KR102216752B1

KR102216752B1 - 황칠나무 추출물을 포함하는 탈수초 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102216752B1
Application number: KR1020190065230A
Authority: KR
Inventors: 양현정; 유우키 스기우라
Original assignee: 국제뇌교육종합대학원대학교 산학협력단
Priority date: 2019-06-03
Filing date: 2019-06-03
Publication date: 2021-02-17
Also published as: KR20200138904A

Abstract

본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 탈수초 질환의 예방, 개선, 치료용 조성물 등에 관한 것으로, 보다 자세하게는, 본 발명의 조성물은 희소돌기아교세포 전구체세포를 희소돌기아교세포로의 분화를 촉진시킬 뿐만 아니라, 희소돌기아교세포의 수초화를 촉진시켜 다양한 탈수초 질환의 치료용도로 사용 가능한 조성물에 관한 것이다.

Description

황칠나무 추출물을 포함하는 탈수초 질환의 예방 또는 치료용 조성물{A composition comprising extracts of Dendropanax morbiferus for preventing or treating demyelinating disease}

본 발명은 황칠나무 추출물을 포함하는 탈수초 질환의 예방 또는 치료용 조성물 등에 관한 것이다.

뇌의 신경섬유는 대부분 수초(미엘린, myelin)라는 지질단백질로 구성된 조직의 많은 층으로 둘러싸여 있는 구조를 이루고 있으며, 수초는 절연체와 비슷한 역할을 수행하기 때문에, 신경섬유를 따라 정확하고 빠른 신경 충동(neural impulse)을 전달하는데 중요한 역할을 수행하고 있다. 이러한 수초가 국소 손상, 면역 장애, 감염, 영양 결핍, 약물, 또는 알려지지 않은 원인 등에 의하여 손상, 파괴 등이 유발되게 되면, 내부에 있는 신경 섬유에 영구적인 손상이 유도된다. 따라서, 체내에서는 수초가 손상되면 이를 회복시키기 위하여 재수초화가 진행되나, 종종 재수초화가 실패하고 탈수초화로 진행되는 경우가 발생된다. 이러한 탈수초화로 인하여 발생되는 탈수초 질환(demyelinating disease)으로는 다발성 경화증(Multiple sclerosis), 급성 파종성 탈수초(acute disseminated demyelination), 레버 유전성 시각 신경병증(Leber hereditary optic neuropathy), 길랭-바레증후군(Guillain-Barre syndrome), 탈수초성 다발성 신경병증(demyelinating polyneuropathy), 샤르코 마리 투스병(Charcot Marie Tooth) 등이 있다. 이러한 탈수초 질환은 대부분이 난치성 질환으로서 치료가 용이하지 않을 뿐만 아니라, 효과적인 치료제가 미비한 실정이다. 최근 말초신경병증 동물모델에서 아스코르브산이 치료 효과를 나타내어 새로운 치료제로서 관심이 증가되었었으나, 임상시험에서 효과가 없는 것으로 확인된 바 있다.

따라서, 수초가 손상되었을 때 재수초화가 촉진되거나, 및/또는 탈수초화를 억제시키기 위해서 희소돌기아교세포 전구체세포를 모집(recruitment)하고, 모인 전구체세포를 희소돌기아교세포로 분화시킬 수 있는 신규 치료제의 개발이 절실히 필요한 실정이다. 이러한 치료제가 개발된다면 탈수초화로 인한 다양한 탈수초 질환의 효과적인 치료제로서 사용가능할 것으로 기대된다.

국내공개특허 10-2017-0022802

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 탈수초 질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 탈수초 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 탈수초 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 희소돌기아교세포 분화 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 황칠나무 잎의 추출물인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 당해 기술분야에 속하는 통상의 전문가에게 이미 알려진 공정에 의하여 추출될 수 있으며, 바람직하게는, 물, 에탄올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 헥산, 벤젠, 에틸아세테이트 등을 단독으로 이용하여, 또는 혼합 용매를 이용하여 추출될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 에탄올이나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 탈수초 질환은 신경계의 수초가 파괴되는 증상을 동반하는 모든 질환을 포함하며, 바람직하게는 다발성 경화증(Multiple sclerosis), 급성 파종성 탈수초(acute disseminated demyelination), 레버 유전성 시각 신경병증(Leber hereditary optic neuropathy), 길랭-바레증후군(Guillain-Barre syndrome), 탈수초성 다발성 신경병증(demyelinating polyneuropathy), 샤르코 마리 투스병(Charcot Marie Tooth) 등이나, 수초의 재생을 촉진함으로써 치료할 수 있는 질환이라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 수초화 재생을 촉진시키거나, 탈수초화를 억제시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 희소돌기아교세포는 희소돌기아교세포 전구체세포(Oligodendrocyte precursor)로부터 분화되는 것을 특징으로 한다. 상기 희소돌기아교세포 전구체세포는 희소돌기아교세포로 분화될 수 있는 상태의 세포라면 제한이 없다.

또한, 본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 탈수초 질환의 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 탈수초 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 탈수초 질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물은 희소돌기아교세포의 분화를 촉진시킬 수 있을 뿐만 아니라, 축삭돌기에의 접촉 및 수초화를 촉진시킨다. 또한, 수초화와 관련된 다양한 유전자의 발현량을 효과적으로 증가시킬 수 있기 때문에 탈수초화로 인하여 발생되는 다양한 탈수초 질환의 예방, 개선, 치료에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 식물 추출물이 혼합 신경교세포의 수초화 형성에 미치는 영향을 면역염색법으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 식물 추출물이 희소돌기아교세포 분화에 미치는 영향을 면역염색법으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 황칠나무의 부위에 따른 추출물이 희소돌기아교세포의 수초화 형성에 미치는 영향을 면역염색법으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 황칠나무 잎 추출물이 희소돌기아교세포 분화에 미치는 영향을 실시간 중합효소연쇄반응으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 황칠나무 잎 추출물이 희소돌기아교세포 분화에 미치는 영향을 웨스턴블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 황칠나무 잎 추출물이 후근신경절 신경세포와 희소돌기아교세포 전구체세포의 공동 배양에서 희소돌기아교세포의 분화에 미치는 영향을 면역염색법으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 황칠나무 잎 추출물이 축삭돌기 접촉에 미치는 영향을 면역염색법으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 황칠나무 잎 추출물이 수초화에 미치는 영향을 실시간 중합효소연쇄반응으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명에서는 황칠나무 잎 추출물이 희소돌기아교세포 전구체세포의 단독 배양뿐만 아니라, 신경세포와의 공동 배양에서도 희소돌기아교세포의 분화를 촉진시키고, 수초화를 촉진하는 다양한 유전자의 발현을 촉진시킬 수 있을 뿐만 아니라, 축삭돌기 접촉도 유도함으로써 효과적으로 수초화를 촉진시킨다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 명세서에 있어서, “탈수초 질환(demyelinating disease)”이란 신경계의 미엘린 수초에서 비정상, 특히 수초의 파괴를 수반하는 질환을 총칭하는 의미로서, 수초의 파괴로 인한 모든 질환에는 제한이 없으나, 그 일례로는 다발성 경화증(Multiple sclerosis), 급성 파종성 탈수초(acute disseminated demyelination), 레버 유전성 시각 신경병증(Leber hereditary optic neuropathy), 길랭-바레증후군(Guillain-Barre syndrome), 탈수초성 다발성 신경병증(demyelinating polyneuropathy), 샤르코 마리 투스병(Charcot Marie Tooth) 등이 있다.

본 명세서에 있어서, “예방(prevention)”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 탈수초 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에 있어서, “개선(improvement)”이란, 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면, 증상의 정도를 적어도 감소시키는 행위를 의미한다. 이때 상기 본 발명의 조성물을 탈수초 질환의 예방 또는 개선을 위하여 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.

본 명세서에 있어서, "치료(treatment)"란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 탈수초 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에 있어서, “개체(individual)”란 본 발명의 조성물이 투여될 수 있는 대상을 말하며, 그 대상에는 제한이 없다.

본 명세서에 있어서, “약학적 조성물(pharmaceutical composition)”이란 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약제적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 500 mg/kg 또는 0.001 내지 500 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 식품 조성물은, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등에 사용할 수 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태로 사용할 수 있다. 상기 식품 조성물은 건강기능식품 조성물을 포함한다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 황칠나무 추출물의 양은, 일반적으로 본 발명의 식품 조성물의 경우 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량 %로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물의 경우 100 mL를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 당업계에 통상적인 식품첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 식품 조성물은 필수 성분으로서, 상기 황칠나무 추출물 외에 첨가되는 성분에는 특별한 제한은 없으며 통상의 식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린; 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 식물 추출물의 제조

식물 추출물을 제조하기 위하여, 마고영농조합에서 6 년산 황칠나무(Dendropanax morbiferus; DM)의 잎(leaves), 줄기 수피(stem barks) 및 뿌리(roots)를 제공받았다. 그리고 두충(Eucommia ulmoides; EU), 쇠무릎속(Achyranthes aspera; AcA), 도꼬마리(Xanthium strumarium; XS), 황기(Astragalus membranaceus; AM), 쑥(Artemisia princeps; ArP), 개다래(Actinidia polygama; AP), 지황(Rehmannia glutinosa, RG), 방풍(Ledebouriella seseloides; LS), 및 개똥쑥(Artemisia annua; AA)은 지리산 청정 약초에서 구매하였다. 각각의 시료는 건조시킨 후에 잘게 자르고, 갈아서 가루 형태로 제조하였다. 그리고 100 % 에탄올 50 mL에 8 g씩 첨가한 후에 실온에서 일주일 동안 shaking rotator에서 반응시키며 추출을 진행하였다. 그리고 일주일 후에 원심분리하여 침전물이 제거된 상층액을 획득하였다. 획득된 상층액은 70 ℃에서 evaporator를 이용하여 농축시킨 후에, 8 g/mL의 농도로 맞춰준 후에 사용 전까지 -20 ℃에서 보관하였다.

실시예 2: 식물 추출물의 희소돌기아교세포의 멤브레인 층 형성에 미치는 영향 확인

2.1. 혼합 신경교세포의 수초화 형성에 미치는 영향 확인

실시예 1과 동일한 방법으로 제조된 식물 추출물들이 희소돌기아교세포(oligodendrocyte; OL)의 멤브레인 층 형성에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 일차적으로 혼합된 신경교세포(주로, 희소돌기아교세포, 성상세포(astrocyte) 및 소교세포(microglia)가 포함된 혼합 신경교세포)를 배양하였다. 보다 자세하게는, 출생 후 0 내지 2 일된 마우스의 대뇌피질을 획득한 후에, poly-D-lysine(PDL)이 코팅된 커버슬립 위에 올려놓은 후에 10 % 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 5 % 말혈청(horse serum), 및 1x 페니실린-스트렙토마이신(Gibco)이 첨가된 DMEM/F-12 배지에서 8 일간 배양하였다. 그리고 Sato 배지(DMEM containing 1× B-27 supplement, 1X Glutamax, 1X penicillin-streptomycin, 1 % horse serum, 1X sodium pyruvate, 0.34 μg/ml T3, 및 0.4 μg/ml T4)로 교체해준 후에, 실시예 1과 동일한 방법으로 제조된 식물 추출물들을 동량 처리한 후에 12 일(12 DIV; 12 days in vitro)간 배양하였다. 대조군으로는 에탄올을 동량 처리하였다. 그리고 수초 염기성 단백질(myelin basic protein; MBP)을 염색하여 브레인 층의 크기를 측정하였다. 수초 염기성 단백질은 성숙된 수초화의 주요 마커로 알려져 있다. 수초 염기성 단백질 염색을 위하여, 4 % 파라포름알데히드 용액을 이용하여 세포를 고정시킨 후에, 블록킹 용액(5 % normal donkey serum, 0.5 % Triton X-100, 및 0.05 % sodium azide가 첨가된 인산염완충용액(phosphate buffered saline))을 이용하여 세포를 블록킹하였다. 그리고 1 : 300의 농도로 희석된 rat monoclonal antibody to MBP(Chemicon)를 처리하고 4 ℃에서 16 시간 동안 반응시켜 1차 염색을 실시한 후에, 인산염완충용액을 이용하여 3 회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 그리고 다시 2차 항체(Jackson Immunoresearch)를 처리하고 실온에서 45 분간 반응시킨 후에, 인산염완충용액을 이용하여 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 그리고 마운팅 용액을 처리한 후에 현미경을 이용하여 형광 사진을 획득하였다. 획득된 형광 사진은 ImageJ를 이용하여 전체 세포의 면적 중에서 MBP양성 반응 면적의 퍼센트로 정량화하였다. 이후 모든 실험에서 p value가 0.05 이하이면 유의성이 있다고 확인하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 쑥(Arp)추출물과 황칠나무(DM) 추출물이 MBP 양성 반응이 가장 많이 증가된 것을 확인하였다. 상기 결과들을 통하여, 쑥 추출물과 황칠나무 추출물이 희소돌기아교세포, 성상세포 및 소교세포에 영향을 미쳐 수초화 형성을 촉진시킨다는 것을 확인할 수 있었다.

2.2. 희소돌기아교세포의 수초화 형성에 미치는 영향 확인

실시예 1과 동일한 방법으로 제조된 식물 추출물들이 멤브레인 층 형성에 미치는 영향이, 성상세포 또는 소교세포를 통한 것인지, 아니면 희소돌기아교세포에 직접적으로 작용하는 것인지 확인하기 위하여 10 일 동안 배양된 혼합 신경교세포로부터 dish-panning 방법을 사용하여 희소돌기아교세포 전구체세포(oligodendrocyte precursor cell; OPC)를 분리하였다. 분리된 희소돌기아교세포 전구체세포는 PDL이 코팅된 커버슬립 위에 올려놓은 후 Sato 배지에서 배양하였다. 그리고 24 시간 동안 배양한 후에 각각의 식물 추출물이 첨가된 새로운 Sato 배지로 교체해준 후에 4 일 동안 추가로 배양하고, 실시예 2.1과 동일한 방법으로 수초 염기성 단백질을 염색하였다. 염색된 세포들은 ImageJ를 이용하여 MBP 양성 세포 수를 정량하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 다른 식물 추출물들의 경우에는 대조군인 에탄올과 비교하여 MBP 양성 세포의 수가 증가되었으나, 황칠나무 추출물의 경우 다른 식물 추출물과 비교하여 두 배 이상 증가된 것을 확인하였다. 또한 혼합 신경교세포에서 황칠나무 추출물과 유사하게 높은 수초 염기성 단백질 범위를 보여주었던 쑥 추출물의 경우에는 다른 식물 추출물과 유사한 결과를 나타낸다는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 황칠나무 추출물은 쑥 추출물과는 상이하게 성상세포, 소교세포 등에 영향을 미치는 것이 아니라, 독립적으로 희소돌기아교세포의 수초화 형성을 촉진시키는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 황칠나무 부위에 따른 추출물의 희소돌기아교세포의 멤브레인 형성에 미치는 영향 확인

황칠나무의 부위에 따른 추출물이 희소돌기아교세포의 수초화 형성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 제조된 황칠나무 잎 추출물, 줄기 수피 추출물, 및 뿌리 추출물을 실시예 2.2와 동일한 방법으로 1 일 동안 배양된 희소돌기아교세포 전구체세포에 처리하고 2일 동안 배양하였다. 황칠나무 추출물은 고농도(High)로는 배양 배지에 1 : 1,000의 농도로 희석되도록 처리하였고, 저농도(Low)로는 1 : 100,000의 농도로 희석되도록 처리하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 뿌리 추출물의 경우에는 MBP 양성 반응 면적이 약간 증가되었으며, 잎 추출물의 경우에는 다른 추출물의 두 배 정도 MBP 양성 반응 면적이 증가되었으며, 저농도와 비교하여 고농도로 처리하였을 때 MBP 양성 반응 면적이 현저히 증가된 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 황칠나무 중에서 잎 추출물의 성분이 희소돌기아교세포의 수초화 형성에 가장 큰 효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 황칠나무 잎 추출물이 희소돌기아교세포의 분화에 미치는 영향 확인

황칠나무 잎 추출물이 희소돌기아교세포의 분화에 미치는 영향을 확인하기 위하여, Olig1, ID2, Ascl1, 및 MBP 유전자의 발현량을 확인하였다. 보다 자세하게는, 황칠나무 잎 추출물을 실시예 2.2와 동일한 방법으로 희소돌기아교세포 전구체세포를 1 일 동안 배양한 후에, 추출물을 처리하고 2 일 동안 추가 배양하였다. 황칠나무 잎 추출물은 고 농도로는 배양 배지에 1 : 1,000의 농도로 희석되도록 처리하였고, 저 농도로는 1 : 100,000의 농도로 희석되도록 처리하였다. 유전자 발현량을 확인하기 위하여, TRIzol(Sigma)을 이용하여 배양된 세포로부터 RNA를 추출하고 추출된 RNA를 주형으로 하여 SuperScript II Reverse Transcriptase(Invitrogen)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 그리고 Step One Plus Real-Time PCR System(Applied Biosystems)을 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 유전자 발현량은 GAPDH 유전자 발현량을 이용하여 표준화(normalization)하였다. 중합효소연쇄반응에 사용한 프라이머는 하기 표 1에 기재하였으며, 그 결과는 도 4에 나타내었다.

프라이머 명칭	서열(5' -> 3')	서열번호
Olig 1 forward primer	GCTCGCCCAGGTGTTTTGT	1
Olig 1 reverse primer	GCATGGAACGTGGTTGGAAT	2
Id2 forward primer	CCTGCATCACCAGAGACCTG	3
Id2 reverse primer	TTCGACATAAGCTCAGAAGGGAA	4
Ascl1 forward primer	CAACCGGGTCAAGTTGGTCA	5
Ascl1 reverse primer	CTCATCTTCTTGTTGGCCGC	6
MBP forward primer	CCAGAGCGGCTGTCTCTTCC	7
MBP reverse primer	CATCCTTGACTCCATCGGGCGC	8
GAPDH forward primer	GGTCGGTGTGAACGGATTTG	9
GAPDH reverse primer	TCGTTGATGGCAACAATCTCCACT	10

도 4에 나타난 바와 같이, Olig1 및 ID2 유전자의 경우에는 대조군인 에탄올과 비교하여 유의성 있게 발현량이 감소된 반면, MBP 유전자의 경우에는 유의성 있게 발현량이 증가된 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 황칠나무 잎 추출물이 희소돌기아교세포 전구체세포의 Olig1 및 ID2 유전자의 발현은 억제하고, MBP 유전자의 발현은 촉진시켜, 희소돌기아교세포로의 분화를 촉진시킨다는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 단백질 수준에서 재확인하기 위하여 1 : 500의 농도로 희석된 Rat antibody against MBP(Chemicon), 1 : 1,000의 농도로 희석된 rabbit antibodies against phospho-p42/44(Cell signaling), 및 1 : 5,000의 농도로 희석된 beta actin(Abcam)을 이용하여 웨스턴 블롯팅을 실시하였고, 발현량은 actin 발현량을 이용하여 표준화(normalization)하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 황칠나무 잎 추출물을 처리한 희소돌기아교세포 전구체세포에서는 MBP 단백질의 발현량이 증가되었으며, 세포외 신호조절 인산화효소 1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2; ERK 1/2)의 인산화를 촉진시켜 ERK 신호 전달 기작을 활성화시킨다는 것을 확인하였다. 상기 결과들을 통하여, 황칠나무 잎 추출물은 희소돌기아교세포 전구체세포의 ERK 기작을 활성화시켜 희소돌기아교세포의 분화를 촉진시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 황칠나무 잎 추출물이 in vivo에서 희소돌기아교세포의 분화에 미치는 영향 확인

In vivo에서는 희소돌기아교세포의 분화 및 수초화 형성에 다양한 신경 신호전달 기작이 영향을 미치기 때문에, 황칠나무 잎 추출물이 신경세포(neuron)의 존재 하에서도 희소돌기아교세포의 분화에 영향을 주는지 확인하기 위하여, 일차적으로 마우스의 후근신경절 신경세포(dorsal root ganglion neuron; DRG neuron)에 희소돌기아교세포 전구체세포를 공동배양하였다. 보다 자세하게는, B-27 supplement, N-2 supplement, 5 μg/mL의 N-Acetyl-Cysteine, 5 μM의 forskolin, 및 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지에서 배양한 후근신경절 신경세포에 희소돌기아교세포 전구체세포를 접종하여 공동배양하였다. 그리고 황칠나무 잎 추출물이 포함된 새로운 배지로 2 일 마다 교체하며 7 일간 배양하였다. 그리고 1 : 300의 농도로 희석된 rat monoclonal antibody to MBP(Chemicon), 1 : 5의 농도로 희석된 mouse hybridoma supernatants to O4(Chemicon), 및 1 : 500의 농도로 희석된 rabbit polyclonal antibodies to Olig2(Chemicon)를 이용하여 실시예 2.1과 동일한 방법으로 면역염색법을 실시하였다. 그리고 DAPI(Invitrogen)를 이용하여 세포의 핵을 염색하였다. Olig2는 희소돌기아교세포의 모든 단계에서 발현되는 마커로 알려져 있고, O4는 미성숙된 희소돌기아교세포의 마커로 알려져 있고, MBP는 성숙된 희소돌기아교세포의 마커로 알려져 있다. 그 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, Olig2 양성 세포수 및 O4 양성 면적의 경우에는 유의성 있는 차이를 나타내지 않는 것을 확인하였다. 그러나, MBP 양성 면적의 경우에는 대조군으로 에탄올을 처리한 세포와 비교하여 황칠나무의 잎 추출물(Cultivation)을 처리한 경우에 유의성있는 증가를 나타내는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 황칠나무 잎 추출물은 희소돌기아교세포 전구체세포의 단독 배양에서뿐만 아니라, 신경세포와의 공동 배양 시에도 희소돌기아교세포 전구체세포의 분화를 촉진시킬 수 있다는 것과 희소돌기아교세포 전구체세포의 증식에는 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 수초화 촉진을 위하여 축삭돌기 접촉(axonal contact)이 유도되는지 확인하기 위하여 동일한 방법으로 12 일 동안 후근신경절 신경세포와 희소돌기아교세포 전구체세포와 공동배양한 후에 1 : 1,000의 농도로 희석된 Caspr 항체(Chemicon)를 이용하여 면역염색법을 실시하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 황칠나무 잎 추출물을 처리한 경우에 Caspr 양성 면적이 유의성있게 증가되는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 황칠나무 잎 추출물은 희소돌기아교세포의 분화를 촉진할 뿐만 아니라, 축삭돌기 접촉 또한 촉진시켜 수초화를 효과적으로 촉진시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

면역염색법으로 확인한 결과를 재확인하기 위하여, 정량 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 실시간 중합효소연쇄반응은 실시예 4와 동일한 방법으로 실시하였으며, 사용한 프라이머는 하기 표 2에 기재하였다. 그 결과는 도 8에 나타내었다.

프라이머 명칭	서열(5' -> 3')	서열번호
Olig 1 forward primer	GCTCGCCCAGGTGTTTTGT	1
Olig 1 reverse primer	GCATGGAACGTGGTTGGAAT	2
MBP forward primer	CCAGAGCGGCTGTCTCTTCC	7
MBP reverse primer	CATCCTTGACTCCATCGGGCGC	8
GAPDH forward primer	GGTCGGTGTGAACGGATTTG	9
GAPDH reverse primer	TCGTTGATGGCAACAATCTCCACT	10
Myrf forward primer	TGGCAACTTCACCTACCACA	11
Myrf reverse primer	GTGGAACCTCTGCAAAAAGC	12
CNP forward primer	GTTCTGAGACCCTCCGAAAA	13
CNP reverse primer	CCTTGGGTTCATCTCCAGAA	14
PLP forward primer	GGTACAGAAAAGCTAATTGAGACC	15
PLP reverse primer	GATGACATACTGGAAAGCATGA	16

도 8에 나타난 바와 같이, 황칠나무 잎 추출물이 처리된 실험군의 경우 미엘린(myelin) 유전자들을 활성화시키는 전사인자인 Myrf, non-compact 미엘린 단백질인 CNP, compact 미엘린 단백질의 구조적 성분인 MBP 및 PLP 모두 유의성있게 발현이 증가된 것을 확인하였다. 상기 결과들을 통하여, 황칠나무 잎 추출물이 효과적으로 수초화를 촉진시킨다는 것 확인할 수 있었다.

실시예 6: 황칠나무 잎 추출물의 성분 확인

황칠나무 잎 추출물에 포함되어 있는 성분을 확인하기 위하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 준비한 황칠나무 잎 추출물을 LC-MS/MS(Liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry)로 분석하였다. 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

[표 3]

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> University of Brain Education Industrial Cooperation Group <120> A composition comprising extracts of Dendropanax morbiferus for preventing or treating demyelinating disease <130> MP19-064 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Olig 1 forward primer <400> 1 gctcgcccag gtgttttgt 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Olig 1 reverse primer <400> 2 gcatggaacg tggttggaat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Id2 forward primer <400> 3 cctgcatcac cagagacctg 20 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Id2 reverse primer <400> 4 ttcgacataa gctcagaagg gaa 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ascl1 forward primer <400> 5 caaccgggtc aagttggtca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ascl1 reverse primer <400> 6 ctcatcttct tgttggccgc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MBP forward primer <400> 7 ccagagcggc tgtctcttcc 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MBP reverse primer <400> 8 catccttgac tccatcgggc gc 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 9 ggtcggtgtg aacggatttg 20 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 10 tcgttgatgg caacaatctc cact 24 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Myrf forward primer <400> 11 tggcaacttc acctaccaca 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Myrf reverse primer <400> 12 gtggaacctc tgcaaaaagc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CNP forward primer <400> 13 gttctgagac cctccgaaaa 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CNP reverse primer <400> 14 ccttgggttc atctccagaa 20 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLP forward primer <400> 15 ggtacagaaa agctaattga gacc 24 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLP reverse primer <400> 16 gatgacatac tggaaagcat ga 22

Claims

황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는, 탈수초 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 탈수초 질환은 급성 파종성 탈수초(acute disseminated demyelination), 레버 유전성 시각 신경병증(Leber hereditary optic neuropathy), 탈수초성 다발성 신경병증(demyelinating polyneuropathy) 및 샤르코 마리 투스병(Charcot Marie Tooth)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 황칠나무 추출물은 황칠나무 잎의 추출물인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 황칠나무 추출물은 물, 에탄올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 헥산, 벤젠, 및 에틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매를 이용하여 추출되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 수초화 재생을 촉진시키거나, 탈수초화를 억제시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는, 탈수초 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서,
상기 탈수초 질환은 급성 파종성 탈수초(acute disseminated demyelination), 레버 유전성 시각 신경병증(Leber hereditary optic neuropathy), 탈수초성 다발성 신경병증(demyelinating polyneuropathy) 및 샤르코 마리 투스병(Charcot Marie Tooth)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
제 6 항에 있어서,
상기 황칠나무 추출물은 황칠나무 잎의 추출물인 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
제 6 항에 있어서,
상기 황칠나무 추출물은 물, 에탄올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 헥산, 벤젠, 및 에틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매를 이용하여 추출되는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
삭제
제 6 항에 있어서,
상기 조성물은 수초화 재생을 촉진시키거나, 탈수초화를 억제시키는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는, 희소돌기아교세포 분화 촉진용 조성물로서,
상기 조성물은 in vitro 상에서 희소돌기아교세포 전구체세포(Oligodendrocyte precursor)로부터 희소돌기아교세포로의 분화를 촉진시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제 11 항에 있어서,
상기 황칠나무 추출물은 황칠나무 잎의 추출물인 것을 특징으로 하는, 희소돌기아교세포 분화 촉진용 조성물.
제 11 항에 있어서,
상기 황칠나무 추출물은 물, 에탄올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 헥산, 벤젠, 및 에틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매를 이용하여 추출되는 것을 특징으로 하는, 희소돌기아교세포 분화 촉진용 조성물.
삭제