCHPNurease 내의 CLC 피치(및 반사색)를 증가시킬 수 있을 것으로 예상된다.
관련하여 도 12는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 ICLCHPNurease 필름을 나타낸 사진으로서, (a)는 기울어진 5×4 ICLCHPNurease 필름에 요소 수용액을 떨어뜨린 직후의 사진이고, (b)는 3×3 ICLCHPNurease 필름에 서로 다른 농도의 요소 수용액을 떨어뜨린 후의 색상변화를 나타낸 사진이다. 이때 도 12의 (b)의 도트 위에 기재된 숫자는 요소 수용액의 농도이다.
도 12의 (a)를 참조하면, ICLCHPNurease 필름은 소수성인 CLC 필름으로 인해 어레이의 액적들 사이에는 교차점이 없는 것을 알 수 있다. 광학 현미경(또는 육안)을 통한 관찰을 위해 과량의 분석물 용액은 마이크로 피펫을 통해 제거하였다.
도 12의 (b)를 참조하면, ICLCHPNurease 필름의 도트에 요소 수용액(3.5μL)을 떨어뜨리고 난 다음, 도트의 색상은 맑은 녹색에서 노란색으로 변화하였다.
구체적으로, 요소 수용액의 농도가 0.5mM 및 0.9mM인 경우 ICLCHPNurease 필름의 녹색은 변하지 않았고, 1.9mM 및 3.8mM인 경우 녹색과 황색이 섞인 혼색으로 관찰되었고, 7.5mM인 경우 노란색으로 관찰되었으며, 15mM 이상인 경우 노란색이 적색으로 변화하였다.
한편, 건강한 사람의 혈액 내 요소 농도는 성인 남성의 경우 17 ~ 51mg/dL이고, 여성의 경우 13 ~ 44.6 mg/dL이므로, ICLCHPNurease를 우레아 바이오센서로 활용하기 위해서는 요소가 최대 45mg/dL(7.5mM) 농도로 포함된 시료에서 효소 반응하여 색상이 변경되어야 한다.
따라서 상기의 결과로부터, ICLCHPNurease 필름의 색 변화는 우레아 수용액의 농도에 크게 의존하고, 농도 7.5mM인 요소 수용액에서 색상이 변하였으므로, 실제 혈액을 분석하기 위한 요소 바이오센서로 활용할 수 있음을 확인하였다.
(6) 사람 혈청에서 ICLCHPN urease 필름의 선택성 및 민감성 평가
본 발명의 일실시예에 따라 제조된 ICLCHPNurease 필름의 사람 혈청 내 요소 선택성 및 민감성을 평가하기 위하여, 혈액 내 성분들 및 묽은 혈청(×10 with PBS buffer solution)을 이용하여 검출실험을 수행하였다.
먼저, 실제 사람의 혈액에 존재하는 성분들을 이용하여 검출실험을 수행하였다.
관련하여 도 13은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 ICLCHPNurease 필름의 선택성 및 민감성을 나타낸 것으로서, (a)는 2×3 ICLCHPNurease 필름에 다양한 혈액 내 성분들을 떨어뜨린 후의 색상변화를 나타낸 사진이고, (b)는 2×4 ICLCHPNurease 필름에 서로 다른 요소 농도를 가지는 사람 혈청을 떨어뜨린 후의 색상변화를 나타낸 사진이다.
도 13의 (a)를 참조하면, 혈액 내의 성분인 (i) 요소(0.21mg/dL), (ii) 글루코스(0.126mg/dL), (iii) 콜레스테롤(0.24mg/dL), (iv) 비오틴(0.003mg/dL), (v) 아스코르빈산(0.017mg/dL) 및 (vi) 요산(0.006mg/dL) 용액(PBS 버퍼 용액 이용)을 어레이 도트에 3.5μL씩 각각 떨어뜨린 후, ICLCHPNurease 필름의 색상변화를 확인할 수 있다. 구체적으로 요소 용액을 떨어뜨린 ICLCHPNurease 어레이 필름만 노란색으로 색상이 변화하였으며, 나머지 성분들의 용액을 떨어뜨린 ICLCHPNurease 어레이 필름은 색상이 변화하지 않았다.
이에 따라, ICLCHPNurease 필름은 요소에 대해 높은 선택성을 가지며, 요소 바이오센서로 사용될 수 있음을 확인하였다.
다음으로, PBS 버퍼 용액으로 희석한 혈청을 이용하여 검출실험을 수행하였다. 이때 사람 혈청은 콜레스테롤, 포도당, 나트륨, 철, 단백질, 독소 및 중성 지방을 포함하는 것으로 알려져 있으므로, 상이한 농도의 요소를 희석한 혈청을 이용하였다.
도 13의 (b)에 기재된 숫자는 요소 수용액의 농도이다. 이를 참조하면, 요소 수용액의 농도가 3.5mM인 경우 ICLCHPNurease의 녹색은 노란색으로 변화하기 시작하였고, 7.5mM인 경우 노란색으로 나타났으며, 14mM 및 28mM인 경우 노란색에서 빨간색으로 변화하기 시작하였다. 이러한 결과는 도 12의 (b)의 결과와 유사하므로, 혈청 내의 다른 성분들이 ICLCHPNurease의 요소 검출 성능을 저해하지 않는 것을 알 수 있다.
상기의 결과로부터, ICLCHPNurease는 요소 검출에 대한 충분한 특이성을 제공하며, 실제 혈액 검사에 사용할 수 있음을 확인하였다.
덧붙여, pH 및 요소 수용액에 대한 ICLCHPN 및 ICLCHPNurease 어레이 필름의 가역성을 분석하였다.
관련하여 도 14는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 ICLCHPN 필름과 ICLCHPNurease 필름의 pH 및 요소 수용액에 대한 가역성을 나타낸 것으로서, (a)는 2×2 ICLCHPN 필름에 pH 2 및 12인 수용액을 교대로 떨어뜨린 후의 색상변화를 나타낸 사진이고, (b)는 2×2 ICLCHPNurease 필름에 교대로 물로 세척하고, 요소 수용액을 떨어뜨린 후의 색상변화를 나타낸 사진이다.
도 14의 (a)를 참조하면, pH 2인 수용액을 떨어뜨려 하늘색을 나타내는 ICLCHPN 필름에 pH 12인 수용액을 떨어뜨려 빨간색으로 변화시켰으며, (i), (iii), (v) 및 (vii)은 pH 2인 수용액을 떨어뜨린 후의 ICLCHPN 필름 사진이고, (ii), (iv), (vi) 및 (viii)은 pH 12인 수용액을 떨어뜨린 후의 ICLCHPN 필름 사진이다. 이렇게 pH 2 수용액 및 pH 12 수용액을 교대로 떨어뜨리는 것을 4번 반복하는 동안 ICLCHPN 필름은 교대로 하늘색과 빨간색으로 변화하였으므로, 수용액의 pH에 따라 ICLCHPN 내 PAA 하이드로겔의 가역적인 팽창 및 수축이 일어나는 것을 확인하였다.
도 14의 (b)를 참조하면, 물로 세척하여 녹색을 나타내는 ICLCHPNurease 필름에 요소 수용액(3.5μL, 7.5mM)을 떨어뜨려 노란색으로 변화시켰으며, (i), (iii), (v) 및 (vii)은 물로 세척한 후의 ICLCHPNurease 필름 사진이고, (ii), (iv), (vi) 및 (viii)은 요소 수용액을 떨어뜨린 후의 ICLCHPNurease 필름 사진이다. 이렇게 물로 세척하고, 요소 수용액을 떨어뜨리는 것을 4번 반복하는 동안 ICLCHPNurease 필름은 교대로 녹색 및 노란색으로 변화하였으므로, ICLCHPNurease 필름은 물로 간단히 세척하여 여러번 재사용할 수 있음을 확인하였다.
전술한 내용은 후술할 발명의 청구범위를 더욱 잘 이해할 수 있도록 본 발명의 특징과 기술적 장점을 다소 폭넓게 상술하였다. 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

  1. (1) 비반응성 키랄 도판트와 반응성 네마틱 메조겐을 혼합 및 경화한 후, 나선형 구조를 유지하면서 키랄 도판트를 제거하여 고상의 나선형 광결정 구조체를 제조하는 단계;
    (2) 상기 광결정 구조체의 내부 공간에 PAA 하이드로겔을 침투시킨 후, 경화하여 IPN 구조의 복합체를 형성하는 단계;
    (3) 상기 IPN 구조의 복합체에 효소를 고정하는 단계; 및
    (4) 상기 효소가 고정된 복합체에 검출대상을 첨가하는 단계;를 포함하고, 상기 복합체의 광결정 색상의 변화에 따라 상기 검출대상의 농도를 측정하는, 고상의 광결정 IPN 복합체를 이용한 농도 측정방법.
  2. 제1항에 있어서,
    (1) 평행하게 쌓인 두 개의 기판 사이에 비반응성 키랄 도판트와 반응성 네마틱 메조겐을 혼합한 혼합물을 주입 및 경화한 후, 상부 기판을 제거하고 나선형 구조를 유지하면서 키랄 도판트를 제거하여, 고상의 나선형 광결정 필름을 제조하는 단계;
    (2) 상기 광결정 필름 상에 PAA 하이드로겔 혼합물을 코팅함으로써, 상기 광결정 필름의 내부 공간에 PAA 하이드로겔을 침투시키고 경화하여 IPN 구조의 복합체를 형성하는 단계;
    (3) 효소 수용액에 상기 IPN 구조의 복합체를 침지하고 경화함으로써, 상기 복합체에 효소를 고정하는 단계; 및
    (4) 상기 효소가 고정된 복합체에 검출대상을 첨가하는 단계;를 포함하고, 상기 복합체의 광결정 색상의 변화에 따라 상기 검출대상의 농도를 측정하는, 고상의 광결정 IPN 복합체를 이용한 농도 측정방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 효소는 우레아제(Urease), 글루코스 산화효소(Glucose oxidase), 콜레스테롤 산화효소(Cholesterol oxidase), 홍당무 과산화효소(Horseradish peroxidase) 또는 크레아티닌 탈이민효소(Creatinine deiminase)인 것을 특징으로 하는, 고상의 광결정 IPN 복합체를 이용한 농도 측정방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 비반응성 키랄 도판트는 C15, CB15, CM21, R/S-811, CM44, CM45, CM47, R/S-2011, R/S-3011, R/S-4011, R/S-5011 및 R/S-1011로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 도판트인 것을 특징으로 하는, 고상의 광결정 IPN 복합체를 이용한 농도 측정방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 반응성 네마틱 메조겐은 RM 82, RM 257, RM308 및 RMM727로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 메조겐인 것을 특징으로 하는, 고상의 광결정 IPN 복합체를 이용한 농도 측정방법.
  6. 비반응성 키랄 도판트와 반응성 네마틱 메조겐을 혼합 및 경화한 후, 나선형 구조를 유지하면서 키랄 도판트를 제거하여 고상의 나선형 광결정 구조체를 제조하고, 상기 광결정 구조체의 내부 공간에 PAA 하이드로겔을 침투시킨 후 경화하여 IPN 구조의 복합체를 형성하며, 상기 IPN 구조의 복합체에 효소를 고정하고, 상기 효소가 고정된 복합체에 검출대상을 첨가하여, 상기 복합체의 광결정 색상이 변화함에 따라 상기 검출대상의 농도를 측정하는, 농도측정용 고상의 광결정 IPN 복합체.
  7. 제6항에 따른 광결정 IPN 복합체를 이용하여 제조되는 것을 특징으로 하는, 바이오센서.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 효소의 반응에 의한 pH 변화로 PAA 하이드로겔의 카르복시기가 이온화되고, 상기 이온화된 카르복시기가 사슬간 척력을 야기하며, 척력으로 인해 수축 및 팽창된 PAA 하이드로겔이 상기 광결정 구조체의 수축 및 팽창을 유도하여 광 밴드갭의 파장 범위가 변화함으로써, 생체 고분자를 감지하는 것을 특징으로 하는, 바이오센서.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 파장 범위의 변화는 pH 2 내지 12에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 바이오센서.
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