KR101989814B1 - 클로스트리디움 및 대장균에서 복제가 가능한 셔틀 플라스미드 및 이를 이용하여 제조된, 오탄당 대사 및 발효 성능이 증강된 재조합 미생물 - Google Patents

클로스트리디움 및 대장균에서 복제가 가능한 셔틀 플라스미드 및 이를 이용하여 제조된, 오탄당 대사 및 발효 성능이 증강된 재조합 미생물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대장균에서 복제 가능한 제1 복제기점의 염기 서열; pUB110 플라스미드에서 유래한 복제단백질 영역을 암호화하는 염기 서열;및 유전자의 발현 종결 서열을 포함하는 클로스트리디움 및 대장균에서 복제가 가능한 셔틀 플라스미드에 대한 것이다.

Description

클로스트리디움 및 대장균에서 복제가 가능한 셔틀 플라스미드 및 이를 이용하여 제조된, 오탄당 대사 및 발효 성능이 증강된 재조합 미생물{SHUTTLE PLASMID REPLICABLE IN CLOSTRIDIUM AND ESCHERICHIA COLI, AND RECOMBINANT MICROORGANISM HAVING ENHANCED PENTOSE METABOLISM AND FERMENTATION PERFORMANCE PREPARED USING THE SAME}
본 발명은 클로스트리디움 및 대장균에서 복제가 가능한 셔틀 플라스미드 및 이를 이용하여 제조된 재조합 미생물에 대한 것이다.
부탄올은, 화장품, 향수, 호르몬, 위생제, 산업용 코팅제, 페인트첨가제, 섬유, 플라스틱 모노머, 의료용품, 비타민, 항생제, 농약 등 활용범위가 매우 넓은 중간체 화합물로 그 효용성이 매우 크다.
기존의 부탄올 제조방법은 클로스트리디움 균주로 당을 발효하여 부탄올, 아세톤 및 에탄올을 생산하는 방법이 80년대까지 이용되었으나 이후로는 석유로부터 얻어진 프로필렌으로부터 부탄올을 합성하는 옥소법(oxo process)이 널리 이용되어 왔다. 그러나 석유 기반의 부탄올 제조법은 고온 고압을 사용하여 공정이 복잡하며 다량의 유해성 폐기물과 이산화탄소를 배출하는 문제점으로 최근에는 다시 재생 가능한 자원으로부터 미생물의 발효를 통해 친환경적으로 부탄올을 생산하기 위한 요구가 증가하고 있다.
그러나 미생물을 이용하여 산업적으로 유용한 수준으로 부탄올을 생산하기 위하여는 부탄올의 선택성, 수율 및 생산성, 즉 단위시간 당 부탄올의 생산량 모두가 우수하여야 한다. 그러나 바이오 부탄올 생산을 위한 야생형 및 재조합 미생물들 중 이들 조건들을 모두 만족하는 미생물은 아직 발견되지 않았다.
구체적으로 예를 들어, 야생형 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) ATCC824 균주 경우 아세톤, 에탄올 및 부탄올을 발효를 통해 약 3:1:6의 질량비로 생산하는 것으로 알려져 있으며, 소량의 아세트산과 부틸산을 생산한다. 이때 야생형 균주의 수율은 약 25%이고, 최종 농도는 약 10g/L 정도이다. 클로스트리디움 아세토부틸리쿰과 같이 아세틸 코에이 생합성 경로 및 부티릴 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물은, 일반적으로 아세톤, 부탄올 및 에탄올을 합성하는 것으로 알려져 있다. 최근 대사공학 기술의 발달로 좀더 효율적으로 부탄올을 생산하고자 하는 노력이 지속되고 있으며 특히 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 경우 최근 genome 서열이 알려지면서 대사경로 조작과 관련된 연구가 활발히 진행되고 있다.
예컨대, 부탄올 생성관련 유전자(adc, ctfAB 및 adhE1(알코올/알데히드 탈수소 효소) 및 adhE2(알코올/알데히드 탈수소 효소))가 존재하는 거대 플라스미드가 결실된 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 M5 균주에 adhE1과 ctfAB 유전자를 동시에 과발현한 결과가 보고되었는데, 이 보고에 따르면 부탄올 선택도가 질량비로 0.78로 향상되었으나 균주의 생장이 저해되고 아세트산 생산이 증가하면서 생산성과 수율이 크게 저하되는 한계가 있었다(Lee, et al.,Biotechnology Journal, 4:1432-1440, 2009; Lee, et al., WO 2009/082148)
아세틸코에이(Acetyl-CoA)를 아세테이트로 전환하는 pta유전자를 결실시킨 경우 및 pta 및 부티릴코에이(Butyryl-CoA)를 부티레이트로 전환하는 buk 유전자 모두를 결실시키고 aad(알코올/알데히드 탈수소 효소)를 과발현한 경우 모두 부탄올 농도, 선택도 및 수율이 증가한 결과가 보고되었으나, 양자 모두 여전히 생산성 및 균주의 안정성 측면에서 한계가 있었다(LEE et al., WO 2011/037415). 또한 pta와 buk을 결실시킨 변이주에 추가로 코에이 트란스퍼라제(CoAT)를 코드하는 CtfB 유전자를 결실시킨 경우에도 생산성이 여전히 낮았다(LEE et al., WO 2011/037415).
그 밖에도, 무작위 돌연변이로 유발된 돌연변이주 Clostridium beijerinckii BA101 균주를 이용하여 탄소원으로 말토덱스트린을 사용하여 발효한 결과, 18.6 g/ℓ의 부탄올이 생산된다는 것을 보고한 예도 있다(Ezeji et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 63:653, 2004). 하지만, 상기 재조합 균주들을 이용하더라도 모두 최종 산물인 부탄올의 생산성이 낮아 산업적 이용이 불가능하다.
또한 코에이트랜스퍼라아제를 코딩하는 ctfAB 또는 아세토아세트산 탈 탄산효소인 adc를 결실시킴으로써 아세톤의 농도를 감소시키고 부탄올의 선택도를 증가시킨 보고가 있지만 이들은 부탄올의 최종 농도가 10g/L 미만이고 균주의 안정성에 문제가 있다(Jiang et al., Metab. Eng., 11(4-5):284-291, 2009).
또한 adc(아세토아세트산 탈탄산효소) 및 ctfAB(코에이 트란스퍼라제) 유전자를 야생형 클로스트리디움 아세토부틸리쿰에서 과발현한 경우 야생형에 비해 아세톤, 에탄올 및 부탄올 생산성이 각각 95%, 90% 37% 증가한 것이 보고되었으나, 부탄올 선택도 및 수율이 낮은 문제가 있다(Mermelstein et al., Biotechnol. Bioeng., 42:1053, 1993).
그러므로, 부탄올의 산업적 규모의 생산을 위하여는 효과적인 높은 대사 활성을 가진 클로스트리디움 균주를 개발할 필요가 있다. 또한 높은 대사 활성을 가진 클로스트리디움 균주를 개발하기 위하여, 효과적인 숙주/플라스미드 시스템의 개발 또한 요구되고 있다.
따라서, 클로스트리디움 및 대장균에서 복제가 가능한 셔틀 플라스미드와 같아 개량된 셔틀 벡터가 개발된 바 있다(한국 등록특허 10-1565726호). 본 발명자들은 상기 셔틀 플라스미드를 더욱 발전시켜, 플라스미드의 크기가 감소되고, 항생제 내성 유전자의 교체 없이 한 가지 항생제 내성 유전자 (Chloramphenicol 내성 유전자)를 이용하는 것만으로도 클로스트리디움 및 대장균에서 복제가 가능하며, 복제 안정성이 한층 더 우수한 셔틀 플라스미드를 발명하였다. 또한 본 발명자들은 본 발명의 셔틀 플라스미드를 이용하여 재조합 미생물을 제조하고, 그 부탄올 생산성이 우수한 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국등록특허 10-1565726호 한국등록특허 10-1548480호 한국등록특허 10-1487057호
본 발명의 목적은 높은 복제 안전성 및 간편성으로 클로스트리디움 및 대장균에서 복제가 가능한 셔틀 플라스미드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 부탄올 선택도 및 수율이 높으면서도, 에탄올 선택도가 낮아 산업적 규모로 지속적으로 바이오 부탄올을 생산할 수 있는 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 발효 성능은 유지하거나 높으며, 자일로즈와 같은 오탄당 이용 효율이 증대된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
대장균에서 복제 가능한 제1 복제기점의 염기 서열;
pUB110 플라스미드에서 유래한 복제단백질 영역을 암호화하는 염기 서열;및
유전자의 발현 종결 서열을 포함하는
클로스트리디움 및 대장균에서 복제가 가능한 셔틀 플라스미드를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 셔틀 플라스미드를 이용하여 제조된 재조합 미생물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 셔틀 플라스미드를 이용하여 재조합 미생물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 셔틀 플라스미드는 높은 복제 안전성 및 간편성으로 클로스트리디움 및 대장균에서 복제가 가능하다.
또한 본 발명의 재조합 미생물은 ABE(아세톤, 에탄올 및 부탄올) 수율 및 부탄올 생산성, 부탄올 선택도가 높으면서도, 에탄올 선택도는 낮은 특징이 있다. 그러므로 본 발명의 재조합 미생물은 산업적인 규모로 지속적으로 바이오부탄올을 생산할 수 있다.
도 1은 스타필로코거스 아우레우스 유래 잠재 플라스미드 (cryptic plasmid) pUB110의 유전자 지도이다.
도 2는 pUB110 잠재 플라스미드및 pUC19 플라스미드의 복제 기점의 염기서열을 포함하는 pMTL500E 플라스미드로부터 셔틀 플라스미드 pLK1-MCS의 제작 공정을 나타낸다.
도 3은 pLK1-MCS 플라스미드 및 pGS1-MCS 플라스미드를 이용하여 pCK2-MCS 셔틀 플라스미드를 제작하는 것을 보여주는 모식도이다.
도 4는 pLK1-MCS 플라스미드를 나타낸다.
도 5는 pGS1-MCS 플라스미드를 나타낸다.
도 6은 pCK2-MCS 셔틀 플라스미드를 나타낸다.
한국등록특허 10-1565726 및 한국등록특허 10-1548480은 그 특허공보 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다.
본 발명은,
대장균에서 복제 가능한 제1 복제기점의 염기 서열;
pUB110 플라스미드에서 유래한 복제단백질 영역을 암호화하는 염기 서열;및
유전자의 발현 종결 서열을 포함하는
클로스트리디움 및 대장균에서 복제가 가능한 셔틀 플라스미드에 대한 것이다.
또한 본 발명은
본 발명의 셔틀 플라스미드를 준비하는 단계;
상기 셔틀 플라스미드에 하나 이상의 유전자를 도입하여 제1 재조합 셔틀 플라스미드를 제조하는 단계; 및
상기 제1 재조합 셔틀 플라스미드를 미생물에 도입하는 단계를 포함하는 재조합 미생물의 제조 방법에 대한 것이다.
또한 본 발명은,
제2 재조합 셔틀 플라스미드를 미생물에 도입하는 단계;및
하나 이상의 유전자를 본 발명의의 셔틀 플라스미드에 도입하여 제조한, 제1 재조합 셔틀 플라스미드를 상기 미생물에 추가로 도입하는 단계를 포함하는,
재조합 미생물의 제조 방법에 대한 것이다.
또한 본 발명은
본 발명의
셔틀 플라스미드를 준비하는 단계;
상기 셔틀 플라스미드에 하나 이상의 유전자를 도입하여 제1 재조합 셔틀 플라스미드를 제조하는 단계; 및
상기 제1 재조합 셔틀 플라스미드 및 제2 재조합 셔틀 플라스미드를 미생물에 동시에 도입하는 단계를 포함하는
재조합 미생물의 제조 방법에 대한 것이다.
또한 본 발명은
본 발명의 제조 방법에 의하여 제조된 재조합 미생물을 배양하여 배양물을 제조하는 단계;및
상기 배양물로부터 발효산물을 수득하는 단계를 포함하는,
발효산물의 수득 방법에 대한 것이다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
본 발명의 셔틀 플라스미드
본 발명의 셔틀 플라스미드는 대장균에서 복제 가능한 제1 복제기점의 염기 서열; pUB110 플라스미드에서 유래한 복제단백질 영역을 암호화하는 염기 서열;및 유전자의 발현 종결 서열을 포함하며, 클로스트리디움 및 대장균에서 복제가 가능하다.
상기 대장균에서 복제 가능한 제1 복제기점의 염기 서열은 pUC19 플라스미드의 복제기점의 염기 서열일 수 있고, 이는 복제기점으로서 기능을 갖는 한 pUC19 플라스미드의 복제기점의 염기 서열과 80% 이상 동일성을 갖는 염기서열을 포함한다. 바람직하게는 상기 대장균에서 복제 가능한 제1 복제기점의 염기 서열은 서열 번호 9의 염기 서열일 수 있고, 이는 대장균에서 복제 가능한 복제기점으로서 기능성을 유지하는 한, 서열번호 9의 염기 서열과 80% 이상 동일성을 갖는 염기 서열을 포함한다.
상기 pUB110 플라스미드에서 유래한 복제단백질 영역을 암호화하는 염기 서열은 pUB110 플라스미드의 복제 단백질(RepA)을 암호화 하는 염기서열일 수 있고, 이는 이와 80% 이상 동일성을 갖는 염기서열을 포함한다. 바람직하게는 상기 pUB110 플라스미드에서 유래한 복제단백질 영역을 암호화하는 염기 서열은 서열번호 4의 염기서열일 수 있고, 이는 이와 80% 이상 동일성을 갖는 염기서열을 포함한다. 또한 상기 pUB110 플라스미드에서 유래한 복제단백질 영역을 암호화하는 염기 서열은 서열번호 5의 아미노산 서열을 코드하는 염기서열일 수 있고, 이는 이와 80% 이상 동일성을 갖는 염기서열을 포함한다.
상기 유전자의 발현 종결 서열은 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 아세토아세테이트 디카르복시라아제 유전자의 전사 종결 인자 (Adc terminator)의 염기서열일 수 있고, 이는 유전자 발현 종결 기능을 유지하는 한, 이와 80% 이상 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 바람직하게는 상기 유전자의 발현 종결 서열은 서열번호 18의 염기서열이며, 이는 유전자 발현 종결 기능을 유지하는 한, 이와 80% 이상 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
또한 본 발명의 셔틀 플라스미드는 클로스트리디움 및 대장균에서 발현되는 항생제 저항성 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 상기 항생제 저항성 유전자는 클로람페니콜 저항성 유전자인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 상기 항생제 저항성 유전자는 서열번호 17의 염기서열을 갖는다.
이로써 본 발명의 셔틀 플라스미드는 항생제 저항성 유전자의 교체 없이 클로스트리디움 및 대장균 모두에서 복제가 가능하다. 즉, pLK1-MCS 셔틀 플라스미드와 같은 기존의 셔틀 플라스미드의 경우, 클로스트리디움에 셔틀 플라스미드를 도입하다가 그 후 대장균에 셔틀 플라스미드를 도입하거나, 또는 그 반대로 대장균에 셔틀 플라스미드를 도입하다가 그 후 클로스트리디움에 셔틀 플라스미드를 도입할 때, 항생제 저항성 유전자를 교체하여야 한다. 그러나 본 발명의 셔틀 플라스미드는 클로스트리디움에 셔틀 플라스미드를 도입하다가 그 후 대장균에 셔틀 플라스미드를 도입할 때 항생제 내성 유전자를 교체할 필요가 없다. 물론, 본 발명의 셔틀 플라스미드는 대장균에 셔틀 플라스미드를 도입하다가 그 후 클로스트리디움에 셔틀 플라스미드를 도입할 때에도 항생제 내성 유전자를 교체할 필요가 없다.
본 발명의 셔틀 플라스미드는 3000 bp 내지 4000 bp의 크기를 가지며, 바람직하게는 3200 bp 내지 3800 bp의 크기를 갖는다.
본 발명의 셔틀 플라스미드는 티올라제(Thiloase) 프로모터 영역의 염기 서열, 다중 클로닝 영역 (multiple cloning site, MCS) 영역의 염기 서열, 또는 pUB110 플라스미드의 복제기점의 염기 서열을 더 포함할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 셔틀 플라스미드는 티올라제(Thiloase) 프로모터 영역의 염기 서열, 다중 클로닝 영역 (multiple cloning site, MCS) 영역의 염기 서열, 및 pUB110 플라스미드의 복제기점의 염기 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 티올라제(Thiloase) 프로모터 영역 및 다중 클로닝 영역 (multiple cloning site, MCS)의 염기 서열은 서열번호 9의 염기 서열이며, 이는 프로모터 기능 및 다중 클로닝 기능을 유지하는 한, 이와 80% 이상 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 상기 pUB110 플라스미드의 복제기점의 염기 서열은 서열번호 3의 염기 서열이며, 이는 복제기점으로서 작용하는 한, 이와 80% 이상 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
재조합 미생물의 제조 방법
본 발명은 본 발명의 셔틀 플라스미드를 준비하는 단계; 상기 셔틀 플라스미드에 하나 이상의 유전자를 도입하여 제1 재조합 셔틀 플라스미드를 제조하는 단계; 및 상기 제1 재조합 셔틀 플라스미드를 미생물에 도입하는 단계를 포함하는 재조합 미생물의 제조 방법에 대한 것이다. 이 때, 상기 제1 재조합 셔틀 플라스미드를 미생물에 도입한 후, 제2 재조합 셔틀 플라스미드를 상기 미생물에 추가로 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한 본 발명은, 제2 재조합 셔틀 플라스미드를 미생물에 도입하는 단계;및 하나 이상의 유전자를 본 발명의의 셔틀 플라스미드에 도입하여 제조한, 제1 재조합 셔틀 플라스미드를 상기 미생물에 추가로 도입하는 단계를 포함하는, 재조합 미생물의 제조 방법에 대한 것이다.
또한 본 발명은 본 발명의 셔틀 플라스미드를 준비하는 단계; 상기 셔틀 플라스미드에 하나 이상의 유전자를 도입하여 제1 재조합 셔틀 플라스미드를 제조하는 단계; 및 상기 제1 재조합 셔틀 플라스미드 및 제2 재조합 셔틀 플라스미드를 미생물에 동시에 도입하는 단계를 포함하는, 재조합 미생물의 제조 방법에 대한 것이다.
즉, 본 발명의 재조합 미생물은 제1 재조합 셔틀 플라스미드 및 제2 재조합 셔틀 플라스미드를 미생물에 순차적 또는 동시에 도입하여 제조할 수 있으며, 순차적으로 도입 시 제1 재조합 셔틀 플라스미드와 제2 재조합 셔틀 플라스미드는 어느 것을 먼저 도입하여도 무방하다.
이 때, 상기 제2 재조합 셔틀 플라스미드는 본 발명의 셔틀 플라스미드의 복제기점과 동일한 복제기점을 갖는 재조합 셔틀 플라스미드인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 pLK1-MCS 셔틀 플라스미드에 유전자가 도입된 재조합 셔틀 플라스미드이다.
상기 셔틀 플라스미드에 도입된 유전자, 즉 제1 재조합 셔틀 플라스미드에 도입된 유전자는 자일로스 키나아제를 코드하는 유전자, 자이룰로스 이소메라제를 코드하는 유전자, 알코올/알데히드 탈수소 효소를 코드하는 유전자 및 코에이트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
이때 상기 제2 재조합 셔틀 플라스미드는 상기 제1 재조합 셔틀 플라스미드에 도입된 유전자와 다른 유전자를 포함할 수 있고, 또는 상기 제2 재조합 셔틀 플라스미드는 상기 제1 재조합 셔틀 플라스미드에 도입된 유전자와 동일한 유전자를 포함할 수 있다. 또한 상기 제2 재조합 셔틀 플라스미드는 자일로스 키나아제를 코드하는 유전자, 자이룰로스 이소메라제를 코드하는 유전자, 알코올/알데히드 탈수소 효소를 코드하는 유전자 및 코에이트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다.
즉, 상기 제2 재조합 셔틀 플라스미드는 자일로스 키나아제를 코드하는 유전자, 자이룰로스 이소메라제를 코드하는 유전자, 알코올/알데히드 탈수소 효소를 코드하는 유전자 및 코에이트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하되, 상기 제2 재조합 셔틀 플라스미드는 상기 제1 재조합 셔틀 플라스미드에 도입된 유전자와 동일하거나 또는 다른 유전자를 포함할 수 있다.
상기 하나 이상의 유전자는 자일로스 키나아제를 코드하는 유전자 또는 자이룰로스 이소메라제를 코드하는 유전자일 수 있고, 바람직하게는 상기 하나 이상의 유전자는 자일로스 키나아제를 코드하는 유전자 및 자이룰로스 이소메라제를 코드하는 유전자일 수 있다. 상기 자일로스 키나아제를 코드하는 유전자는 XylB일 수 있고, 상기 자이룰로스 이소메라제를 코드하는 유전자는 XylA일 수 있다. 상기 하나 이상의 유전자는 XylBA 오페론일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 29의 XylBA 오페론일 수 있다.
이 때, 상기 미생물은 아세틸 코에이 생합성 경로 및 부티릴 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물일 수 있다. 상기 미생물은 또한 알코올/알데히드 탈수소 효소를 코드하는 유전자 및 코에이트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자를 포함하는 미생물일 수 있다. 상기 미생물은 바람직하게는 대장균 또는 클로스트리디움일 수 있다. 상기 알코올/알데히드 탈수소 효소를 코드하는 유전자는 adhE1일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 20의 유전자일 수 있다. 상기 코에이트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자는 ctfAB일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 26의 유전자일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 셔틀 플라스미드에 자일로스 키나아제를 코드하는 유전자 또는 자이룰로스 이소메라제를 코드하는 유전자를 도입하는 단계;및 상기 유전자가 도입된 제1 재조합 셔틀 플라스미드를 아세틸 코에이 생합성 경로 및 부티릴 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물에 도입하는 단계를 포함하는 부탄올 생성능이 증강된 재조합 미생물의 제조 방법에 대한 것이다.
미생물
본 발명의 셔틀 플라스미드를 이용하여 미생물에 유전자를 도입하여 재조합 미생물을 제조할 수 있다. 이 때, 상기 미생물은 아세틸 코에이 생합성 경로 및 부티릴 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물일 수 있다. 상기 미생물은 또한 알코올/알데히드 탈수소 효소를 코드하는 유전자 및 코에이트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자를 포함하는 미생물일 수 있다. 상기 미생물은 바람직하게는 대장균 또는 클로스트리디움일 수 있다.
재조합 미생물
본 발명은 본 발명의 재조합 미생물의 제조 방법에 따라 제조된 재조합 미생물에 대한 것이다. 또한 본 발명은 자일로스 키나아제를 코드하는 유전자 및/또는 자이룰로스 이소메라제를 코드하는 유전자를 포함하는, 부탄올 생산용 재조합 미생물에 대한 것이다. 상기 자일로스 키나아제를 코드하는 유전자 및/또는 자이룰로스 이소메라제를 코드하는 유전자를 포함하는 부탄올 생산용 재조합 미생물은 알코올/알데히드 탈수소 효소를 코드하는 유전자 및 코에이트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 이 때, 상기 재조합 미생물은 아세틸 코에이 생합성 경로 및 부티릴 코에이 생합성 경로를 가질 수 있으며, 바람직하게는 상기 재조합 미생물은 재조합 클로스트리디움이고, 더욱 바람직하게는 재조합 클로스트리디움 아세토부틸리쿰이다.
본 발명은 또한 아세틸 코에이 생합성 경로 및 부티릴 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물에, 자일로스 키나아제를 코드하는 유전자, 자이룰로스 이소메라제를 코드하는 유전자, 알코올/알데히드 탈수소 효소를 코드하는 유전자 및 코에이트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상, 바람직하게는 둘 이상, 더욱 바람직하게는 셋 이상의 유전자들이 도입되어 제조된, 부탄올 생산용 재조합 미생물에 대한 것이다. 상기 유전자는 본 발명의 셔틀 플라스미드를 이용하여 상기 미생물에 도입될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 재조합 미생물은 자일로스 키나아제를 코드하는 유전자, 자이룰로스 이소메라제를 코드하는 유전자, 알코올/알데히드 탈수소 효소를 코드하는 유전자 및 코에이트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 제1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 기재된 셔틀 플라스미드에 도입되어 제조된 제1 재조합 셔틀 플라스미드; 및 자일로스 키나아제를 코드하는 유전자, 자이룰로스 이소메라제를 코드하는 유전자, 알코올/알데히드 탈수소 효소를 코드하는 유전자 및 코에이트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 제2 재조합 셔틀 플라스키드를 이용하여 상기 미생물 내에 유전자가 도입되어 제조될 수 있다. 상기 부탄올 생산용 재조합 미생물은 서열번호 29의 염기 서열, 서열번호 20의 염기 서열 및 서열번호 26의 염기 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염기 서열, 바람직하게는 둘 이상의 염기 서열들, 더욱 바람직하게는 셋 이상의 염기 서열들이 미생물에 도입되어 제조될 수 있다.
본 발명의 재조합 미생물은 오탄당의 이용 효율이 야생형 미생물보다 높은 특징이 있다. 상기 오탄당은 자일로스, 아라비노스, 리블로스, 리보스 등이며, 바람직하게는 자일로스이다. 상기 오탄당의 이용 효율이 야생형 미생물보다 높다는 것은 글루코스와 오탄당의 혼합 배지에서 미생물을 배양 시 오탄당을 대사하여 발효에 이용하는 비율, 즉 오탄당 소모 속도가 야생형 미생물보다 본 발명의 재조합 미생물이 높다는 것을 의미한다.
또한 본 발명은 본 발명의 재조합 미생물을 배양하여 배양물을 제조하는 단계;및 상기 배양물로부터 발효산물을 수득하는 단계를 포함하는, 발효산물의 수득 방법에 대한 것이다.
상기 재조합 미생물은 재조합 대장균 또는 재조합 클로스트리디움일 수 있다. 상기 배양 단계는 통상적인 방법으로 수행할 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 상기 발효산물은 탄소 수 6 이하의 저가 알코올, 유기산 등이 될 수 있고, 예컨대, 부탄올, 부탄디올, 프로판올, 프로판디올, 젖산, 프로피온산 등이 될 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<재료 및 방법>
pta 및 buk가 결실된 돌연변이 균주로는, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 TM2-1-C(기탁번호 KCTC 12604BP)를 사용하였다.
한편, 재조합 C. 아세토부틸리쿰 균주의 바이오 부탄올 생성능의 평가 시, 알코올 선택도(생산되는 혼합용매(ABE: 아세톤, 부탄올, 에탄올) 중 특정 알코올의 비율), 부탄올 생산성 및 수율은 하기와 같이 계산하였다.
-부탄올 선택도(%): 부탄올 생산량(g)/ABE 생산량(g) × 100
-에탄올 선택도(%): 에탄올 생산량(g)/ABE 생산량(g) × 100
-부탄올 생산성(g/L/h): 단위 시간, 단위 부피당 생산되는 부탄올 양
(이 때, 회분식 및 유가식 방법에서 부탄올 생산성은 exponential phase 기준임, 연속배양에서는 전체 phase에서 생산된 누적 ABE량을 기준으로 계산함)
-수율(%): ABE 생산량(g)/탄소원(g) × 100
-ABE 생산성(g/L/h): 단위 시간, 단위 부피당 생산되는 ABE의 양
<실험예 1> pLK1-MCS 셔틀 플라스미드의 제작
pUB110 플라스미드는 스타필로코거스 아우레우스 유래 잠재 플라스미드 (cryptic plasmid) 로 그 유전자 지도는 도 1과 같다. 서열번호 1의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 pUB110 잠재플라스미드를 주형으로 pUB110 플라스미드의 복제기점과 복제단백질 암호화 부위를 증폭하여 수득하였다. 상기 pUB110 플라스미드의 복제기점의 염기서열은 서열번호 3과 같고 복제 단백질(RepA)을 암호화 하는 염기서열은 서열번호 4과 같고, 상기 복제단백질의 아미노산 서열은 서열번호 5와 같다.
이 때, PCR 반응 혼합물 100 μl는 dNTP 250 μM, 상기 프라이머들을 각각 20p mol, 1.5mM MgCl2, 10ⅹbuffer 10 μl, DNA 주형100 ng, pfu 폴리머라제 1 unit을 첨가하여 제조하였으며. 95 ℃에서 5분 동안 초기 변성 과정을 거친 다음 95℃에서 1분 동안 변성, 58℃에서 1분 동안 어닐링 및 72℃에서 2분 동안 중합과정을 30회 반복하였다. 이후의 실시예에서의 PCR 반응은 상기 방법과 동일하게 진행하였다. 증폭된 DNA 절편은 1% 아가로오즈 젤에서 정제하고 SacI/BglII 제한효소로 DNA 단편을 절단하였다.
Figure 112017118272092-pat00001
한편, 도 2에서 제시된 바와 같이, pMTL500E 플라스미드를 SacI/BamHI 제한효소로 절단하여 pMTL500E 플라스미드에 포함된 앰피실린 저항성 유전자, 에리스로마이신 저항성 유전자 및 pUC19 플라스미드의 복제기점 영역(pUC origin)을 1% 아가로오즈 젤에서 정제하여 수득하였다. 이를 상기 PCR반응으로 증폭하고 SacI/BglII 제한효소로 절단한 pUB110의 복제기점과 복제단백질을 포함하는 DNA 절편(서열번호 3과 4)와 라이게이션하여 pLK1-temp를 제작하였다. 이렇게 제작된 pLK1-temp를 PvuII/SacI 제한효소로 다시 절단하고, 바이오니아사로부터 화학적으로 합성한 티올라제(thiolase) 프로모터(promoter) 및 다중 클로닝 영역(multiple cloning site, MCS)을 포함하는 DNA (서열번호 6) 를 SmaI/SacI으로 절단한 DNA절편과 클로닝하여 최종 pLK1-MCS를 제작하였다(서열번호 10, 도 2). 상기 pLK1-MCS는 에리스로마이신 저항성 유전자의 염기 서열(서열번호 7), 앰피실린 저항성 유전자의 염기 서열(서열번호 8), pUB110 플라스미드의 복제기점의 염기서열(서열번호 3), 복제단백질(RepA)을 코드하는 염기서열(서열번호 4) 및 pUC19 플라스미드의 복제기점의 염기 서열(서열번호 9)를 포함한다.
상기 pLK1-MCS(DNA 플라스미드)는 한국생명공학연구원에 2015년 2월 4일 기탁하였다(KCTC 12755BP).
Figure 112017118272092-pat00002
Figure 112017118272092-pat00003
Figure 112017118272092-pat00004
Figure 112017118272092-pat00005
<실험예 2> pCK2-MCS 셔틀 플라스미드의 제작
<2-1> pLK1-MCS 플라스미드의 복제 기점 등 증폭
상기 <실험예 1>에서 제작한 pLK1-MCS 플라스미드의 pUC19 플라스미드의 복제기점 영역, Thiloase 프로모터 영역, MCS 영역, pUB110 플라스미드의 복제기점과 복제단백질 암호화 부위를 증폭하여 수득하였다. 증폭하여 수득된 DNA 단편의 염기서열은 서열번호 14와 같다.
이 때 서열번호 11의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 pLK1-MCS 플라스미드를 주형으로 증폭하였다. 상기 pUC19 플라스미드의 복제기점 영역의 염기서열은 서열번호 9와 같고, pUB110 플라스미드의 복제기점의 염기서열은 서열번호 3과 같고 복제 단백질을 암호화 부위의 염기서열은 서열번호 4와 같고, 상기 복제단백질의 아미노산 서열은 서열번호 5와 같다. Thiolase 프로모터 영역의 염기서열은 서열번호 13과 같으며, 다중 클로닝 영역(MCS)의 염기서열은 서열번호 6과 같다.
이 때, PCR 반응 혼합물 50 ul는 dNTP 100 uM, 상기 프라이머들을 각각 10 p mol, 10x buffer 5 ul, DNA 주형 100 ng, pfu 폴리머라제 0.5 unit을 첨가하여 제조하였으며, 95℃에서 5분 동안 초기 변성 과정을 거친 다음 95℃에서 1분 동안 변성, 58℃에서 1분 동안 어닐링 및 72℃에서 3분 동안 중합과정을 30회 반복하였다. 증폭된 DNA 절편은 1% 아가로오즈 젤에서 정제하고 StuI/BamHI 제한효소로 DNA 단편을 절단하였다.
Figure 112017118272092-pat00006
Figure 112017118272092-pat00007
<2-2> 클로람페니콜 저항성 유전자 증폭
pGS1-MCS 플라스미드에 포함된 클로람페니콜 저항성 유전자를 증폭하여 수득하였다. 이 때 서열번호 15와 서열번호 16의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 PCR반응으로 증폭하고, BglII/XmaI 제한효소로 절단한 DNA 절편을 수득하였다. 증폭된 DNA 절편의 서열은 서열번호 17과 같다(표 4). 상기 pGS1-MCS 플라스미드는 pIM13 플라스미드의 복제기점과 복제단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 플라스미드로(J. Microbiol. Biotechnol. (2015), 25(10), 1702-1708, J. Microbiol. Biotechnol. (2016), 26(4), 725-729 등)며, 그 구조는 도 5와 같다. 그러나 본 발명에서는 클로람페니콜 저항성 유전자의 염기 서열을 수득하기 위하여 상기 pGS1-MCS 플라스미드를 사용한 것인 바, 서열번호 17의 염기 서열을 얻을 수 있다면 반드시 pGS1-MCS 플라스미드를 사용할 필요는 없으며, 적절한 다른 플라스미드들을 사용할 수도 있고, 또는 상기 서열을 합성하여 이용할 수도 있다.
Figure 112017118272092-pat00008
<2-3> pLK1-MCS 플라스미드 및 클로람페니콜 저항성 유전자 서열의 접합
상기 <2-1>에서 증폭된 DNA 절편과 상기 <2-2>에서 증폭된 클로람페티콜 유전자 부분을 T4 Ligase 효소를 이용하여 접합(ligation)하여 pCK2-temp 접합체를 제조하였다.
<2-4> Adc 유전자의 터미네이터의 삽입
바이오니아사로부터 화학적으로 합성한 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 아세토아세테이트 디카르복시라아제 (Acetoacetate decarboxylase) 유전자의 전사 종결 인자 (Adc terminator)를 포함하는 DNA 서열 (서열번호 18)을 수득하였다. 상기 DNA 서열(서열번호 18)를 EcoRI/PvuII 제한효소로 절단하고, 상기 <2-3>에서 제작된 pCK2-temp 접합체를 EcoRI/PvuII 제한효소로 절단하여 제조한 DNA 절편과 클로닝하여, 최종적으로 pCK2-MCS 셔틀 플라스미드를 제작하였다 (서열번호 19, 표 5, 도 3 내지 도 6). 상기 Adc 유전자의 터미네이터가 삽입됨으로써 셔틀 플라스미드가 미생물에 도입 시, 미생물 내에서 셔틀 플라스미드에 의하여 도입된 유전자의 발현이 정상적으로 일어나고, 단백질이 제대로 만들어지게 된다. 제조된 pCK2-MCS 셔틀 플라스미드는 2017년 5월 16일 한국생명공학연구원에 기탁하였다(수탁번호: KCTC13267BP).
Figure 112017118272092-pat00009
Figure 112017118272092-pat00010
<실험예 3> pCK2-MCS 셔틀 플라스미드 평가
상기 <실험예 2>에서 제조한 pCK2-MCS 셔틀 플라스미드의 특성을 평가하였다. 이 때 대조군으로는 pLK1-MCS 셔틀 플라스미드를 사용하였다.
<3-1> 플라스미드 크기 평가
pCK2-MCS 셔틀 플라스미드와 pLK1-MCS 셔틀 플라스미드의 크기를 비교하였다.
그 결과, pLK1-MCS 셔틀 플라스미드는 5014 bp였고, pCK2-MCS 셔틀 플라스미드는 3660 bp였다. 그러므로 pCK2-MCS 셔틀 플라스미드는 상당히 작은 크기를 갖는 것으로 확인되었다.
<3-2> 형질전환체의 제조
pCK2-MCS 셔틀 플라스미드의 형질전환체의 제조
먼저, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC 824 균주에 상기 pCK2-MCS 셔틀 플라스미드를 도입하여 형질전환된 재조합 미생물을 제작하였다. 구체적인 방법은 하기와 같다. 상기 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 미생물을 CGM(Clostridium Growth Media) 액체배지(0.75 g/L K2HPO4, 0.75 g/L KH2PO4, 0.7 g/L, MgSO4·7H2O, 0.017 g/L MnSO4·5H2O, 0.01 g/L, FeSO4·7H2O, 2 g/L (NH4)2SO4, 1 g/L NaCl, 2 g/L asparagine, 0.004 g/L p-aminobenzoic acid, 5 g/L, yeast extract, and 10 g/L glucose) 100ml에서 OD600=1.0이 될 때까지 혐기 조건에서 배양한 후 배양액을 얼음에서 10분 동안 방치 후 7000g로 10분 동안 4 ℃ 에서 배양세포를 원심 분리하였다. 세포 펠렛(pellet)을 완충용액으로 3회 씻은 다음 같은 완충용액 2ml에 현탁하여 형질전환용 세포를 제작한다. 이렇게 제작된 형질전환용 세포 500ul에 5.0ug 의 pCK2-MCS 셔틀 플라스미드를 첨가하여 Bio-Rad사의 Gene pulser II를 이용하여 전기천공(4mm cuvette, 2.5kV, 25uF)을 수행하고 클로람페니콜 항생제가 첨가된 배지에서 형질전환 균주를 확인하였다.
형질 전환을 위해 사용한 플라스미드들은 모두 전기천공 전에 pAN1 plasmid로 (GCNGC서열이 존재할 경우 내부 cytosine을 메틸화시키는 유전자를 가지고 있음)로 형질 전환된 대장균 TOP10 균주에서 메틸화되어 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 균주의 restriction system에 작용을 받지 않게 제작된 것들이다.
pLK1-MCS 셔틀 플라스미드의 형질전환체의 제조
pCK2-MCS 셔틀 플라스미드 대신 pLK1-MCS 셔틀 플라스미드를 도입한 것과 배지에 클로람페니콜이 아닌, 에리스로마이신 항생제가 첨가된 점을 제외하면, pCK2-MCS 셔틀 플라스미드의 형질전환체와 동일한 방법으로 pLK1-MCS 셔틀 플라스미드의 형질전환체를 제조하였다.
<3-3> 클로스트리디움 아세토부틸리쿰에서의 복제 안정성 평가
상기 <3-2>에서 제작된 pCK2-MCS 셔틀 플라스미드를 함유하고 있는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 균주를 대상으로 상기 셔틀 플라스미드 pCK2-MCS 플라스미드의 복제안정성 평가를 진행하였다. 평가방법은 기존에 보고된 것을 응용하였다(Shin MH, Jung MW, Lee J-H, Kim MD, Kim KH. 2008. Strategies for producing recombinant sucrose phosphorylase originating from Bifidobacterium longum in Escherichia coli JM109. Process Biochemistry 43:822-828).
먼저 상기 셔틀 플라스미드를 클로스트리드움 아세토부틸리쿰 ATCC 824 균주에 전기천공방법으로 도입하고 클로람페니콜 항생제가 포함된 고체 배지에서 혐기적 배양 조건에서 2일간 37 ℃에서 배양하였다. 그 후 콜로니 하나를 40ml CGM 액체배지를 포함하는 배양 tube에서 항생제 없이 37 ℃에서 세포농도가 1.0 (OD600nm)이 될 때까지 배양하였다. 이 때, 세포 농도는 스펙트로포토메터를 (Hach, USA) 이용하여 측정하였다.
배양된 세포는 희석 후 항생제가 없는 고체 CGM 배지에 도말 후 36시간 동안 37 ℃에서 배양하고 그 후 형성되는 콜로니의 수를 확인하였다. 그 후 형성된 콜로니 50개를 클로람페니콜 항생제가 포함된 CGM고체 배지로 replica plating하여 셔틀 플라스미드가 유실된 세포의 수를 확인하였다. 셔틀 플라스미드가 유실되었을 경우 클로람페니콜 항생제 저항성이 없으므로 replica plating시 콜로니를 형성 할 수 없다.
또한 초기 액체 배양액 40 uL를 다시 항생제가 없는 40ml CGM 액체에 접종(초기 배양액 농도의 1/1000이 되게 희석)하여 동일한 상기 기술한 방법으로 10회 반복하여, 셔틀플라스미드가 유실된 세포의 수를 확인하여, 100 세대 동안의 셔틀 플라스미드의 유실안정성을 평가하였다. 매 회마다 세포농도가 1000배 희석된 상태로 접종되기 때문에 각 세대를 10회 분열된 것으로 가정하였다. ( 210-1024).
그 결과, pCK2-MCS 플라스미드는 기존에 대장균-클로스트리디움 셔틀 플라스미드로 사용되고 있는 pMTL500E (pAMβ1 복제기점 및 복제단백질을 암호화하는 염기서열을 포함), pGS1-MCS 셔틀 플라스미드는 물론, pLK1-MCS 셔틀 플라스미드보다 복제 안정성이 우수하고 유실 안정성 또한 개선된 것으로 확인되었다(표 6).
Figure 112017118272092-pat00011
<3-4> 대장균에서의 복제 안정성 평가
상기 셔틀 플라스미드 pCK2-MCS가 안정적으로 복제 가능함은 이미 실험예 <3-2>에서 상기 셔틀 플라스미드 pCK2-MCS를 메틸화 하기위해 pAN1 플라스미드를 함유하고 있는 대장균 TOP10에 형질전환 후 메틸화된 pCK2-MCS를 수득하면서 충분히 확인하였다(표 7).
Figure 112017118272092-pat00012
<3-5> 복제 편의성
pLK1-MCS 셔틀 플라스미드의 경우 대장균에서 발현되어 대장균에서 선택표지가 가능한 제1항생제 저항성 유전자 및 클로스트리디움에서 발현되어 클로스트리디움에서 선택표지가 가능한 제2항생제 저항성 유전자를 포함한다. 만약 셔틀 플라스미드의 크기를 감소시키기 위하여 상기 항생제 저항성 유전자들 중 어느 하나를 제거할 경우, 클로스트리디움과 대장균 모두에 적용하기 어렵다.
반면, 본 발명의 pCK2-MCS 셔틀 플라스미드의 경우 대장균 및 클로스트리디움 모두에서 발현되어 선택표지가 가능한 항생제 저항성 유전자를 사용한다. 그러므로 플라스미드의 크기가 작을 뿐 아니라, 클로스트리디움과 대장균 모두에 적용하는 것이 가능하다.
그러므로 pCK2-MCS 셔틀 플라스미드의 복제 편의성이 더 높은 것으로 판단되었다. 또한 pCK2-MCS 셔틀 플라스미드는 pLK1-MCS 셔틀 플라스미드와 복제기점이 pUC19 플라스미드의 복제기점 영역으로 동일하므로, pCK2-MCS 셔틀 플라스미드와 pLK1-MCS 셔틀 플라스미드를 함께 형질전환 시 같은 정도로 발현이 되는 장점이 있다.
<실험예 4> 재조합 균주의 제조
<4-1> 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 TM2-1-C의 준비
본 발명에서는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 TM2-1-C(기탁번호 KCTC 12604BP)를 사용하였다. 이는 Clostridium acetobutylicum ATCC824 △pta △buk에 메틸-N-니트로-N-니트로소구아니딘(Methyl-N-Nitro-N-nitrosoguanidine, NTG)를 처리하여 무작위 돌연변이를 유발한 균주로, 글루코스와 자일로스에 대하여 동시발효 성능을 갖는다.
참고로, 상기 Clostridium acetobutylicum ATCC824 △pta △buk는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824 야생균주를 이용하여 WO2011/037415에 기재된 방법으로 제작한 재조합 균주이다. 이것은 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824 야생균주에서 인산-아세테이트 전달 효소(phosphotransacetylase)를 발현하는 유전자인 pta와 부티레이트 인산화효소(butyrate kinase)를 발현하는 유전자인 buk가 동시에 결실된 재조합 미생물이다.
<4-2> 재조합 균주 TM-pLK1-AdhE1-CtfAB의 제조
플라스미드 벡터 pLK1-AdhE1-CtfAB의 제조
상기 pLK1-MCS 플라스미드 벡터에 AdhE1, CtfA 및 CtfB 3가지 유전자를 클로닝하여, 인위적 오페론이 포함된 플라스미드 벡터 pLK1-AdhE1-CtfAB을 제조하였다.
구체적인 제조 방법은 하기와 같다. 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 AdhE1 유전자 (서열번호 20)를 프라이머 쌍(서열번호 21 및 22)을 이용하여 PCR을 이용하여 증폭시키고, 증폭된 단편과 pLK1-MCS 셔틀 플라스미드를 PmeI/XhoI으로 cutting 및 ligation하여 pLK1-AdhE1을 제작하였다(표 8).
Figure 112017118272092-pat00013
Figure 112017118272092-pat00014
그 후 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 Thiolase promoter (서열번호 23) 를 프라이머 쌍 (서열번호 24 및 25)를 이용하여 PCR 반응으로 증폭시키고, 증폭된 단편과 상기 pLK1-AdhE1을 XhoI/BglII로 cutting, ligation하여 pLK1-AdhE1-pThl-MCS를 제작하였다.
이 후 CtfAB 유전자군 (서열번호 26)을 프라이머 쌍(서열번호 27 및 28)를 이용해 PCR 반응으로 증폭시키고, 증폭된 단편과 상기 pLK1-AdhE1-pThl-MCS를 BglII/EcoRI으로 cutting, ligation하여 최종적으로 플라스미드 벡터 pLK1-AdhE1-CtfAB를 제작하였다(표 9).
Figure 112017118272092-pat00015
재조합 균주 TM-pLK1-AdhE1-CtfAB의 제조
클로스트리디움 아세토부틸리쿰 TM2-1-C에 상기 플라스미드 벡터 pLK1-AdhE1-CtfAB를 도입하였다. 이는 상기 <3-2>의 형질전환 방법과 동일한 방법을 이용하였다. 이로써, AdhE1, CtfA 및 CtfB 유전자들이 도입된 재조합 균주 TM-pLK1-AdhE1-CtfAB이 제조되었다.
<4-3> 재조합 균주 TM-pLK1-AdhE1-CtfAB+pCK2-XylBA의 제조
플라스미드 벡터 pCK2-XylBA의 제조
pCK2-MCS 플라스미드 벡터에 Xylose 대사 효소인 Xylose kinase를 코드하는 유전자 XylB 및 Xylulose isomerase 를 코드하는 유전자인 XylA를 포함하는 native 오페론 부분을 클로닝하여, XylBA 오페론이 포함된 플라스미드 벡터 pCK2-XylBA를 제조하였다. 구체적인 제조 방법은 하기와 같다. 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 Xylose kinase와 Xylulose isomerase의 유전자들이 포함된 오페론(서열번호 29)을 프라이머 (서열번호 30 및 31)를 이용해 PCR 반응으로 증폭시키고, 증폭된 단편과 pCK2-MCS를 PstI/NotI으로 cutting, ligation하여 pCK2-XylBA를 제작하였다. 이렇게 제조된 플라스미드 벡터 pCK2-XylBA는 TM2-1-C 균주에 형질전환하지 않고, pLK1-AdhE1-CtfAB를 도입한 TM-pLK1-AdhE1-CtfAB 균주에 연속적으로 형질전환하였다(표 10).
Figure 112017118272092-pat00016
Figure 112017118272092-pat00017
재조합 균주 TM-pLK1-AdhE1-CtfAB+pCK2-XylBA의 제조
상기 <4-2>에서 제조한 재조합 균주 TM-pLK1-AdhE1-CtfAB에 상기 플라스미드 벡터 pCK2-XylBA를 도입하였다. 이로써, XylB 및 XylA 유전자들이 도입된 재조합 균주 TM-pLK1-AdhE1-CtfAB+pCK2-XylBA 이 제조되었다. 상기재조합 균주 TM-pLK1-AdhE1-CtfAB+pCK2-XylBA (Clostridium sp. XyloMax1)는 2017년 5월 16일 한국생명공학연구원에 기탁되었다(수탁번호: KCTC13268BP).
<4-4> 재조합 균주 TM-pLK1-AdhE1-CtfAB+pCK2-XylBA의 제조
재조합 균주 TM-pCK2-XylBA의 제조
상기 <4-3>에서 제조한 플라스미드 벡터 pCK2-XylBA를 상기 <3-2>의 형질전환 방법으로 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 TM2-1-C 균주에 먼저 도입하여 TM-pCK2-XylBA 재조합 균주를 먼저 제조하였다.
재조합 균주 TM-pLK1-AdhE1-CtfAB+pCK2-XylBA의 제조
상기에서 제조한 재조합 균주 TM-pCK2-XylBA에 플라스미드 벡터 pLK1-AdhE1-CtfAB를 도입하였다. 이때, 상기 <4-2>의 재조합 균주 TM-pLK1-AdhE1-CtfAB의 제조에서와 동일한 방법으로 도입하였다. 이로써, 상기 <4-3>과 같은 재조합 균주 TM-pLK1-AdhE1-CtfAB+pCK2-XylBA를 제조하였다.
즉, 플라스미드 벡터 pLK1-AdhE1-CtfAB를 도입한 후 플라스미드 벡터 pCK2-XylBA를 도입한 <4-3>과 달리, <4-4>에서는 플라스미드 벡터 pCK2-XylBA를 도입한 후, 플라스미드 벡터 pLK1-AdhE1-CtfAB를 도입하여, 동일한 재조합 균주를 제조하였다.
<4-5> 재조합 균주 TM-pLK1-AdhE1-CtfAB+pCK2-XylBA의 제조
서로 다른 플라스미드 벡터를 각각 순차적으로 도입한 <4-3> 및 <4-4>와 달리, TM2-1-C 균주에 두 가지 플라스미드 벡터를 동시에 삽입하는 방법을 이용하였다. 형질전환용 세포 500ul에 5.0ug의 pLK1-AdhE1-CtfAB 플라스미드 벡터 및 pCK2-XylBA 플라스미드 벡터를 첨가하여 전기천공을 수행하고, 에리스로마이신 항생제와 클로람페니콜 항생제가 모두 첨가된 배지에서 형질전환 균주를 확인하였다. 이 ? 형질전환 방법은 상기 <3-2>의 형질전환 방법과 동일하다.
<실험예 5> 회분식 배양에 의한 바이오 부탄올의 생산
회분식 배양을 통하여, 재조합 미생물들에 따른 부탄올 생성능을 시험하였다.재조합 미생물들로는 상기 실험예 <4-2>에서 제조한 재조합 균주 TM-pLK1-AdhE1-CtfAB, 상기 실험예 <4-3>에서 제조한 재조합 균주 TM-pLK1-AdhE1-CtfAB+pCK2-XylBA을 사용하였으며, 대조군으로는 야생형인 C. 아세토부틸리쿰 ATCC824를 사용하였다.
상기 미생물들을 각각 CGM 고체배지에 도말하여 37℃에서 밤새 혐기 배양하였다. 배양된 콜로니 각각 1개를 CCM 40ml이 포함된 50ml 일회용 튜브(Falcon, USA)에 접종하고, 37 ℃에서 정치하며 OD600=1이 될 때까지 혐기 배양하였다. 배양된 종균을 다시 400ml 6% glucose를 포함하는 CGM 액체배지에 접종하고 37℃에서 정치하며 OD600=1가 될 때까지 혐기 배양하여 8% glucose가 첨가된 CGM 액체배지 1.6L가 포함된 발효조에 접종하여 배양을 시작하였다. pH는 수산화암모늄(NH4OH)를 이용하여 혐기 배양 중 5.0을 유지하였고 질소를 20ml/min 속도로 주입하면서 혐기조건을 유지하였다. Glucose배양 시작 후 3시간 마다 생성되는 부탄올 및 혼합용매의 농도를 분석하였다. 부탄올 및 혼합용매의 분석은 가스 크로마토그래피(Agilent, USA)를 이용하였으며 분석 조건은 하기 표 8과 같다. 당과 유기산의 농도는 배양액을 원심 분리한 후, 상등액을 수득하고, HPLC, 당분석기를 이용해 확인하였다. HPLC 조건은 이동상으로 0.01N 황산을 함유한 물을 이용하였으며 유속은 0.6ml/min이었다. 칼럼은 Aminex87H 및 Aminex87P(Bio-Rad, USA)을 이용하였으며, 생성되는 당과 유기산은 RI(Reflective Index) detector를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 재조합 균주 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 TM-pLK1-AdhE1-CtfAB+pCK2-XylBA는 오탄당 함량이 높은 당 조건에서 부탄올의 생산성 및 선택도가 높고, 오탄당 이용률 또한 높은 것으로 확인되었다(표 11).
Figure 112017118272092-pat00018
유가식 배양을 통하여, 재조합 미생물들에 따른 부탄올 생성능을 시험하였다.재조합 미생물들로는 상기 실험예 <4-2>에서 제조한 재조합 균주 TM-pLK1-AdhE1-CtfAB, 상기 실험예 <4-3>에서 제조한 재조합 균주 TM-pLK1-AdhE1-CtfAB+pCK2-XylBA을 사용하였으며, 대조군으로는 야생형인 C. 아세토부틸리쿰 ATCC824를 사용하였다.
상기 미생물들을 각각 CGM 고체배지에 도말하여 37 ℃에서 밤새 혐기 배양하였다. 배양된 콜로니들을 각각 1개씩 CCM 40ml이 포함된 50ml 일회용 튜브(Falcon, USA)에 접종하고, 37℃에서 정치하며 OD600=1이 될 때까지 혐기 배양하였다. 배양된 종균을 다시 400ml 6% 글루코스를 포함하는 CGM 액체배지에 접종하고 37℃에서 정치하며 OD600=1가 될 때까지 혐기 배양하여 8% 글루코스와 부탄올을 선택적으로 흡착하는 흡착제 200g을 첨가된 CGM 액체배지 1.6L가 포함된 발효조에 접종하여 배양을 시작하였다. pH는 수산화암모늄(NH4OH)를 이용하여 혐기 배양 중 5.0을 유지하였고 질소를 20ml/min 속도로 주입하면서 혐기조건을 유지하였다. 글루코스 배양 시작 후 3시간 마다 생성되는 부탄올 및 혼합용매의 농도를 분석하였다. 배양액 내 글루코스 농도는 10g/L이상을 유지하기 위해 700g/L Glucose용액을 feeding 용액으로 이용하였다.
연속배양을 통해 부탄올을 고수율, 고생산성 및 고선택도로 생산하기 위해서는 배양 시간 동안 에탄올이 균주에 독성을 야기하지 않도록 에탄올 농도를 낮게 유지하는 것이 매우 중요하다. 유가식 배양 결과를 볼 때, 재조합 균주 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 TM-pLK1-AdhE1-CtfAB+pCK2-XylBA은 에탄올 선택도가 낮게 유지되면서 부탄올 생산 균주로서의 성능은 높게 유지되는 것으로 확인되었는바, 이들이 장기 연속 배양에 적합할 것으로 예상되었다(표 12).
Figure 112017118272092-pat00019
<실험예 7> 연속배양방법을 이용한 바이오 부탄올의 생산
연속 배양을 통하여, 재조합 미생물들에 따른 부탄올 생성능을 시험하였다.재조합 미생물들로는 상기 실험예 <4-2>에서 제조한 재조합 균주 TM-pLK1-AdhE1-CtfAB, 상기 실험예 <4-3>에서 제조한 재조합 균주 TM-pLK1-AdhE1-CtfAB+pCK2-XylBA을 사용하였으며, 대조군으로는 야생형인 C. 아세토부틸리쿰 ATCC824를 사용하였다.
먼저 연속 공정을 위한 배양기를 특허출원 제 10-2012-0038770 호를 바탕으로 제작하였다. 먼저 3L의 부피를 가지는 칼럼에 위 아래로 흡착제가 용출돼 유실되는 것을 방지하고자 약 150um 정도의 필터를 장착한 후에 교반기를 장착하고 흡착제 200g을 충진하여 칼럼 2 개를 완성하고 이를 배양기에 실리콘 튜브를 이용하여 연결하고 펌프를 장착하여 배양액이 각 칼럼 간을 순환하도록 장착하였다. 칼럼의 inlet과 outlet은 4-way밸브를 장착하여 배양 과정에서 칼럼내의 흡착제가 부탄올 및 혼합용매로 포화될 때 용출용 용매를 흘려 실시간으로 탈착할 수 있도록 하였다. 첫 번째 칼럼을 탈착시킬 경우, 이때 배양액을 두 번째 칼럼으로 순환시켜, 배양액의 흐름이 연속적으로 이루어질 수 있도록 하였다. 배양액의 순환 방향은 칼럼의 위쪽에서 아래로 순환하였으나 그 방향은 문제가 되지 않는다. 제작한 배양기로 미생물들을 배양하였다. 먼저 3.2L의 CGM 액체배지가 포함된 반응기에 밤새 CGM액체배지에서 혐기 배양한 800ml 종균을 접종하면서 배양을 시작하였다. 본 실험예에서는 일반 배치 발효로 종균을 배양하였다. 배양 시작 후 부탄올 농도가 약 7~8g/L가 되면 배양액을 펌프를 통해 유속을 50ml/min 속도로 칼럼을 통과시키며 배양액을 순환시켰다. 칼럼으로 배양액이 통과하면서 흡착제가 배양액에 현탁되어 묽은 슬러리상을 형성하면서 배양액의 흐름이 cell flock에 의해 막히지 않고 칼럼을 통과하였으며 칼럼 통과직전과 통과직후의 배양액 배양액 시료를 채취하여 부탄올 농도가 8g/L 이하게 되게 유지하였다.
그 결과, 재조합 균주 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 TM-pLK1-AdhE1-CtfAB+pCK2-XylBA는 오탄당 함량이 높은 EFB(Empty fruit Bunch) 당화액을 이용 시 부탄올의 생산성 및 선택도가 높고, 오탄당 이용률 또한 높은 것으로 확인되었다. 이는 EFB 당화액의 당 농도 및 조성을 모사한 EFB 모사액을 이용한 시험 및 실제 EFB 당화액을 이용한 시험 모두에서 동일하게 나타났다 (표 13 및 표 14).
Figure 112017118272092-pat00020
EFB 모사액 이용 (85시간 발효결과)
Figure 112017118272092-pat00021
EFB 당화액 이용 (95시간 발효결과)
<서열목록 설명>
서열번호 1은 pUB110 플라스미드의 복제기점과 복제단백질 암호화 부위를 증폭하기 위한 프라이머의 서열이다.
서열번호 2는 pUB110 플라스미드의 복제기점과 복제단백질 암호화 부위를 증폭하기 위한 프라이머의 서열이다.
서열번호 3은 pUB110 플라스미드의 복제기점의 염기서열이다.
서열번호 4는 복제 단백질(RepA)을 암호화 하는 염기서열이다.
서열번호 5는 복제 단백질(RepA)의 아미노산 서열이다.
서열번호 6은 프로모터(promoter) 및 다중 클로닝 영역(multiple cloning site)을 포함하는 DNA의 서열이다.
서열번호 7은 에리스로마이신 저항성 유전자의 염기 서열이다.
서열번호 8은 앰피실린 저항성 유전자의 염기 서열이다.
서열번호 9는 pUC19 플라스미드의 복제기점의 염기 서열이다.
서열번호 10은 플라스미드 pLK1-MCS의 염기서열이다.
서열번호 11은 pLK1-MCS 플라스미드의 pUC19 플라스미드의 복제기점 영역 등의 증폭 시 사용한 프라이머 서열이다.
서열번호 12는 pLK1-MCS 플라스미드의 pUC19 플라스미드의 복제기점 영역 등의 증폭 시 사용한 프라이머 서열이다.
서열번호 13은 Thiolase 프로모터 영역의 염기서열이다.
서열번호 14는 pLK1-MCS 플라스미드의 pUC19 플라스미드의 복제기점 영역, Thiloase 프로모터 영역, MCS 영역, pUB110 플라스미드의 복제기점과 복제단백질 암호화 부위를 증폭한 DNA 단편의 염기서열이다.
서열번호 15는 pGS1-MCS 플라스미드에 포함된 클로람페니콜 저항성 유전자를 증폭할 때 사용한 프라이머의 서열이다.
서열번호 16은 pGS1-MCS 플라스미드에 포함된 클로람페니콜 저항성 유전자를 증폭할 때 사용한 프라이머의 서열이다.
서열번호 17은 pGS1-MCS 플라스미드에 포함된 클로람페니콜 저항성 유전자를 증폭한 DNA 단편의 염기 서열이다.
서열번호 18은 아세토아세테이트 디카르복시라아제 유전자의 전사 종결 인자를 포함하는 DNA 서열이다.
서열번호 19는 pCK2-MCS 셔틀 플라스미드의 염기서열이다.
서열번호 20은 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 AdhE1 유전자의 염기서열이다.
서열번호 21은 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 AdhE1 유전자를 증폭할 때 사용한 프라이머의 서열이다.
서열번호 22는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 AdhE1 유전자를 증폭할 때 사용한 프라이머의 서열이다.
서열번호 23은 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 Thiolase promoter의 서열이다.
서열번호 24는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 Thiolase promoter의 서열을 증폭할 때 사용한 프라이머의 서열이다.
서열번호 25는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 Thiolase promoter의 서열을 증폭할 때 사용한 프라이머의 서열이다.
서열번호 26은 CtfAB 유전자군의 염기서열이다.
서열번호 27은 CtfAB 유전자군을 증폭할 때 사용한 프라이머의 서열이다.
서열번호 28은 CtfAB 유전자군을 증폭할 때 사용한 프라이머의 서열이다.
서열번호 29는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 Xylose kinase와 Xylulose isomerase의 유전자들이 포함된 오페론의 염기 서열이다.
서열번호 30은 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 Xylose kinase와 Xylulose isomerase의 유전자들이 포함된 오페론을 증폭할 때 사용한 프라이머의 서열이다.
서열번호 31은 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 Xylose kinase와 Xylulose isomerase의 유전자들이 포함된 오페론을 증폭할 때 사용한 프라이머의 서열이다.
한국생명공학연구원 KCTC12604BP 20140610 한국생명공학연구원 KCTC12755BP 20150204 한국생명공학연구원 KCTC13268BP 20170516 한국생명공학연구원 KCTC13267BP 20170516
<110> GS CALTEX <120> SHUTTLE PLASMID REPLICABLE IN CLOSTRIDIUM AND ESCHERICHIA COLI, AND RECOMBINANT MICROORGANISM HAVING ENHANCED PENTOSE METABOLISM AND FERMENTATION PERFORMANCE PREPARED USING THE SAME <130> DNP170014 <160> 31 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a primer for amplifying coding region of RepA and replication origin of pUB110 <400> 1 atagagctca cgaagtcgag atcagggaat gag 33 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a primer for amplifying coding region of RepA and replication origin of pUB110 <400> 2 gcgagatctc tcgtcttcct aagcatcctt caatcc 36 <210> 3 <211> 178 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence coding for replication origin of pUB110 <400> 3 cttgttcttt cttatcttga tacatataga aataacgtca tttttatttt agttgctgaa 60 aggtgcgttg aagtgttggt atgtatgtgt tttaaagtat tgaaaaccct taaaattggt 120 tgcacagaaa aaccccatct gttaaagtta taagtgacta aacaaataac taaataga 178 <210> 4 <211> 1005 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cgatgatgaa 780 gaaaagaatt tgaaacgttt gtctgatttg gaggaaggtt tacaccgtaa aaggttaatc 840 tcctatggtg gtttgttaaa agaaatacat aaaaaattaa accttgatga cacagaagaa 900 ggcgatttga ttcatacaga tgatgacgaa aaagccgatg aagatggatt ttctattatt 960 gcaatgtgga attgggaacg gaaaaattat tttattaaag agtag 1005 <210> 5 <211> 333 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence coding for RepA <400> 5 Gly Val Ser Phe Asn Ile Met Cys Pro Asn Ser Ser Ile Tyr Ser Asp 1 5 10 15 Glu Lys Ser Arg Val Leu Val Asp Lys Thr Lys Ser Gly Lys Val Arg 20 25 30 Pro Trp Arg Glu Lys Lys Ile Ala Asn Val Asp Tyr Phe Glu Leu Leu 35 40 45 His Ile Leu Glu Phe Lys Lys Ala Glu Arg Val Lys Asp Cys Ala Glu 50 55 60 Ile Leu Glu Tyr Lys Gln Asn Arg Glu Thr Gly Glu Arg Lys Leu Tyr 65 70 75 80 Arg Val Trp Phe Cys Lys Ser Arg Leu Cys Pro Met Cys Asn Trp Arg 85 90 95 Arg Ala Met Lys His Gly Ile Gln Ser Gln Lys Val Val Ala Glu Val 100 105 110 Ile Lys Gln Lys Pro Thr Val Arg Trp Leu Phe Leu Thr Leu Thr Val 115 120 125 Lys Asn Val Tyr 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taacgtctat tgaattagac 180 agtcatctat tcaacttatc gtcagaaaaa ttaaaactga atactcgtgt cactttaatt 240 caccaagata ttctacagtt tcaattccct aacaaacaga ggtataaaat tgttgggagt 300 attccttacc atttaagcac acaaattatt aaaaaagtgg tttttgaaag ccatgcgtct 360 gacatctatc tgattgttga agaaggattc tacaagcgta ccttggatat tcaccgaaca 420 ctagggttgc tcttgcacac tcaagtctcg attcagcaat tgcttaagct gccagcggaa 480 tgctttcatc ctaaaccaaa agtaaacagt gtcttaataa aacttacccg ccataccaca 540 gatgttccag ataaatattg gaagctatat acgtactttg tttcaaaatg ggtcaatcga 600 gaatatcgtc aactgtttac taaaaatcag tttcatcaag caatgaaaca cgccaaagta 660 aacaatttaa gtaccgttac ttatgagcaa gtattgtcta tttttaatag ttatctatta 720 tttaacggga ggaaataa 738 <210> 8 <211> 861 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of ampicillin resistance gene <400> 8 atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 60 gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 120 cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 180 gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 240 cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg 300 gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 360 tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc 420 ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt 480 gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg 540 cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct 600 tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc 660 tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct 720 cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac 780 acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc 840 tcactgatta agcattggta a 861 <210> 9 <211> 615 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of replication origin of pUC19 plasmid <400> 9 tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 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gtttatctgt taccccgtat caaaatttag gaggttagtt taaacctgca gagatctctc 240 gaggcggccg cgtcgactct agacccggga attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg 300 actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca 360 gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga 420 atggcgaatg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc 480 gagctcacga agtcgagatc agggaatgag tttataaaat aaaaaaagca cctgaaaagg 540 tgtctttttt tgatggtttt gaacttgttc tttcttatct tgatacatat agaaataacg 600 tcatttttat tttagttgct gaaaggtgcg ttgaagtgtt ggtatgtatg tgttttaaag 660 tattgaaaac ccttaaaatt ggttgcacag aaaaacccca tctgttaaag ttataagtga 720 ctaaacaaat aactaaatag atgggggttt cttttaatat tatgtgtcct aatagtagca 780 tttattcaga tgaaaaatca agggttttag tggacaagac aaaaagtgga aaagtgagac 840 catggagaga aaagaaaatc gctaatgttg attactttga acttctgcat attcttgaat 900 ttaaaaaggc tgaaagagta aaagattgtg ctgaaatatt agagtataaa caaaatcgtg 960 aaacaggcga aagaaagttg tatcgagtgt ggttttgtaa atccaggctt tgtccaatgt 1020 gcaactggag gagagcaatg aaacatggca ttcagtcaca aaaggttgtt gctgaagtta 1080 ttaaacaaaa gccaacagtt cgttggttgt ttctcacatt aacagttaaa aatgtttatg 1140 atggcgaaga attaaataag agtttgtcag atatggctca aggatttcgc cgaatgatgc 1200 aatataaaaa aattaataaa aatcttgttg gttttatgcg tgcaacggaa gtgacaataa 1260 ataataaaga taattcttat aatcagcaca tgcatgtatt ggtatgtgtg gaaccaactt 1320 attttaagaa tacagaaaac tacgtgaatc aaaaacaatg gattcaattt tggaaaaagg 1380 caatgaaatt agactatgat ccaaatgtaa aagttcaaat gattcgaccg aaaaataaat 1440 ataaatcgga tatacaatcg gcaattgacg aaactgcaaa atatcctgta aaggatacgg 1500 attttatgac cgatgatgaa gaaaagaatt tgaaacgttt gtctgatttg gaggaaggtt 1560 tacaccgtaa aaggttaatc tcctatggtg gtttgttaaa agaaatacat aaaaaattaa 1620 accttgatga cacagaagaa ggcgatttga ttcatacaga tgatgacgaa aaagccgatg 1680 aagatggatt ttctattatt gcaatgtgga attgggaacg gaaaaattat tttattaaag 1740 agtagttcaa caaacgggcc agtttgttga agattagatg ctataattgt tattaaaagg 1800 attgaaggat gcttaggaag acgagagatc ctagcagcac gccatagtga ctggcgatgc 1860 tgtcggaatg 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agttttgaga atattttata tttttgttca tgtaatcact ccttcttaat 2760 tacaaatttt tagcatctaa tttaacttca attcctatta tacaaaattt taagatactg 2820 cactatcaac acactcttaa gtttgcttct aagtcttatt tccataactt cttttacgtt 2880 tccgccattc tttgctgttt cgatttttat gatatggtgc aagtcagcac gaacacgaac 2940 cgtcttatct cccattatat ctttttttgc actgattggt gtatcatttc gtttttcttt 3000 ttatcccgca agaggcccgg cagtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc 3060 ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct 3120 gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg 3180 cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg 3240 tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc 3300 tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca 3360 cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac 3420 tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa 3480 agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg 3540 ataacactgc 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ggaacggaaa aattatttta ttaaagagta gttcaacaaa 1020 cgggccagtt tgttgaagat tagatgctat aattgttatt aaaaggattg aaggatgctt 1080 aggaagacga gagatcctag cagcacgcca tagtgactgg cgatgctgtc ggaatggacg 1140 atcaaattcc ccgtaggcgc tagggacctc tttagctcct tggaagctgt cagtagtata 1200 cctaataatt tatctacatt ccctttagta acgtgtaact ttccaaattt acaaaagcga 1260 ctcatagaat tatttcctcc cgttaaataa tagataacta ttaaaaatag acaatacttg 1320 ctcataagta acggtactta aattgtttac tttggcgtgt ttcattgctt gatgaaactg 1380 atttttagta aacagttgac gatattctcg attgacccat tttgaaacaa agtacgtata 1440 tagcttccaa tatttatctg gaacatctgt ggtatggcgg gtaagtttta ttaagacact 1500 gtttactttt ggtttaggat gaaagcattc cgctggcagc ttaagcaatt gctgaatcga 1560 gacttgagtg tgcaagagca accctagtgt tcggtgaata tccaaggtac gcttgtagaa 1620 tccttcttca acaatcagat agatgtcaga cgcatggctt tcaaaaacca cttttttaat 1680 aatttgtgtg cttaaatggt aaggaatact cccaacaatt ttatacctct gtttgttagg 1740 gaattgaaac tgtagaatat cttggtgaat taaagtgaca cgagtattca gttttaattt 1800 ttctgacgat aagttgaata gatgactgtc taattcaata gacgttacct gtttacttat 1860 tttagccagt ttcgtcgtta aatgcccttt acctgttcca atttcgtaaa cggtatcggt 1920 ttcttttaaa ttcaattgtt ttattatttg gttgagtact ttttcactcg ttaaaaagtt 1980 ttgagaatat tttatatttt tgttcatgta atcactcctt cttaattaca aatttttagc 2040 atctaattta acttcaattc ctattataca aaattttaag atactgcact atcaacacac 2100 tcttaagttt gcttctaagt cttatttcca taacttcttt tacgtttccg ccattctttg 2160 ctgtttcgat ttttatgata tggtgcaagt cagcacgaac acgaaccgtc ttatctccca 2220 ttatatcttt ttttgcactg attggtgtat catttcgttt ttctttttat cccgcaagag 2280 gcccggcagt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt 2340 ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa 2400 taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt 2460 tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat 2520 gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag 2580 atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg 2640 ctatgtggcg cggtattatc 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amplication of chloramphenicol resistance gene comprised in pGS1-MCS plasmid <400> 16 atacccgggc agctctaggc aatattatat ctgcaa 36 <210> 17 <211> 902 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of DNA fragment amplifying chloramphenicol resistance gene comprised in pGS1-MCS plasmid <400> 17 agatctcgac tttttaacaa aatatattga taaaaataat aatagtgggt ataattaagt 60 tgttagagaa aacgtataaa ttagggataa actatggaac ttatgaaata gattgaaatg 120 gtttatctgt taccccgtag gatccacttg aatttaaaag gagggaactt agatggtatt 180 tgaaaaaatt gataaaaata gttggaacag aaaagagtat tttgaccact actttgcaag 240 tgtaccttgt acatacagca tgaccgttaa agtggatatc acacaaataa aggaaaaggg 300 aatgaaacta tatcctgcaa tgctttatta tattgcaatg attgtaaacc gccattcaga 360 gtttaggacg gcaatcaatc aagatggtga attggggata tatgatgaga tgataccaag 420 ctatacaata tttcacaatg atactgaaac attttccagc ctttggactg agtgtaagtc 480 tgactttaaa tcatttttag cagattatga aagtgatacg caacggtatg gaaacaatca 540 tagaatggaa ggaaagccaa atgctccgga aaacattttt aatgtatcta tgataccgtg 600 gtcaaccttc gatggcttta atctgaattt gcagaaagga tatgattatt tgattcctat 660 ttttactatg gggaaatatt ataaagaaga taacagaatt atactccctt tggcaattca 720 agttcatcac gcagtatgtg acggatttca catttgccgt tttgtaaacg aattgcagga 780 attgataaat agttaacttc aggtttgtct gtaactggcg ccacttaatg atttgccagt 840 aaaagagatt gtttctagct ctcacattct tgcagatata atattgccta gagctgcccg 900 gg 902 <210> 18 <211> 146 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence comprising trascription termination factor of acetoacetate decarboxylase gene <400> 18 gaattctaaa aataagagtt accttaaatg gtaactctta tttttttaat attgttactg 60 gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt 120 gcagcacatc cccctttcgc cagctg 146 <210> 19 <211> 3660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of pCK2-MCS shuttle plasmid <400> 19 catgatttta agggggttag cagatgcata agtttaattt ttttgttaaa aaatattaaa 60 ctttgtgttt tttttaacaa aatatattga taaaaataat aatagtgggt ataattaagt 120 tgttagagaa aacgtataaa ttagggataa actatggaac ttatgaaata gattgaaatg 180 gtttatctgt taccccgtat caaaatttag gaggttagtt taaacctgca gagatctctc 240 gaggcggccg cgtcgactct agacccggga attctaaaaa taagagttac cttaaatggt 300 aactcttatt tttttaatat tgttactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa 360 ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa 420 tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg 480 gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gagctcacga 540 agtcgagatc agggaatgag tttataaaat aaaaaaagca cctgaaaagg tgtctttttt 600 tgatggtttt gaacttgttc tttcttatct tgatacatat agaaataacg tcatttttat 660 tttagttgct gaaaggtgcg ttgaagtgtt ggtatgtatg tgttttaaag tattgaaaac 720 ccttaaaatt ggttgcacag aaaaacccca tctgttaaag ttataagtga ctaaacaaat 780 aactaaatag atgggggttt cttttaatat tatgtgtcct aatagtagca tttattcaga 840 tgaaaaatca agggttttag tggacaagac aaaaagtgga aaagtgagac catggagaga 900 aaagaaaatc gctaatgttg attactttga acttctgcat attcttgaat ttaaaaaggc 960 tgaaagagta aaagattgtg ctgaaatatt 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cctcactagt taaatctgct 600 tattcttccg gaaaaccagc aataggtgtt ggtccgggta acaccccagt aataattgat 660 gaatctgctc atataaaaat ggcagtaagt tcaattatat tatccaaaac ctatgataat 720 ggtgttatat gtgcttctga acaatctgta atagtcttaa aatccatata taacaaggta 780 aaagatgagt tccaagaaag aggagcttat ataataaaga aaaacgaatt ggataaagtc 840 cgtgaagtga tttttaaaga tggatccgta aaccctaaaa tagtcggaca gtcagcttat 900 actatagcag ctatggctgg cataaaagta cctaaaacca caagaatatt aataggagaa 960 gttacctcct taggtgaaga agaacctttt gcccacgaaa aactatctcc tgttttggct 1020 atgtatgagg ctgacaattt tgatgatgct ttaaaaaaag cagtaactct aataaactta 1080 ggaggcctcg gccatacctc aggaatatat gcagatgaaa taaaagcacg agataaaata 1140 gatagattta gtagtgccat gaaaaccgta agaacctttg taaatatccc aacctcacaa 1200 ggtgcaagtg gagatctata taattttaga ataccacctt ctttcacgct tggctgcgga 1260 ttttggggag gaaattctgt ttccgagaat gttggtccaa aacatctttt gaatattaaa 1320 accgtagctg aaaggagaga aaacatgctt tggtttagag ttccacataa agtatatttt 1380 aagttcggtt gtcttcaatt tgctttaaaa gatttaaaag atctaaagaa 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gtggtcacgt 960 agatgttact gttttagggg ctctccaggt agatgaaaag ggtaatatag ccaattggat 1020 tgttcctgga aaaatgctct ctggtatggg tggagctatg gatttagtaa atggagctaa 1080 gaaagtaata attgcaatga gacatacaaa taaaggtcaa cctaaaattt taaaaaaatg 1140 tacacttccc ctcacggcaa agtctcaagc aaatctaatt gtaacagaac ttggagtaat 1200 tgaggttatt aatgatggtt tacttctcac tgaaattaat aaaaacacaa ccattgatga 1260 aataaggtct ttaactgctg cagatttact catatccaat gaacttagac ccatggctgt 1320 ttaa 1324 <210> 27 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of a primer used in amplication of a CtfAB gene group <400> 27 cacagatcta tgaactctaa aataattaga tttgaaaatt taag 44 <210> 28 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of a primer used in amplication of a CtfAB gene group <400> 28 cacgaattct taaacagcca tgggtctaag ttcattggat atga 44 <210> 29 <211> 3773 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of a operon comprising Xylose kinase and Xylulose isomerase genes of Clostridium acetobutylicum <400> 29 atgaggtatt tattaggtat agacgttgga acatcaggaa ccaagacagc tttgtttgat 60 gaatgtggaa atacaataaa aacttcaacg catgagtatg agttatttca accacaggtt 120 ggatgggcag aacaaaatcc tgaaaattgg tggacagctt gtgttaaagg tataagagaa 180 gtaattgaaa aaagtaaaat tgatccttta gatattaaag gaattggtat aagtggacaa 240 atgcatggac ttgttttgat tgacaaagag tacaaagtaa ttagaaactc cataatttgg 300 tgtgatcaga gaacagaaaa ggaatgtact cagattacag ataccatagg aaaagaaaaa 360 ttaattagga taacaggcaa tcctgcatta acgggtttca ccctttcaaa actattatgg 420 gttaggaata atgaaccaga caattataag agaatatata aggttcttct tcctaaggat 480 tatataagat ttaaacttac tggagttttt gctgccgaag tttcagatgc tagtggtact 540 cagatgttag atataaatac tagaaattgg agtgaagaac ttttagatga cttaagaata 600 gataagaaca tattacctga tgtatatgaa tcagttgttg ttagtggatg cgttatagaa 660 aaagcttcaa aagagactaa gttagcagtt aacactcccg ttgtaggtgg ggcaggagat 720 caagcagctg gagctatagg gaatggaatc gttagagaag gtttaatatc aacagtgata 780 ggaacttctg gagtagtatt tgcggctaca gatacgccta 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tatggtaatt aaaagtgtta 1680 cagacaagga gttcaaaaaa tatggcaaga tattaagaga ttatgattgt acagagataa 1740 tagaaaaaat gaaatctaca ccacttccag gtgatgtagt atatgaacca tcaattaaag 1800 aacttgaaga gcttgatatt gcaaaggaat taaaggaaag agaatatgga gagcttccaa 1860 tacaagtagg atactgcaat ggtaacaatt atttattaaa tgcagtcgaa tatcatcgtt 1920 catctgaaat aaatatagca gtaacagatt tcatactact tttaggctct agagatgata 1980 ttgaagaaga ttactcatat agtacttcta aaattaaagc atttaaagtt ccagctggta 2040 ctgctattga ggtttatgca actactcttc actatgcacc ttgcaatgta aatgaagggg 2100 gattcagatg tgttgtggtt ttgccaagag atacaaattt gcctttagaa aaagagtata 2160 aaaaaactgg tgaagatgct ctactttttg ctaaaaacaa atggttaatt gcccataagg 2220 atactaacct agataaagaa ggagcattta taggattaat aggtaaaaat atttcaataa 2280 aataaaatgg aggaattaaa atgaataata caccaaaatt aaaattagga attgttgcag 2340 taagtagaga ctgctttcca atggaattat cagagaatag aagaaaggca gtagtagatg 2400 cttacaatgg agaaatcttc gagtgcttaa caactgttga aaatgaaaaa gatatgagaa 2460 aagctttaaa agaagtgaaa agtgcaggtg taaatgcact agtagtatat ttaggtaact 2520 ttggaccaga aactccagaa actttaattg ctaaagaatt tgatggacca gttatgtttg 2580 cagccgcagc agaagagaga ggagacaatc tagttaatgg acgtggagat gcttattgtg 2640 gaatgctaaa tgcaagctat aatttagcac ttagaaacat aaatgcttat attcctgaat 2700 atccagtggg aacagcttca gatgttgcaa atatgattaa tgaatttgta ccggttgcta 2760 ctgcattaat tggattaaag aatttaaaga ttatttcttt tgggccaaga cctcaggatt 2820 tcctagcttg caatgctcct attaagcagt tatataattt aggtgttgaa atagaggaaa 2880 attcggagct tgatttgttt gcctcattta atgaacatga aaacgattct agaattccag 2940 atgtagtaaa agacatggag gaagagttag gtgagggcaa taaaatgcct ggtattttgc 3000 caaagcttgc tcaatatgaa cttacattac tagattgggc agaggagcat aaaggatcaa 3060 gagaatatgt tgtgtttgca aataaatgct ggccagcgtt tcaaacacaa tttggatgtg 3120 tgccttgcta tgtaaacagt agactaacgg ctagaggaat tccagtatct tgtgaggttg 3180 acatttatgg agctttaagt gaatacattg gaacatgtgt aagtcaagat gttgtaacct 3240 tacttgatat taataacaca gtaccaaaag atatgtatga atcagaaatt aaaagcaaat 3300 ttaactatac gttaaaggat accttcatgg gttttcactg tggaaacaca gcagcatgta 3360 aattaacaag cggaactatg aaaaatcaaa tgattatggc aagagctctt gagccaaatc 3420 aagagcctaa tataactaga ggaacgttag agggagatat tgtaccagga gaaatcactt 3480 tcttccgtct acaaagtaat gcagatagtg agttaacagc ctatgtagca gaaggagagg 3540 ttttacctgt taagacacgc tcttttggat ctattggagt atttgcaatt cctcaaatgg 3600 ggagatttta ccgccatgta ctaattgaaa atagattccc acaccatggt gcagttgcat 3660 ttggacattt tggtaaagca atttataatt tgtttagata tttgggagtt aaagaggtag 3720 gttttaatag gccaaaggaa atgctatata aaacagaaaa tccttttgag taa 3773 <210> 30 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of a primer used for amplication of a operon comprising Xylose kinase and Xylulose isomerase genes of Clostridium acetobutylicum <400> 30 cgctgcagat gaggtattta ttaggtatag acgttg 36 <210> 31 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of a primer used for amplication of a operon comprising Xylose kinase and Xylulose isomerase genes of Clostridium acetobutylicum <400> 31 ggcggccgct tactcaaaag gattttctgt tttatatagc 40

Claims (28)

  1. 대장균에서 복제 가능한 제1 복제기점의 염기 서열;
    pUB110 플라스미드에서 유래한 복제단백질 영역을 암호화하는 염기 서열;
    유전자의 발현 종결 서열;및
    클로스트리디움 및 대장균 모두에서 발현되는 항생제 저항성 유전자의 염기 서열을 포함하고
    3000 bp 내지 4000 bp의 크기를 가지며,
    항생제 저항성 유전자의 교체 없이 클로스트리디움 및 대장균 모두에서 복제가 가능한 셔틀 플라스미드.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 항생제 저항성 유전자는 클로람페니콜 저항성 유전자인 것을 특징으로 하는 셔틀 플라스미드.
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 유전자 발현 종결 서열은 아세토아세테이트 디카르복실라아제를 코드하는 유전자의 전사 종결인자의 염기 서열인 것을 특징으로 하는 셔틀 플라스미드.
  6. 삭제
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 셔틀 플라스미드는 하기 i) 또는 ii)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 셔틀 플라스미드:
    i) 티올라제(thiloase) 프로모터 영역 및 다중 클로닝 영역(MCS)의 염기 서열
    ii) pUB110 플라스미드의 복제기점의 염기 서열.
  8. 제 1항, 제 3항, 제 5항 및 제 7항으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 한 항에 기재된 셔틀 플라스미드를 준비하는 단계;
    상기 셔틀 플라스미드에 하나 이상의 유전자를 도입하여 제1 재조합 셔틀 플라스미드를 제조하는 단계; 및
    상기 제1 재조합 셔틀 플라스미드를 미생물에 도입하는 단계를 포함하는 재조합 미생물의 제조 방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 하나 이상의 유전자는 자일로스 키나아제를 코드하는 유전자 및 자이룰로스 이소메라제를 코드하는 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물의 제조 방법.
  10. 제 8항에 있어서,
    상기 미생물은 아세틸 코에이 생합성 경로 및 부티릴 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물의 제조 방법.
  11. 제 8항에 있어서,
    상기 미생물은 알코올/알데히드 탈수소 효소를 코드하는 유전자 및 코에이트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자를 포함하는 미생물인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물의 제조 방법.
  12. 제 8항에 있어서,
    상기 셔틀 플라스미드에 도입된 유전자는 자일로스 키나아제를 코드하는 유전자, 자이룰로스 이소메라제를 코드하는 유전자, 알코올/알데히드 탈수소 효소를 코드하는 유전자 및 코에이트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물의 제조 방법.
  13. 제 8항에 있어서,
    상기 제1 재조합 셔틀 플라스미드를 미생물에 도입한 후, 제2 재조합 셔틀 플라스미드를 상기 미생물에 추가로 도입하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물의 제조 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 제2 재조합 셔틀 플라스미드는 상기 제1 재조합 셔틀 플라스미드에 도입된 유전자와 동일한 유전자를 포함하거나, 또는 상기 제1 재조합 셔틀 플라스미드에 도입된 유전자와 다른 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물의 제조 방법.
  15. 제 13항에 있어서,
    상기 제2 재조합 셔틀 플라스미드는 자일로스 키나아제를 코드하는 유전자, 자이룰로스 이소메라제를 코드하는 유전자, 알코올/알데히드 탈수소 효소를 코드하는 유전자 및 코에이트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하되,
    상기 제2 재조합 셔틀 플라스미드는 상기 제1 재조합 셔틀 플라스미드에 도입된 유전자와 동일한 유전자를 포함하거나, 또는 상기 제1 재조합 셔틀 플라스미드에 도입된 유전자와 다른 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물의 제조 방법.
  16. 제2 재조합 셔틀 플라스미드를 미생물에 도입하는 단계;및
    하나 이상의 유전자를 제 1항, 제 3항, 제 5항 및 제 7항으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 한 항의 셔틀 플라스미드에 도입하여 제조한, 제1 재조합 셔틀 플라스미드를 상기 미생물에 추가로 도입하는 단계를 포함하는,
    재조합 미생물의 제조 방법.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 제1 재조합 셔틀 플라스미드에 도입된 유전자는 자일로스 키나아제를 코드하는 유전자, 자이룰로스 이소메라제를 코드하는 유전자, 알코올/알데히드 탈수소 효소를 코드하는 유전자 및 코에이트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물의 제조 방법.
  18. 제 16항에 있어서,
    상기 제2 재조합 셔틀 플라스미드는 자일로스 키나아제를 코드하는 유전자, 자이룰로스 이소메라제를 코드하는 유전자, 알코올/알데히드 탈수소 효소를 코드하는 유전자 및 코에이트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물의 제조 방법.
  19. 제 1항, 제 3항, 제 5항 및 제 7항으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 한 항에 기재된 셔틀 플라스미드를 준비하는 단계;
    상기 셔틀 플라스미드에 하나 이상의 유전자를 도입하여 제1 재조합 셔틀 플라스미드를 제조하는 단계; 및
    상기 제1 재조합 셔틀 플라스미드 및 제2 재조합 셔틀 플라스미드를 미생물에 동시에 도입하는 단계를 포함하는,
    재조합 미생물의 제조 방법.
  20. 제 19항에 있어서,
    상기 제1 재조합 셔틀 플라스미드에 도입된 유전자는 자일로스 키나아제를 코드하는 유전자, 자이룰로스 이소메라제를 코드하는 유전자, 알코올/알데히드 탈수소 효소를 코드하는 유전자 및 코에이트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물의 제조 방법.
  21. 제 19항에 있어서,
    상기 제2 재조합 셔틀 플라스미드는 자일로스 키나아제를 코드하는 유전자, 자이룰로스 이소메라제를 코드하는 유전자, 알코올/알데히드 탈수소 효소를 코드하는 유전자 및 코에이트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물의 제조 방법.
  22. 제 8항의 제조 방법에 의하여 제조된 재조합 미생물을 배양하여 배양물을 제조하는 단계;및
    상기 배양물로부터 발효산물을 수득하는 단계를 포함하는,
    발효산물의 수득 방법.
  23. 제 16항의 제조 방법에 의하여 제조된 재조합 미생물을 배양하여 배양물을 제조하는 단계;및
    상기 배양물로부터 발효산물을 수득하는 단계를 포함하는,
    발효산물의 수득 방법.
  24. 제 19항의 제조 방법에 의하여 제조된 재조합 미생물을 배양하여 배양물을 제조하는 단계;및
    상기 배양물로부터 발효산물을 수득하는 단계를 포함하는,
    발효산물의 수득 방법.
  25. 아세틸 코에이 생합성 경로 및 부티릴 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물에, 자일로스 키나아제를 코드하는 유전자, 자이룰로스 이소메라제를 코드하는 유전자, 알코올/알데히드 탈수소 효소를 코드하는 유전자 및 코에이트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 제 1항, 제 3항, 제 5항 및 제 7항으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 한 항에 기재된 셔틀 플라스미드를 이용하여 도입되어 제조된, 부탄올 생산용 재조합 미생물.
  26. 삭제
  27. 제 25항에 있어서,
    자일로스 키나아제를 코드하는 유전자, 자이룰로스 이소메라제를 코드하는 유전자, 알코올/알데히드 탈수소 효소를 코드하는 유전자 및 코에이트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 제 1항, 제 3항, 제 5항 및 제 7항으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 한 항에 기재된 셔틀 플라스미드에 도입되어 제조된 제1 재조합 셔틀 플라스미드; 및
    자일로스 키나아제를 코드하는 유전자, 자이룰로스 이소메라제를 코드하는 유전자, 알코올/알데히드 탈수소 효소를 코드하는 유전자 및 코에이트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 제2 재조합 셔틀 플라스미드를
    이용하여 미생물 내에 유전자가 도입되어 제조된,
    부탄올 생산용 재조합 미생물.
  28. 제 25항에 있어서,
    상기 부탄올 생산용 재조합 미생물은 서열번호 29의 염기 서열, 서열번호 20의 염기 서열 및 서열번호 26의 염기 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 염기 서열이 미생물에 도입되어 제조된 것을 특징으로 하는, 부탄올 생산용 재조합 미생물.
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