KR101999476B1

KR101999476B1 - Alk 저해제에 내성을 획득한 eml4-alk 양성 비소세포폐암의 치료를 위한 약물 선택의 정보 제공 방법

Info

Publication number: KR101999476B1
Application number: KR1020180009369A
Authority: KR
Inventors: 조병철; 윤미란; 김혜련; 최헌미; 임선민
Original assignee: 연세대학교 산학협력단; (주)제욱
Priority date: 2018-01-25
Filing date: 2018-01-25
Publication date: 2019-07-11
Also published as: KR20180120565A

Abstract

본 발명은 ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암의 치료에 있어서 약물 선택의 정보를 제공하기 위한 바이오마커를 제공하는 것으로, ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암의 치료에 있어서 약물 선택의 정보를 제공하기 위해 miR-34a 및/또는 miR-449의 발현 수준을 탐지하기 위한 방법, 조성물 및 키트를 제공할 수 있다.

Description

ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암의 치료를 위한 약물 선택의 정보 제공 방법 {Method of providing the information for selecting the drugs for treating EML4-ALK positive non-small-cell lung cancer resistant to ALK inhibitors}

본 발명은 ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암의 치료에 있어서 약물 선택의 정보를 제공하기 위해 miR-34a 및/또는 miR-449의 발현 수준을 탐지하기 위한 방법, 조성물, 키트 및 상기 비소세포폐암이 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

히스톤 탈아세틸화 효소(Histone deacetylase, HDAC) 억제제는 세포 분화 및 사멸을 유도하는 항암 약물의 새로운 부류를 이루고 있다.　히스톤 탈아세틸화 효소 억제제는 히스톤　탈아세틸화　효소(HDAC)를 표적으로 하여　히스톤　아세틸화를 통해 크로마틴 구조에 영향을 미침으로써, 복잡한 전사 재프로그램화, 예를 들어 종양억제 유전자의 재활성화 및 암 유전자의 억제를 유도한다. 또한, 코어　히스톤　단백질 내 N-말단 리신 잔기의 아세틸화를 일으키는 것 외에 열충격 단백질(HSP90), 튜불린(tubulin) 또는 p53 종양 억제 인자 단백질과 같은 암세포 생물학에 중요한 비히스톤　단백질 표적이 존재한다. 따라서, 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제는 염증성 질환, 류마티스 관절염 및 신경 퇴행성 동물 모델에서의 효능을 보였기 때문에 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제의 의학적 용도는 항암 요법에 제한되지 않는다.

현재까지 밝혀진 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제들은 그 구조에 따라 1) short chain fatty acids (butyric acid, valproic acid), 2) hydroxamic acids(trichostatin A, SAHA, LBH-589), 3) cyclic peptides(desipeptide), 4) benzamides(MS-275, MGCD-0103) 등 네 가지 종류로 나뉠 수 있다(비특허문헌 1), 이들 다수의　히스톤　탈아세틸화　효소 억제제(SAHA, LBH-589 및 MS-275 등)들은 동물 모델 뿐만 아니라 배지 내 다양한 형질 변환된 세포의 성장을 억제하고, 분화 및 세포 사멸을 효과적으로 유도하며(비특허문헌 2), SAHA, LBH-589 및 MS-275 등 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제는 다양한 암 질환을 치료하기 위한 목적으로 임상 연구에서 평가되고 있다(비특허문헌 3). 현재 히스톤 탈아세틸화 효소 저해제의 대표 화합물로는 하이드록사메이트 화합물인 SAHA(Zolinza, Vorinostat), PXD101(Belinostat), LBH-589(Panobinostat)와 벤즈아마이드 화합물인 MS-275(Entinostat), MGCD0103(Mocetinostat)이 있다.　

한편, ALK(Anaplastic Lymphoma kinase)는 티로신 키나아제 수용체(tyrosine kinase receptor)로서 Ras/Raf/MEK/ERK1/2 경로, JAK(Janus kinase)/STAT(signal transducers and activators of transcription) 경로, Pl3K(Phosphatidylinositol 3-kinase)/Akt 경로를 통해 세포의 증식, 생장 및 생존에 중요한 역할을 한다. 그러나 ALK의 과다 발현은 암세포의 비정상적인 증식과 생장을 초래한다.

한편, 비소세포폐암(Non-small cell lung cancer)에서 ALK의 EML4(echinoderm microtubule-associated protein-like 4)-ALK 돌연변이(mutation)는 암세포의 비정상적인 증식에 중요한 역할을 한다고 알려져 있어 ALK를 표적으로 하는 항암 치료에 대한 연구와 관심이 커지고 있다. 이러한 ALK의 표적 치료제로 크리조티닙(crizotinib)과 세리티닙(ceritinib) 등의 ALK 저해제(inhibitor)가 사용되어 왔으며, ALK 저해제를 통한 비소세포폐암 치료시 ALK 저해제에 대한 내성을 보일 뿐만 아니라, ALK 저해제에 대한 내성을 보이는 폐암 세포주 중에는 ALK 유전자의 돌연변이에 의한 내성이 아닌 새로운 기전의 내성을 보이는 경우가 발생하게 되는 문제가 있다.

따라서, ALK 저해제에 대해 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암의 환자군에서 치료 효능을 나타내는 새로운 표적 치료제의 연구, 개발이 필요한 실정이다.

Sonia et al., International Journal of oncology 33, 637-646, 2008 Paul A. Marks et al., Curr Opin. Oncol. 13, 477-483, 2001 Johnstone. R.W, Nat. Rev. Drug. Discov. 1, 287-299, 2002

본 발명의 목적은 ALK 저해제에 내성을 획득한 비소세포폐암의 치료에 있어서 약물 선택의 정보를 제공하기 위한 바이오마커를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암의 치료에 있어서 약물 선택의 정보를 제공하기 위해 miR-34a 및/또는 miR-449의 발현 수준을 탐지하기 위한 조성물, 키트 및 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암의 치료를 위한 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자에서 분리한 시료로부터 ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암의 치료용 약물 선택을 위한 정보를 제공하기 위해,

ALK 저해제의 투여 후 miR-34a 및/또는 miR-449의 발현 수준의 감소 여부를 확인하는 단계를 포함하는, miR-34a 및/또는 miR-449의 발현 수준의 탐지 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, miR-34 및/또는 miR-449의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암의 치료용 약물 선택의 정보 제공을 위한 miR-34 및/또는 miR-449 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 포함하는, ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암의 치료를 위해 ALK 저해제와 병용 투여하기 위한 약학 조성물을 제공한다.

도 1은 세리티닙에 대한 내성 획득 세포주의 구축 과정을 나타낸 것으로, A는 세리티닙의 농도에 따른 내성 획득 비소세포폐암 세포주의 세포 생존율을 MTT assay를 통해 나타내었고, B는 ALK, AKT, ERK의 발현 수준을 immunoblot 분석을 통해 나타낸 것이며, C는 내성 획득 세포주에 다른 ALK 저해제를 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 2에서 A는 모세포주와 세리티닙에 대한 내성 획득 세포주의 형태를 위상차 현미경을 통해 관찰한 결과이고, B는 EMT 관련 단백질의 발현 수준을 immunoblot 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3에서 A는 세리티닙 내성 획득 세포주를 마우스에 이종이식(xenograft)한 후 세리티닙을 투여하여 종양 크기를 관찰한 결과를 나타낸 것이고, B는 re-growth가 일어난 동물 모델에서 EMT 관련 유전자의 발현 수준을 microarray를 통해 확인한 결과이다.
도 4에서 A는 모세포주와 내성 획득 세포주의 히스톤 단백질의 아세틸화와 DNA 메틸화 변화를 나타낸 것이고, B는 H3K27Ac 부위의 아세틸화를 나타낸 것이며, C는 내성 획득 세포주에서 AXL 및 EMT 관련 유전자의 mRNA와 miR-34a와 miR-449 등의 miRNA의 발현 수준을 나타낸 것이고, D는 후성 유전체 분석을 통해 miR-34a와 miR-449의 탈아세틸화에 의한 발현 감소를 규명한 결과이다.
도 5에서 A는 세리티닙 내성 획득 세포주에 AXL 저해제인 포레티닙(Foretinib)을 처리한 경우의 EMT 관련 유전자의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이고, B는 내성 획득 세포주에서 miR-34a 및 miR-449의 탈아세틸화에 의한 발현 감소가 AXL의 과발현 및 활성과 관련이 있는지를 immunoblot 분석을 통해 확인한 것이다.
도 6에서 A는 세리티닙 내성 획득 세포주에 miR-34a 및 miR-449 억제제/mimics를 형질전환한 후 MTT assay를 이용하여 miR-34a 및 miR-449에 따른 세포 증식을 확인한 결과이고, B는 내성 획득 세포주에서 AKT, ERK의 발현 수준을 immunoblot 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 7은 내성 획득 세포주에 파노비노스탯(Panobinostat)을 처리한 후 q-PCR, RNA-seq, ChIP-seq 분석을 통해 아세틸화 조절을 통한 miR-34a 및 miR-449의 발현 조절 가능성에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 8에서 A는 모세포주와 세리티닙 내성 세포주에서 파노비노스탯의 병용 투여 효과를 colony formation assay를 통해 확인한 결과이며, B는 파노비노스탯과 세리티닙의 병용 처리에 의한 p21, cleaved PARP, cleaved caspase-3의 발현을 immunoblot 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 9에서 A는 모세포와 세리티닙 내성 세포주에서 파노비노스탯과 세리티닙의 병용 처리에 의한 AXL, MET 등의 단백질 발현 수준을 immunoblot 분석을 통해 확인한 결과이고, B는 N-Cadherin과 E-Cadherin의 발현 수준을 확인한 결과이다.

본 발명은 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자에서 분리한 생물학적 시료로부터 ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암의 치료용 약물 선택의 정보를 위해,

ALK 저해제의 투여 후 miR-34a 및/또는 miR-449의 발현 수준의 감소 여부를 확인하는 단계를 포함하는, miR-34a 및/또는 miR-449의 발현 수준의 탐지 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 miR-34a 및/또는 miR-449의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암의 치료용 약물 선택의 정보 제공을 위한 miR-34a 및/또는 miR-449 검출용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 miR-34a 및/또는 miR-449의 검출용 키트에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 포함하는, ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암의 치료를 위해 ALK 저해제와 병용 투여하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자에서 miR-34a 및/또는 miR-449의 발현이 감소되는 것을 기초로, ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암의 치료에 있어서 약물 선택의 정보를 제공하기 위해, 환자의 시료로부터 miR-34a 및/또는 miR-449의 miRNA 발현 수준을 탐지하기 위한 조성물, 키트 및 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자에서 분리한 생물학적 시료로부터 ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암의 치료용 약물 선택의 정보를 위해,

보다 구체적으로, 본 발명은 ALK 저해제에 내성을 획득한 비소세포폐암 환자의 시료에 존재하는 miR-34a 및/또는 miR-449의 발현 수준을 측정하여, ALK 저해제의 투여 후에 miR-34a 및/또는 miR-449의 발현 수준이 감소한 경우 해당 시료의 비소세포폐암 환자에게 비소세포폐암의 치료를 약물 선택의 정보를 제공하는 것이다.

본 발명에서는 ALK 저해제에 내성을 갖는 EML4-ALK 양성 비소세포폐암의 치료에 있어서 약물 선택의 정보를 제공하기 위하여, 비침습적인 도구로 miRNA 바이오마커를 사용하는 것이다.

본 발명에서, 용어 "miRNA"는 microRNA 또는 miRs로 지칭될 수 있다. miRNA의 길이는 약 19 내지 25, 또는 21 내지 23개의 뉴클레오티드인 RNA 가닥일 수 있다. miRNA는 DNA로부터 전사되지만 단백질로 번역되지 않으므로, 비-코딩 RNA를 포함하는 유전자에 의해 코딩된다. miRs는 공지의 원발성 전사체 pri-miRNA로부터 pre-miRNA라고 불리는 짧은 스템-루프 (stem-loop) 구조로 프로세스되고, 최종적으로 생성된 단일 가닥 miRNA로 프로세스된다. premiRNA는 자가-상보 영역 내에서 자체적으로 안으로 접히는 구조를 형성할 수 있다. 그 후 상기 구조는 동물에서는 뉴클레아제에 의해 프로세스된다. 성숙 miRNA 분자는 하나 이상의 mRNA 분자에 부분적으로 상보적이며, 단백질의 전사를 조절하는 기능을 할 수 있다. miRNA의 확인된 서열은 www.microRNA.org, www.mirbase.org 또는 www.mirz.unibas.ch/cgi/miRNA.cgi 와 같은 공개된 이용가능한 데이터베이스에서 평가할 수 있다. miRNAs는 " mir-[숫자]"와 같은 작명 협정에 따라 일반적으로 번호를 할당받는다. miRNA의 숫자는 이미 확인된 miRNA 종에 대해 발견된 순서에 따라 할당된다. miRNA가 상이한 유기체의 공지의 miRNA에 유사한 것으로 발견되었다면, 이름은 [유기체 확인자]-mir-[숫자]의 형태로, 선택적 유기체 확인자 이름이 제공된다. 성숙한 microRNA는 보통 접두사 "miR"가 붙고, 유전자 또는 전구물질 miRNA는 접두사 "mir"가 붙는다. 본 발명의 내용에서, 접두사 mir-* 또는 miR-*를 가진 임의의 microRNA(miRNA 또는 miR)는 명시적으로 다른 언급이 없는 한, 전구물질 및/또는 성숙 종을 모두 포함하는 것으로 이해해야 한다. miR 명명에 대한 상세한 내용은 www.mirbase.org 또는 Ambros et al., A uniform system for microRNA annotation, RNA 9:277-279 (2003)을 참고한다.

본 발명의 바이오마커인 miR-34a 및 miR-449의 염기서열 정보는 miRBASE(http://www.mirbase.org/) 등의 공지된 유전자 데이터베이스에서 확인할 수 있다. 보다 구체적으로, miR-34a의 염기서열은 유전자 등록번호 MIMAT0000255로 등록되어 있으며, SEQ ID NO: 1로 기재하였다. miR-449의 염기서열은 유전자 등록번호 MIMAT0001541로 등록되어 있으며, SEQ ID NO: 2로 기재하여 아래 표 1에 나타내었다.

miRNA	서열
SEQ ID NO: 1 (miR-34a-5p)	5' uggcagugucuuagcugguugu 3'
SEQ ID NO: 2 (miR-449)	5' uggcaguguauuguuagcuggu 3'

또한, 본 발명에 있어서, 상기 miR-34a 및 miR-449는 천연적으로 존재하는 miR-34a, miR-449 뿐만 아니라 그의 기능적 변이체를 포함하는 것으로 해석할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 miR-449는 miR-449a, miR-449b 및 miR-449c를 포함하여 해석할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 "EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자"는 비소세포폐암 환자 중 ALK 유전자의 변이가 발생한 환자를 말한다. 상기 ALK 유전자의 변이는 EML4와 ALK 유전자가 융합되는 것으로부터 형성될 수 있다. 융합이 일어난 유전자는 EML4-ALK을 발현함으로써 암을 유발시킨다.

본 발명에 있어서, 상기 "ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자"는 비소세포폐암 환자 중 ALK 저해제의 투여 후 내성이 발생했을 시 miR-34a 및/또는 miR-449의 발현 수준이 감소된 상태의 환자를 포함할 수 있다. 상기 miR-34a 및/또는 miR-449의 발현 감소는 히스톤 디아세틸라아제(Histone deacetylase, HDAC)에 의한 탈아세틸화로 인해 유발되는 것일 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 miR-34a 및/또는 miR-449의 발현 감소는 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 중 ALK 저해제에 내성을 갖는 비소세포폐암으로부터 확인한 새로운 내성 획득 기전으로서, 2차적 ALK 돌연변이가 일어나지 않고 상기 miR-34a 및/또는 miR-449이 히스톤 탈아세틸화 효소(Histone deacetylase, HEAC)에 의해 탈아세틸화되어 발현 수준이 감소되는 경우 ALK 저해제에 대해 내성을 획득하였다고 말할 수 있으며, 이는 본 발명자에 의해 밝혀진 것이다.

상기 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자는 크리조티닙(crizotinib), 세리티닙(ceritinib), 알렉티닙(alectinib), 브리가티닙(brigatinib) 및 엔트렉티닙(entrectinib)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 ALK 저해제(ALK inhibitior)에 내성을 갖는 환자를 포함할 수 있으며, 예를 들면 세리티닙(ceritinib)에 내성을 갖는 환자일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 "생물학적 시료"는 비소세포폐암 환자로부터 분리한 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 변, 타액, 눈물, 척수액, 세포, 조직 또는 그 조합일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 "ALK 저해제"는 상기 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자에 치료 효과를 나타내는 약물로, EML4-ALK의 카이네이즈 활성을 억제시키는 약물을 의미한다.

본 발명에 있어서, ALK 저해제에 대한 내성 획득 여부는 비소세포폐암 환자에게 비소세포폐암의 치료를 위해 ALK 저해제를 일정 기간 투여하였을 때, 약물이 투여된 초기의 약물 반응과 비교하여 일정 기간 약물을 투여한 후에 ALK 저해제에 대해 극히 낮은 감수성을 나타내어 암의 증세가 호전, 완화, 경감 또는 치료 증상을 나타내지 않거나, 2차적 ALK 돌연변이가 없고, 다른 ALK 저해제를 투여한 후에도 암이 진행성을 나타내었을 때 ALK 저해제에 대해 비의존적 내성을 획득했다고 말할 수 있다. 특히 상기와 같이 ALK 저해제에 내성을 획득한 경우, miR-34a 및/또는 miR-449의 발현 수준 감소는 내성 유발의 중요한 인자라 말할 수 있다. 상기 비소세포폐암의 진행은 암의 발생을 이미징하여 확인할 수 있는 모든 수단, 예를 들어 컴퓨터 단층촬영(CT), 자기공명영상(MRI), 초음파, X-선 영상, 유방조영술, PET 스캔, 방사성 핵종 스캔, 뼈 스캔 등의 영상화 기법을 통해 확인할 수 있는 것이라면 그 수단이 특별히 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 ALK 저해제에 대한 내성 획득 여부는 세포 수준에서 확인할 수 있다. 한 구체예에서, ALK 저해제에 민감성을 보이는 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 세포주에 ALK 저해제를 지속적으로 처리하여 내성을 획득한 세포주에 대해 MTT assay, colony formation assay 등의 분석법을 이용하여 ALK 저해제에 대한 내성 획득 여부를 확인할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 생물학적 시료에 존재하는 miR-34a 및/또는 miR-449의 발현 수준을 측정하기 위해서는, 이들 miRNA를 검출할 수 있는 각종 제제들을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 "발현 수준을 측정할 수 있는 제제"란, 환자의 시료 내에서 miR-34a 및/또는 miR-449의 존재를 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 예를 들어, miR-34a 및/또는 miR-449에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 조합이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 miR-34a 및/또는 miR-449의 염기서열에 특이적으로 결합하고 다른 핵산물질의 염기서열에는 특이적 결합을 하지 않는 것이 바람직하다. 이때, 상보적으로 결합한다는 것은 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 miRNA 타겟에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포함하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

한 구체예에서, 본 발명의 miRNA 바이오마커를 검출하는 데 사용되는 제제는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 용어, "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 타겟으로 하는 miRNA, 특히 miRNA의 씨드 서열에 대한 상보적인 서열을 가지고 있어 miRNA와 이합체를 형성할 수 있는 핵산 기반의 분자를 의미하며, 본 발명의 miRNA 바이오마커를 검출하는 데 사용될 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 miRNA 바이오마커를 검출하는데 사용되는 제제는, 프라이머일 수 있다. 용어, "프라이머"란, 주형 가닥에 상보적인 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 7개 내지 50개의 핵산서열을 의미한다. 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 핵산에서 이용할 수도 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 혼입할 수 있는 추가의 특징의 예로 메틸화, 캡화, 하나 이상의 핵산을 동족체로의 치환 및 핵산 간의 변형 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 본 발명의 프라이머는 miR-34a 및/또는 miR-449의 miRNA를 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 miRNA 바이오마커를 검출하는 데 사용되는 제제는, 프로브일 수 있다. 용어, "프로브"란 타겟 miRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미한다. 바람직하게, 프로브는 표지(Labelling)되어 있어서 특정 miRNA의 존재 유무를 쉽게 확인할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 miR-34a 및 miR-449에 대한 프로브의 염기서열은 각각 SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4로 기재하여 아래 표 2에 나타내었다.

miRNA	서열
SEQ ID NO: 3 (miR-34a-5p probe)	5' acaaccagctaagacactgcca 3'
SEQ ID NO: 4 (miR-449 probe)	5' accagctaacaatacactgcca 3'

본 발명에 있어서, miRNA의 발현 수준 측정은 EML4-ALK 양성 비소세포폐암에서 ALK 저해제에 내성을 획득한 경우, 상기 비소세포폐암의 치료를 위한 약물 선택의 정보를 제공하기 위해 환자의 시료로부터 miRNA의 발현 수준을 확인하는 과정으로서 miRNA 양의 측정일 수 있다. 이는 miRNA를 직접 분리하거나, 상기 miRNA에 대한 프라이머 또는 프로브를 이용하여 측정할 수 있다.

상기 miRNA의 발현 수준은 환자로부터 분리한 생물학적 시료 중의 발현 수준일 수 있다. 상기 시료는 비소세포폐암 환자로부터 분리한 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 변, 타액, 눈물, 척수액, 세포, 조직 또는 그 조합일 수 있다.

따라서, 본 발명의 miRNA 발현 수준의 탐지 방법을 통해, EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자 중 ALK 저해제에 내성을 획득한 경우 miR-34a 및/또는 miR-449의 발현 수준을 탐지함으로써, ALK 저해제에 내성을 획득한 비소세포폐암 환자의 치료를 위한 약물 선택의 정보를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 miR-34a 및/또는 miR-449의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암의 치료용 약물 선택의 정보 제공을 위한 miR-34a 및/또는 miR-449 검출용 조성물을 제공한다.

상기 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 위에서 기술한 내용을 그대로 적용 또는 준용할 수 있다.

또한, 상기 miR-34a 및/또는 miR-449 검출용 조성물은 키트의 형태로 구현되어 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 키트는 miR-34a 또는 miR-449의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드 등의 검출 제제를 포함할 뿐만 아니라, 분석 방법에 적합한 하나 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 키트는 시료 내 miRNA를 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 유전자 증폭 키트일 수 있다. 다른 한 구체예에서, 상기 키트는 고정 기판의 표면에 miRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 프로브가 고정화되어 있는 마이크로어레이(microarray) 키트일 수 있다.

상기 키트는 바이오마커 miR-34a 및/또는 miR-449의 발현 수준에 대한 분석을 어떻게 수행하는지 기재되어 있는 지시서를 포함할 수 있다. 상기　지시서는 기준 코호트 내의 바이오마커의 발현 수준을 어떻게 결정하는지, 어떻게 코호트를 결정하는지, 환자들을 비교하기 위한 기준을 결정하기 위해 발현 데이터를 어떻게 수집하는지에 대한 지시를 포함할 수 있다. 또한, 상기　지시서는 검사 환자 내의 바이오마커 발현 분석을 위한 지시 및 그 발현을 기준 코호트의 발현과 비교하고 이후 검사 환자에 대한 적절한 화학요법을 결정하기 위한 지시를 포함할 수 있다.

상기 키트에 포함된 정보 자료는 서술, 지시, 홍보물이거나 본 명세서에 기술된 방법과 연관된 다른 자료 및/또는 본 명세서에 기술된 방법을 위한 시약의 용도일 수 있다. 예를 들어,　키트의 정보 자료는　키트의 사용자가, 특히 이들이 특정 치료제에 대한 양성 응답을 가지는 인간의 확률을 적용할 경우에 유전자 발현 분석을 수행하고 결과를 해석하는데 대한 실질적인 정보를 얻을 수 있는 연락처, 예컨대, 물리적 주소, 이메일 주소, 웹사이트 또는 전화번호를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자에서 분리한 생물학적 시료로부터 ALK 저해제에 대한 내성 획득 여부를 확인하고,

ALK 저해제에 내성을 획득한 경우 EML4-ALK 양성 비소세포폐암의 치료를 위해 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제 및 ALK 저해제를 병용 투여하도록 정보를 제공하는 것을 포함하는,

ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암의 치료용 약물 선택을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 약물 선택을 위한 정보를 제공하는 방법에 있어서, 상기 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자 중 ALK 저해제에 내성을 획득한 환자에 대해 추가로 miR-34a 및/또는 miR-449의 발현 감소 여부를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, miR-34a 및/또는 miR-449의 검출 방법은 위에서 기술한 내용을 그대로 적용 또는 준용할 수 있다.

한 구체예에서, 상기 생물학적 시료는 비소세포폐암 환자로부터 분리한 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 변, 타액, 눈물, 척수액, 세포, 조직 또는 그 조합일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 "히스톤 탈아세틸화 효소 억제제(Histone deacetylase inhibitor)"는 히스톤 디아세틸라아제(histone deacetylase, HDAC)라는 효소에 작용하여 활성을 억제하는 약물로, 히스톤 단백질의 변형을 통해 유전자의 발현을 조절하는 히스톤 디아세틸라아제의 활성을 저해시키면 세포주기 정지, 혈관 형성 억제, 면역 조절, 세포사멸 등을 유도해 암세포 생성을 늦추거나 박멸시키는 약물을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제는 보리노스탯(Vorinostat), 로미뎁신(Romodepsin), 치다마이드(Chidamide), 트리코스타틴 A(Trichostatin A), 베리노스탯(Belinostat), 파노비노스탯(Panobinostat), 엔티노스탯(Entinostat), 발프로산(Valproic acid), 모세티노스탯(Mocetinostat), 아베시노스탯(Abexinostat), 레스미노스탯(Resminostat), 지비노스탯(Givinostat) 및 퀴지노스탯(Quisinostat)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 한 구체예에서, 상기 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제는 파노비노스탯(Panobinostat)일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제는 약물 그 자체뿐만 아니라 약제학적으로 허용 가능한 그의 염일 수 있다. 상기 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제의 약제학적으로 허용 가능한 염은 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서, 이 염에 기인한 부작용이 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제의 이로운 효능을 떨어뜨리지 않는 유기 또는 무기 부가염을 의미한다. 예를 들어, 약제학적으로 허용 가능한 염은 유기산 또는 무기산을 이용하여 형성된 산 부가염일 수 있으며, 상기 유기산은, 예를 들면 포름산, 아세트산, 프로피온산, 락트산, 부티르산, 이소부티르산, 트리플루오로아세트산, 말산, 말레산, 말론산, 푸마르산, 숙신산, 숙신산 모노아미드, 글루탐산, 타르타르산, 옥살산, 시트르산, 글리콜산, 글루쿠론산, 아스코르브산, 벤조산, 프탈산, 살리실산, 안트라닐산, 디클로로아세트산, 아미노옥시 아세트산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 및 메탄술폰산계 염을 포함하며 무기산은 예를 들면 염산, 브롬산, 황산, 인산, 질산, 탄산 및 붕산계 염을 포함한다.　바람직하게는 염산염 또는 아세트산염 형태일 수 있다. 또한, 알칼리 금속염(나트륨염, 칼류염 등) 및 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염) 등일 수 있다.

본 발명에 있어서, ALK 저해제는 약물 그 자체뿐만 아니라 약제학적으로 허용 가능한 그의 염일 수 있다. 상기 ALK 저해제의 약제학적으로 허용 가능한 염은 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제의 약제학적으로 허용 가능한 염에 대하여 위에서 기술한 모든 내용이 그대로 적용 또는 준용될 수 있다.

본 발명에 있어서, ALK 저해제에 대한 내성 획득 여부는 위에서 기술한 모든 내용이 그대로 적용 또는 준용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제는 비소세포폐암 세포에서 히스톤 탈아세틸화 효소로부터 발생하는 miR-34a 및/또는 miR-449의 탈아세틸화를 억제하는 효과가 우수하여 비소세포폐암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

하기 실시예에서, 본 발명자들은 ALK 저해제에 내성을 갖는 EML4-ALK 양성 비소세포폐암에 대해서, 새로운 내성 기전으로 miR-34a 및/또는 miR-449의 탈아세틸화에 의한 발현 감소를 규명하였고, 이에 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제를 처리함으로써 내성 획득 세포주에서 항종양 효능을 확인하였으며, 상기 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제와 함께 ALK 억제제를 병용 투여함으로써 비소세포폐암의 항종양 효과에 있어서 시너지 효과를 보이는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 EML4-ALK 양성 비소세포폐암에 있어서 miR-34a 및/또는 miR-449의 발현 감소로부터 ALK 저해제에 대한 내성을 획득한 경우, 비소세포폐암의 치료를 위한 약물 선택의 정보를 제공할 수 있고, 상기 비소세포폐암 환자에게 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제와 ALK 저해제를 병용 투여함으로써 치료 효과를 기대할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 miR-34a 및/또는 miR-449를 검출하는 방법을 이용하여 검출된 miR-34a 및/또는 miR-449의 발현 수준을 통하여 약물 선택의 정보를 제공하기 위한, ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암의 진단 방법을 제공한다.

상기 진단 방법에 의해, EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자 중 miR-34a 및/또는 miR-449의 발현 감소에 따라 ALK 저해제에 내성을 획득한 환자에 대해서, 상기 비소세포폐암의 치료를 위해 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제 및 ALK 저해제를 병용 투여하기 위한 정보를 제공할 수 있다.

상기 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제 및 ALK 저해제에 대하여 위에서 기술한 내용을 그대로 적용 또는 준용할 수 있다.

또한, 본 발명은 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하는, ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 치료를 위해 ALK 저해제와 병용 투여하기 위한 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제, ALK 저해제, EML4-ALK 양성 비소세포폐암 및 ALK 저해제에 대한 내성 획득 여부에 대하여 위에서 기술한 모든 내용이 그대로 적용 또는 준용될 수 있다.

히스톤 탈아세틸화 효소 억제제는 암, 염증성 질환 등의 치료를 위한 용도로 사용되어 온 약물로, 본 발명에 따른 약학 조성물은 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제 및 ALK 저해제를 포함함으로써 EML4-ALK 양성 비소세포폐암의 환자 중 ALK 저해제에 내성을 획득한 환자에 대해서 비소세포폐암의 치료 효과를 나타낼 수 있다.

따라서, 본 발명은 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제 및 ALK 저해제의 병용 투여에 대한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암의 치료 효능을 제공하는 것이다.

한 구체예에서, 상기 약학 조성물은 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제 및 ALK 저해제가 혼합된 복합제를 포함하는, 두 약물의 동시 투여를 위한 형태일 수 있다.

또 다른 구체예에서, 상기 약학 조성물은 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제 및 ALK 저해제가 각각 제제화되어, 두 약물을 동시적 또는 순차적으로 투여하기 위한 형태일 수도 있다. 이 경우, 상기 약학 조성물은 유효성분으로 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제를 포함하는 제 1 약학 조성물 및 유효성분으로 ALK 저해제를 포함하는 제 2 약학 조성물을 포함하는, 동시적 또는 순차적 투여를 위한 약학 조성물일 수 있다. 순차적 투여의 경우, 그 순서는 서로 바뀌어도 무방하다.

본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 필요에 따라 약물의 제조, 사용 및 판매를 관장하는 정부 기관에 의해 지시된 형태로 포장과 연계된 지시서가 수반될 수 있으며, 상기 지시서는 조성물의 형태 또는 인간이나 동물 투여에 관하여 상기 기관의 승인을 나타내고 있고, 예를 들어, 약물의 처방에 대하여 미국 식품의약국에서 승인된 표지일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 성분의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 본 발명에서의 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 또는 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여, 조직 또는 장기에 주입하기에 적합한 주사제의 형태로 제형화할 수 있다. 또한, 등장성 멸균 용액, 또는 경우에 따라 멸균수나 생리식염수를 첨가하여 주사 가능한 용액이 될 수 있는 건조 제제(특히 동결 건조제제)로 제형화할 수도 있다. 또한, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다.

또한 바람직하게 본 발명의 조성물은 충진제, 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화 될 수 있다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 명세서에서, "유효량"은 목적하는 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나 전적으로 중지시키는 데 필요한 양을 의미한다. 본 발명에서 조성물은 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다.

본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실험예 및 제조예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실험예 및 제조예에 한정되는 것이 아니라, 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

제조예 1. 크리조티닙(crizotinib)에 대한 내성을 획득한 비소세포폐암 세포주의 구축

EML4-ALK 양성 비소세포폐암 세포주인 H3122와 H2228(각각을 Parental이라 명명함) 세포주에 ALK 저해제인 세리티닙(ceritinib, 노바티스, CH)을 0.001μM에서 시작하여 1μM까지 농도를 지속적으로 증량시키면서 살아남은 H3122 및 H2228 세포주를 1μM 세리티닙(ceritinib)이 첨가된 배지에서 계속 배양하여 내성 획득 비소세포폐암 세포주를 구축하였다(각각 H3122 LR-pool 및 H2228 LR-pool이라 명명함). H3122 LR-pool 및 H2228 LR-pool로부터 single cell isolation을 통해 여러 개의 clonal cell line(#1 내지 #11이라 명명함)을 구축하여 clone들에 대해 MTT assay(도 1A)를 수행하여 세리티닙(ceritinib)에 대한 내성 획득 여부를 확인하였다. 또한, 상기 내성 획득 세포주에 세리티닙 이외의 ALK 저해제(크리조티닙, PF-06463922)를 처리한 경우의 세포 증식 결과를 통해 ALK 저해제 비의존적 내성을 확인하였다. 도 1의 A는 세리티닙의 농도에 따른 내성 획득 비소세포폐암 세포주의 세포 생존율을 나타낸 것이고, B는 Immunoblot 분석을 통한 ALK, AKT 및 ERK의 발현 수준을 나타낸 것이며, C는 다른 ALK 저해제(크리조티닙 및 PF-06463922, 화이자, US)를 처리한 경우의 세포 생존율을 나타낸 것이다.

도 1B에서 볼 수 있는 바와 같이, 각 세포주의 모세포(parental)의 경우 1μM 세리티닙에 의해 ALK, AKT 및 ERK 모두 활성이 억제되었고, H3122 LR-pool에서는 AKT의 활성은 감소되었으나 H2228 LR-pool에서는 AKT의 활성을 감소시키는데 실패한 것을 알 수 있었다. ERK의 활성은 두 내성 획득 세포주(H3122 LR-pool, H2228 LR-pool)에서 모두 세리티닙에 의해 감소되지 않았다. 또한, 두 내성 획득 세포주 모두 모세포주와 비교하여 ALK의 basal 발현 및 활성이 훨씬 감소한 것을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라, ALK 저해제의 내성 유발과 관련된 것으로 보고된 ALK kinase domain 내의 2차 돌연변이(secondary mutation) 여부를 Sanger 시퀀싱으로 확인하였으나, 이들 내성 획득 세포주에서는 2차 돌연변이가 일어나지 않은 것을 확인하였다. 또한, 도 1C에서는 세리티닙 이외의 ALK 저해제를 처리하더라도 세포 증식이 억제되지 않은 것을 확인할 수 있으며, 이는 2차 돌연변이가 일어나지 않은 결과와 일치하는 것을 의미한다. 따라서, 본 실험을 통해 본 발명자들이 구축한 세리티닙 내성 획득 세포주는 ALK에 비-의존적이며, 2차 돌연변이로부터 유발된 내성이 아닌 새로운 기전을 통해 ALK 저해제에 대한 내성을 획득한 것을 알 수 있었다.

실험예 1. 세리티닙 ( ceritinib ) 내성 획득 세포주의 특성 확인

EMT(상피간엽이행, Epithelial mesenchymal transition)는 상피 극성(epithelial polarized) 표현형이 간엽 섬유모세포(mesenchymal fibroblastoid) 표현형으로 변하는 현상으로, 전이 및 다양한 항암제 내성과 관련있는 것으로 알려져 있다. 본 실험예에서 두 모세포주와 각각의 내성 획득 세포주의 세포 모양을 도 2A에 나타내었다.

도 2A에서 보는 것처럼, H3122 모세포주는 대부분 동그란 모양을 가지며 콜로니를 형성하면서 증식하는데, 세리티닙 내성 획득 세포주에서는 위족과 같은 돌출부를 가진 길쭉한 형태로 세포 모양의 변화가 일어났음을 관찰할 수 있다. 이는 모세포주에 비해 내성 획득 세포주가 이동성이 강한 세포 형태(migratory phenotype)로 변형되어 EMT로 세포 특성의 변화가 일어났을 가능성을 유추할 수 있다. 이에, Immunoblot 분석을 통해 EMT 관련 단백질의 발현을 도 2B에서 확인한 결과, 두 내성 획득 세포주 모두 모세포주와 비교하여 AXL의 발현 및 활성과 N-Cadherin의 발현은 증가하고, E-Cadherin의 발현은 감소한 것을 알 수 있었다.

실험예 2. In vivo 이종이식( xenograft ) 동물 모델에서의 EMT 관련 유전자 발현 수준 확인

상기 실험예 1에서 확인한 세포 수준의 결과를 동물 모델에서 확인하기 위해, H3122 세포주를 nude 마우스에 이종이식하여 종양 크기가 300mm³에 달했을 때 세리티닙을 50, 75, 87.5, 100mg/kg의 용량으로 매일 경구투여를 지속하며 종양 크기를 관찰하여 도 3에 나타내었다.

그 결과, 50mg/kg 투여군은 약물 투여 후 18일째에 34.05% 정도의 maximum volume reduction을 보였으나, 24일이 지나면서 re-growth가 일어났다. 75mg/kg 투여군은 약물 투여 후 32일째에 62.2%의 maximum volume reduction을 보였으나, 48일이 지나면서 re-growth가 일어났다. 87.5mg/kg 투여군은 약물 투여 후 42일째에 72.98% 정도의 maximum volume reduction을 보였으나, 62일이 지나면서 re-growth가 일어났다. 100mg/kg 투여군은 약물 투여 후 42일째에 74.25% 정도의 maximum volume reduction을 보였으나, 108일이 지나면서 re-growth가 일어났다.

Re-growth가 일어난 마우스는 희생 후, 종양 조직을 확보하여 RNA를 분리하고, Microarray 분석을 통해 EMT 관련 유전자들의 발현 수준을 비교하였다.

그 결과, 대조군(0 mpk)에서는 epithelial 특성 유전자의 발현이 높은 반면, 대부분의 용량군에서는 mesenchymal 특성 유전자들의 발현이 증가되어 있는 것을 확인할 수 있다. 상기와 같은 결과들을 통해, ALK 저해제에 내성을 획득한 마우스 모델은 특이적으로 EMT의 특성이 두드러져 있음을 알 수 있었다.

실험예 3. 세리티닙 ( ceritinib ) 내성 획득 세포주의 후성 유전체 분석

상기 제조예 1에서 구축한 세포주에 대해, ALK 저해제 내성 획득 기전을 규명하기 위해 RNA-seq, MBD-seq, ChIP-seq 통합 분석을 통해 내성 획득 세포주의 전사체, DNA 메틸화, 히스톤 아세틸화 등 후성 유전체 통합 분석을 실행하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4의 A는 모세포주와 내성 획득 세포주의 히스톤 단백질의 아세틸화와 DNA 메틸화 변화를 나타낸 것이고, B는 H3K27Ac 부위의 아세틸화를 나타낸 것이며, C는 내성 획득 세포주에서 mRNA와 miRNA의 발현 수준을 나타낸 것이고, D는 후성 유전체 분석을 통해 miR-34a와 miR-449의 탈아세틸화에 의한 발현 감소를 규명한 결과이다.

도 4에서 보는 바와 같이, 모세포주와 비교하여 내성 획득 세포주에서 DNA 메틸화에는 큰 변화를 보이지 않았으나, H3K27AC 부위에서 탈아세틸화가 두드러지게 나타나는 것을 알 수 있었다(A 및 B). 또한, 내성 획득 세포주에서 AXL, GAS6(AXL 리간드) 및 N-Cadherin의 mRNA 발현이 증가되어 있고, DUSP6을 포함한 종양 억제(tumor suppressor) 유전자들의 발현은 감소되어 있음을 확인하였다. 또한, mRNA의 발현이 증가하는 유전자를 50종 선별하여 후성 유전체 통합 분석한 결과, AXL 발현을 negative regulation하는 miR-34a와 miR-449의 H3K27(전사 시작 부위) 부위의 아세틸화가 감소하고 발현이 감소되는 것을 규명하였다.

실험예 4. 세리티닙(ceritinib) 내성 획득 세포주에서 EMT의 관련 특성 확인

최근 AXL은 폐암 표적 치료제의 새로운 내성 기전으로 주목 받고 있는 인산화 효소 수용체로서, EMT 관련 유전자들과도 깊은 상관관계를 갖는 것으로 알려져 있다. 이에, 본 실험예에서는 세리티닙 내성 획득 세포주에서 AXL의 기능을 규명하기 위해 AXL 활성 저해제인 포레티닙(Foretinib)을 처리하여 EMT 관련 유전자들의 발현을 조사하였다.

도 5A에서 보는 바와 같이, 포레티닙은 내성 획득 세포주에서 증가한 AXL의 활성과 N-Cadherin의 발현을 완벽하게 억제시켰고, 감소되었던 E-Cadherin의 발현을 다시 증가시킨 것을 확인하였다.

miRNA는 약 19 내지 25개의 뉴클레오타이드(nucleotide)로 구성된 RNA로서 표적 mRNA와 결합하여 유전자의 발현을 억제하는 역할을 하는데, 특히 miR-34a와 miR-449는 AXL, MET 등을 표적으로 하여 항암제와 관련이 높다. 이에, 내성 획득 세포주에서 miR-34a 및 miR-449의 탈아세틸화에 의한 발현 감소가 AXL의 과발현 및 활성과 관련 있는지 확인하기 위해, H3122 모세포에는 miR-34a 및 miR-449 억제제를, 내성 획득 세포주에는 miR-34a 및 miR-449 mimics를 리포펙타민 RNAimax를 이용하여 형질전환한 후 이를 처리하여 immunoblot으로 분석하였다.

그 결과, 도 5A와 동일하게 내성 획득 세포주에서 증가한 AXL와 N-Cadherin의 발현은 완벽하게 억제시켰고, 감소되었던 E-Cadherin의 발현을 다시 증가시킨 것을 확인하였다. 이는 내성 획득 세포주에서 miR-34a와 miR-449의 발현 감소가 EMT 조절 인자임을 시사하는 것이라 판단하였다.

실험예 5. 세리티닙 ( ceritinib ) 내성 획득 세포주에서 miR -34a 및 miR -449의 내성 유발 인자로서의 가능성 검증

세리티닙 내성 획득 세포주에서 세포 생존에 대한 miR-34a와 miR-449의 기능을 규명하기 위해 상기 실험예 4와 동일하게 억제제/mimics를 형질전환한 후 MTT assay를 이용하여 miR-34a와 miR-449가 세포 증식에 미치는 영향을 알아보았다.

그 결과, 두 모세포주에서는 음성 대조군과 비교하여 miR-449 억제제 처리군에서 세포 증식이 약 20% 정도 증가하였고, 두 내성 획득 세포주에서는 반대로 음성 대조군과 비교하여 miR-449 mimics 처리군에서 세포 증식이 약 40% 이상 억제되는 것을 알 수 있었다(도 6A). 또한, 동일한 조건에서 immunoblot 분석을 통해 대표적 세포 생존 신호 전달 인자인 AKT, ERK의 활성을 조사한 결과, miR-34a 및 miR-449 mimics 모두 ERK의 활성을 억제시켰고 세리티닙 처리시 시너지 억제 효과를 보이는 것을 확인하였다(도 6B). miR-34a 및 miR-449 억제제의 경우, ERK의 활성이 증가되었지만, 세리티닙을 처리하면 음성 대조군과 비슷하게 억제시키는 것을 알 수 있었다.

상기 결과들을 통해, 모세포에서는 비록 miR-34a 및 miR-449 억제제가 ERK의 활성 및 종양 형성(tumorigenesis)을 촉진시키지만 세리티닙에 의해 완벽하게 억제되는 것으로 보아, 모세포는 여전히 ALK 의존적인 폐암 세포주로서, miR-34a 및 miR-449가 세리티닙의 민감성에 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었다. 반면, 내성 획득 세포주에서는 miR-34a 및 miR-449가 중요한 내성 유발 인자임을 제시하였다.

실험예 6. 세리티닙 ( ceritinib ) 내성 획득 세포주에서 파노비노스탯(Panobinostat)에 의한 miR -34a 및 miR -449의 탈아세틸화 조절 가능성 확인

세리티닙 내성 획득 세포주에서 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제인 파노비노스탯(Panobinostat)에 의한 miR-34a 및 miR-449의 탈아세틸화 및 발현 조절이 가능한지 확인하기 위하여, 파노비노스탯을 처리한 후 q-PCR(real time quantitative RT-PCR), RNA-seq 및 ChIP-seq 분석을 수행하였다. 이때, q-PCR은 TaqMan® MicroRNA Assays(Life Technologies, USA)를 이에 포함된 프로브 및 프라이머를 제조자의 방법대로 사용하여 수행하였다.

도 7에서 보는 바와 같이, 파노비노스탯이 내성 획득 세포주의 H3K27AC 부위에서 아세틸화를 증가시키는 것을 알 수 있었다. 비록 파노비노스탯에 의한 miR-34a의 발현 수준은 변화가 없었지만, AXL이라는 같은 표적을 가지는 miR-449의 아세틸화 및 발현이 증가됨을 확인하였다.

실험예 7. 세리티닙 ( ceritinib ) 내성 획득 세포주에서 miR -34a 및 miR -449의 탈아세틸화 조절을 통한 내성 극복 가능성 검증

파노비노스탯과 세리티닙 각각의 단일 항종양 효과 및 병용 효과를 확인하기 위해 colony formation을 수행하였다.

그 결과, 두 모세포주에서는 각 약물의 단일 효과는 보이나 병용 효과는 관찰되지 않았고, 내성 획득 세포주에서는 유의성 있게 시너지 효과를 보였다(도 8A). 또한, immunoblot 분석을 통해 파노비노스탯과 세리티닙의 병용 처리에 의해 G1 arrest 유도 단백질로 알려진 CDK 억제 단백질(CIP/KIP family)인 p21의 발현과 세포사멸(apoptosis) 관련 단백질인 cleaved PARP 및 cleaved caspase-3의 발현을 증가시킨 것을 확인하였다(도 8B). 뿐만 아니라, miR-34a 및 miR-449가 표적으로 하는 AXL, MET 등의 단백질 및 N-Cadherin의 발현은 감소시켰고, 감소되었던 E-Cadherin의 발현은 다시 증가시킨 것을 확인하였다(도 9A 및 B).

상기 결과들을 통해, 비록 파노비노스탯이 miR-34a의 발현은 증가시키는데 실패하였지만, 동일한 표적에 경쟁적으로 작용하는 miR-449의 아세틸화 및 발현 증가를 통해 AXL 및 EMT 조절로부터 세리티닙의 내성을 극복할 수 있음을 알 수 있었다. 나아가 miR-34a 및 miR-449의 탈아세틸화로 인한 발현 감소가 세리티닙의 내성 기전에서 중요한 인자이며, 이를 극복하기 위한 새로운 치료방법으로서 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제와 세리티닙의 병용 요법에 대한 전략을 제시해주었다.

<110> University-Industry Foundation, Yonsei University JEUK Co.,Ltd. <120> Method of providing the information for selecting the drugs for treating EML4-ALK positive non-small-cell lung cancer resistant to ALK inhibitors <130> P18U18C0130 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 uggcaguguc uuagcugguu gu 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 uggcagugua uuguuagcug gu 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-34a-5p probe <400> 3 acaaccagct aagacactgc ca 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-449 probe <400> 4 accagctaac aatacactgc ca 22

Claims

히스톤 탈아세틸화 효소 억제제 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 포함하는, ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암의 치료를 위해 ALK 저해제와 병용 투여하기 위한 약학 조성물로서,
상기 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제는 파노비노스탯(Panobinostat)이고, ALK 저해제는 세리티닙(ceritinib)인 약학 조성물.
제1항에 있어서,
히스톤 탈아세틸화 효소 억제제와 ALK 저해제는 병용 투여시 단일 약물로 각각 투여되는 것인, 약학 조성물.
제1항에 있어서,
히스톤 탈아세틸화 효소 억제제와 ALK 저해제는 병용 투여시 복합제의 형태로 투여되는 것인, 약학 조성물.
제1항에 있어서,
ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암은 ALK 저해제의 투여 후 miR-34a 및/또는 miR-449의 발현이 감소되어 있는 상태인 약학 조성물.
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