KR102002891B1 - 삼색도장버섯 추출물 및 삼색도장버섯 균사체로 발효시킨 발효물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 삼색도장버섯의 자실체, 삼색도장버섯의 균사체 및 삼색도장버섯 균사체의 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상으로부터 수득한 삼색도장버섯 추출물; 및 삼색도장버섯 균사체로 발효시킨 발효물;을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 삼색도장버섯의 자실체 및 균사체로부터 수득한 추출물, 또는 삼색도장버섯 균사체의 배양액으로부터 수득한 삼색도장버섯 추출물과, 삼색도장버섯의 균사체로 발효시킨 발효물을 유효성분으로 포함하여 피부 탄력 증진 및 주름 개선 효과가 우수하다.
또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 노화 방지, 미백, 피부자극 완화, 여드름 방지, 항산화, 피부 보습, 아토피 개선, 항염증, 모발손상 방지, 탈모방지 및 육모 개선 효과 등의 복합 기능을 나타내어 피부 토탈캐어를 위한 용도로 활용이 가능하다.

Description

삼색도장버섯 추출물 및 삼색도장버섯 균사체로 발효시킨 발효물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITIONS COMPRISING EXTRACTS OF DAEDALEOPSIS TRICOLOR AND FERMENTATION MATERIAL BY MYCELIUM OF DAEDALEOPSIS TRICOLOR}

본 발명은 삼색도장버섯의 추출물과 삼색도장버섯의 균사체로 발효시킨 발효물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부환경으로부터 생체를 보호하는 보호막의 기능을 하는 기관으로, 물 또는 전해질 등과 같은 인체 구성성분의 손실을 방지하고, 외부로부터 유해물질이 인체 내로 침입하지 못하도록 보호하는 역할을 하며, 크게 표피층, 진피층 및 피하지방층으로 구분할 수 있다.

피부는 유전적인 요소 또는 환경적인 요소 등의 원인들로 인해 시간이 경과함에 따라 끊임없이 변화하는 특성을 보이며, 유전적인 요소에 영향을 받는 자연 노화는 인위적인 조절이 어려운 반면, 환경적인 요소로 인한 외적 노화는 인위적인 조절이 비교적 용이한 것으로 알려져 있으며, 특히, 환경적인 요소로 인한 외적 노화로 자외선에 의한 주름 형성이 가장 두드러지게 나타나는 현상인 것으로 알려져 이를 방지하기 위한 다양한 화장료에 대한 연구가 진행되고 있다.

화장료는 아름답고 건강한 피부를 유지하도록 도움을 주는 물질로, 피부의 산화적 손상을 방지하는 항산화 기능, 피부 주름 형성을 방지하는 주름 개선 기능, 자외선의 피부 조사량을 줄일 수 있는 자외선 차단 기능, 피부에 충분한 수분을 공급하는 보습 기능 등의 역할을 하며, 이밖에도 피부에 충분한 영양분을 공급하여 피부 건강을 유지시키는 기능을 한다. 최근에는, 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 제조되어 왔던 종래의 화장료와는 달리, 피부에 부작용이 적을 뿐만 아니라 안전성이 우수하고 피부 생리활성이 우수한 천연물을 소재로 활용한 화장료에 대한 다양한 개발이 진행되고 있다.

한편, 천연 재료 중 하나로 버섯은 통상 식용 또는 약용으로 제공되는 자실체와 버섯류의 경 또는 뿌리에 상당하는 균사체로 구성되어 있으며, 버섯의 자실체는 번식기관으로서의 기능을 하고, 균사체는 자실체에 영양분을 공급하는 영양기관으로서의 기능을 하며, 자칠체가 식용 또는 약용으로 쓰여져 왔으나, 담자균류에는 자실체보다 균사체에 많은 영양분과 약효성분이 축적되어 있는 것으로 알려져 관심이 증가하고 있다.

특히, 삼색도장버섯(Daedaleopsis tricolor)은 담자균류 민주름버섯목 구멍장이버섯과의 버섯으로, 죽은 활엽수에 기와 모양으로 무리지어 발생하는 갈색 버섯이다. 버섯 표면은 밋밋하지만 형태는 반원형 또는 편평한 조개 껍질 모양을 하고 있으며, 갓의 빛깔인 황갈색, 적갈색, 암갈색의 3가지 색으로 인해 삼색도장버섯이라고 명명된 것으로 알려져 있다. 삼색도장버섯에 갓 밑면의 자실층은 완전한 주름을 이루고 있고 이와 같은 자실층이 면역 활성 및 항암 효과가 있는 것으로 알려져 관심이 증가하고 있으며, 삼색도장버섯을 화장료로 활용하기 위한 연구 또한 진행되고 있다.

일례로, 한국등록특허 제10-1580965호에는 삼색도장버섯 자실체 추출물 또는 삼색도장버섯 균사체 추출물 또는 삼색도장버섯 균사체의 배양액을 함유하는 화장료 조성물 및 피부외용제 조성물에 관한 기술 내용이 개시된 바 있다.

하지만, 상기 문헌 1에 기재된 화장료 조성물은 피부 탄력 증진 및 주름 개선 효과가 다소 떨어진다는 문제가 있어, 이를 보완할 수 있는 방법에 대한 연구가 필요하다.

한국등록특허 제10-1580965호 (공개일 : 2015.12.31)

심성미, 임경환, 김정완, 이우윤, 김하원, 이민웅, 이태수., 삼색도장버섯(Daedaleopsis tricolor)에서 추출한 조다당류의 면역 활성 및 항암 효과., 한국균학회지 제31권 제3호., 2003. 12., page 161-167 임형선, 윤경하., 삼색도장버섯(Daedaleopsis tricolor TP3)에 의한 Methylene blue의 탈색과 분해., 순천향자연과학연구., Vol.6 No.1 2000년., page 51-58

본 발명은 상기한 바와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 삼색도장버섯 추출물 및 삼색도장버섯 균사체로 발효시킨 발효물을 유효성분으로 포함하여 피부 탄력 증진 및 주름 개선 효과가 현저히 향상된 화장료 조성물에 대한 기술 내용을 제공하고자 하는 것이다.

상기한 바와 같은 기술적 과제를 달성하기 위해서 본 발명은, 삼색도장버섯의 자실체, 삼색도장버섯의 균사체 및 삼색도장버섯 균사체의 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상으로부터 수득한 삼색도장버섯 추출물; 및 삼색도장버섯 균사체로 발효시킨 발효물;을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 상기 발효물은 브로콜리, 시금치 및 토마토로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 식물로부터 수득한 추출물에 상기 삼색도장버섯 균사체를 접종하여 1 내지 10일 동안 발효한 후, 200 내지 600 메쉬(mesh)의 여과망으로 여과하여 수득한 식물 발효 추출물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 발효물은 콜라겐 포함 혼합용액에 상기 삼색도장버섯 균사체를 접종하여 1 내지 10일 동안 발효한 후, 200 내지 600 메쉬(mesh)의 여과망으로 여과하여 수득한 콜라겐 발효물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 아이 크림, 세럼, 영양 크림, 맛사지 크림, 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 파우더, 엣센스, 팩, 헤어토닉, 헤어 트리트먼트, 샴푸, 린스의 제형인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 화장료 조성물은 조성물의 총중량을 기준으로 삼색도장버섯 추출물 0.1 내지 30 중량% 및 삼색도장버섯 균사체로 발효시킨 발효물 0.01 내지 30 중량%;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 삼색도장버섯의 자실체 및 균사체로부터 수득한 추출물, 또는 삼색도장버섯 균사체의 배양액으로부터 수득한 삼색도장버섯 추출물과, 삼색도장버섯의 균사체로 발효시킨 발효물을 유효성분으로 포함하여 피부 탄력 증진 및 주름 개선 효과가 우수하다.

또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 노화 방지, 미백, 피부자극 완화, 여드름 방지, 항산화, 피부 보습, 아토피 개선, 항염증, 모발손상 방지, 탈모방지 및 육모 개선 효과 등의 복합 기능을 나타내어 피부 토탈캐어를 위한 용도로 활용이 가능하다.

도 1은 실시예에 따른 (a) 시금치 추출물, (b) 토마토 추출물, (c) 시금치 발효물 및 (d) 토마토 발효물의 항산화 효과를 측정한 결과이다.
도 2는 실시예 1, 실시예 2, 비교예 1 및 비교예 2의 화장료가 나타내는 피부 탄력 개선효과를 분석한 결과를 나타내는 표이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하도록 한다.

본 발명은, 삼색도장버섯의 자실체, 삼색도장버섯의 균사체 및 삼색도장버섯 균사체의 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상으로부터 수득한 삼색도장버섯 추출물; 및 삼색도장버섯 균사체로 발효시킨 발효물;을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 삼색도장버섯 추출물은 자연채취되거나, 인공배양된 삼색도장버섯의 자실체 또는 균사체로부터 수득한 자실체 추출물 또는 균사체 추출물을 포함할 수 있다.

상기 자실체 추출물 또는 균사체 추출물은 물 또는 알코올 등을 추출용매로 하여 상기 삼색도장버섯의 자실체 또는 균사체로부터 수득한 추출물이라면 제한받지 않고 사용할 수 있으며, 상기 추출물은 냉침 추출, 환류 추출, 가열 추출, 초암파 추출, 초고압 추출 등의 추출방법을 통해 수득한 삼색도장버섯의 자실체 추출물 또는 균사체 추출물을 사용할 수 있다.

일례로, 상기 삼색도장버섯의 자실체 및 균사체를 포함하는 혼합물에 에탄올을 2 내지 5배로 첨가하여 혼합용액을 제조하고, 제조한 혼합용액을 상온에서 2 내지 10회 이상 수회 반복 환류추출하는 방법을 통해 삼색도장버섯의 자실체 추출물 또는 균사체 추출물을 수득할 수 있다.

또한, 상기 삼색도장버섯 추출물은 상기 삼색도장버섯 균사체를 배양하여 수득한 배양액 또는 상기 배양액을 각종 유기용매 또는 알코올로 추출한 배양액 추출물을 포함할 수 있으며, 배양액을 건조하여 분말 형태로 제조한 것을 사용할 수 있다. 그리고, 삼색도장버섯을 배양한 후, 배양액을 여과한 여과액을 삼색도장버섯 추출물로 사용할 수도 있으며, 삼색도장버섯 균사체를 액체 발효시키고, 균사체를 원심분리를 통해 제거한 후, 종이필터로 여과하여 수득된 여과액을 삼색도장버섯 추출물로 사용할 수 있다.

한편, 상기 삼색도장버섯 균사체 추출물 또는 삼색도장버섯 균사체를 배양하여 수득한 배양액은, 동물성 소재, 식물성 소재 또는 이들의 혼합물을 기질로 사용한 삼색도장버섯 균사체의 추출물일 수 있으며, 상기 기질로 버섯의 균사체를 배양하기 위해 통상적으로 사용되는 동물성 소재 또는 식물성 소재를 기질로 사용할 수 있다.

상기와 같은 방법으로 수득한 자실체 추출물, 균사체 추출물, 삼색도장버섯 배양액 또는 이들의 혼합물을 포함하는 삼색도장버섯 추출물은 여과, 감압농축 또는 동결건조한 후, 극성용매를 가해 가용화할 수 있다.

일례로, 수득된 추출액을 여과시킨 후, 농축조로 이송하여 30 내지 50 ℃의 온도에서 감압농축하여 농축물을 제조하거나, 농축물을 동결 건조하는 방법을 통한 감압농축물 또는 동결건조물이 0.00001 내지 70.0 중량% 함유되도록 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 액상의 추출물을 제조할 수도 있다.

상기와 같은 삼색도장버섯 추출물은 상기 삼색도장버섯 자실체 또는 균사체로부터 수득한 추출물 또는 삼색도장버섯 균사체의 배양액에서 수득한 추출물을 포함하며, 삼색도장버섯의 다당체를 다량 포함하여 우수한 피부 미용 개선 효과를 나타낼 수 있고, 항산화 효과, 기질 금속단백질분해효소(MMP-1) 활성 저해효과, 기질 금속단백질분해효소(MMP-1) 발현 억제효과, 프로콜라겐 생합성 촉진효과, 엘라스틴 생성촉진효과, 미백효과, 염증유발관련 효소(hyaluronidase) 활성 억제효과, 자외선 조사에 의한 세포독성 완화효과, 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과, 자외선 조사에 의한 프로스타글란딘 생합성 억제 효과, 여드름균에 대한 항균효과, 아토피 피부염에 대한 항염증효과, 피부 자극 완화효과, 모발손상 방지 효과, 탈모방지 또는 육모 개선 효과가 매우 우수하여 다기능성 화장료 조성물에 이용될 수 있다.

한편, 상기 삼색도장버섯 균사체로 발효시킨 발효물은 동물 또는 식물로부터 수득한 원료로부터 발효물 제조를 위한 원재료 추출물을 제조하고, 원재료 추출물에 삼색도장버섯 균사체를 접종한 후 발효시켜 유효성분의 포함함량을 증가시키고, 원재료에 포함된 고분자 물질을 저분자화하여 발효물을 제조할 수 있다.

상기와 같은 발효물은 원재료 추출물을 발효시킴에 따라, 원재료에 포함된 다당류를 알코올로 변화시키고, 원재료에 포함된 플라보노이드, 각종 아미노산을 저분자화하여 흡수를 용이하게 하고, 비타민과 아미노산 등의 유효성분의 추출효율을 현저히 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라, 천연소재를 안정화시키고 독성을 저감하여 불활성 물질을 활성화시켜 파뷰 탄력성 증진 및 피부주름 개선 효과를 극대화 시킬 수 있다.

바람직하게는, 상기 발효물은 삼색도장버섯의 종균을 한천 배지 등과 같은 배양액에 접종하여 배양하고, 배양된 균주를 수득한 후, 상기 원재료 추출물에 접종하는 방법을 통해 발효물을 제조할 수 있으며, 교반속도 및 용존산소량을 균사체의 증식 속도에 따라 조절하고, 1 내지 10일 동안 발효할 수 있다. 발효시킨 원재료 추출물은 200 내지 600 메쉬(mesh)의 여과망으로 여과하여 발효물을 수득할 수 있다.

바람직하게는, 상기 발효물은 브로콜리, 시금치 및 토마토 분말 또는 절편 등의 원재료에서 열추추출 방법으로 추출하여 제조한 브로콜리 열수추출물, 시금치 열수추출물 및 토마토 열수추출물을 발효물 제조를 위한 원재료로 사용할 수 있다.

구체적으로, 상기 열수추출물은 바람직하게 브로콜리, 시금치 또는 토마토를 각각 세절하고, -30 내지 -50 ℃에서 급속 냉각시키고 진공상태에서 수분을 승화시켜 동결건조된 브로콜리, 시금치 또는 토마토 절편을 각각 분쇄하여 분말을 제조한 후, 제조한 분말에 물을 가한 후, 가열하는 방법으로 열수추출하고, 300 내지 500 mesh의 여과망으로 체걸음(sieving) 또는 여과하여 수득한 각각의 열수추출물을 사용할 수 있다. 상기와 같은 각각의 열수 추출물에 삼색도장버섯 균사체를 접종하고, 이를 발효시켜 브로콜리 발효물, 시금치 발효물, 토마토 발효물 또는 이들을 혼합한 혼합 발효물을 수득할 수 있으며, 이와 같은 브로콜리 발효물, 시금치 발효물 및 토마토 발효물은 피부에 도입시 각각의 추출물에 비해 현저히 향상된 피부 보습효과, 항산화, 피부 재생 효과를 나타낸다.

상기 발효물은 발효를 완료한 직후의 상태 또는 발효완료 후 균사체를 걸러낸 상태 또는 균사체 외에 기타 잔여물을 걸러낸 상태를 모두 포함하는 개념으로, 상기 발효물은 다양한 건조의 방법을 통해 액체를 휘발시키제조한 발효물의 고형분을 포함할 수 있으며, 제조한 발효물은 화장품 제형에 첨가되기에 적합하도록, 에탄올, 부틸렌글리콜 등의 용매를 사용하여 가용화시킨 형태일 수 있고, 용매의 특성에 따라 특정 성분을 농축하여 추출한 것을 발효물로 사용할 수도 있다.

한편, 상기 발효물은 콜라겐을 포함하는 수용액에 삼색도장버섯 균사체를 접종하여 발효시킨 콜라겐 발효물을 포함할 수 있다. 상기와 같은 콜라겐 발효물은 콜라겐을 직접적으로 도입하는 것에 비해, 삼색도장버섯 균사체로 발효되어 저분자화됨에 따라, 피부에 도입시 피부 보습력 향상, 피부 주름 개선, 피부 탄력 향상, 모발의 유연성 증가 등의 콜라겐의 특성이 현저히 향상된 효과를 나타낼 수 있다.

상기 콜라겐은 돼지 등의 동물 유래 콜라겐 또는 어류 유래 콜라겐인 피쉬 콜라겐(fish collagen)을 사용할 수 있으나, 바람직하게는, 동물 유래 콜라겐에 비해 분자량이 작고, 하이드록시 프롤린의 함량이 높은 어류 유래 콜라겐을 사용하여 피부 도입량을 증가시키도록 구성할 수 있다.

상기 콜라겐의 피부 도입량의 증가를 위해서는 콜라겐이 피부의 상피세포를 통과해 진피층 내부로 경피전달되어야 하는데, 피부 세포들간 간격은 대략 70 내지 300 nm인 것으로 알려져 있다. 상기 콜라겐은 일반적인 길이가 대략 300 nm 이상으로 상기와 같은 길이를 갖는 동물 유래 콜라겐은 피부에 도입이 쉽지 않으며, 동물 유래 콜라겐에 비해 저분자량을 갖는 어류 유래 콜라겐 또한 피부에 적합하지 않은 크기를 갖는다.

이에, 본 발명에서는 상기와 같은 어류 유래 피쉬 콜라겐를 삼색도장버섯 균사체로 발효시키는 방법으로 콜라겐을 저분자량 처리하여 화장료 조성물에 포함시킬 수 있다. 상기와 같이 저분자화된 피쉬 콜라겐이 피부에 도입되면, 하이드록시 프롤린 등과 같은 아미노산의 피부 도입량이 증가되어 진피층의 섬유아세포에서 프로콜라겐의 합성을 증진시키고, 체내 콜라겐의 합성을 촉진시켜 피부 탄력을 증진시키는 역할을 할 수 있다.

종래에는, 피쉬 콜라겐은 어류 껍질을 원료로 산 또는 가열 등의 처리 공정으로 연화시키고, 단백질 가수분해 효소로 분해한 후, 여과하여 제조하고 있다. 하지만, 상기와 같은 피쉬 콜라겐은 분자량 5 kDA을 초과하는 펩티드를 다량 포함하여 콜라겐 입자의 크기가 커 피부에 도입하기에 적합할 정도로 저분자화되지 않고, 미세한 이취가 잔존하는 문제가 있다.

이에, 본 발명에서 사용하는 피쉬 콜라겐은, 명태, 오징어, 대구 등과 같은 어류의 껍질을 원료로 미생물 발효 등의 방법으로 효소처리하여 1차 가수분해하고, 1차 가수분해처리한 콜라겐을 펩신(pepsin) 또는 뉴트라아제(neutrase) 등의 효소로 2차 가수분해처리 한 후, 수압을 이용해 100 MPa 이상의 압력을 가해 액화처리하여 점성 및 미세 이취를 제거한 콜라겐을 제조할 수 있으며, 이와 같은 콜라겐을 포함하는 수용액에 삼색도장버섯 균사체를 접종하여 발효시킬 수 있다.

구체적으로, 상기 콜라겐 발효물은 콜라겐 1.0 내지 30.0 중량%와 정제수 70.0 내지 99.0 중량%를 포함하는 콜라겐 수용액에 삼색도장버섯 균사체를 접종한 후, 상온에서 0.1 내지 1.0 vvm의 통기량 조건에서 1 내지 10일 동안 발효하고, 발효된 콜라겐 수용액을 여과하는 공정을 통해 콜라겐 발효물을 제조할 수 있다.

바람직하게는, 상기 콜라겐은 어류에서 추출한 분자량(molecular weight) 10,000 Dalton 이하의 저분자량 콜라겐을 사용할 수 있으며, 삼색도장버섯 균사체는 상온에서 0.1 내지 1.0 vvm의 통기량의 조건으로 3 내지 10일간 배양하여 획득한 균사체를 사용할 수 있다. 상기 발효물은 콜라겐 포함 혼합용액에 상기 삼색도장버섯 균사체를 접종하여 1 내지 10일 동안 발효한 후, 200 내지 600 메쉬(mesh)의 여과망으로 여과하여 수득한 콜라겐 발효물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 조성물의 총중량을 기준으로 삼색도장버섯 추출물 0.1 내지 30 중량% 및 삼색도장버섯 균사체로 발효시킨 발효물 0.01 내지 30 중량%;를 포함할 수 있으며, 상기 삼색도장버섯 추출물 및 발효물의 포함함량이 상기 범위에 미달할 경우 피부개선효과가 미미하고, 초과할 경우에는 추가적인 피부개선 향상효과를 기대하기 어렵다. 바람직하게는, 삼색도장버섯 추출물 0.1 내지 5 중량% 및 삼색도장버섯 균사체로 발효시킨 발효물 0.01 내지 2 중량%;를 포함하도록 구성할 수 있다.

상기한 바와 같은 본 발명에 따른 화장료 조성물은 삼색도장버섯의 자실체 및 균사체로부터 수득한 추출물, 또는 삼색도장버섯 균사체의 배양액으로부터 수득한 삼색도장버섯 추출물과, 삼색도장버섯의 균사체로 발효시킨 발효물을 유효성분으로 포함하여 피부 탄력 증진 및 주름 개선 효과가 우수하다.

또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 노화 방지, 미백, 피부자극 완화, 여드름 방지, 항산화, 피부 보습, 아토피 개선, 항염증, 모발손상 방지, 탈모방지 및 육모 개선 효과 등의 복합 기능을 나타내어 피부 토탈캐어를 위한 용도로 활용이 가능하다.

또한, 상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 아이 크림, 세럼, 영양 크림, 맛사지 크림, 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 파우더, 엣센스, 팩, 헤어 토닉, 헤어 트리트먼트, 샴푸, 린스의 제형을 갖는 화장품 제조에 효과적으로 활용이 가능하다. 이를 위해, 상기 화장료 조성물은 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 맞게 정제수, 유분, 계면활성제, 보습제, 고급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 지방산, 산화방지제, 방부제, 왁스, pH조절제, 향료 등을 추가로 첨가하여 다양한 화장료를 제조할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하도록 한다.

제시된 실시예는 본 발명의 구체적인 예시일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.

<제조예 1> 삼색도장버섯 추출물의 제조

(1) 자실체 추출물의 제조

삼색도장버섯(Daedaleopsis tricolor) 자실체 추출물을 제조하기 위해서, 삼색도장버섯의 자실체를 동결건조하고 분쇄하여 수득한 자실체 분말을 에탄올 수용액[70%(v/v)]으로 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하여 추출물을 수득하였다. 수득한 추출물을 50 ℃이하에서 감압농축시키고, 동결건조하여 동결 건조물을 제조하고, 제조한 동결 건조물이 15중량% 함유되도록 부틸렌글리콜에 용해시켜 삼색도장버섯 자실체 추출물 함유 부틸렌글리콜 용액. 즉, 삼색도장버섯 자실체 추출물을 제조하였다.

(2) 균사체 추출물의 제조

삼색도장버섯(Daedaleopsis tricolor) 균사체 추출물을 제조하기 위해서, 삼색도장버섯(Daedaleopsis tricolor) 균주는 신선한 자실체로부터 직접 분리하였으며, 삼색도장 버섯 균사체를 효모-맥아즙 한천배지(효모 추출물 3 g, 맥아즙 3 g, 포도당 10 g, 펩톤 5 g, 한천 20 g, 증류수 1 ℓ)가 든 시험관에 사면배양하여 4 ℃에 보관하고 1개월마다 계대배양하여 사용하였다. 상기 사면배지에서 자란 균사체를 무균적으로 균질화하고, 이를 포도당 3%, 효모 추출물 1.0%를 함유한 단순 복합 배지로 하여, pH 5.5로 조정한 액체배지에 5%(v/v)가 되게 접종한 후, 발효조 내에서 온도 27 ℃, 회전수 150 rpm, 통기량 1.5 vvm의 조건으로 10일간 배양하였다.

배양 후, 삼색도장버섯(Daedaleopsis tricolor) 균사체를 원심분리를 통해 회수하였다. 그 후, 균사체를 동결건조하고 분쇄하여 균사체 분말을 수득하였으며, 이를 에탄올이 70%(v/v) 함유된 수용액으로 5시간씩 3회 환류추출 및 냉침하고, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 50 ℃이하에서 감압농축 및 동결건조시킨 후, 수득한 동결 건조물이 15중량% 함유되도록 부틸렌글리콜에 용해시켜 삼색도장버섯 균사체 추출물 함유 부틸렌글리콜 용액, 즉, 삼색도장버섯 균사체 추출물을 제조하였다.

(3) 삼색도장버섯 균사체 배양액의 제조

삼색도장버섯(Daedaleopsis tricolor) 균사체의 배양액을 수득하기 위해서, 신선한 자실체로부터 삼색도장버섯 균주를 직접 분리하였으며, 삼색도장버섯 균사체를 효모-맥아즙 한천배지(효모 추출물 3 g, 맥아즙 3 g, 포도당 10 g, 펩톤 5 g, 한천 20 g, 증류수 1 L)가 담지된 시험관에 사면배양하여 4 ℃에 보관하고 1개월마다 계대배양하였다. 사면배지에서 자란 균사체를 무균조건에서 균질화하고, 이를 포도당 3%, 효모 추출물 1.0%를 함유한 단순 복합 배지로 하여, pH 5.5로 조정한 액체배지에 5%(v/v)가 되게 접종한 후, 발효조 내에서 온도 27 ℃, 회전수 150 rpm, 통기량 1.5 vvm의 조건으로 10일간 배양하였다.

배양완료 후, 균사체를 원심분리를 통해 제거한 배양여액을 종이필터 (watman no.4)로 여과하고, 여과된 추출물을 50 ℃ 이하에서 감압농축한 후, 동결건조하고, 수득한 동결 건조물이 5 중량% 함유되도록 부틸렌글리콜에 용해시켜 삼색도장버섯 균사체 배양액 함유 부틸렌글리콜 용액, 즉, 삼색도장버섯 균사체 배양액을 제조하였다.

<제조예 2> 삼색도장버섯 균사체의 발효물 제조

(1) 식물 원재료 추출물의 제조

브로콜리 200 g을 절단하여 -40 ℃에서 동결건조한 후, 분쇄하여 25 g의 브로콜리 분말을 제조하였으며, 브로콜리 분말 10 g을 정제수 200 g과 혼합한 후 가열하여 브로콜리 열수추출물을 제조하고, 열수추출물을 400 mesh로 여과하여 브로콜리 추출물을 제조하였다.

시금치 및 토마토를 각각 사용하는 것을 제외하고는 브로콜리 추출물 제조방법과 동일하게 시금치 추출물 및 토마토 추출물을 각각 제조하였다.

(2) 콜라겐 수용액의 제조

콜라겐 25 g 및 증류수 75g을 혼합하여 콜라겐 수용액을 제조하였으며, 상기 콜라겐은 명태 껍질 유래 콜라겐을 미생물 발효한 것을 펩신으로 가수분해한 후, 액화처리한 평균분자량 10,000 Mw의 저분자 콜라겐을 사용하였다.

(3) 삼색도장버섯 균사체의 배양

초기 삼색도장버섯 균사체를 전남 산림자원연구소에서 분양받아 배양하였으며, 삼색도장버섯 균사체의 배양 유지는 PDA(Potato Dextrose Agar) 상에서 4 ℃에 보관하였으며 4주 간격으로 계대 배양하였다. 삼색도장버섯 균사체 액체 배양은 200 mL PDB(Potato Dextrose Broth) 배지에서 150 rpm, 25 ℃의 조건으로 7일 동안 배양하였다.

(4) 균사체 배양액을 이용한 삼색도장버섯 발효물의 제조

1) 브로콜리 발효물, 시금치 발효물 및 토마토 발효물의 제조

상기와 같은 방법으로 제조한 브로콜리 추출물, 시금치 추출물 및 토마토 추출물 200 g을 각각의 시험관에 공급하고, 상기 삼색도장버섯 균사체를 7일간 배양한 배양액을 2.5% 부피비로 접종한 후 7일 동안 발효시켜 발효 추출물을 수득하였다. 수득한 발효 추출물을 멸균하여 균사체를 사멸시킨 후, 400 mesh로 여과하여 브로콜리 발효물, 시금치 발효물 및 토마토 발효물을 각각 제조하였다.

2) 균사체 배양액을 이용한 콜라겐 발효물의 제조

콜라겐 수용액 200 mL을 시험관에 공급하고, 상기 삼색도장버섯 균사체를 7일간 배양한 배양액을 2.5% 부피비로 접종한 후 7일 동안 발효시켜 발효 용액을 수득하였다. 수득한 발효 용액을 멸균하여 균사체를 사멸시킨 후, 400 mesh로 여과하여 콜라겐 발효물을 제조하였다.

<실시예 1> 삼색도장버섯 추출물, 브로콜리 발효물, 시금치 발효물 및 토마토 발효물을 포함하는 화장료의 제조

하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 상기 제조예 1에서 제조한 삼색도장버섯 추출물 및 제조예 2에서 제조한 삼색도장버섯 균사체의 발효물을 혼합하여 삼색도장버섯 추출물, 브로콜리 발효물, 시금치 발효물 및 토마토 발효물을 포함하는 화장료를 제조하였다.

제조된 화장료는 크림형태이며, 표 1의 (다)상을 가열하여 70℃에 보존하였고, (다)상에 (가)상 및 (나)상을 가하여 예비 유화 후, 호모믹서로 균일하게 유화하고, 서서히 냉각하여 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 배양액을 함유하는 화장료를 제조하였다.

<실시예 2> 삼색도장버섯 추출물, 브로콜리 발효물, 시금치 발효물, 토마토 발효물 및 콜라겐 발효물을 포함하는 화장료의 제조

상기 제조예 1에서 제조한 삼색도장버섯 추출물 및 제조예 2에서 제조한 삼색도장버섯 균사체의 발효물을 혼합하여 삼색도장버섯 추출물, 브로콜리 발효물, 시금치 발효물, 토마토 발효물 및 콜라겐 발효물을 포함하며, 상기 표 1의 조성을 갖는 화장료를 제조하였다.

<비교예 1> 삼색도장버섯 추출물을 포함하는 화장료의 제조

상기 제조예 2에서 제조한 삼색도장버섯 균사체의 발효물을 혼합하지 않는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 상기 표 1의 조성을 갖는 화장료를 제조하였다.

<비교예 2> 삼색도장버섯 균사체로 발효시킨 발효물을 포함하는 화장료의 제조

상기 제조예 1에서 제조한 삼색도장버섯 추출물을 혼합하지 않는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 브로콜리 발효물, 시금치 발효물 및 토마토 발효물을 포함하며, 상기 표 1의 조성을 갖는 화장료를 제조하였다.

<실험예 1> 삼색도장버섯 추출물의 항산화 효능 평가

상기 제조예 1에서 제조한 삼색도장버섯 자실체 추출물, 상기 제조예 2에서 제조한 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 상기 제조예 3에서 제조한 삼색도장버섯 균사체 배양액의 항산화 효과를 측정하였다.

항산화 효과의 측정을 위해, NBT(Nitroblue tetrazolium)법을 이용하였고, NBT법은 크산틴과 크산틴옥시다아제에 의해 활성산소를 생성시키고, 생성된 활성산소와 니트로블루테트라졸리움이 반응하여 생성된 청색을 파장 560 nm에서 측정하는 방법으로 이를 이용해 활성산소 소거율을 측정하였으며, 항산화제로 잘 알려진 비에이치티(butylated hydroxytoluene, BHT)를 양성대조군으로 사용하였다.

먼저, 바이엘병에 0.05 M의 탄산나트륨(Na₂CO₃) 2.4 mL, 3 mM의 크산틴 용액 0.1 mL, 3 mM의 EDTA 용액 0.1 mL, BSA 용액 0.1 mL, 0.72 mM의 NBT 용액 0.1 mL를 가하고, 여기에 제조예 1에서 제조한 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 배양액을 0.025, 0.05, 0.1, 0.25 중량% 농도로 희석하여 각각 0.1 mL씩 첨가한 후, 25 ℃에서 10분간 방치하였다. 그 후, 크산틴옥시다아제 용액 0.1 mL를 가하여 교반한 다음, 25 ℃에서 20분간 배양하였고, 여기에 6 mM의 염화구리(CuCl₂) 용액 0.1 mL를 가하여 반응을 정지시키고 560 nm에서의 흡광도(S_t)를 측정하였다. 공시험은 상기 자실체 추출물, 균사체 추출물 및 균사체 배양액 대신 증류수를 사용한 것으로, 상기와 동일한 방법으로 흡광도(B_t)를 측정하였다. 시료용액의 블랭크(Blank)는 상기 크산틴옥시다아제 용액 대신 증류수를 사용해 상기와 동일한 방법으로 흡광도(B_o)를 측정하였으며, 활성산소 소거율(%)은 하기 수학식 1에 의하여 산출하였고, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다(단, 하기 수학식 1에서 S_t는, 시료용액의 효소 반응 후의 560 nm에서의 흡광도, B_t는, 공시험용액의 효소 반응 후의 560 nm에서의 흡광도, S_o는, 효소 무첨가 시료용액의 560 nm에서의 흡광도, B_o는, 효소 무첨가 공시험용액의 560 nm에서의 흡광도를 나타내는 것임).

[수학식 1]

표 2에 나타난 바와 같이, BHT와 같은 농도에서 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액 모두 BHT보다 우수한 항산화 효과를 발휘하는 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 2> DPPH법을 이용한 항산화 효과 측정

(1) 삼색도장버섯 추출물의 항산화 효과 측정

제조한 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액을 포함하는 삼색도장버섯 추출물의 항산화 효과를 측정하였다.

DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 자유라디칼 소거활성을 측정하는 방법으로, 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560 nm에서 자유라디칼 소거율을 측정하였으며, 측정방법은 하기와 같았다.

제조한 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 배양액을 0.025, 0.05, 0.1, 0.25 중량% 농도로 희석하여 각각 96-웰 플레이트에 각각 20 ㎕씩 공급하였다. 여기에 100 μM 메탄올 용액으로 제조된 DPPH를 첨가하여 용액의 총 부피가 200 ㎕가 되도록 하였다. 이것을 37 ℃에서 30분간 방치한 후 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 자유라디칼 소거활성(%)은 하기 수학식 2로 산출하였으며, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다(단, 하기 수학식 2에서, A는, 삼색도장버섯 자실체 추출물 또는 균사체 추출물 또는 균사체 배양액을 첨가하지 않은 대조군 웰의 흡광도, B는, 삼색도장버섯 자실체 추출물 또는 균사체 추출물 또는 균사체 배양액을 첨가한 실험군 웰의 흡광도를 의미하는 것임).

[수학식 2]

표 3에 나타난 바와 같이, BHT와 같은 농도에서 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액 모두 BHT 보다 우수한 항산화 효과를 발휘하는 것을 확인할 수 있었다.

(2) 삼색도장버섯 균사체 발효물의 항산화 효과 측정

상기 제조예 2에서 제조한 시금치 발효물 및 토마토 발효물의 항산화 효과를 측정하기 위해서, 시금치 추출물 및 토마토 추출물과, 이를 이용한 각각의 발효물을 각각 0.312, 0.625, 1.25, 2.35, 5% 농도로 희석한 후, 각각 96-웰 플레이트에 20 ㎕씩 넣었다. 여기에 0.1 mM의 DPPH 180 ㎕를 첨가하여 10분간 상온에서 반응시켰다.

양성대조군으로는 1mM의 아스코르브산을 사용하였으며, 상기의 방법과 동일하게 반응시켰다. 그 후, 분광광도계 (MULTI SKAN Thermo, Rockford, Illinois)를 이용하여 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 저해율은 하기 수학식 3으로 계산하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다(단, 하기 수학식 3에서, A는, 대조군의 흡광도, B는, 대조군 미처리군의 흡광도, C는, 시료군의 흡광도, D는, 시료 미처리군의 흡광도를 나타냄).

[수학식 3]

도 1에 나타난 바와 같이, 열수추출물에 비해 삼색도장버섯 균사체 발효물이 더욱 우수한 항산화 효능을 갖는 것으로 확인되었으며, 이와 같은 결과를 통해 발효에 의해 발효물에 항산화 물질이 과량 생성되었다는 사실을 확인할 수 있었다.

<실험예 3> 자외선 조사 후 금속단백질분해효소(MMP-1) 발현억제 정도 측정

제조한 삼색도장버섯 자실체 추출물, 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액에 자외선을 조사하여 후 금속단백질분해 효소(MMP-1) 발현억제 정도를 측정하였다.

이를 위해, UV 조사 후, 제조한 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 배양액을 0.02, 0.01, 0.005 중량% 농도로 희석하여 각각 0.5 mL씩 첨가하였다. 그 후, 금속단백질분해효소(MMP-1) 농도를 측정하기 위해서 효소면역 시험법(ELISA)을 수행하였다. UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 6.3 J/cm²의 에너지로 조사하였고, 자외선 조사량과 배양시간은 예비 실험을 통하여 섬유아세포에서 금속단백질분해효소(MMP-1) 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다.

음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간 유지하였고, UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사한 후, 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양한 다음, 배지를 회수하여 96-웰 플레이트에 코팅하였다. 일차항체 MMP-1(Ab-5) 단일 클론항체를 처리하고 37 ℃에서 60분 동안 반응시켰다.

이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질 용액 1 mg/mL(ｐ-nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액)을 상온에서 30 분간 반응시키고 마이크로플레이트 리더로 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였고, 양성대조군으로는 레티놀을 사용하였으며,하기 수학식 4를 이용하여 MMP-1 발현억제율을 산출하였다. 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

[수학식 4]

표 4에 나타난 바와 같이, 시료를 처리하지 않은 대조군에 비해 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액 모두 우수한 억제율을 나타냄을 확인할 수 있었고, 양성대조군인 레티놀의 억제율에 비해서도 우수한 결과를 보이는 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 4> 프로콜라겐 생합성 촉진효과 측정

제조한 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액의 피부기질 성분인 타입 1 프로콜라겐의 생합성을 촉진시키는 프로콜라겐 생합성 촉진 효과를 확인하였다.

먼저, 신생아의 표피조직에서 분리한 사람진피섬유아세포(human dermal fibroblast)는 MTT사로부터 분양받아 DMEM/F-12(3:1) 배지에 10% 우태아혈청(FBS)을 첨가하여 1 × 10⁴ cell/cm² 농도로 배양하였다. 80% 정도 자라면 1:3의 비율로 분주하여 계대 배양하였고, 4차 계대 배양된 세포를 실험에 이용하였다.

프로콜라겐의 양을 측정하기 위해서, 섬유아세포를 48-웰 플레이트(well plate)에 90% 이상 배양한 후, 제조한 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 배양액을 0.02, 0.01, 0.005 중량% 농도로 희석하여 각각 0.5 mL씩 첨가하고, 24시간이 지난 후, 배지 중에 유리된 프로콜라겐의 양을 프로콜라겐타입-1C-펩타이드 EIA 키트(procollagen type-1 C-peptide EIA kit, MK101, Takara, Japan)를 사용하여 측정하였다. 이때, 양성대조군으로 TGF-β를 사용하였다. 프로콜라겐 생합성촉진율은 하기 수학식 5를 이용하여 산출하였으며, 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.

[수학식 5]

표 5에 나타난 바와 같이, 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액은 대조군(세포신호전달 물질 TGF-β)과 유사한 효과를 나타낸다는 사실을 확인할 수 있었다.

<실험예 5> 엘라스타아제 활성 억제효과 측정

제조한 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액의 엘라스타아제 활성 억제효과를 측정하였다.

먼저, 사람의 섬유아세포를 배양용 플라스크에 넣고 80% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 이후, 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 배양액을 0.02, 0.01, 0.005 중량% 농도로 희석하여 각각 0.2 mL씩 첨가한 후, 세포배양액을 채취하여 상업적으로 이용 가능한 엘라스틴 측정기구를 이용하여 엘라스틴 생성 정도를 측정하였다. 즉, 엘라스타아제의 기질인 'Suc-(Ala) 3 NA'의 NA가 분해되면서 생기는 색의 변화를 흡광도를 이용하여, 엘라스타아제의 활성도를 측정하였다. 이때, 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액을 처리하지 않은 군을 대조군으로 사용하였으며, 그 결과는 하기 표 6에 나타내었다.

[수학식 6]

표 6에 나타난 바와 같이, 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액 모두 농도의존적으로 엘라스타아제의 활성 억제율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 6> 티로시나아제 활성 억제효과 측정

제조한 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액의 티로시나아제 활성 억제효과를 측정하였다.

티로시나아제는 생체 내에서 티로신(tyrosine)이라는 물질의 산화과정을 촉진하여 멜라닌이 생성되도록 하는 효소로서, 티로시나아제는 버섯에서 분리 및 정제된 것으로 시그마(Sigma) 사에서 구입하여 사용하였다. 기질인 L-티로신은 0.05 M 인산나트륨 완충용액(pH 6.8)에 용해하여 0.1 ㎎/mL 용액으로 만들고, 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 배양액은 각각 0.05 M 인산나트륨 완충용액(pH 6.8)에 0.005, 0.01, 0.02중량% 농도가 되도록 조절하여 용해하여 사용하였다.

L-티로신 용액 0.5 mL를 시험관에 넣고 여기에 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액 0.5 mL를 각각 가하고 37 ℃ 항온기에서 10분간 방치하였다. 그 후, 200 unit/mL 티로시나아제 0.5 mL를 첨가하고 37 ℃에서 10분간 반응시켰다. 상기 반응액이 든 시험관을 얼음 위에 놓아 급냉시켜 반응을 중지시킨 후, 분광광도계를 파장 475 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 삼색도장버섯 자실체 추출물 함유 샘플, 삼색도장버섯 균사체 추출물 함유 샘플 및 삼색도장버섯 균사체 배양액 함유 샘플 대신 완충용액 0.5 mL를 넣은 것을 사용하였고, 양성대조군으로는 미백제로 잘 알려진 알부틴을 사용하였다. 또한, 상기 각 시료의 티로시나아제 활성 저해율은 하기 수학식 7에 따라 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 7에 나타내었다.

[수학식 7]

표 7에 나타난 바와 같이, 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액 모두 알부틴과 유사한 티로시나아제 활성 저해율을 나타내었다.

<실험예 7> 멜라닌 합성 억제효과 측정

제조한 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액의 멜라닌 합성 억제효과를 측정하였다.

사용된 B16F1 멜라닌 세포(melanocyte)는 마우스에서 유래한 세포주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. B16F1 멜라닌 세포의 멜라닌 합성 억제효과 측정은 다음과 같이 수행하였다. B16F1 멜라닌 세포를 6- 웰 플레이트에 각 웰당 2 × 10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후, 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 배양액을 0.02, 0.01, 0.005 중량% 농도로 희석하여 각각 2 mL씩 첨가하여 72시간 동안 배양하였다.

72시간 배양 후, 세포를 트립신-EDTA로 떼어낸 다음, 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포 내 멜라닌의 정량은 로탄(R Lotan and D Lotan, Cancer Res, 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 변형하여 하기와 같이 실시하였다.

셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후, 균질화 완충액(50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 1 mL를 첨가하고, 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000 rpm, 10분)하여 수득한 세포 여액에 1N NaOH(10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후, 마이크로 플레이트 판독기로 405 nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음, 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. 또한, 대조군으로 삼색도장버섯 자실체 추출물 또는 삼색도장버섯 균사체 추출물 또는 삼색도장버섯 균사체 배양액을 첨가하지 않은 것으로 하였고, 양성대조군으로 미백제로 알려진 알부틴을 사용하였다. B16F1 멜라닌 세포의 멜라닌 생성 저해율(%)은 하기 수학식 8에 의하여 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 8에 나타내었다(단, A는, 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양, B는, 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양을 나타냄).

[수학식 8]

표 8에 나타난 바와 같이, 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액은 알부틴과 유사한 멜라닌 합성 저해율을 나타내었다.

<실험예 8> 염증유발관련 효소 활성 억제효과 측정

제조한 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액의 히알루로니다아제(hyaluronidase) 활성 억제효과를 측정하고자 하였다.

히알루로니다아제(hyaluronidase)는 히아루론산을 가수분해하는 효소로 염증을 유발하는 효소로서, 히알루로니다아제(hyaluronidase)의 활성을 억제하여 항염증효과를 측정하는 방법(Kakegawa Y: Japanese J. of Inflammation, 4, 437-438, 1984)을 응용해 항염증 효과를 판정하였으며, 양성대조군으로 컴프리 추출물, 시소 추출물, 유용성 감초 추출물을 사용하였다.

먼저, 제조한 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 배양액 각각의 100 ㎕와 히알루로니다아제 용액(type Ⅳ-S, Sigma, 400 U/mL) 50 ㎕를 넣고 37 ℃에서 20분간 반응시킨 후, 효소활성화용액(compound 48/80 CaCl₂ㅇ2H₂O, Sigma, 0.1 ㎎/mL)을 100 ㎕ 첨가하고 다시 37 ℃에서 20분간 반응시켰다. 히알루론산(hyaluronic acid) 용액(0.4 ㎎/mL)을 250 ㎕ 넣고, 37 ℃에서 40분간 반응시킨 후, 0.4N NaOH 100 ㎕를 넣어 반응을 종결시켰다. 포타슘보레이트 용액을 100 ㎕ 첨가하여 95 ℃ 에서 3분간 반응시키고, 냉각시킨 후, ｐ-디메틸아미노벤즈알데히드 용액 3 mL을 넣고 다시 20분간 37 ℃에서 반응시킨 후 발색시켰다. 585 nm에서 흡광도를 측정하여 히알루로니다아제 활성 저해율을 측정하였으며, 수학식 9에 의한 결과값은 하기 표 9에 나타내었다(단, 하기 수학식 9에서 A는, 시료를 첨가하지 않은 웰의 효소활성, B는, 시료를 첨가한 웰의 효소 활성을 나타냄). 히알루로니다아제의 활성 저해율(%)은 하기 수학식 8을 이용해 계산하였으며, IC₅₀ 값은 히알루로니다아제 효소 활성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

[수학식 9]

표 9에 나타난 바와 같이, 삼색도장버섯 자실체 추출물의 IC₅₀ 값, 삼색도장버섯 균사체 추출물 IC₅₀ 값 및 삼색도장버섯 균사체 배양액의 IC₅₀ 값은 항염증제로 잘 알려진 컴프리 추출물, 시소 추출물 및 유용성 감초 추출물과 동등 이상의 효과를 나타내었다.

<실험예 9> 자외선 조사에 의한 세포독성 완화 효과 측정

제조한 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액의 자외선 조사에 의한 세포독성의 완화 효과를 측정하였다.

먼저, 섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1 × 10⁵의 농도로 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500 ㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UV B) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/cm²를 조사한 후, PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 10% FBS가 첨가된 것) 1 mL를 첨가하였다. 여기에 제조한 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 배양액을 0.02, 0.01, 0.005 중량% 농도로 희석하여 각각 0.1 mL씩 첨가한 후, 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500 ㎕와 MTT용액(2.5 ㎎/mL) 60 ㎕를 넣은 후, 2시간 동안 37 ℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04 N)을 500 ㎕씩 넣어주었다.

그 후, 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고, 상등액 100 ㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 565 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율(%)은 하기 수학식 10에 의해 계산하였고, 자외선에 의한 세포독성 완화율(%)은 하기 수학식 11에 의하여 계산하였으며, 그 값은 하기 표 10에 나타내었다(단, 하기 수학식 10에서 B_o는, 세포배양배지만을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도, B_t는, 시료를 첨가하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도, S_t는, 시료를 첨가한 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도를 나타내는 것이고, 하기 수학식 11에서 B_o는, 자외선 조사하지 않고 시료 첨가하지 않은 웰의 세포 생존율, Bt는, 자외선 조사하고 시료를 첨가하지 않은 웰의 세포 생존율, S_t는, 자외선 조사하고 시료를 첨가한 웰의 세포 생존율을 나타내는 것임).

[수학식 10]

[수학식 11]

표 10에 나타난 바와 같이, 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액은 자외선에 의한 세포 독성을 우수하게 완화하여 자외선에 의한 세포독성을 효과적으로 방어한다는 사실을 확인할 수 있었다.

<실험예 10> 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과 측정

제조한 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액의 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제 정도를 측정하였다.

먼저, 사람의 표피조직에서 분리한 섬유아세포(Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5 × 10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500 ㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/cm²를 조사한 후, PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350 ㎕를 첨가하였다. 여기에 제조한 삼색도장버섯 자실체 추출물 함유 샘플, 삼색도장버섯 균사체 추출물 함유 샘플 및 삼색도장버섯 균사체 배양액 함유 샘플을 각각 0.5 mL 첨가한 후, 5시간 동안 배양하였다.

배양 후, 배양 상층액을 150 ㎕ 취하여 'IL-1'를 정량함으로서, 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액의 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 평가하였다. 'IL-1'의 양은 효소면역분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)을 이용하여 정량화하였으며, 'IL-1'의 생성율은 하기 수학식 12에 의해 계산하였다. 그 값은 하기 표 11에 나타내었다(단, 하기 수학식 12에서 B_o는, 자외선 조사하지 않고 시료 첨가하지 않은 웰의 IL-1 생성량, B_t는, 자외선 조사하고 시료를 첨가하지 않은 웰의 IL-1 생성량, S_t는, 자외선 조사하고 시료를 첨가한 웰의 IL-1 생성량을 나타내는 것임).

[수학식 12]

표 11에 나타난 바와 같이, 낮은 농도에서도 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액은 염증성 사이토카인 발현을 억제하여 자외선에 의한 염증 발생을 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었다.

<실험예 11> 여드름균에 대한 항균력 측정

제조한 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액의 여드름균에 대한 항균력을 확인하였고, 페이퍼 디스크 테스트(Paper Disc Test)를 수행하였다.

먼저, 여드름 발생원인의 피부 상재균인 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes)를 활성화시키기 위하여 BHI 액체배지(Brain-Heart Infusion Broth, 3.7%)에서 48시간 전배양하였다. 이렇게 준비한 균 배양액을 BHI 고체배지(Brain-Heart Infusion Broth 3.7%, aggar 1.5%)에 0.1 mL씩 도말 한 후, 건조시켰다. 제조한 삼색도장버섯 자실체 추출물 함유 샘플, 삼색도장버섯 균사체 추출물 함유 샘플 및 삼색도장버섯 균사체 배양액 함유 샘플을 각각 95% 에탄올 수용액에 12%(w/v)로 희석하여 직경 8 mm의 페이퍼 디스크(paper disc)에 50 ㎕씩 점적한 후, 앞서 준비한 고체 배지 위에 올려놓은 후, 이것을 35 ℃ 혐기 배양조에서 3일간 배양하였다. 페이퍼 디스크(Paper disc) 주변에 생긴 균 성장 저지 영역을 관찰하고 저지환의 크기를 측정함으로써 항균력을 평가하였고, 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다.

표 12에 나타난 바와 같이, 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액의 균 성장 저지환의 크기는 0.02중량% 농도에서 18 mm인 것으로 나타나, 우수한 항균력을 갖는다는 사실을 확인할 수 있었다.

<실험예 12> 항염증 효과 측정

제조한 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액의 항염증 효과를 측정하였고, Compound 48/80에 의한 아토피 피부염 유발하여 항염증 효과를 측정하였다.

먼저, BALB/c 마우스(5 wks, male)의 등 쪽 목 부위 피부의 진피 내로 마리당 30 ㎕의 compound 48/80(Sigma, Co.; 1 ㎎/mL in saline)을 주사한 후, 케이지에 집어넣고 60분 동안 마우스가 목을 긁는 행동을 관찰하였다. 항염 치료 효능을 검정하기 위하여 compound 48/80을 주사하기 5일 전부터 제조한 삼색도장버섯 자실체 추출물 함유 샘플, 삼색도장버섯 균사체 추출물 함유 샘플 및 삼색도장버섯 균사체 배양액 함유 샘플을 250 ㎕/mL의 농도로 마리당 100 ㎕씩 각각 마우스의 등 쪽 목 부위에 도포하였다. 도포방법은 5일 동안 하루에 두번씩 총 10회에 걸쳐 마우스의 등 쪽 목 부위에 도포하여 전처리 한 다음 compound 48/80을 주사한 후, 총 1시간 동안 5분 간격으로 마우스가 뒷발로 목을 긁는 시간을 측정하여 소양증 정도를 측정하였고, 그 결과를 하기 표 13에 나타내었다.

표 13에 나타난 바와 같이, 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액 모두 compound 48/80에 의한 아토피 피부염(피부 소양증) 유발을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 13> 수분 흡습성 측정

제조한 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액의 수분 흡습성을 측정하고자 하였다.

먼저, 사람의 건조 표피세포를 제조한 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액과 증류수에 각각 포화 흡수시키고 흡수된 물의 양을 측정한 후, 48시간 건조 후의 질량변화를 측정하였다. 각각의 측정된 질량의 변화로부터 피부 세포 단위 질량당 흡수된 물의 양을 비교하였다. 이러한 실험은 표피세포에 흡습되는 물의 양을 비교하기 위한 방법으로 실제 사람의 피부에 있어서도 그 보습효과를 예상할 수 있는 한가지 방법으로 사용되고 있다.

구체적으로, 사람의 표피세포를 건조시켜 단위질량당 함유된 수분의 양을 일정하게 만든 후, 각각의 표피세포 시료의 무게와 함유된 물의 양을 카이저 방법(Kaiser method)을 사용하여 측정하였다. 물의 함량이 측정된 표피 세포를 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액 및 정제수에 각각 24시간 담지하여 포화 흡수시켜준 뒤, 세포 내에 물이 포화흡수된 표피세포를 꺼내서 무게를 달고, 일부를 채취하여 카이저 수분 측정기로 함유되어 있는 단위질량당 수분의 양을 측정하였다.

그 후, 다시 48시간 감압건조시키고, 무게를 달고난 후, 일부를 채취하여 카이저 방법에 의해 수분량을 측정하여 함유되어 있는 단위질량당 수분의 양을 측정하였으며(수분 mg/표피세포 질량 g), 그 값은 하기 표 14에 나타내었다.

표 14에 나타난 바와 같이, 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액으로 포화 흡습시킨 표피세포가 정제수에 의하여 포화 흡습된 표피세포보다 재건조 과정에 있어 훨씬 많은 물을 함유하고 있음을 확인할 수 있었다.

<실험예 14> 사람 모발 단백질의 결합 효과

삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액의 사람 모발 단백질의 결합 효과를 확인하였다.

먼저, 사람 모발 케라틴 단백질 50 ㎍에 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 배양액을 0.5, 0.25, 0.1 중량%의 시험 농도가 되게 희석하고, 각각 상온에서 30분 동안 반응시킨 후, 6% 과산화수소와 0.5% 암모니아 1:1 혼합 용액으로 처리하여 30분 동안 반응시켰다.

반응액을 10% SDS-폴리아크릴아미드 젤에서 램리(Laemmli)의 방법에 따라 전기영동하고, 젤에 있는 케라틴 단백질을 0.1% 쿠마시 블루(Coomassie brilliant blue R 250), 10% 빙초산 및 40% 에탄올의 혼합 용액에서 1시간 동안 염색한 후, 10% 빙초산 및 40% 에탄올의 혼합용액에서 탈색시키고 케라틴 단백질 띠를 확인하였다. 이미지 마스터(Amersham Pharmacia Biotech.) 소프트웨어를 사용하여 50 ㎍의 사람 모발 케라틴 단백질만 전기영동했을 때 나타나는 케라틴 단백질 띠를 100%로 하고, 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 또는 삼색도장버섯 균사체 배양액을 첨가하지 않은 군을 대조군으로 비교하여 케라틴 결합 효과를 %로 표시하여 하기 표 15에 나타내었다.

표 15에 나타난 바와 같이, 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액 모두 함량이 증가함에 따라 모발 단백질 케라틴과의 결합 능력도 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 15> 모발 성장 효과 시험

제조한 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 배양액의 모발 성장 효과를 확인하였다.

먼저, 삼색도장버섯 자실체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 추출물, 삼색도장버섯 균사체 배양액을 2 중량%를 함유하는 30% 함수 에탄올 용액을 각각 제조하여 모발 성장 효과 시험에 사용하였다. 모발 성장 효과 시험은 마우스(ICR), 생후 47 내지 53일인 것을 사용하여 등 부위 털을 제거하고, 등 부위가 깨끗한 것을 골라 물질 군 마다 10마리를 사용하여 다음날부터 매일 시험물질을 개체당 100 mL씩 도포하였다. 시간 경과에 따른 모발의 길이 및 모발 성장 정도를 모 제거 후, 복원 정도에 따라 점수를 0에서 2까지 부가하여 각각 비교하였다. 모발성장 정도를 비교하기 위하여, 대조군으로는 30% 알코올 용액을 각 개체에 도포하여 성장 상태를 관찰하였다.

또한, 모발성장 촉진 효과 정도를 3등급으로 분류하여 평가하였다 (0:전혀 자라지 않음, 1:약간자람, 2:많이자람). 그 값은 하기 표 16에 나타내었다.

표 16에 나타난 바와 같이, 삼색도장버섯 자실체 추출물과 삼색도장버섯 균사체 배양액의 우수한 모발성장 촉진 효과를 확인할 수 있었다.

<실험예 16> 발효물의 피부 보습력 평가

제조한 브로콜리 열수추출물, 시금치 열수추출물, 토마토 열수추출물, 브로콜리 발효물, 시금치 발효물 및 토마토 발효물의 보습력을 평가하였다.

제조한 각각의 추출물 및 발효물의 보습력을 측정하기 위해, 일정한 온도와 압력이 유지되는 챔버에서 브로콜리 열수추출물, 시금치 열수추출물, 토마토 열수추출물, 브로콜리 발효물, 시금치 발효물 및 토마토 발효물의 수분이 감소하는 양을 측정하였다.

이를 위해, 무게를 측정한 페트리 접시에 5 mL의 브로콜리 열수추출물, 시금치 열수추출물, 토마토 열수추출물, 브로콜리 발효물, 시금치 발효물 및 토마토 발효물을 올린 페트리 접시를 도자기제 바닥판에 올려두고 24시간에 한번 씩 4일간 그 무게를 측정하였고, 그 결과를 하기 표 17에 나타내었으며, 증류수를 대조군 1로, 30% 부틸렌글라이콜을 대조군 2로 사용하였다.

표 17에 나타난 바와 같이, 1 내지 2일 동안의 보습력은 모든 브로콜리 열수추출물, 시금치 열수추출물, 토마토 열수추출물, 브로콜리 발효물, 시금치 발효물 및 토마토 발효물 모두에서 유의적인 차이가 없었으나, 3일 이후부터 브로콜리 발효물 및 시금치 발효물의 경우, 브로콜리 추출물 및 시금치 추출물 보다 약 4배의 보습력이 있는 것을 확인하였다. 또한, 토마토 발효물은 토마토 추출물 보다 2배 이상의 보습력을 갖는 것을 확인하였다. 이는, 실험 초기인 1 내지 2일에는 과량의 수분을 함유하고 있어, 발효물에 함유되어 있는 유효성분의 보습력에 대한 효력이 나타나지 않았으나, 3일 이후로는 보습력이 급격하게 차이가 난다는 사실을 확인할 수 있어, 발효물이 우수한 피부 보습력을 가질 수 있음을 확인할 수 있었다.

<실험예 17> 화장료의 피부 탄력 개선 효과 측정

제조한 화장료의 피부 탄력 개선효과를 측정하기 위해서, 실험자(20세 내지 35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 1, 실시예 2, 비교예 1 및 비교예 2의 화장료를 얼굴 왼쪽 부위에는 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 피부 탄력 개선효과를 확인하기 위해 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부탄력측정기(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하였다. 실험결과는 하기 도 2에 'Cutometer SEM 575'의 R7값으로 기재하였는데, R7값은 피부의 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다 (n=20, p<0.05).

도 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1 및 실시예 2에 따른 화장료의 피부탄력 개선효과가 더욱 우수하다는 사실을 확인할 수 있어 삼색도장버섯 추출물, 브로콜리, 토마토 및 시금치 발효물을 포함함에 따라 피부탄력 효과가 향상된다는 사실을 확인할 수 있었으며, 특히, 실시예 2의 화장료는 콜라겐 발효물을 추가로 포함하여 피부탄력 증진효과가 더욱 향상된다는 사실을 확인할 수 있었다. 따라서, 상기 결과로부터 본 발명의 화장료 조성물의 우수한 피부 탄력 개선효과를 확인할 수 있었다.

<실험예 18> 화장료의 주름개선 효과 측정

제조한 화장료 조성물의 주름개선 효과를 측정하기 위해서, 실험자(20세 내지 35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 1 및 실시예 2의 화장료를, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1 및 비교예 2의 화장료를 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

화장료의 피부 주름개선 효과를 확인하기 위해서, 화장료 사용 전과 2개월간 사용 후에 실리콘 재질의 모사판(replica)을 제작하여 지정 부위의 주름의 상태를 화상분석기인 비지오 미터(visiometer, SV60, C+K Electronic Co., Germany)로 측정하였으며, 그 결과는 2개월 후의 각각의 파라미터(parameter) 값에서 2개월 전 파라미터 값을 뺀 것의 평균으로 계산하였다. 즉, 값이 음수가 나올수록 주름 개선효과가 높다는 것을 의미하며, 그 값은 하기 표 18에 나타내었다(단, 하기 표 18에서 R1은, 주름 등고선의 최고치와 최저치의 차이값, R2는, 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값 들의 평균, R3는, 5개씩 나눈 R1값 중 최고치, R4는, 주름 등고선의 기선(baseline)에서 각각의 꼭대기와 계곡의 값을 뺀 평균값, R5는, 주름 등고선의 기선에서 각각의 주름 윤곽을 뺀 값의 평균값을 나타내는 것임).

표 18에 나타난 바와 같이, 삼색도장버섯 추출물 및 발효물을 함유한 실시예 1 및 2의 화장료가 피부 주름 개선효과가 비교예 1 및 2 보다 우수함을 확인할 수 있었으며, 이와 같은 결과를 통해, 제조한 화장료가 우수한 주름 개선효과를 확인할 수 있었다.

<실험예 19> 여드름 개선 효능 분석

제조한 화장료가 나타내는 여드름 개선효과를 확인하기 위해서, 붉은색 여드름과 화농성 여드름을 동반한 여드름 환자 30명을 대상으로 30일간 여드름 개선효과를 조사하였다. 각 10명씩 실시예 1 및 실시예 2의 화장료를 각각 여드름 부위에 문질러 바르게 하고, 이틀에 한 번씩 여드름의 상태를 육안으로 점검하였다. 얼굴 부분을 2분할하여 한쪽은 시험군으로서 또 다른 한쪽은 대조군으로 비교예 1 및 비교예 2의 화장료를 적용하였다. 여드름 염증에 대한 치료 효과의 평가 기준은 하기의 5단계를 이용하였는데, 얼굴 전체에 대하여 평가하였고, 여드름의 염증을 확인하지 못한 경우에는 0점, 여드름 염증이 대조군에 비하여 80% 회복된 경우에는 1점, 여드름 염증이 대조군에 비하여 50% 회복된 경우에는 2점, 여드름 염증이 대조군에 비하여 30% 회복된 경우에는 3점, 여드름 염증이 대조군에 비하여 전혀 회복되지 않은 경우에는 4점으로 점수를 부여하였다.

각 평점의 평균을 산출하여 하기 표 19에 나타내었으며, 평점의 평균 산출방법은 2일 간격으로 시험군과 대조군의 여드름 염증 상태를 10명에 대하여 측정하여 0 내지 4 중 해당되는 단계를 정한 후, 합산하여 평점을 계산하였다.

표 19에 나타난 바와 같이, 실시예 1 및 실시예 2의 화장료가 나타내는 여드름 개선효과가 우수하다는 사실을 확인할 수 있었으며, 특히, 콜라겐 발효물을 포함하는 화장료의 효과가 더욱 우수함을 확인할 수 있었다.

이와 같은 결과를 통해, 삼색도장버섯 추출물 및 삼색도장버섯 균사체 발효물을 동시에 포함하는 화장료의 경우 여드름 개선효과가 더욱 향상되어 우수한 특성을 갖는다는 사실을 확인할 수 있었다.

Claims (5)

1. 삼색도장버섯의 자실체, 삼색도장버섯의 균사체 및 삼색도장버섯 균사체의 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상으로부터 수득한 삼색도장버섯 추출물; 및 삼색도장버섯 균사체로 발효시킨 발효물;을 포함하고,
   상기 발효물이 브로콜리, 시금치 및 토마토로부터 수득한 추출물에 상기 삼색도장버섯 균사체를 접종하여 1 내지 10일 동안 발효한 후, 200 내지 600 메쉬(mesh)의 여과망으로 여과하여 수득한 식물 발효 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 발효물은 콜라겐 포함 혼합용액에 상기 삼색도장버섯 균사체를 접종하여 1 내지 10일 동안 발효한 후, 200 내지 600 메쉬(mesh)의 여과망으로 여과하여 수득한 콜라겐 발효물을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 아이 크림, 세럼, 영양 크림, 맛사지 크림, 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 파우더, 엣센스, 팩, 헤어 토닉, 헤어 트리트먼트, 샴푸 또는 린스의 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   조성물의 총중량을 기준으로 삼색도장버섯 추출물 0.1 내지 30 중량% 및 삼색도장버섯 균사체로 발효시킨 발효물 0.01 내지 30 중량%;를 포함하는 화장료 조성물.
   

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