KR101983850B1 - 탈미엘린화 유발 신경계 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물 및 건강기능식품 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미엘린 막 리모델링 억제제를 포함하여 다양한 탈미엘린화 유발 신경계 질환, 특히, 염증성 신경병증에 대해 우수한 약효 및 건강기능성을 나타내는 의약 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

Description

탈미엘린화 유발 신경계 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물 및 건강기능식품{MEDICINAL COMPOSITION AND HEALTH FUNCTIONAL FOOD FOR PREVENTING OR TREATING NERVOUS DISEASE INDUCED BY DEMYELINATION}

본 발명은 탈미엘린화 유발 신경계 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

탈미엘린화(탈수초)는 신경세포돌기를 피복하는 미엘린이, 미엘린 그 자체 또는 그것을 생성해 내는 올리고덴드로글리와(중추신경계) 또는 시반세포(말초신경계) 중 어느 쪽의 병적 변화에 의해 탈락하는 것을 의미한다.

탈미엘린화 유발 신경계 질환은 미엘린 수초가 손상되는 신경계 질환으로, 손상된 신경의 신호 전달을 감소시킨다. 차례로, 이 전달 감소는 감각 (sensation), 운동 (movement), 인지 (cognition), 또는 신경에 의존하는 다른 기능의 감소를 야기시킨다. 상기 질환은 중추신경계에 영향을 주는 것과 말초신경계에 영향을 주는 것을 포함할 수 있다.

이러한 탈미엘린화 관련 질환에 대해 현재까지 그 구체적인 메커니즘이 밝혀지지 않아, 이를 근본적으로 방지할 수 있는 의약에 대한 개발이 필요한 실정이다.

한국공개특허 제2016-0053711호

본 발명은 우수한 약효를 갖는 탈미엘린화 유발 신경계 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 우수한 건강기능성을 갖는 탈미엘린화 유발 신경계 질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. 미엘린 막 리모델링 억제제를 포함하는 탈미엘린화 유발 신경계 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물.

2. 위 1에 있어서, 상기 탈미엘린화 유발 신경계 질환은 말초 신경외상, 말초신경 독성, 말초신경염, 신경퇴행성 질환, 다발성 경화증 및 염증성 신경병증으로 이루어진 군에서 선택된 질환인 탈미엘린화 유발 신경계 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물.

3. 위 1에 있어서, 상기 탈미엘린화 유발 신경계 질환은 염증성 신경병증인 탈미엘린화 유발 신경계 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물.

4. 위 1에 있어서, 상기 미엘린 막 리모델링 억제제는 클로로퀸, 바필로마이신 A1 및 암모늄클로라이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 탈미엘린화 유발 신경계 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물.

5. 미엘린 막 리모델링 억제제를 포함하는 탈미엘린화 유발 신경계 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.

6. 위 5에 있어서, 상기 탈미엘린화 유발 신경계 질환은 말초 신경외상, 말초신경 독성, 말초신경염, 신경퇴행성 질환, 다발성 경화증 및 염증성 신경병증으로 이루어진 군에서 선택된 질환인 탈미엘린화 유발 신경계 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.

7. 위 5에 있어서, 상기 탈미엘린화 유발 신경계 질환은 염증성 신경병증인 탈미엘린화 유발 신경계 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.

8. 위 5에 있어서, 상기 미엘린 막 리모델링 억제제는 클로로퀸, 바필로마이신 A1 및 암모늄클로라이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 탈미엘린화 유발 신경계 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.

본 발명의 의약 조성물은 미엘린 막 리모델링 억제제를 포함하여 다양한 탈미엘린화 유발 신경계 질환, 특히, 염증성 신경병증에 대해 우수한 약효를 나타낸다.

본 발명의 건강기능식품은 미엘린 막 리모델링 억제제를 포함하여 다양한 탈미엘린화 유발 신경계 질환, 특히, 염증성 신경병증에 대해 우수한 건강기능성을 나타낸다.

도 1은 B7-2KO 신경에서 슈반세포 탈분화를 나타낸다.
A는 B7-2KO mice의 좌골 신경에서 탈수초화의 진전을 보이는 Semithin plastic section이다(Scale bar=50 ㎛)
B는 WD를 겪는 B7-2KO 신경 및 손상 신경에서 Krox20/c-jun 발현의 안타고니스틱 조절을 나타낸다. 발현 수준이 NOD 신경 및 un-cut control 신경과 비교되었다. 수치는 평균 및 표준편차(n=3)으로 나타내었다.
C는 NOD 신경 및 un-cut control 신경 대비 B7-2KO 신경에서 유전자 발현 수준을 나타내는 마이크로어레이 분석이다.
D는 B7-2KO 신경에서 선택된 9개의 임의 유전자의 발현 변화를 나타내는 qPCR 결과이다. 수치는 NOD control의 수치의 평균 배수를 나타낸다. HMCGR; HMG-CoA reductase, Sult1a1; sulfotransferase 1A1, HMGCS1; HMG-CoA synthase 1, MBP; myelin basic protein, pmp22; peripheral myelin protein 22 (HMGCS1), MPZ; myelin protein zero, Ccna2; cyclin A2, GDNF; glial cell-derived neurotrophic factor, CCL2; C-C Motif Chemokine Ligand 2.
E는 B7-2KO 신경에서 fatty acid 2-hydroxylase(FA2H), HMGCS1, HMGCR, 및 성숙한 형태의 sterol regulatory element-binding factor 2 (m-SREBF2)의 하향 조절을 나타내는 웨스턴 블롯 분석이다. 정량 분석에서, NOD 신경으로부터의 웨스턴 밴드의 강도는 임의 단위 1로 간주되었고, B7-2KO 신경에서 각 밴드의 상대 강도가 표시되었다 (*; p<0.05, **; p<0.01, n=3).
F는 B7-2KO 신경에서 mitotic figure (positive to antiphospho-histone 3 (PH3) staining, arrowheads)의 증가를 나타내는 IF staining이다. p75NGFR에 대한 IF staining이 탈분화된 SCs의 감지에 사용되었다(Scale bar=50 ㎛). 정량 분석은 좌골 신경에서 PH3-positive 슈반세포의 숫자를 나타낸다(**; p<0.01, n=3).
G는 B7-2KO mice의 좌골 신경에서 Sox10-positive 슈반세포의 숫자를 나타내는 IF staining이다(Scale bar=50 ㎛). 정량 분석은 NOD 및 B7-2KO mice의 좌골 신경의 섹션(130 ㎛ x 130㎛ area)에서 Sox10-positive 슈반세포의 숫자를 나타낸다(**; p<0.01, n=3).
도 2는 IDN에서 demyelinating 슈반세포 내의 접합 파괴를 나타낸다.
A는 B7-2KO 및 손상 신경에서 E-cadherin (E-cad)의 선택적 파괴를 나타내는 웨스턴 블롯 분석이다. 정량 분석에서 수치는 평균 및 표준편차(n=3)를 나타낸다.
B는 B7-2KO 신경에서 E-cadherin/β-catenin (β-cat) stain의 normal punctate pattern의 손실을 나타내는 IF staining이다. 화살표는 B7-2KO 신경에서 punctate stain의 손실을 나타낸다.
C는 완전한 Ecadherin 파괴(별표)를 나타내는 p75NGFR-negative 슈반세포를 보이는 IF staining이다. 화살표는 p75NGFR-positive 슈반세포를 나타낸다(Scale bar=50 ㎛).
D는 B7-2KO 신경에서 abaxonal cytoplasm (double 별표s) 및 비정상 외부 메삭손 (arrow)의 증가를 나타내는 전자 현미경 사진이다. arrow head는 외부 메삭손에서 tentacle-like SC process를 나타낸다. 하얀 별표는 uncompacted 미엘린에서 확장된 사이토플라즘을 나타낸다.
E는 EAN(experimental autoimmune neuritis) 쥐의 좌골 신경에서 전형적인 punctate E-cadherin stain 손실을 나타내는 IF staining이다. G0 및 G2는 임상 단계를 나타낸다(Scale bar=50 ㎛).
F는 NOD 및 B7-2KO mice로부터의 좌골 신경의 Teased sciatic nerve preparations이 fluorescein-conjugated phallodin (green, F-actin) 및 anti-E-cadherin antibody (red)로 면역염색된 것을 나타낸다. 별표는 SLI(Schmidt-Lanterman Incisure)를 나타내고, B7-2KO 신경의 SLI에서 E-cadherin의 소실을 나타낸다. arrowhead는 확장된 abaxonal cytoplasm으로 연장되는 F-actin tails을 나타낸다(Scale bar=50μm).
G는 B7-2KO 신경에서 미엘린 막 불안정성 및 유연성(plasticity)을 나타내는 세로 전자 현미경 사진이다. Left panel; 두번째 가장 바깥쪽 myelin lamella (흰 화살표)에 결합된 가장 바깥쪽 myelin lamella (검정 화살표)의 외부층. Arrowheads는 미엘린 막의 자기 분해를 나타낸다. Middle panel; myelin lamella는 그것의 루트(화살표)로부터 주의를 돌리고(detract), 오토파고솜 형성이 일어날 가능성이 있을 때에 미토콘드리움을 감싸는 것으로 나타났다. Right panel; peri-incisural abaxonal cytoplasm이 폴리리보솜(흰 별표)으로 채워짐을 나타내는 세로 현미경 사진. 최외부 myelin lamella (화살표)는 미엘린 수초로부터 분리되고 원형질막을 향했다. 검정 별표는 normal SLI에 존재하지 않는 uncompacted major dense line 내의 확장된 사이토플라즘을 나타낸다. arrowhead는 myelin lamella 또는 막 자기분해의 세포내 소낭성 변화(endocytotic vesicular change)를 나타낸다.
도 3은 "myelin corpse theory"의 형태학적 증거를 나타낸다.
A는 미엘린 수초로부터 핵-함유 슈반세포 세포체의 부분적 분리를 나타내는 B7-2KO mice 좌골 신경의 전자 현미경 사진이다. Box 1에서 원형질 막(검정 화살표)은 불연속적(별표)이고 myelin lamella(흰 화살표)와 융합되어 cytoplasmic tongue을 형성한다. Box1 에서 최외부 myelin lamella (흰 화살표)는 Box2에서 uncompacted myelin lamella와 함께 연속적이다 (흰 화살표).
B는 nwrapped SC images의 측면도를 나타낸다. Cytoplasmic amputation은 대식세포에 의해 파괴되는 new tongue 및 myelin corpse를 만들어 낸다.
C는 SC에서 cytoplasmic amputation을 통해 형성된 것으로 추정되는 3개의 cytoplasmic tongues(Box3에서 화살표, pseudo-colored image에서 별표)을 나타내는 전자 현미경 사진이다.
Box1(별표)에서 cytoplasmic tongue(pseudo-colored image 에서 small blue tongue)은 first major dense line(Box1에서 흰 두개 화살표)를 따라 연속적이고, 이에, tongue은 insinuated macrophage의 과정이 아니지만, 대신에 amputation 이전에 외부 cytoplasmic tongue (pseudo-colored image에서 2개 흰색 별표)을 따라 연속적이기 위해 사용되는 amputated cytoplasm이다. Box2에서 별표 표시된 층은 first uncompacted major dense line처럼 보임에도 불구하고 second uncompacted major dense line인 것으로 판단된다.
D는 미엘린 수초(myelin corpse) 및 외부 SC cytoplasm(SC) 사이의 공간(별표)를 나타내는 세로 전자 현미경 사진이다.
E는 myelin corpse 형성 모델을 나타내는 Schematic drawing이다. 최외부 myelin lamella (파랑 반원)의 외면은 detracted되고 원형질 막에 결합되어, 미엘린 수초로부터 슈반세포 세포체(노랑)을 분리시킨다. myelin corpse 및 슈반세포 세포체 사이 공간(별표)은 도 19에서 first intraperiod line 및 공간과 상응한다.
도 4는 분절 탈수초화의 마지막 단계에서의 불안정화된 myelin corpse의 Intratubal macrophage 소화를 나타낸다.
A는 미엘린 잔해(화살표)가 슈반세포에는 존재하지 않고, 대식세포(MQ) 내에 존재하는 것을 나타내는 B7-2KO mice의 좌골 신경의 전자 현미경 사진이다. Ax; axon. macrophage-associated demyelination (MAD)의 진행은 last panel 에서 denuded axon에 의해 입증된 바와 같이 분절 탈수초화의 마지막 단계를 나타낸다.
B는 MAD의 진행(왼쪽에서 오른쪽 패널으로)을 나타내는 세로 좌골 신경 섹션이다. 대식세포(MQ)는 left panel에서 SC cytoplasm 및 미엘린 수초(arrowhead) 사이의 공간에 있다. middle panel의 arrowhead는 슈반세포 세포체와 myelin corpse (MC) 사이의 공간을 나타낸다. right panel에서 myelin corpse는 분해되었고, denuded axon (Ax)은 노출되었다. 화살표는 대식세포 내 미엘린 잔해를 나타낸다.
C는 75NGFR positive 슈반세포(red)를 투과하는 CD68-positive macrophage (green, 화살표)을 나타내는 Double IF staining이다. 파랑색은 Hoechst stain로 표시된 핵을 나타낸다. 별표는 액손을 나타낸다(Scale bar=20 ㎛).
D는 대식세포가 SC cytoplasmic pocket 내의 myelin corpse를 휩싸는 것을 나타내는 schematic drawing이다.
E는 대식세포에 둘러싸인 myelin corpse를 나타내는 전자 현미경 사진이다.
F는 S100-positive 슈반세포(arrowheads)에는 위치하지 않고 주로 CD68-macrophges (화살표) 내에 위치하는 Bodipy stains를 나타내는 Double IF staining이다(Scale bar=50 ㎛).
도 5는 오토파고라이소솜(Autophagolysosome)이 B7-2KO 신경에서 SAD-MAD transition 및 분절 탈수초화를 감소시킴을 나타낸다.
A는 B7-2KO 신경의 peri-incisural cytoplasm에서 LAMP1 및 LC3 (arrowhead)의 유도를 나타내는 teased nerve preparations의 IF staining이다. 별표는 SLI를 나타낸다(Scale bar=30 ㎛).
B는 PBS-injected animals과 비교했을 때 chloroquine (CQ) injection 다음에 B7-2KO 신경의 슈반세포에서 증가된 LC3 staining (upper panels)을 나타내는 IF staining이다. Bodipy stain (lower panels)은 많은 대식세포가 PBS-injected B7-2KO animals에서 Bodipy stain을 보인 반면에, CQ-injected B7-2KO animals에서 적은 수의 대식세포만이 lipid droplets (arrow)을 함유했음을 보였다(Scale bar=50 ㎛).
C는 PBS 또는 CQ-injected B7-2KO mice에서 좌골 신경 내의 Bodipy-stained macrophages의 비율을 나타내는 그래프이다(**; p<0.01, n=3).
D는 CQ 또는 PBS injection 다음에 B7-2KO 신경 내에서 대식세포의 총 수의 정량화이다.
E는 CQ 또는 PBS injection 다음에 B7-2KO 신경에서 denuded axons(화살표)를 나타내는 전자 현미경 사진이다.
F는 CQ 또는 PBS injection 다음에 B7-2KO 신경에서 전자 현미경 하에 카운트 된 denuded axons의 수를 나타내는 그래프이다(**; p<0.01, n=3).
G는 CQ injection 이후에 B7-2KO 신경에서 E-cadherin의 punctate stain pattern의 파괴를 나타내는 E-cadherin의 IF staining이다(Scale bar=50μm).
H는 CQ injection 다음에 B7-2KO 신경에서 확장된 abaxonal cytoplasm 및 uncompacted myelin(화살표)을 나타내는 전자 현미경 사진이다
도 6은 SAD-MAD transition theory를 묘사한 모델이다.
A는 슈반세포에서 자가 포식 저해에 따르는 슈반세포 및 대식세포 내에서 lipid stain의 표현형을 묘사한 모델이다. SAD-MAD transition theory에서, 슈반세포에서 자가 포식 저해는 delayed myelin rejection에 이르고, 식세포성 미엘린 소화를 못하게 한다. SAD 및 MAD가 미엘린 소화에 독립적으로 연루되었음을 시사한다면, 슈반세포에서 자가 포식 저해는 지질포식의 결함 때문에 그들의 지질 함량을 증가시킨다.
B는 SAD-MAD transition theory에 기초한 다양한 탈수초화 조건에서 탈수초화 메커니즘을 나타낸다.

본 발명은 미엘린 막 리모델링 억제제를 포함하여 다양한 탈미엘린화 유발 신경계 질환, 특히, 염증성 신경병증에 대해 우수한 약효 및 건강기능성을 나타내는 의약 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

peripheral myelin sheath를 형성하는 슈반 세포(Schwann cells (SCs))는 다양한 탈수초화(demyelination) 조건 하에서 미엘린 수초(myelin sheath)를 탈분화하고(dedifferentiate) 파괴하는 특별한 능력을 가지고 있다.

신경 돌기의 손상(axonal injury) 이후에 월러변성(Wallerian degeneration, 이하 WD)에서 SAD(SC dedifferentiation-associated demyelination) 동안에 슈반세포는 미엘린 불안정성, 미엘린 유전자 발현의 감소 및 미엘린 자가 소화 분해(autophagic myelin decomposition)를 보인다. 그러나, 염증성 탈수초성 신경병증(inflammatory demyelinating neuropathy (IDN))에서 슈반세포가 대식세포가 미엘린 제거(clearance)를 위해 활성화 되기 이전에 어떻게 분절 탈수초화(segmental demyelination)에 기여하는지는 불명확하다.

본 발명자들은 초미세구조 및 분자 분석을 이용하여 SAD가 IDN의 마우스 모델에서 관찰되는 초기 탈수화에 관여하는 메커니즘임을 보였다.

탈분화된 슈반세포에 의해 보여지는 미엘린 막 불안정성은 축삭 함유 미엘린 수초와 슈반세포 세포체 사이의 오토파고리소솜(autophagolysosome) 의존적인 분리에 이르고, 이 현상은 세포체와 분리된 미엘린 수초 덩어리, 즉 Myelin corpse를 형성하여 대식세포(macrophages)가 분절 탈수초화 마지막 단계에서 myelin corpse를 식균하도록 허용한다.

최종적으로, 슈반세포에서 리소솜 저해는 분절 탈수초화를 저해했을 뿐만 아니라 IDN에서 myelin corpse 형성을 억제함으로써 임상 단계의 진전을 지연시켰다.

이에, 이러한 발견은 IDN에서 분절 탈수초화과정은 슈반세포 및 대식세포에 의한 myelin corpse 형성 및 소화 각각에 대한 순차 분업을 포함하는 일련의 과정일 수 있음을 나타내고, IDN에서 분절 탈수초화를 예방하는 치료적 전략의 발전에 대한 식견을 제공한다.

본 발명의 탈미엘린화 유발 신경계 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물은 미엘린 막 리모델링 억제제를 포함한다.

본 명세서에서 탈미엘린화 유발 신경계 질환은 탈미엘린화(탈수초화, demyelination)에 의해 유발되는 신경계 질환을 의미한다. 이는 예를 들면 말초신경 외상, (예를 들면, 약물에 의한) 말초신경 독성, 말초신경염, 신경퇴행성 질환, 다발경화증(multiple sclerosis), 염증성 신경병증(inflammatory neuropathy)일 수 있으며, 구체적으로는 염증성 신경병증일 수 있다.

염증성 신경병증은 말초신경, 신경근(神經根, nerve root), 그리고 감각 및 자율신경절 내 염증성 세포의 침윤이 특징적이다. 일부에서는 감염원이 염증반응을 야기하며, 다른 일부에서는 면역기전이 염증의 원인으로 생각된다. 길랑-바레증후군(guillain-barre syndrome, acute inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy)은 치명적인 말초신경계 질환이다. 이 질병은 임상적으로 사지의 끝에서 시작되지만 빠르게 위쪽으로 퍼져나가는 상행마비(ascending paralysis)가 특징적이며, 조직학적으로는 척수신경뿌리 및 말초신경의 염증이 특징적이다. 기존의 연구에 따르면 탈수초화과정은 대식세포에 의해 슈반세포 미엘린 수초가 파괴되는 단순한 과정으로 치부되었으나 미엘린 수초를 생산하는 슈반세포의 수동적 혹은 능동적 기여 없이 탈수초와가 어떻게 가능한지에 대한 과학적 결과는 존재하지 않았다.

본 발명자들은 탈미엘린화에 의해 쓸모 없어진 미엘린이 제거되기 위해서 슈반 세포가 스스로 미엘린을 끊어내는 과정이 필요하고, 이 과정에서 미엘린 막 리모델링이 필요하다는 것을 발견하였다. 즉, 미엘린 막 리모델링이 억제되면 탈미엘린화를 억제할 수 있어, 이에 의해 유발되는 질병을 예방 또는 치료할 수 있다.

이와 같은 미엘린 막 리모델링은 자가포식체와 자가포식 리소좀 형성에 의존적으로 일어나는 것으로서, 미엘린 막 리모델링 억제제는 자가포식체 형성, 자가포식 리소좀 형성을 억제할 수 있는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면 클로로퀸, 바필로마이신 A1, 암모늄클로라이드 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 의약 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물을 함유하는 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈(lactose), 덱스트로즈, 수크로스(sucrose), 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 의약 조성물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 1 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 미엘린 막 리모델링 억제제를 포함하는 탈미엘린화 유발 신경계 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품은 상기 미엘린 막 리모델링 억제제를 포함한 음료 (알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품 (예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품 (예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류 (예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품 (예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등일 수 있다.

또한, 본 발명의 건강기능식품은 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제, 액제 제형 등으로 제형화된 것일 수도 있다. 이들은 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 더 포함하여 제형화될 수 있다.

본 발명에 더 포함될 수 있는 첨가제로는, 천연 탄수화물, 향미제, 영양제, 비타민, 광물(전해질), 풍미제(합성 풍미제, 천연 풍미제 등), 착색제, 충진제(치즈, 초콜렛 등), 팩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 산화 방지제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 및 과육으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 사용할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품은 천연 과일 쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예로는 이에 한정하는 것은 아니나, 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로즈, 물, 설탕시럽, 메틸셀룰로즈, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아트산 마그네슘 및 미네랄 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상이 사용되는 것이 바람직하다.

상기 상술한 제형 내 유효성분으로서의 본 발명의 건강기능식품의 함량은 사용 형태 및 목적, 사용자 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 고형분 중량 기준으로 0.001 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 50 중량%일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.

실시예

재료 및 방법

재료

β-actin, p75 neurotrophin receptor, c-jun, myelin protein zero, E-cadherin, Sox10, CD68 및 LAMP1에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구매하였다. β-catenin, p120 및 phospho-histone 3 (PH3) 항체는 Cell Signaling Lab (Beverly, MA, USA)으로부터 얻었다. Krox20의 항체는 Covance (Princeton, NJ, USA)로부터 구입하거나 Dr. Meijer로부터 공급받았다. LC3B 및 myelin basic protein 항체는 각각 Life technologies (Carlsbad, CA, USA) 및 Millipore (Middlesex, MA, USA)로부터 구입하였다. SREBF-2, HMGCS1 및 FA2H 항체는 Abcam (Cambridge, UK)으로부터 얻었고, HMGCR 항체는 Santa Cruz Biotechnology로부터 구매하였다. Horseradish peroxidase (HRP)-linked anti-rabbit IgG 및 anti-mouse IgG는 Cell Signaling Lab으로부터 얻었다. Alexa Fluor 488 또는 Texas red-labeled donkey anti-rat 및 anti-rabbit IgG은 Molecular probes (Carlsbad, CA, USA)로부터 구매하였다.

Cy3-conjugated donkey anti-goat IgG 및 Fluorescein-conjugated phalloidin은 Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA, USA)로부터 구매하였다. Bodipy®493/503 (Bodipy)는 ThermoFisher Scientific (Waltham, MA, USA)로부터 얻었다. Real-time PCR reagents는 Applied Biosystems (Carlsbad, CA, USA)로부터 얻었다. 모든 지정되지 않은 나머지 시약은 Sigma (St. Louis, MO, USA)로부터 얻었다.

동물

Non-obese diabetic (NOD) 및 NOD-B7-2 knockout mice (B7-2KO)는 Jackson Lab (Bar Harbor, ME, USA)으로부터 구매하였다. 그들의 유전형은 PCR(Jang et al., 2016)에 의해 결정되었고, neuropathy는 생후 20주간 매주 tail-drop 및 hind-limb paralysis를 검사함으로써 평가되었다.

20주 이상의 female B7-2KO mice에서의 운동 결핍의 임상 단계는 5 단계로 나뉘어졌다: grade (G) 0, no signs; G1, floppy tail; G2, mild paraparesis or unilateral hind limb paralysis; G3, severe paraparesis; G4, tetraparesis; G5, moribund condition or death (Moon et al., 2006).

Female NOD mice가 염증성 신경병증(inflammatory neuropathy)의 컨트롤로 사용되었다. Atg7flox/flox mice(Atgflox, obtained from Dr. Masaaki Komatsu, Juntendo University School of Medicine (Komatsu et al., 2005)) 및 myelin protein zero-Cre transgenic mice (obtained from Dr. Laura Feltri, University of Buffalo (Feltri et al., 1999))는 the SC-specific Atg7 conditional knockout mice (Atg7-SCKO) (Jang et al., 2015)를 제조하기 위해 교배되었다. Atg7 gene의 특정 knockout은 qPCR 및 injured nerves of KO mice의 LC3 수정의 결실에 의해 확인되었다(Jang et al., 2015; 2016). Atg7 transgenic mice의 분석을 위해, 양 성(sex)의 2-3 개월령 쥐가 사용되었다. 모든 수술적 절차는 대한의학회에 의해 정립된 동물 실험을 위한 가이드라인을 따르는 동아대학교 동물 연구 위원회에 의해 승인된 프로토콜 및 "Principles of laboratory animal care" (NIH publication No.86-23)에 따라 수행되었다.

월러변성(Wallerian degeneration, 이하 WD) 동안 혈액 단핵 백혈구를 감소시키기 위해, C57BL/6 mice (2~3 개월령, 양 성)에게 170 ㎕의 Clophosome-ATM-Clodronate Liposomes (FormuMax Scientific, USA)이 1일 전 및 축색 절단의 1, 3, 5일 후에 복강내 주사되었다. 동물은 손상 6, 7일 후에 희생되었다. B7-2KO 신경에서 lysosomes을 저해하기 위해, chloroquine (CQ, 30 mg/kg) 또는 phosphate buffered saline (PBS)가 12일간 10번 복강내 주사되었고, 동물은 마지막 주사 2~3일 이후에 희생되었다.

자가 면역 신경염 모델의 유도(Induction of experimental autoimmune neuritis ( EAN ) in Rats)

Lewis rats이 Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN, USA)에서 얻어지고, 동물 시설에서 길러졌다. 7~12 주령의 160~200g의 Female rats이 사용되었다. 모든 동물 실험은 제주대의 실험 동물의 관리 및 사용을 위한 가이드라인에 따라 수행되었다. rats 에서 Active EAN은 (Moon et al., 2006)에 따라 유도되었다. 간략히, 각 rat의 양 뒷발바닥에 SP-26 100mg, a neuritogenic peptide homologous to amino acids 53-78 of bovine myelin P2 protein (Shimadzu, Kyoto, Japan) 및 Freund's complete adjuvant (CFA;M. tuberculosis H37Ra, 5 mg/mL)을 함유한 에멀젼이 주사되었다. 각 rat에 면역법 후 0 및 2일째에 500 ng pertussis toxin (Sigma)이 처리되었다. CFA control rats은 CFA만으로 면역화되었고 주사로부터 12일 후에 희생되었다.

좌골 신경 손상(Sciatic nerve injury)

10% ketamine hydrochloride (Sanofi-Ceva, Dusseldorf, Germany; 0.1 ml/100 g body weight) and Rompun (Bayer, Leverkusen, Germany; 0.05 ml/100 g body weight)를 사용한 마취 이후에,

adult C57BL/6 mice의 좌골 신경이 a fine iris scissor (FST Inc, Foster City, CA) 경비골 분기점으로부터 상위 5 mm 지점에서 절단되었다.퇴행 신경의 형태학적인 분석을 위해, 손상 부위로부터 1mm 길이의 말초 신경 잘린 끝 부분이 버려졌고, 다음 5mm의 말초 신경 잘리 끝 부분이 지시된 시간에 수집되었으며, 2% glutaraldehyde 존재 또는 부존재 하에 4% paraformaldehyde (PFA)로 밤새(overnight) 고정되었다.

마이크로어레이 분석 및 역전사 PCR

Trizol reagent (Life Technology)를 이용하여 절개 좌골 신경(n=3, 각 그룹별)으로부터 총 RNA가 분리되었다. RNA는 DNase 처리되었고, 이후 페놀 추출 및 알코올 침전이 수행되었다. RNA는 genespecific oligonucleotides (~22,000 genes, Affimetrix)를 이용하여 Macrogen Biochip corporation (Macrogen, Seoul, Korea)에 의해 마이크로어레이에 대한 혼성화를 위해 처리되었다. 반복 실험으로 얻어진 mean fold values는 도 1에 나타내었다.

qPCR을 위해, 500 ng의 총 RNA가 제조사에 의해 표시된 바와 같이 Ready-To-Go-Your-Prime First Strand Beads (Amersham Biosciences) and oligo (dT) primers와 함께 배양되었다. SYBR Green PCR Master mix, cDNA와 프라이머가 첨가되었고, (Shin et al., 2013b)에 기재된 방법에 따라 real-time RT-PCR thermocycler (Applied Biosystems)로 qPCR이 수행되었다. PCR 산물은 Applied Biosystems 7500 software (v2.05)로 분석되었다. 3회 반복실험이 각 유전자별 2번씩 수행되었다.

전자 현미경 분석 및 형태 계측

좌골 신경은 EM을 위해 [23]의 방법에 따라 처리되었다. 고정제(2.5% glutaraldehyde and 2.0% PFA in 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 7.4)에 4 overnight 담금 고정한 후에, 신경은 1% osmium tetroxide를 함유한 동일 버퍼에 2시간 후고정되었고 알코올 탈수 이후에 Epon에 삽입되었다. Semithin section은 toluidine blue로 염색되었고, ultrathin section은 5% uranyl acetate 및 Reynold's lead citrate로 염색되었다. Section은 digital camera(ES500W, GATAN, Pleasanton, CA, USA)를 갖춘 Hitach electron microscope로 검사되었다. enlarged 메삭손, uncompacted myelin, foamy macrophage, 및 completely denuded axons를 포함하는 탈미엘린화 지수를 평가하기 위해 좌완 신경(n=3 in each group)의 영역 전체가 5000~40000x 배율 하에 검사되었다. myelin-rejecting 슈반세포의 비율은 clodronate injection을 통한 후분쇄 6일째에 직경 5㎛ 이상의 myelin clump를 함유한 좌골 신경세포로부터 전자 현미경 하에서 카운트되었다.

형광항체법( Immunofluorescence (IF) staining)

4% PFA에 고정된 좌골 신경은 20% sucrose solution에 크리오프로텍트(cryoprotected)되었다. 14 ㎛ 두께의 횡단면도는 cryostat (Frigocut, Leica, Germany)을 이용하여 얻어졌고, section은 사용될 때까지 초저온 냉장고에 보관되었다. teased nerve preparations을 위해, 고정된 신경이 tease되었고 입체 현미경 하에 슬라이드 상에 고정되었다. 슬라이드는 0.2% Triton X-100 및 2% bovine serum albumin in PBS를 함유한 용액에 1시간 블록되었다. 섹션은 1차 항체와 함께 4℃에서 16시간 배양되었고 PBS로 3회 세척되었다. 이후에, 슬라이드는 Cy3- or Alexa 488-conjugated secondary antibody와 함께 상온에서 3시간 배양되었고, 30분간 DAPI 염색되었다. neutral lipid staining을 위해, 슬라이드는 2차 항체 배양 동안 Bodipy (1:1000)와 함께 배양되었다. 섹션은 이후 PBS로 3회 세척되었고, 커버슬립은 mounting medium (Gel Mount, BioMeda, USA)과 함께 유리 슬라이드에 부착되었고 laser confocal microscope (LSM510, Carl Zeiss, Germany)로 관찰되었다. the mounted cross sections으로부터 Sox10-, Bodipy- 및 CD68-immunopositive cells 를 카운트하기 위해, 40x/1.2NA water immersion lens (Carl Zeiss) 사용하에 Zen 2009 software 를 이용하여 20-30 images (130 ㎛ x 130 ㎛)가 3 마리 동물로부터 캡쳐되었다.

Bodipy-positive macrophages를 카운트하기 위해, CD68-positive macrophages로부터 Bodipy- and CD68-double positive cells의 수가 카운트되었다. the cross sections으로부터 PH3-positive 슈반세포를 카운트하기 위해, 각 그룹별 5-6 좌골 신경 섹션/동물 내의 PH3 및 p75-double positive cells가 카운트되었고, 3회 독립 실험이 수행되었다

웨스턴 블롯 분석

웨스턴 블롯 분석을 위해, 좌골 신경이 수집되었고 lysing matrix beads 및 RIPA lysis buffer를 함유한 튜브로 옮겨졌다. Tube는 TissueLyser LT (Qiagen) 안에 놓여졌고, 2분간 균질화되었다. 용해물은 4℃에서 10분간 8,000g로 원심분리되었고 상등액이 수집되었다. 단백질(25~35 ㎍)은 SDSPAGE에 의해 분리되었고, 이후 nitrocellulose membrane (Amersham Biosciences) 상에 옮겨졌다. 0.1% Tween-20 and 5% nonfat dry milk in Tris buffered saline (pH 7.2, TBS)로 블록킹 후에, 막은 primary antibodies (1:500-1,000) in TBST(2% nonfat dry milk 함유)와 함께 4℃에서 밤새 배양되었다. 15분간 TBST 세척 3회 이후에, 막은 a HRP-conjugated secondary antibody (1:3,000)와 함께 상온에서 1시간 배양되었다. 신호는 ECL system (ECL Advance kit, Amersham Biosciences)을 이용하여 감지되었다. 정량 분석을 위해, 3회 독립 실험으로부터의 필름이 스캔되었고 강도는 imageJ analysis system (NIH, USA)를 이용하여 분석되었다.

control 신경으로부터의 액틴 로딩 컨트롤에 대한 Western bands의 강도는 임의 단위 1로 간주되었고, 각 반대의 상대 강도는 도면에 나타내었다. 3회 독립 실험으로부터의 대표적인 블롯은 도면에 나타내었다.

통계 분석

통계 분석은 GraphPad Prism software (GraphPad, San Diego, CA, USA)를 이용하여 수행되었다. 표시된 p값은 Student's two-tailed t-test 로부터 얻어졌고, 결과는 평균 및 표준편차로 표현되었다. P values < 0.05은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

결과

염증성 말초신경병증에서 슈반세포의 탈분화 (inflammatory demyelinating neuropathy, 염증성 탈수초성 신경병증)

자연 자가면역 탈수초성 신경병증이 발달한 20주령 이상의 Female B7-2-KO/NOD (B7-2KO)이 만성 IND의 모델이다(도 1A). 가장 빠른 시작 신호는 꼬리 약화였고, 임상 단계는 단독 뒷다리 약화(G2)를 보인 이후 4주 이내에 4단계(G4)로 진행되었다. p75NGFR 및 c-jun의 상향은 오토파지 활성화와 더불어 슈반세포 탈분화의 의 주요 2가지 마커이다. 본 연구에서 본 발명자들은 non-neuropathic NOD 신경과 비교했을 때 B7-2KO 신경에서 c-jun은 상향조절된 반면, 일생을 통해 미엘린 수초의 유지를 위한 중요하고 필수적인 전사 인자인 Krox20의 발현이 크게 감소함을 발견했다. IDN에서 슈반세포의 탈분화 상태를 상세히 결정하기 위해, microarray analysis를 이용하여 G2 단계에서 B7-2KO mice로부터 neuropathic sciatic nerves의 유전자 발현 프로파일을 검사했다.

더욱이, 이 유전자 발현 프로파일들을 axotomy (6 days post-injury, 6dPI) 이후에 WD를 겪고 있는 control mice의 손상 신경으로부터의 유전자 발현 프로파일과 비교했다. B7-2KO 신경에서, NOD 신경과 비교했을 때 2배 이상인, 725개의 상향 조절, 724개의 하향 조절 유전자를 확인했다. 게다가, 신경손상후 WD (모두 월러변성으로 바꾸어도 무방)이 진행중인 신경에서는 비손상 컨트롤 신경과 비교했을 때 2배 이상인, 602개의 상향 조절, 657개의 하향 조절 유전자가 있었다. WD 동안 상향 조절된 602개의 유전자 중에, B7-2KO 신경에서 317개(52.6%) 및 575개(95.5%)가 각각 2배 및 1.5배 이상 상향조절되었다. 이들 중, 슈반세포 탈분화에 관련된 기능적으로 분류된 유전자; 미성숙/탈분화 슈반세포 (ex, p75Ngfr, Id2, 도 1C)로 표현되는 것으로 알려진 것과 cell cycle progression에 관련된 유전자(ex, Cyclins, 도 1C)가 B7-2KO 신경에서 상향조절되었다. WD 동안 하향 조절된 657개의 유전자 중에, B7-2KO 신경에서 402개(61.2%) 및 633개(96.3%)가 각각 2배 및 1.5배 이상 하향조절되었다. 그들은 myelin genes (ex, myelin protein zero, myelin basic protein, peripheral myelin protein 22, 도 1C) 및 지질 합성에 관련된 유전자(HMG-CoA synthase 1 (Hmgcs1), Sterol regulatory element binding factor 2 (Srebf2), Fatty acid 2-hydroxylase (Fa2h)(data not shown, 도 1D-E))로 기능적으로 분류되었다. IDN에서 발견된 이러한 마이크로어레이 중 일부는 qPCR을 통해 확인되었다. 웨스턴 블롯 분석은 B7-2KO 신경에서 FA2H, HMGCS1, HMGCR and SREBF2를 포함하는 lipid/cholesterol biosynthesis에 관여하는 단백질의 상당한 하향 조절을 보였다(도 1E).

게다가, B7-2KO 신경에서 phospho-histone 3 (a mitotic marker)에 대한 IF staining은 NOD 신경과 비교했을 때 SC mitosis에서 크게 증가했다 (도 1F). 그리고, B7-2KO 신경에서 Sox10-positive 슈반세포의 숫자는 또한 증가했다(도 1G). 이러한 발견들은 탈분화 상태를 보이는 슈반세포가 axonal degeneration이 나타나지 않을 IDN의 초기 단계에서 immature status 및 슈반세포 증식 에 관련된 유전자의 발현을 상향 조절하는 반면에, myelin protein 및 lipid synthesis에 관련된 유전자를 잘 발현하지 않는 탈분화상태임을 명확히 나타낸다.

탈수초가 일어나는 IDN의 슈반세포에서 미엘린 접합단백질의 변화

성숙한 미엘린 수초의 구조 유지는 SLI를 포함하는 접합 영역의 안정성에 의존한다. 추가로 WD 동안에 액틴 폴리머화 의존적인 E-cadherin과 같은 접합 단백질의 파괴는 미엘린 수초 파쇄와 관련되어 있다. IDN의 초기 단계에서 접합 단백질의 변화를 알아보기 위해 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 G2 단계 B7-2KO 신경에서 E-cadherin, β-catenin 및 p120의 발현 수준을 검사했다.

NOD 신경과 비교했을 때, β-catenin 및 p120 발현 수준은 크게 변화하지 않은 반면에, B7-2KO 신경에서 E-cadherin 수준은 크게 감소했다(도 2A). 이러한 E-cadherin의 선택적인 감소는 또한 WD를 겪고 있는 신경에서도 관찰되었다(도 2A). IF staining에서, NOD 신경에서 E-cadherin/β-catenin의 정상 반점 패턴(normal punctate pattern )에 반하여, B7-2KO 신경에서 반점 염색(punctate stain)의 손실이 많았고, 이는 접합 구조의 파괴를 잠재적으로 의미한다(도 2B). 그러나, 반점 E-cadherin/β-catenin staining의 손실은 p75NGFR staining의 유도와 밀접하게 관련되어 있지 않고(도 2C), 이는 IDN에서 액손이 여전히 손상되지 않은 반면에, axo-glial interface의 변화(alteration)에 앞서서 일어남을 나타낸다. 대신에, 완전히 탈수초화된 슈반세포에서 p75NGFR staining은 크게 증가했다(도 2C). 접합 파괴를 보이는 IF staining은 B7-2KO animals의 좌골 신경의 접합 영역의 초미세 구조적 특징을 검사하도록 이끌었다. B7-2KO 신경에서 가장 명백한 초미세 구조적 변화는 특별히 Mesxaon 바깥 주변에서의 슈반세포의 abaxonal cytoplasm의 증가였다(도 2D).

비정상적인 외부 메삭손에 인접한 abaxonal cytoplasm은 자주 tentacle-like protrusions 및 myelin uncompaction을 보였다(도 2D). 본 발명자들은 양적 분석을 수행했고, B7-2KO 신경에서 확장된 cytoplasm과 함께 슈반세포로부터 대략 68%의 외부 메삭손이 tentacle-like protrusion을 보임을 발견했다. 게다가, 80% 이상의 uncompacted myelin sheath가 비정상 외부 메삭손과 연관되어 있었다. 그러나, NOD 신경에서 어떠한 슈반세포도 tentacles or myelin uncompaction을 보이지 않았다. intraperiod line 및 major dense line 모두에서 myelin lamellae의 분리를 명백하게 보이는 Myelin uncompaction은 lamellae 사이의 interdigitating cytoplasm의 축적과 연관되어 있다(도 2D). 슈반세포에서 외부 메삭손 주변의 이러한 초기 탈미엘린화 특징은 macrophage invasion 없이 초미세 구조적인 관찰 하에서 endoneurial tube를 나타냈다. SC cytoplasm 및 myelin uncompaction의 반응성 돌출(reactive protrusion)은 experimental autoimmune neuritis (EAN) 쥐 모델에서 EM에 의해 보여졌다. 이러한 현상들이 Ecadherin 파괴와 관련되어 있는지를 조사하기 위해, rat EAN의 좌골 신경에서 E-cadherin 분포를 조사했고 E-cadherin의 반점 염색 패턴의 유사한 손실을 발견했다(도 2E).

이후, teased nerve preparations을 이용하여 좌골 신경의 SLI에서 E-cadherin의 발현을 조사했고, B7-KO 신경의 SLI에서 E-cadherin stain의 광범위한 손실을 발견했다(도 2F). 세로 EM으로, 외부 메삭손al 영역 주변의 myelin uncompaction 과 매우 유사하게, 많은 폴리리보솜 및 막 구조와 함께 incisural cytoplasm이 확장되었다(도 2G). 흥미롭게도, SLI에서 uncompacted myelin lamellae는 다른 다른 미엘린 막이나 세포 내 막성구조물 예를 들어 미토콘드리아 등과의 융합을 암시하는 많은 막 리모델링의 역동적인 특징을 보였다. (도 2G).

이러한 결과는 초기 IDN에서 미엘린 막의 불안정와 미엘린 접합부의 파괴등이 슈반세포 탈분화상태와 밀접히 관련되어 있음을 보여준다.

IDN에서 대식세포에 의한 탈수초화된 미엘린 제거현상

다른 myelin lamella 사이의 막 융합과 보수 또는 원형질 막에의 myelin lamella의 융합은 myelin remnant가 슈반세포 세포체에서 떨어지도록 유발하면서 cytoplasmic amputation으로 이어졌다(도 3). 게다가, abaxonal area 내에서 또는 uncompacted major dense line을 따라서 2개 이상의 SC cytoplasmic tongues의 출현은 SC cytoplasm의 amputation의 또다른 암시이다(도 3B, C). myelin membrane remodeling에 의한 비정상적 amputation은 nucleus-containing 슈반세포 세포체(노랑색, 도 3C, E)를 main myelin sheath로부터 분리시키고, 두 파트 사이의 커뮤니케이션은 중단된다. 도 3에 도시된 바와 같이, 슈반세포 세포체로부터 분리된 미엘린 수초를 "myelin corpse"라 이름지었다. 왜냐하면 그것이 비손상 액손을 포함함에도 불구하고 parental 슈반세포 세포체와의 접촉의 손실 때문에 제거되거나, intratubal macrophages(도 3B)에 의해 쉽게 제거될 운명이기 때문이다

IDN에서 슈반세포 harboring myelin debris가 아닌 이전의 연구에 따르면 IDN에서 미엘린을 탐식하고 있는 대식세포의 결과는 대식세포 의존적인 탈수초화 (Macrophage-associated demyelination, MAD)를 제시한다(Prineas, 1972; Saida et al., 1978; Prineas, 1981; Midroni and Bilbao, 1995). 이에, 우리의 결과는 SAD가 macrophages가 destabilized myelin corpse를 비손상 액손으로부터 떨어져나가도록 하는 것을 허용함을 나타낸다.

EAN에서의 이전의 EM 결과에 따라, 본 발명자들은 특별히 G3, G4 단계에서 destabilized myelin을 제거하는 macrophages의 수많은 패턴을 발견했다. 이러한 가장 전형적인 특징은 대식세포가 슈반세포의 세포체와 분리된 미엘린 수초사이에 존재하며 수초탐식을 진행하고 있다는 관찰이다. (도 4A-D).

이러한 현상은 longitudinal sections의 EM 분석에서 명백히 관찰된다(도 4B). Double IF staining은 또한 CD68-positive macrophage processes가 p75NGFR-positive SC cytoplasmic pocket 내에서 발견됨을 나타냈다(도 4C, D). 이는 myelin corpse가 형성되면 macrophage processes가 슈반세포 세포체로부터 demyelinating axon을 분리시킬 수 있음을 제안한다. 이에, macrophages가 myelin corpse를 둘러싸고 식균할 수 있었다(도 4D, E).

슈반세포가 SAD를 통해 직접 미엘린 수초를 소화하는지를 알아보기 위해 수초파괴 산물인 중성지방을 Bodipy 염색액으로 염색해보고자 하였다.

IDN 신경에서 Bodipy stain은 CD68-positive macrophages 에서 lipid droplets이 항상 관찰되고 S100-positive 슈반세포에서는 그렇지 않음을 보였고, 이는 myelin lipid digestion이 주로 macrophages에 의해 수행됨을 제안한다(도 4F). 따라서, 슈반세포는 SAD를 통해 미엘린을 세포체로부터 분리하고 대식세포는 이를 탐식하여 소화하는 두 과정이 IDN에서 분절탈수초화의 기전임을 시사한다.

이러한 과정을 myelin clearance를 위한 SAD-MAD transition이라고 이름지었다.

B7-2 KO 신경에서 Chloroquine이 SAD-MAD transition을 저해함에 의해 segmental demyelination을 방해함

IDN에서 myelin corpse formation이 Autophagolysosome에의한 현상이라면, 슈반세포에서 autophagolysosome 저해는 myelin corpse formation을 저해할 수 있고, 이는 IDN에서 macrophages에 의한 myelin digestion을 이차적으로 저해시킬 수 있다. 이에, lysosomal associated membrane protein 1 (LAMP1) 및 LC3와 함께, B7-2KO 신경에서 autophagolysosomes의 발현을 검사했다(도 5A).

B7-2KO nerves의 teased nerve preparation에서, LAMP1 staining은 NOD 신경과 비교했을 때 peri-incisural cytoplasm에서 small puncta 또는 patches의 응집의 발생을 증가시키는 것으로 발견되었다. 더욱이, autophagy marker인 LC3 stain의 증가는 LAMP1 induction에 동반되었다.

다음으로 lysosomes의 인히비터인 클로로퀸(CQ)이 B7-2KO 신경에서 SAD-MAD transition을 감소시키는지를 검사하였다.

B7-2KO mice에서 뒷다리 비정상을 감지하자 마자, CQ 또는 PBS가 10일간 주사되었고, 이후, 나머지 뒷다리의 마비 및 조직학이 최종 주사 2~3일 이후에 분석되었다.

최종 주사 이후에 주로 임상 단계 G3(severe paraparesis, G2.77±0.12, n=9)를 나타낸 PBS-주사 동물에 대하여, clodronate-주사 mice는 가벼운 대부전 마비를 보이거나 또는 여전히 G2 단계(G2.17±0.17, p=0.04, n=6)에 머물렀다. LC3에 대한 IF staining은 슈반세포에서 CQ 주사에 뒤따르는 LC3 staining의 증가를 보였고, 이는 in vivo에서 CQ injection에 의한 lysosomal function의 효과적인 억제를 나타낸다(도 5B). 좌골 신경에서 Bodipy stain은 PBS-treated B7-2KO mice에서 Bodipy-positive macrophages가 많이 있는 반면에, CQ-injected animals의 macrophages에서 lipid droplets이 거의 감지되지 않음을 보였다. 그러나, 양 그룹에서 macrophage infiltration은 비슷한 수준이었다(도 5B-D). 게다가, CQ injection은 슈반세포에서 Bodipy stain을 증가시키지 않았다.

결과적으로, CQ에 의한 SAD-MAD transition의 억제는 segmental demyelination의 진행의 저해로 이어졌다(도 5E, F). 그러나, E-cadherin에 대한 immunostaining에 의해 밝혀진 접합적 파괴 및 외부 메삭손 주변의 myelin uncompaction의 초미세 구조적 특징은 CQ-treated B7-2KO animals에서 여전히 관찰됐다(도 5G, H). 이는 autophagolysosomes가 SAD의 마지막 단계에서 myelin corpse의 형성에 선택적인 역할을 가짐을 나타낸다.

Claims (8)

1. 클로로퀸을 포함하는 말초 신경외상, 말초신경 독성, 말초신경염, 말초신경퇴행성 질환 및 염증성 탈수초성 말초신경병증으로 이루어진 군에서 선택된 탈미엘린화 유발 신경계 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
   
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3. 청구항 1에 있어서, 상기 탈미엘린화 유발 신경계 질환은 염증성 탈수초성 말초신경병증인 탈미엘린화 유발 신경계 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
   
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5. 클로로퀸을 포함하는 말초 신경외상, 말초신경 독성, 말초신경염, 말초신경퇴행성 질환 및 염증성 탈수초성 말초신경병증으로 이루어진 군에서 선택된 탈미엘린화 유발 신경계 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
   
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7. 청구항 5에 있어서, 상기 탈미엘린화 유발 신경계 질환은 염증성 탈수초성 말초신경병증인 탈미엘린화 유발 신경계 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
   
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