KR101970888B1 - 항균능력을 가지고 있는 박테리오신의 생산을 유산균에서 증진시키기 위한 방법 - Google Patents

항균능력을 가지고 있는 박테리오신의 생산을 유산균에서 증진시키기 위한 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 병원균에 대한 효과적인 항균능력을 가지고 있는 미생물의 항균성 단백질의 생산을 증진시키기 위한 방법에 관한 것으로, 미생물의 먹이가 되는 다당류에 소수성 잔기를 도입시켜 입자 크기가 작고 균일한 나노입자를 개발하여 이를 유산균에 처리함으로써 항균성 단백질의 생산 능력이 향상된 유산균 및 이로부터 생산된 항균성 단백질을 이용하여 항생제 대체 물질뿐 아니라 식품 천연 보존제로서 상업적으로 활용할 수 있다.

Description

항균능력을 가지고 있는 박테리오신의 생산을 유산균에서 증진시키기 위한 방법{A method for promoting the production of bacteriocin in lactic acid bacteria}
본 발명은 미생물로부터 항균성 단백질을 대량으로 얻기 위한 항균성 단백질의 생산 증강방법에 관한 것이다.
최근 경제발전과 더불어 육류의 소비량이 급증하는 반면, 전세계적으로 가축 성장촉진용 사료첨가 항생제의 사용이 규제되어 가축의 성장 및 건강을 향상시키는데 큰 영향을 미쳐 농가의 경제적 손실이 발생하고 있다. 또한, 육제품의 최소가공 및 비가열 식품의 소비가 확대됨에 따라, 식품에 사용되는 천연보존제의 개발이 필수적으로 요구되고 있다. 이에 따라, 여러 연구자들이 가축의 건강을 보호하고 증진시키면서 식품의 안전성을 확보하기 위한 새로운 방법을 찾고 있는데, 이러한 방법에 대한 많은 후보들 중 생균제 및 생균제가 분비하는 항균물질의 이용은 항생제를 대체하는 훌륭한 대안이 될 수 있다.
생균제(probiotics)는 가축이 유해 미생물에 대한 저항능을 가질 수 있도록 가축에 급여하는 살아있는 미생물로, 가축에게 생균제를 적절하게 급여할 경우에는 가축의 건강에 긍정적인 효과를 미쳐 가축 생산성을 향상시킬 수 있다. 이러한 생균제로는 병원균에 대해 항균력을 가지는 유산균이 활용되어, 가장 효과적인 항생제 대체제로 각광받고 있다. 또한, 생균제가 분비하는 다양한 항균물질(antimicrobial molecule)은 병원균에 대한 효과적인 항균능력을 가짐으로써 실제로 천연 식품보존제로서 식품보전 기술 개발에 널리 이용되고 있다. 특히, 생균제가 분비하는 항균물질 중 항균성 단백질(bacteriocin)은 식품의 미생물학적 안전성과 저장성을 개선시키기 위한 천연 보존료로 주목받고 있다. 대한민국 등록특허 제1047948호에는 박테리오신을 생산하는 4종의 유산균 및 이를 함유하여 가축의 항생제 대체물질로 사용 가능한 생균제 조성물이 기재되어 있다.
항균성 단백질은 주로 그람 양성균 및 그람 음성균에서 생성되는 단백질 또는 단백질과 탄수화물의 복합체로 구성되며, 섭취시 체내 단백질 가수분해효소에 의해 분해되어 체내에 무독하고 잔류성이 없어 일반적으로 안전한 물질(GRAS)로 알려져 있다. 이러한 항균성 단백질은 폭넓은 항균범위와 안전성을 가지고 있으며, 실제로 다양한 병원균에 대해서 효과적인 항균능력을 가지고 있는 것이 입증된 바 있다. 항균성 단백질 중 가장 많이 연구개발된 니신(nisin)은 락토코커스 락티스(lactococcus lactis)에서 생산되는 것으로, 유일하게 상업적으로 대량 생산되어 kg당 40만원 이상의 높은 가격으로 판매되며 주로 가공치즈의 보존료로 사용되고 있다. 그러나, 아직까지 다양한 생균제 및 이들로부터 생산된 항균성 단백질을 상업적으로 대량 생산하기에는 많은 연구개발이 필요한 실정이다.
대한민국 등록특허 제1047948호
상기한 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 미생물에서 생합성되는 항균성 단백질의 생산량을 향상시키기 위한 항균성 단백질의 생산 증강방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 소수성 잔기를 가지는 다당류가 함유된 배지에서 항균성 단백질을 생산하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 항균성 단백질의 생산 증강방법을 제공한다.
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본 발명에 따른 항균성 단백질의 생산 증강방법은 생균제의 먹이가 되는 프리바이오틱스를 소수성 잔기를 가지는 다당류로 제공함으로써 생균제의 유기산, 항균성 단백질 등 항균물질의 생산량을 향상시킬 수 있다. 이때, 생균제에서 생산되는 항균성 단백질은 생균제에 소수성 잔기가 없는 일반적인 다당류를 제공하여 생산된 항균성 단백질에 비해 발현양이 최대 4배 이상 증가되는 것으로 확인되어, 항균성 단백질의 상업적 대량 생산 및 활용 가능성을 기대할 수 있다.
이러한 방법으로 생산된 항균성 단백질은 체내 독성을 나타내지 않지만, 병원균의 활성을 억제할 수 있기 때문에 가축의 항생제 대체 물질로 이용 가능할 뿐 아니라 햄, 소시지 등과 같은 가공육제품에 대한 식품의 천연 보존제로 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 예에 따른 소수성 잔기를 가지는 다당류(inulin nanoparticles)의 항균능력 증진 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 예에 따른 소수성 잔기를 가지는 다당류(PIN, PDN)의 화학적 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 예에 따른 소수성 잔기를 가지는 다당류(PIN)의 합성과정 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 예에 따른 소수성 잔기를 가지는 다당류(PIN)의 SEM 이미지이다.
도 5는 본 발명의 일 예에 따른 소수성 잔기를 가지는 다당류(PIN)의 입자 크기, 소수성 잔기의 함량, 표면전하를 측정한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 예에 따른 소수성 잔기를 가지는 다당류(PIN)의 항균능력을 측정한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 예에 따른 소수성 잔기를 가지는 다당류(PIN)의 미생물 내 도입과 입자 크기에 따른 도입을 확인한 이미지이다.
도 8은 본 발명에 따른 소수성 잔기를 가지는 다당류(PIN)의 온도 및 운반체에 따른 도입을 확인한 이미지이다.
도 9는 본 발명의 일 예에 따른 소수성 잔기를 가지는 다당류(PIN)의 도입에 의한 페디오신의 발현을 측정한 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 예에 따른 소수성 잔기를 가지는 다당류(PIN)의 도입에 의한 유산균 활성을 측정한 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 예에 따른 소수성 잔기를 가지는 다당류(PDN)의 SEM 이미지, 소수성 잔기의 함량, 입자 크기, 표면전하를 측정한 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 예에 따른 소수성 잔기를 가지는 다당류(PDN)의 항균능력을 측정한 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일 예에 따른 소수성 잔기를 가지는 다당류(PDN)의 유산균 내 배양 온도 및 시간에 따른 도입을 확인한 이미지이다.
도 14는 본 발명에 따른 소수성 잔기를 가지는 다당류(PDN)의 운반체에 따른 도입을 확인한 이미지이다.
도 15는 본 발명의 일 예에 따른 소수성 잔기를 가지는 다당류(PDN)의 도입에 의한 페디오신의 농도 및 유전자 발현을 측정한 그래프이다.
도 16은 본 발명의 일 예에 따른 소수성 잔기를 가지는 다당류(PDN)의 도입에 의한 유산균 활성을 측정한 그래프이다.
도 17은 본 발명의 일 예에 따른 소수성 잔기를 가지는 다당류(CPN)의 도입에 의한 유산균 활성을 측정한 그래프이다.
도 18은 본 발명의 일 예에 따른 소수성 잔기를 가지는 다당류(PrlN)의 도입에 의한 유산균 활성을 측정한 그래프이다.
도 19은 본 발명의 일 예에 따른 소수성 잔기를 가지는 다당류(PSN)의 도입에 의한 유산균 활성을 측정한 그래프이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 항균성 단백질의 생산 증강방법, 이로부터 생산된 항균성 단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 조성물을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
<항균성 단백질의 생산 증강방법>
항균성 단백질(bacteriocin)은 유산균, 효모, 광합성균, 바실러스균 등 유용한 미생물에서 생합성되는 단백질 또는 단백질과 탄수화물이 결합된 당단백질로, 미생물 자신을 스스로 방어하기 위해 생산하는 항균 효과가 있는 물질이다. 상기 항균성 단백질 또는 항균성 단백질을 생산하는 미생물(생균제)을 섭취할 경우에는 체내에서 유익균의 활성 및 생장을 향상시키는 반면 유해균의 활성 및 생장을 억제하고, 체내 단백질 가수분해효소에 의해 분해되어 독성이 나타나지 않고 체내 잔류하지 않아 부작용이 없다. 이러한 항균성 단백질은 체내 투여시 부작용을 나타내는 항생제의 안전한 대체 물질로 사용할 수 있으며, 나아가 식품 보존제로 활용할 수 있다는 장점이 있다. 그러나, 미생물에서 생합성되는 항균성 단백질의 양이 매우 소량이기 때문에 이를 상업적으로 이용하기에는 제약이 있다.
이로 인해, 본 발명에서는 미생물로부터 항균성 단백질의 생산량을 향상시키기 위한 새로운 방법을 제공하고자 한다. 이때, 미생물의 먹이로 소수성 잔기를 가지는 다당류(polysaccharide with hydrophobic group)가 함유된 배지에서 미생물을 배양함으로써 소수성 잔기가 없는 다당류가 함유된 배지에서 배양된 미생물에 비해 많은 양의 항균성 단백질을 얻을 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 항균성 단백질의 생산 증강방법은 소수성 잔기를 가지는 다당류가 함유된 배지에서 항균성 단백질을 생산하는 미생물을 배양하는 단계를 포함한다.
상기 미생물은 항균성 단백질을 생산하는 유산균, 효모, 광합성균, 바실러스균 등일 수 있다. 특히, 생균제(probiotics)로 사용되는 유산균인 것이 바람직하며, 항균성 단백질을 소량으로 생산하는 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)인 것이 더욱 바람직하다.
도 1을 참조하면, 미생물(microorganism)은 외부 또는 내부 자극에 의해 유전자 발현이 활성화되면서 에너지원을 이용하여 항산화물질, 해독물질, 항균물질, 호르몬 등 다양한 생리활성 물질을 생합성한다. 상기 에너지원으로는 생균제 등 유용한 미생물이 이용할 수 있으면서 체내에서 소화되지 않는 비소화성 성분인 프리바이오틱스(prebiotics)일 수 있다. 상기 프리바이오틱스로는 올리고당류(oligosaccharide), 당알코올류(sugar alcohol), 다당류(polysaccharide) 등일 수 있다. 상기 올리고당류의 비제한적인 예로는 말토올리고당(maltooligo), 이소말토올리고당(isomaltooligo), 프락토올리고당(fructooligo), 갈락토올리고당(galactooligo), 키토올리고당(chitooligo) 등이 있다. 상기 당알코올류의 비제학적인 예로는 아라비톨(arabitol), 락티톨(lactitol), 소르비톨(sorbitol), 자일리톨(xylitol) 등이 있다. 상기 다당류의 비제한적인 예로는 셀룰로오스(cellulose), 이눌린(inulin), 풀루란(pullulan), 전분(starch), 덱스트란(dextran), 펙틴(pectin) 등이 있다. 본 발명에서는 프리바이오틱스로 다당류를 사용하는 것이 바람직하다.
이러한 다당류는 자연에서 얻은 것으로 소수성 잔기가 없는 구조이나, 도 2를 참조하면 본 발명의 일 예에 따른 방법에서 사용되는 다당류는 인위적으로 다당류(polysaccharide)의 1차 알코올기에 에스터 결합(ester bond)으로 소수성 잔기(hydrophobic group)를 도입시킨 구조이다. 상기 소수성 잔기로는 아세테이트(acetate), 프로피오네이트(propionate), 부틸레이트(butyrate), 프탈레이트(phthalate), 콜레스테롤(cholesterol), 메르캅토숙신산(mercaptosuccinic acid), 메틸 글루타르산(methyl glutaric acid) 등일 수 있다. 이러한 소수성 잔기가 도입된 다당류는 소수성 잔기들이 서로 결합(소수성 결합)하여 소수성 잔기가 없는 다당류에 비해 크기가 작고 구조가 균일하게 형성되며, 나노입자 형태이다. 이와 같이 소수성 잔기를 가지는 다당류는 미생물의 활성 및 자극을 증가시켜 항균성 단백질의 생합성을 증강시킬 수 있다. 이러한 소수성 잔기를 가지는 다당류의 일 예로는 아세틸 이눌린(acetyl inulin), 프탈릴 이눌린(phthalyl inulin), 프탈릴 덱스트란(phthalyl dextran), 프탈릴 스타치(phthalyl starch), 프탈릴 풀루란(phthalyl pullulan), 콜레스테릴 풀루란(cholesteryl pullulan), 프로필 이눌린(propyl inulin) 등일 수 있다.
상기 소수성 잔기를 가지는 다당류는 다당류와 소수성 물질을 반응시킨 후 동결건조하여 얻을 수 있으며, 이때 촉매제를 사용하여 다당류와 소수성 물질의 반응을 촉진시킬 수 있다. 상기 소수성 물질은 수용액에 용해되지 않으므로, 상기 다당류와 소수성 물질을 유기용매에 용해하여 반응시킬 수 있다. 이러한 반응 후 촉매제나 유기용매를 제거하기 위해 투석과정을 거치는데, 투석을 통해 소수성 잔기를 가지는 다당류의 입자가 보다 균일하고 작게 형성될 수 있어 투석을 1회 이상 수행하는 것이 바람직하다.
보다 구체적으로, 도 3을 참조하면, 상기 소수성 잔기를 가지는 다당류는 (a) 반응기에 유기용매에 용해된 다당류 및 소수성 물질, 촉매제를 투입한 후 질소 분위기 하에서 30 내지 50℃에서 12 내지 36시간 동안 반응시켜 반응액을 제조하는 단계; (b) 상기 반응액을 1차 투석튜브에 주입한 후 증류수에서 1차 투석하는 단계; (c) 상기 1차 투석하여 얻은 1차 반응물질을 동결건조하는 단계; (d) 상기 동결건조된 1차 반응물질을 유기용매에 용해하고, 이를 2차 투석튜브에 주입한 후 증류수에서 2차 투석하는 단계; 및 (e) 상기 2차 투석하여 얻은 2차 반응물질을 동결건조하는 단계를 포함하는 공정을 통해 얻을 수 있다.
상기 (a) 단계에서, 다당류는 셀룰로오스, 이눌린, 풀루란, 전분, 덱스트란 및 펙틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것이 바람직하다. 소수성 물질은 소수성 잔기를 함유하는 염, 산, 산화물, 무수물 등의 형태일 수 있으며, 상기 소수성 잔기는 아세테이트, 프로피오네이트, 부틸레이트, 프탈레이트, 콜레스테롤, 메르캅토숙신산 및 메틸 글루타르산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것이 바람직하다. 이러한 다당류와 소수성 물질을 유기용매에 용해하여 사용하며, 이때 다당류 0.01 내지 2 g/유기용매 ml, 소수성 물질 0.01 내지 3 g/유기용매 ml로 용해할 수 있다. 상기 다당류와 소수성 물질을 혼합하는 비율은 사용되는 다당류 및 소수성 물질에 따라 상이하며, 다당류:소수성 물질=1:0.1 내지 10의 몰비일 수 있고, 바람직하게는 다당류:소수성 물질=1:0.2 내지 6의 몰비일 수 있다. 상기 소수성 물질의 몰비가 0.1 미만일 경우에는 소수성 잔기가 적어 입자가 작고 균일한 소수성 잔기를 가지는 다당류를 얻을 수 없고, 몰비가 10을 초과할 경우에는 다당류에 도입되지 않고 남은 소수성 잔기를 제거하는 과정이 추가로 요구될 수 있다. 촉매제는 다당류와 소수성 물질의 반응속도를 향상시켜 소수성 결합을 빠르게 유도는 것으로, 소듐 아세테이트(sodium acetate), 디메틸아미노피리딘(dimethylaminopyridine) 등을 사용할 수 있다. 이러한 (a) 단계에서는 질소 분위기 하에서 촉매제를 사용하여 다당류와 소수성 물질을 반응시켜 소수성 잔기를 가지는 다당류가 포함된 반응액을 제조할 수 있다.
상기 (b) 단계에서는 상기 반응액에 함유된 유기용매 성분을 제거하기 위해 1차 투석을 진행할 수 있다. 1차 투석은 반응액이 주입된 1차 투석튜브를 증류수에 넣고 저온에서 교반하여 진행할 수 있다.
상기 (c) 단계에서는 1차 투석한 후 상기 1차 투석튜브에서 1차 반응물질을 회수하여 동결건조하여 -20℃에서 보관할 수 있다. 이때, 동결건조를 통해 분말형태의 1차 반응물질을 얻을 수 있으나 균일한 나노입자로 형성되지 않을 수 있어, 반복하여 투석을 진행할 수 있다.
상기 (d) 단계에서는 1차 반응물질의 소수성 잔기들의 결합을 촉진하여 보다 입자 크기가 작은 나노입자로 만들면서 유기용매 성분을 제거하기 위해, 2차 투석을 수행할 수 있다. 이때, 1차 반응물질 0.01 내지 1 g/유기용매 ml로 용해하고, 2차 투석시 상기 1차 반응물질이 주입된 2차 투석튜브를 증류수에 넣고 저온에서 교반하여 진행할 수 있다.
상기 (e) 단계는 2차 투석한 후 상기 2차 투석튜브에서 2차 반응물질을 회수하여 동결건조하여 -20℃에서 보관할 수 있다.
이러한 공정을 통해 얻은 2차 반응물질, 즉 소수성 잔기를 가지는 다당류는 소수성 잔기가 없는 다당류에 비해 입자 크기가 작고 균일한 나노입자일 수 있다.
상기 소수성 잔기를 가지는 다당류를 이용하여 항균성 단백질을 대량 생산하기 위해서는 미생물이 생장할 수 있는 조건의 배지에 상기 소수성 잔기를 가지는 다당류 및 상기 항균성 단백질을 생산하는 미생물을 투입한 후 30 내지 40℃에서 8 내지 24시간 배양할 수 있다.
이후, 미생물이 배양된 배양물에서 항균성 단백질을 회수 및 정제할 수 있으며, 소수성 잔기가 없는 다당류를 사용한 경우에 비해 많은 양의 항균성 단백질을 회수할 수 있다. 이때, 항균성 단백질은 당 업계에 공지된 통상적인 단백질 회수 방법을 이용하여 회수 및 정제될 수 있다.
<항균성 단백질>
본 발명은 상기 항균성 단백질의 생산 증강방법으로부터 생산된 항균성 단백질을 제공한다.
상기 항균성 단백질은 항균성 단백질을 생산하는 미생물 균주에 따라 종류가 상이하다. 유산균에서 생산된 항균성 단백질로는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) 또는 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici)에서 생산된 페디오신(pediocin), 락토바실러스 락티스 속(Lactobacillus lactis subsp.) 또는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)에서 생산된 니신(nisin), 락토바실러스 사케(Lactobacillus sake)에서 생산된 사카신(sakacin), 락토바실러스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius)에서 생산된 살리바리신(salivaricin), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)에서 생산된 헬베티신(heveticin) 또는 락토신(lactocin), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)에서 생산된 아시도필루신(acidophilucin) 또는 락타신(lactacin), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)에서 생산된 플란타리신(plantaricin) 또는 플란타신(plantacin), 바실러스 종(bacillus spp)에서 생산된 메르사시딘(mersacidin), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)에서 생산된 시톨리신(cytolysin), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)에서 생산된 엔테리신(Entericin), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri)에서 생산된 가세리신(gassericin) 등일 수 있다.
<항균성 단백질을 함유하는 조성물>
본 발명은 상기 항균성 단백질을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공한다.
상기 항균성 단백질은 병원균 등 유해 미생물의 생장 및 활성을 억제할 수 있어, 동물의 항생제 대체용 조성물과 식품의 천연 보존용 조성물로 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 구체적으로 설명하나, 하기 실시예는 본 발명의 한 형태를 예시한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[ 준비예 1] PIN1
이눌린 1 g (MW 5,000 g/mol- 1)을 다이메틸폼아마이드(dimethyl formamide) 5 ml에 용해한 후 여기에 5% 소듐아세테이트(sodium acetate) 0.2 ml, 무수프탈산(phthalic anhydride) 0.295 g을 투입하였다. 이때, 이눌린과 무수프탈산의 혼합 비율은 이눌린:무수프탈산=1:0.3의 몰비였다. 이들을 질소 분위기 하에서 40℃에서 24시간 동안 반응시켜 반응액을 제조하였다. 상기 반응액을 1차 투석튜브(투석막 MW=12~14 KDa)에 주입한 후 증류수에서 4℃, 24시간 동안 교반하면서 1차 투석하였다. 이후, 1차 투석튜브에 남은 1차 반응물질을 회수하여 동결건조하였다. 동결건조된 1차 반응물질 1 g을 다이메틸폼아마이드(dimethyl formamide) 100 ml에 용해하고, 이를 2차 투석튜브(투석막 MW=12~14 KDa)에 주입한 후 증류수에서 4℃, 24시간 동안 교반하면서 2차 투석하였다. 이후, 2차 투석튜브에 남은 2차 반응물질을 회수하여 동결건조하여, 소수성 잔기로 프탈레이트를 가지는 이눌린(phthalyl inulin nanoparticle)(PIN1)을 제조하였다.
[ 준비예 2] PIN2
이눌린과 무수프탈산의 혼합 비율이 1:0.3의 몰비 대신 1:0.6의 몰비인 것을 제외하고는, 준비예 1과 동일한 방법으로 소수성 잔기로 프탈레이트를 가지는 이눌린(PIN2)을 제조하였다.
[ 준비예 3] PIN3
이눌린과 무수프탈산의 혼합 비율이 1:0.3의 몰비 대신 1:1.2의 몰비인 것을 제외하고는, 준비예 1과 동일한 방법으로 소수성 잔기로 프탈레이트를 가지는 이눌린(PIN3)을 제조하였다.
[ 준비예 4] PIN4
이눌린과 무수프탈산의 혼합 비율이 1:0.3의 몰비 대신 1:2의 몰비인 것을 제외하고는, 준비예 1과 동일한 방법으로 소수성 잔기로 프탈레이트를 가지는 이눌린(PIN4)을 제조하였다.
[준비 비교예 1] I
준비예 1의 이눌린(I)을 사용하였다.
[ 실험예 1] PIN의 입자 특성
준비예 1 내지 4의 PIN1~4에 대하여, 입자 표면을 주사전자형미경(FE-SEM)(Carl Zeiss社, SUPRA 55VP-SEM)으로 측정하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
또한, 소수성 잔기의 도입 여부를 고해상도 핵자기공명분광기(Bruker 社, AVANCE 600)로 측정하였고, 그 결과를 도 5의 (1)에 나타내었다.
또한, 입자 크기를 다이나믹 광산란 광도계(Otsuka Electronics社, DLS-7000)로 측정하였고, 그 결과를 도 5의 (2)에 나타내었다.
또한, 표면 전하(zeta potential)를 전기영동 광산란 광도계(Otsuka Electronics社, ELS-8000)로 측정하였고, 그 결과를 도 5의 (3)에 나타내었다.
도 4 및 도 5와 같이, PIN1, PIN2, PIN3, PIN4는 소수성 잔기의 도입량이 많을수록 입자 크키가 더욱 작고 균일하며, 소수성 잔기가 일부 노출되어 입자 표면에 (-) 전하를 띠는 것으로 확인되었다.
[ 실험예 2] PIN에 의한 항균능력
준비예 1 내지 4에서 제조된 PIN1~4, 준비 비교예 1의 I에 대하여, 병원성 미생물인 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum, SG) 및 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes, LM)에 대한 항균능력을 측정하였다. 이때, 유용성 미생물로 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici KCTC 21088 376, PA)를 사용하였다.
상기 살모넬라 갈리나룸은 닭 등 조류를 감염시켜 설사 증상을 일으키는 그람 음성균이고, 상기 리스테리아 모노사이토제니스는 뇌수막염이나 패혈증을 일으키는 그람 양성균이다.
(1) 병원성 미생물의 생균수 측정
각 PIN1~4, I가 포함된 배지에서 각 병원성 미생물 SG, LM과 유용성 미생물인 PA를 공동배양(coculture)한 후 병원성 미생물의 생균수(cfu)를 측정하였고, 그 결과를 도 6의 (1)~(3)에 나타내었다.
살모넬라 갈리나룸(SG)에 대해서는, MRS 액상 배지에 각 PIN1, PIN2, PIN3, PIN4, I을 0.5%씩 처리한 후 SG 2.0 x 105 CFU/ml과 PA 2.0 x 105 CFU/ml를 투입하여 37℃의 항온진탕기(incubator shaker)에서 255rpm으로 8시간 동안 공동배양하였다(호기 조건). 이러한 공동배양물을 MacConkey 한전 배지에 도말한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하고, SG의 콜로니 수를 세었다.
리스테리아 모노사이토제니스(LM)에 대해서는, BHI 액상 배지에 각 PIN1, PIN2, PIN3, PIN4, I을 0.5%씩 처리한 후 LM 2.0 x 106 CFU/ml과 PA 2.0 x 105 CFU/ml를 37℃의 항온진탕기에서 255rpm으로 8시간 동안 공동배양하였다(호기 조건). 이러한 공동배양물을 Oxford 한천 배지에 도말한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하고, LM의 콜로니 수를 세었다.
도 6의 (1)과 같이, 각 PIN1~4가 함유된 배지에서 SG와 PA가 공동배양된 경우(PA/PIN1~4)에는 PIN이 없는 배지에서 SG만 배양된 경우(SG), PIN이 없는 배지에서 SG와 PA가 공동배양된 경우(PA), I가 함유된 배지에서 SG와 PA가 공동배양된 경우(PA/I)에 비해 SG의 생균수가 감소되는 것으로 확인되었다. 특히, PIN3이 함유된 배지에서 SG와 PA가 공동배양된 경우(PA/ PIN3), PIN4가 함유된 배지에서 SG와 PA가 공동배양된 경우(PA/ PIN4)가 SG의 생균수를 감소시키는데 우수한 효과가 있는 것으로 확인되었다.
도 6의 (2)와 같이, 각 PIN1~4가 함유된 배지에서 LM과 PA가 공동배양된 경우(PA/PIN1~4)에는 PIN이 없는 배지에서 LM만 배양된 경우(LM), PIN이 없는 배지에서 LM과 PA가 공동배양된 경우(PA), I가 함유된 배지에서 LM과 PA가 공동배양된 경우(PA/I)에 비해 LM의 생균수가 감소되는 것으로 확인되었다. 특히, PIN4가 함유된 배지에서 SG와 PA가 공동배양된 경우(PA/ PIN4)가 SG의 생균수를 감소시키는데 가장 우수한 효과가 있는 것으로 확인되었다.
도 6의 (3)과 같이, 각 PIN1~4가 함유된 배지에서 SG가 배양된 경우(PIN1~4), I이 함유된 배지에서 SG가 배양된 경우(I)에는 PIN이 없는 배지에서 SG가 배양된 경우(SG)와 SG의 생균수가 차이없는 것으로 확인되었다.
(2) 병원성 미생물의 생장 측정
각 PIN1~4, I와 PA가 배양된 배양물을 이용하여 각 병원성 미생물 SG, LM의 생장정도를 측정하였고, 그 결과를 도 6의 (4), (5)에 나타내었다.
먼저, MRS 액상 배지에 PA와 각 PIN1, PIN2, PIN3, PIN4, I를 투입한 후 37℃의 항온진탕기에서 24시간 동안 배양하고, 각 배양물을 회수하였다. 각 배양물 120 ul(2.0 x 108 CFU/ml)를 디스크(paper disc)에 적신 후 상온에서 20분 동안 건조시켰다.
LB 한천 배지에 SG 120 ul(1.0 ~ 2.0 x 108 CFU/ml)를 도말한 후 상기 준비된 디스크를 올려주고, 37℃ 배양기에서 20시간 동안 배양하였다.
도 6의 (4)와 같이, 각 PIN1~4가 함유된 배지에서 PA가 배양된 배양물(PA/PIN1~4)은 PIN이 없는 배지에서 PA가 배양된 배양물(PA), I가 함유된 배지에서 PA가 배양된 배양물(PA/I)에 비해 SG의 생장을 억제하는 것으로 확인되었다. 특히, PIN4가 함유된 배지에서 PA가 배양된 배양물(PA/ PIN4)이 SG의 생장을 억제하는데 우수한 효과가 있는 것으로 확인되었다.
또한, BHI 한천 배지에 LM 120 ul(1.0 ~ 2.0 x 108 CFU/ml)를 도말한 후 상기 준비된 디스크를 올려주고, 37℃ 배양기에서 20시간 동안 배양하였다.
도 6의 (5)와 같이, 각 PIN1~4가 함유된 배지에서 PA가 배양된 배양물(PA/PIN1~4)은 PIN이 없는 배지에서 PA가 배양된 배양물(PA), I와 PA가 배양된 배양물(PA/I)에 비해 LM의 생장을 억제하는 것으로 확인되었다.
결과적으로, PIN의 입자 크기가 작아질수록 이를 이용한 PA의 항균능력이 향상되는 것을 알 수 있었다.
[ 실험예 3] PIN의 미생물내 도입(internalization)
준비예 1 내지 4에서 제조된 PIN1~4에 대하여, 미생물 내 도입 여부를 확인하였다.
여기서 사용된 미생물은 페디오코커스 애시디락티시(PA)이다.
(1) 도입 유무 확인
먼저, FITC(fluorescence isothiocyanate)가 표지된 PIN4를 준비하였다. FITC 5 mg과 DMSO 1 ml에 용해된 PIN4를 혼합한 후 어두운 곳, 상온에서 4시간 동안 교반하였다. 이후 반응물을 에탄올 10 ml에 떨어트려 미반응 FITC를 제거하고, FITC가 표지된 PIN4를 19,000 xg에서 10분 동안 원심분리하여 회수하였다. 이후 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindol, 2 ug/ml) 용액 200 ml를 처리하여 10분 동안 반응시켰다.
MRS 액상 배지 1 ml에서 배양된 상기 PA 0.5 ~ 2.0 x 105 CFU/ml에 0.1% FITC가 표지된 PIN4를 처리하여 37℃, 6시간 동안 배양한 후 PBS 1 ml로 3회 세척하였다. PIN이 처리되지 않은 PA(PA)와 FITC가 표지된 PIN4가 처리된 PA(PA/PIN4-FITC)를 공초점레이져현미경(confocal laser microscope)(Leica社, SP8 STED)으로 측정하였고, 그 결과를 도 7의 (1)에 나타내었다.
도 7의 (1)과 같이, PA에 PIN4가 도입된 것으로 확인되었다.
(2) 입자 크기별 도입 확인
PIN4 대신 각 PIN1, PIN2, PIN3, PIN4를 사용하고, 6시간 대신 3분 동안 배양한 것을 제외하고는, 실험예 3의 (1)과 동일한 방법으로 실험하였다.
FITC가 표지된 PIN1가 도입된 PA(PA/PIN1-FITC), FITC가 표지된 PIN2가 도입된 PA(PA/PIN2-FITC), FITC가 표지된 PIN3가 도입된 PA(PA/PIN3-FITC), FITC가 표지된 PIN4가 도입된 PA(PA/PIN4-FITC)를 유세포분석기(flow cytometry)(BD Biosciences社, BD FACSCanto2) 및 공초점레이져현미경으로 측정하였고, 그 결과를 도 7의 (2)에 나타내었다.
도 7의 (2)와 같이, FITC가 표지된 PIN4(PA/PIN4-FITC)가 PA에 가장 많이 도입된 것으로 확인되었다.
결과적으로, PIN의 입자 크기가 작을수록 유산균내 PIN의 도입율이 증가하는 것을 알 수 있었다.
(3) 배양 온도별 도입 확인
PA에 FITC가 표지된 PIN4(PIN4-FITC)를 37℃에서만 배양하는 대신 4℃, 25℃, 37℃에서 배양하는 것을 제외하고는, 실험예 3의 (1)과 동일한 방법으로 실험하였다.
PIN이 처리되지 않은 PA(Control)와 각 온도에서 FITC가 표지된 PIN4가 도입된 PA(4℃, 25℃, 37℃)를 유세포분석기 및 공초점레이져현미경으로 측정하였고, 그 결과를 도 8의 (1)에 나타내었다.
도 8의 (1)과 같이, 37℃에서 PA에 가장 많은 PIN이 도입된 것으로 확인되었다.
결과적으로, 배양 온도에 따라 유산균내 PIN의 도입이 조절되는 것을 알 수 있었다.
(4) 운반체별 도입 확인
PIN을 세포내로 도입하는 운반체(transporter)를 확인하기 위해, PIN의 운반차단제로 글루코오스(glucose), 갈락토오스(galactose), 프락토오스(fructose)를 사용하였다.
먼저, PBS 1 ml에서 배양된 PA 0.5 ~ 2.0 x 105 CFU/ml에 각 10 wt% 글루코오스, 10 wt% 갈락토오스, 10 wt% 프락토오스를 10분 동안 전처리하였다. 이후 0.1 wt% FITC가 표지된 PIN4을 처리하여 37℃에서 2시간 동안 배양하고, PBS로 3회 세척하였다.
글루코오스가 전처리된 PA(Glucose 10 wt%), 갈락토오스가 전처리된 PA(Galactose 10 wt%), 프락토오스가 전처리된 PA(Fructose 10 wt%)를 유세포분석기 및 공초점레이져현미경으로 측정하였고, 그 결과를 도 8의 (2)에 나타내었다.
도 8의 (2)와 같이, 글루코오스, 갈락토오스, 프락토오스가 전처리된 PA에서 모두 PIN의 도입이 차단된 것으로 확인되었다. 특히, 글루코오스가 전처리된 PA(Glucose 10 wt%)가 프락토오스가 전처리된 PA(Fructose 10 wt%)에 비해 PIN의 도입율이 유의적으로 감소된 것으로 확인되었다.
결과적으로, 유산균내로 PIN 도입시, 글루코오스를 세포내로 운반하는 운반체(glucose transporter)가 더 관여하는 것을 알 수 있었다.
[ 실험예 4] PIN에 의한 페디오신 발현
준비예 1 내지 4에서 제조된 PIN1~4, 준비 비교예 1의 I를 이용하여 PA에서 생합성되는 항균성 단백질인 페디오신을 정제한 후 페디오신의 활성과 페디오신 유전자의 발현을 측정하였다.
(1) 페디오신 정제
각 PIN1, PIN2, PIN3, PIN4, I가 처리된 MRS 액상 배지에 PA를 투입한 후 37℃의 항온진탕기(255 rpm)에서 24시간 동안 배양하였다. 배양물을 4℃에서 3,000 xg로 30분 동안 원심분리하여 상층액을 분리한 후 상층액에 35 wt% 황산암모늄을 투입하여 30분 동안 교반시켰다. 단백질이 침전되면, 4℃에서 3,000 xg로 30분 동안 원심분리하였다. 상층액이 제거된 펠렛(pellet)에 PBS 완충액을 넣고 용해한 후 원심여과기(centrifugal filter)(Sigma-Aldrich社)로 정제하여 시료(samle)를 회수하였다. 시료를 PBS에서 하룻밤(o/n) 동안 투석하였다. 투석하여 얻은 단백질을 동결건조하여 4℃에서 보관하였다.
PA에 아무것도 처리하지 않고 얻은 단백질(PA), PA에 I을 처리하여 얻은 단백질(PA/I), PA에 PIN1을 처리하여 얻은 단백질(PA/PIN1), PA에 PIN2를 처리하여 얻은 단백질(PA/PIN2), PA에 PIN3을 처리하여 얻은 단백질(PA/PIN3), PA에 PIN4를 처리하여 얻은 단백질(PA/PIN4)을 시판중인 페디오신(standard)을 이용하여 SDS-PAGE로 확인하였고, 그 결과를 도 9의 (1)에 나타내었다.
도 9의 (1)과 같이, PA에서 얻은 단백질은 모두 페디오신인 것으로 확인되었다.
또한, PA에 아무것도 처리하지 않고 얻은 단백질(PA), PA에 I을 처리하여 얻은 단백질(PA/I), PA에 PIN1을 처리하여 얻은 단백질(PA/PIN1), PA에 PIN2를 처리하여 얻은 단백질(PA/PIN2), PA에 PIN3을 처리하여 얻은 단백질(PA/PIN3), PA에 PIN4를 처리하여 얻은 단백질(PA/PIN4)을 BSA(bovine serum albumin)를 이용하여 브래드포드법(Bradford assay)으로 정량하였고, 그 결과를 도 9의 (2)에 나타내었다.
도 9의 (2)와 같이, PA에 각 PIN1~4를 처리하여 얻은 단백질(PA/ PIN1 ~ 4)은 PA에 아무것도 처리하지 않고 얻은 단백질(PA), PA에 I를 처리하여 얻은 단백질(PA/I)에 비해 페디오신의 발현양이 많은 것으로 확인되었다. 특히, PA에 PIN4를 처리하여 얻은 단백질(PA/ PIN4)은 PA에 아무것도 처리하지 않고 얻은 단백질(PA)에 비해 페디오신의 발현양이 약 4배 이상 많은 것으로 확인되었다.
(2) 페디오신 활성
각 PIN1, PIN2, PIN3, PIN4, I가 처리된 MRS 액상 배지에 PA를 투입한 후 37℃의 항온진탕기(255 rpm)에서 24시간 동안 배양하였다. 배양물을 4℃에서 3,000 xg로 30분 동안 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 항균 효과를 없애기 위해, 각 상층액에 1M NaOH를 넣어 pH 5.5로 조절하여 시료(sample)을 준비하였다.
각 시료로 PA에 아무것도 처리하지 않고 얻은 단백질(PA), PA에 I을 처리하여 얻은 단백질(PA/I), PA에 PIN1을 처리하여 얻은 단백질(PA/PIN1), PA에 PIN2를 처리하여 얻은 단백질(PA/PIN2), PA에 PIN3을 처리하여 얻은 단백질(PA/PIN3), PA에 PIN4를 처리하여 얻은 단백질(PA/PIN4)을 LM이 도포된 플레이트에 주입하여 억제영역(inhibition zone)의 지름을 측정하였고, 그 결과를 도 9의 (3)에 나타내었다.
도 9의 (3)과 같이, PA에 각 PIN1~4를 처리하여 얻은 단백질(PA/ PIN1 ~ 4)은 PA에 아무것도 처리하지 않고 얻은 단백질(PA), PA에 I를 처리하여 얻은 단백질(PA/I)에 비해 페디오신의 활성이 우수한 것으로 확인되었다. 특히, PA에 PIN4를 처리하여 얻은 단백질(PA/ PIN4)의 페디오신의 활성이 가장 우수한 것으로 확인되었다.
(3) 페디오신 유전자 발현
페디오신 관련 유전자로는 pedA, pedB, pedC, pedD가 있다.
먼저, 각 PIN1, PIN2, PIN3, PIN4, I가 처리된 MRS 액상 배지에 PA를 투입한 후 37℃의 항온진탕기(255 rpm)에서 24시간 동안 배양하였다. 각 배양물로부터 박테리아 RNA 분리 키트(Thermo Fisher Scientific社, TRIzol® Max™ Bacterial RNA Isolation Kit)를 이용하여 RNA를 추출하여 준비하였다.
아무것도 처리되지 않은 PA(PA), I가 처리된 PA(PA/I), PIN1가 처리된 PA(PA/PIN1), PIN2가 처리된 PA(PA/PIN2), PIN3가 처리된 PA(PA/PIN3), PIN4가 처리된 PA(PA/PIN4)의 RNA 1 ug씩 cDNA 합성 키트(TOYOBO社, ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix)를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 각 cDNA를 각 유전자의 프라이머(primer)와 PCR 키트(TOYOBO社, SYBR qPCR Mix)를 이용하여 실시간 정량 PCR(Real-time quantitative PCR)으로 cDNA를 증폭하였고, 그 결과를 도 9의 (4)에 나타내었다.
도 9의 (4)와 같이, 각 PIN1~4가 처리된 PA(PA/ PIN1 ~ 4)는 아무것도 처리되지 않은 PA(PA), I가 처리된 PA(PA/I)에 비해 pedA, pedD 발현양이 높은 것으로 확인되었다. 특히, PIN4가 처리된 PA(PA/ PIN4)의 pedA, pedD 발현양이 가장 우수한 것으로 확인되었다.
반면, pedB의 발현은 PIN1~4에 따른 차이가 없는 것으로 확인되었고, pedC의 발현은 수치가 너무 낮아 확인되지 않았다.
결과적으로, PIN는 PA에 도입되어 페디오신 유전자인 pedA와 pedD의 발현을 자극하여 페디오신의 발현을 향상시키는 것을 알 수 있었다.
[ 실험예 5] PIN에 의한 유산균 활성
준비예 1 내지 4에서 제조된 PIN1~4, 준비 비교예 1의 I가 미생물의 생리활성에 영향을 미치는지 확인하기 위해, 유산균의 생장속도, 젖산분비 능력, 짧은사슬지방산의 생산량을 확인하였다.
이때, 미생물로 유산균인 페디오코커스 애시디락티시(PA)를 사용하였으며, 이러한 유산균은 대사산물로 젖산과 짧은사슬지방산을 생산한다.
(1) 유산균의 생장속도, 젖산분비 능력
각 PIN1, PIN2, PIN3, PIN4, I가 처리된 MRS 액상 배지에 PA 2.0 x 105 CFU/ml를 투입한 후 37℃의 항온진탕기(255 rpm)에서 24시간 동안 배양하였다.
이때 0, 3, 6, 9, 12, 24시간째 아무것도 처리되지 않은 PA(PA), I가 처리된 PA(PA/I), PIN1가 처리된 PA(PA/PIN1), PIN2가 처리된 PA(PA/PIN2), PIN3가 처리된 PA(PA/PIN3), PIN4가 처리된 PA(PA/PIN4)의 생존 세포수 및 각 배양물의 pH를 측정하였고, 그 결과를 도 10의 (1), (2)에 나타내었다.
도 10의 (1), (2)와 같이, PIN1~4가 처리된 PA(PA/ PIN1 ~4), I가 처리된 PA(PA/I)는 아무것도 처리되지 않은 PA(PA)와 생장속도, pH가 차이 없는 것으로 확인되었다.
(2) 유산균의 짧은사슬지방산 생산량
실험예 5의 (1)에서 24시간째 배양된 배양물을 기체크로마토그래피(gas chromatography)(Thermo Scientific社, Trace 1310)를 이용하여 아무것도 처리되지 않은 PA(PA), I을 처리한 PA(PA/I), PIN1을 처리한 PA(PA/PIN1), PIN2를 처리한 PA(PA/PIN2), PIN3을 처리한 PA(PA/PIN3), PA에 PIN4를 처리한 PA(PA/PIN4)의 짧은사슬지방산(short chain fatty acid, SCFA)을 측정하였고, 그 결과를 도 10의 (3)에 나타내었다.
도 10의 (3)과 같이, 각 PIN1~4가 처리된 PA(PA/ PIN1 ~ 4)는 아무것도 처리되지 않은 PA(PA)에 비해 짧은사슬지방산의 생산량이 감소된 것으로 확인되었다. 특히, PIN4가 처리된 PA(PA/ PIN4)가 짧은사슬지방산의 생산량이 가장 적은 것으로 확인되었다.
결과적으로, PIN 도입이 PA의 생장에 영향을 미치지 않으나, 짧은사슬지방산을 생산하는데 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.
[ 준비예 5] PDN
덱스트란 1 g (MW 6,000 g/mol- 1)을 다이메틸폼아마이드 2 ml에 용해한 후 여기에 5% 소듐아세테이트 0.2 ml, 무수프탈산 1.6 g을 투입하였다. 이때, 덱스트란과 무수프탈산의 혼합 비율은 덱스트란:무수프탈산=1:2의 몰비였다.
이후 준비예 1과 동일한 방법으로 소수성 잔기로 프탈레이트를 가지는 덱스트란(phthalyl dextran nanoparticle, PDN)을 제조하였다.
[준비 비교예 2] D
준비예 5의 덱스트란(D)을 사용하였다.
[ 실험예 6] PDN의 입자 특성
PIN1~4 대신 준비예 5의 PDN를 사용한 것을 제외하고는, 실험예 1과 동일한 방법으로 입자 표면, 소수성 잔기의 도입 여부, 입자 크기, 표면 전하를 측정하였고, 그 결과를 도 11의 (1)~(4)에 나타내었다.
도 11과 같이, PDN은 소수성 잔기가 도입되어 입자가 작고 균일하며, 입자 표면에 (-) 전하를 띠는 것으로 확인되었다.
[ 실험예 7] PDN에 의한 항균능력
준비예 5에서 제조된 PDN, 준비 비교예 2의 D에 대하여, 병원성 미생물인 대장균(Escherichia coli K88, E.coli) 및 살모넬라 갈리나룸(SG)에 대한 항균능력을 측정하였다. 이때, 유용성 미생물로 페디오코커스 애시디락티시(PA)를 사용하였다.
상기 대장균은 포유류에서 복통, 설사, 발열 등을 동반한 장내 질환을 일으키는 그람 음성균이다.
(1) 병원성 미생물의 생균수 측정
각 PDN, D가 포함된 배지에서 각 병원성 미생물 E.coli, SG와 유용성 미생물인 PA를 공동배양한 후 병원성 미생물의 생균수를 측정하였고, 그 결과를 도 12의 (1), (2)에 나타내었다.
대장균(E.coli)에 대해서는, MRS 액상 배지에 각 PIN4, PDN, D를 0.5%씩 처리한 후 E.coli 2.0 x 105 CFU/ml과 PA 2.0 x 105 CFU/ml를 투입하여 37℃의 항온진탕기에서 255rpm으로 8시간 동안 공동배양하였다(호기 조건). 이러한 공동배양물을 MacConkey 한전 배지에 도말한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하고, E.coli의 콜로니 수를 세었다.
도 12의 (1)과 같이, PDN이 함유된 배지에서 E.coli와 PA가 공동배양된 경우(PA/PDN)에는 PDN이 없는 배지에서 E.coli만 배양된 경우(E. coli), PDN이 없는 배지에서 E.coli와 PA가 공동배양된 경우(PA), D가 함유된 배지에서 E.coli와 PA가 공동배양된 경우(PA/D)에 비해 E.coli의 생균수가 감소되는 것으로 확인되었다.
살모넬라 갈리나룸(SG)에 대해서는, 각 PIN1~4, I 대신 PDN, D를 사용한 것을 제외하고는, 실험예 2의 (1)과 동일한 방법으로 실험하였다.
도 12의 (2)와 같이, PDN이 함유된 배지에서 SG와 PA가 공동배양된 경우(PA/PDN)에는 PDN이 없는 배지에서 SG만 배양된 경우(SG), PDN이 없는 배지에서 SG와 PA가 공동배양된 경우(PA), D가 함유된 배지에서 SG와 PA가 공동배양된 경우(PA/D)에 비해 SG의 생균수가 감소되는 것으로 확인되었다.
(2) 병원성 미생물의 생장 측정
각 PDN, D와 PA가 배양된 배양물을 이용하여 각 병원성 미생물 E.coli, SG의 생장정도를 측정하였고, 그 결과를 도 12의 (3), (4)에 나타내었다.
실험예 2의 (2)와 동일한 방법으로 디스크를 준비하였다.
LB 한천 배지에 E.coli 120 ul(1.0 ~ 2.0 x 108 CFU/ml)를 도말한 후 상기 준비된 디스크를 올려주고, 37℃ 배양기에서 20시간 동안 배양하였다.
도 12의 (3)과 같이, PDN이 함유된 배지에서 PA가 배양된 배양물(PA/ PDN)은 PDN이 없는 배지에서 PA가 배양된 배양물(PA), D가 함유된 배지에서 PA가 배양된 배양물(PA/D)에 비해 E.coli의 생장을 억제하는 것으로 확인되었다.
또한, LB 한천 배지에 SG 120 ul(1.0 ~ 2.0 x 108 CFU/ml)를 도말한 후 상기 준비된 디스크를 올려주고, 37℃ 배양기에서 20시간 동안 배양하였다.
도 12의 (4)와 같이, PDN이 함유된 배지에서 PA가 배양된 배양물(PA/ PDN)은 PDN이 없는 배지에서 PA가 배양된 배양물(PA), D가 함유된 배지에서 PA가 배양된 배양물(PA/D)에 비해 SG의 생장을 억제하는 것으로 확인되었다.
결과적으로, PDN에 의한 PA의 항균능력이 우수한 것을 알 수 있었다.
[ 실험예 8] PDN의 도입
준비예 5에서 제조된 PDN, 준비 비교예 2의 D에 대하여, 미생물 내 도입 여부를 확인하였다. 이때, 미생물로 페디오코커스 애시디락티시(PA)를 사용하였다.
(1) 배양 온도별 도입 확인
PIN1~4 대신 PDN, D를 사용한 것을 제외하고는, 실험예 3의 (3)과 동일한 방법으로 실험하였다.
각 온도에서 FITC가 표지된 PDN, D가 도입된 PA(4℃, 25℃, 37℃)를 공초점레이져현미경으로 측정하였고, 그 결과를 도 13의 (1)에 나타내었다.
도 13의 (1)과 같이, 37℃에서 PA에 가장 많은 PDN, D가 도입된 것으로 확인되었다. 특히, 37℃에서 PA에 대한 PDN의 도입이 D에 비해 많은 것으로 확인되었다.
(2) 배양 시간별 도입 확인
PIN1~4 대신 PDN, D를 사용하고, 6시간 대신 각 3, 5, 10분 동안 배양한 것을 제외하고는, 실험예 3의 (1)과 동일한 방법으로 실험하였다.
각 배양 시간에 따라 FITC가 표지된 PDN, D가 도입된 PA(3min. 5min, 10min)를 공초점레이져현미경으로 측정하였고, 그 결과를 도 13의 (2)에 나타내었다.
도 13의 (2)와 같이, 배양시간이 늘어날수록 PA에 대한 PDN, D의 도입이 증가하는 것으로 확인되었다. 특히, 배양 10분째에서 PA에 대한 PDN의 도입이 D에 비해 많은 것으로 확인되었다.
(3) 운반체별 도입 확인
PIN4 대신 PDN, D를 사용하고, 10분 대신 1, 2시간 처리하는 것을 제외하고는, 실험예 3의 (4)와 동일한 방법으로 실험하였다.
글루코오스가 전처리된 PA(Glucose 10 wt%), 갈락토오스가 전처리된 PA(Galactose 10 wt%), 프락토오스가 전처리된 PA(Fructose 10 wt%)를 공초점레이져현미경으로 측정하였고, 그 결과를 도 14의 (1)~(3)에 나타내었다.
도 14의 (1)과 같이, 글루코오스가 전처리된 PA에서는 PDN의 도입이 차단되는 것으로 확인되었다.
도 14의 (2)와 같이, 갈락토오스가 전처리된 PA에서는 배양 1시간째 PDN의 도입이 차단되는 반면, 배양 2시간째 PDN이 도입되는 것으로 확인되었다.
도 14의 (3)과 같이, 프락토오스가 전처리된 PA에서는 PDN의 도입이 차단되지 않는 것으로 확인되었다.
결과적으로, 유산균내로 PIN 도입시, 글루코오스 및 갈락토오스를 세포내로 운반하는 운반체(glucose transporter, galactose transporter)가 관여하는 것을 알 수 있었다.
[ 실험예 9] PDN에 의한 페디오신 발현
준비예 5에서 제조된 PDN, 준비 비교예 2의 D를 이용하여 PA에서 생합성되는 항균성 단백질인 페디오신의 농도와 유전자 발현을 측정하였다.
(1) 페디오신 농도
PIN1~4, I 대신 PDN, D를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실험예 4의 (1)과 동일한 방법으로 실험하였다.
PA에 아무것도 처리하지 않고 얻은 단백질(PA), PA에 D를 처리하여 얻은 단백질(PA/D), PA에 PDN을 처리하여 얻은 단백질(PA/PDN)을 BSA를 이용하여 브래드포드법으로 정량하였고, 그 결과를 도 15의 (1)에 나타내었다.
도 15의 (1)과 같이, PA에 PDN을 처리하여 얻은 단백질(PA/ PDN), PA에 D를 처리하여 얻은 단백질(PA/D)은 PA에 아무것도 처리하지 않고 얻은 단백질(PA)에 비해 페디오신의 발현양이 많은 것으로 확인되었다.
(2) 페디오신 유전자 발현
PIN1~4, I 대신 PDN, D를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실험예 4의 (3)과 동일한 방법으로 실험하였다.
아무것도 처리되지 않은 PA(PA), D가 처리된 PA(PA/D), PDN이 처리된 PA(PA/PDN)의 페디오신 유전자 발현을 측정하였고, 그 결과를 도 15의 (2)에 나타내었다.
도 15의 (2)와 같이, PDN을 처리한 PA(PA/ PDN)는 아무것도 처리되지 않은 PA(PA), D가 처리된 PA(PA/D)에 비해 pedA, pedB, pedC, pedD 발현양이 높은 것으로 확인되었다. 특히, PDN을 처리한 PA(PA/ PDN)의 pedA 발현이 유의적으로 증가한 것으로 확인되었다.
결과적으로, PDN에 의해 pedA 발현이 향상되어 페디오신의 발현을 향상시키는 것을 알 수 있었다.
[ 실험예 10] PDN에 의한 유산균 활성
준비예 5에서 제조된 PDN, 준비 비교예 2의 D가 미생물의 생리활성에 영향을 미치는지 확인하기 위해, 유산균의 생장속도와 젖산분비 능력을 확인하였다.
PIN1~4, I 대신 PDN, D를 사용한 것을 제외하고는, 실험예 5의 (1)과 동일한 방법으로 실험하였다.
이때 0, 3, 6, 9, 12, 24시간째 아무것도 처리되지 않은 PA(PA), D가 처리된 PA(PA/D), PDN이 처리된 PA(PA/PDN)의 생존 세포수 및 각 배양물의 pH를 측정하였고, 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16과 같이, PDN가 처리된 PA(PA/ PDN), D가 처리된 PA(PA/D)는 아무것도 처리되지 않은 PA(PA)와 생장속도, pH가 차이 없는 것으로 확인되었다.
[ 준비예 6] CPN
먼저, 소수성 물질로 사용되는 콜레스테릴 숙신산(cholesteryl succinate, CHS)을 준비하였다. 콜레스테릴 숙신산은 DMSO에 용해된 상태로, 디사이클로헥실카보디이미드(DCC, CHS 대비 1.5당량)와 촉매제로 디메틸아미노피리딘(DMAP, CHS 대비 1당량)을 첨가하여 활성화시켰다.
플루란 0.5 g (MW >2,0000 g/mol- 1)을 DMSO 30 ml에 용해한 후 여기에 준비된 콜레스테릴 숙신산을 투입하였다. 이때, 풀루란과 콜레스테릴 숙신산의 혼합 비율은 풀루란:콜레스테릴 숙신산=1:2의 몰비였다. 이들을 질소 분위기 하에서 45℃에서 48시간 동안 반응시켜 반응액을 제조하였다. 차가운 에탄올(반응액의 5배 볼륨)을 이용하여 상기 반응액을 침전시켜 건조한 후 침전물을 회수하였다. 상기 침전물 10 mg을 DMSO 1 ml에 용해하고, 이를 투석튜브(투석막 MW=12~14 KDa)에 주입한 후 증류수에서 RT, 24시간 동안 교반하면서 투석하였다. 이후, 투석튜브에 남은 반응물질을 회수하여 동결건조하여, 소수성 잔기로 콜레스테롤을 가지는 풀루란(cholesteryl pullulan nanoparticle, CPN)을 제조하였다.
[준비 비교예 3] P
준비예 6의 풀루란(P)을 사용하였다.
[ 실험예 11] CPN에 의한 항균능력
준비예 6에서 제조된 CPN, 준비 비교예 3의 P에 대하여, 병원성 미생물인 대장균(E.coli K88)에 대한 항균능력을 측정하였고, 그 결과를 도 17에 나타내었다. 이때, 유용성 미생물로 페디오코커스 애시디락티시(PA)를 사용하였다.
PDN, D 대신 CPN, P를 사용하는 것을 제외하고는, 실험예 7과 동일한 방법으로 실험하였다.
도 17과 같이, CPN이 함유된 배지에서 E.coli와 PA가 공동배양된 경우(PA/ CPN)에는 CPN이 없는 배지에서 E.coli만 배양된 경우(E. coli), CPN이 없는 배지에서 E.coli와 PA가 공동배양된 경우(PA), P가 함유된 배지에서 E.coli와 PA가 공동배양된 경우(PA/P)에 비해 E.coli의 생균수가 감소되는 것으로 확인되었다.
[ 준비예 7] PrlN
이눌린 1 g (MW 5,000 g/mol- 1)을 다이메틸폼아마이드 10 ml에 용해한 후 여기에 5% 소듐아세테이트 0.2 ml, 무수프로피온산(propionic anhydride) 4 ml을 투입하였다. 이때, 이눌린과 무수프로피온산의 혼합 비율은 이눌린:무수프로피온산=1:6의 몰비였다.
이후 준비예 1과 동일한 방법으로 소수성 잔기로 프로피오네이트를 가지는 이눌린(propyl inulin nanoparticle, PrlN)을 제조하였다.
[준비 비교예 4] I
준비예 7의 이눌린(I)을 사용하였다.
[ 실험예 12] INPr에 의한 항균능력
준비예 7에서 제조된 PrlN, 준비 비교예 4의 I에 대하여, 병원성 미생물인 대장균(Escherichia coli K99, E.coli)에 대한 항균능력을 측정하였고, 그 결과를 도 18에 나타내었다. 이때, 유용성 미생물로 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum GS1, LPGS1)을 사용하였다.
PDN, D 대신 PrlN, I를 사용하는 것을 제외하고는, 실험예 7과 동일한 방법으로 실험하였다.
도 18과 같이, PrlN이 함유된 배지에서 E.coli와 LPGS1가 공동배양된 경우(LPGS1+ PrlN)에는 PrlN이 없는 배지에서 E.coli만 배양된 경우(E. coli), PrlN이 없는 배지에서 E.coli와 LPGS1가 공동배양된 경우(LPGS1), I가 함유된 배지에서 E.coli와 PA가 공동배양된 경우(LPGS1 +I)에 비해 E.coli의 생균수가 감소되는 것으로 확인되었다.
[ 준비예 8] PSN
전분 2 g을 DMSO 20 ml에 용해한 후 여기에 5% 소듐아세테이트 0.4 ml, 무수프탈산 3.25 g을 투입하였다. 이때, 전분과 무수프탈산의 혼합 비율은 전분:무수프탈산=1:2의 몰비였다. 이들을 질소 분위기 하에서 40℃에서 24시간 동안 반응시켜 반응액을 제조하였다.
이후 준비예 6과 동일한 방법으로 소수성 잔기로 프탈레이트를 가지는 전분(phthalyl starch nanoparticle, PSN)을 제조하였다.
[준비 비교예 5] RS
준비예 8의 전분(resistant starch, RS)을 사용하였다.
[ 실험예 13] PSN에 의한 항균능력
준비예 8에서 제조된 PSN, 준비 비교예 5의 RS에 대하여, 병원성 미생물인 대장균(E.coli K99)에 대한 항균능력을 측정하였고, 그 결과를 도 19에 나타내었다. 이때, 유용성 미생물로 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum P177, LP177)을 사용하였다.
PDN, D 대신 PSN, RS를 사용하는 것을 제외하고는, 실험예 7과 동일한 방법으로 실험하였다.
도 19와 같이, PSN이 함유된 배지에서 E.coli와 LP177가 공동배양된 경우(LP177+PSN)에는 PSN이 없는 배지에서 E.coli만 배양된 경우(control), PSN이 없는 배지에서 E.coli와 LP177가 공동배양된 경우(LP177), RS가 함유된 배지에서 E.coli와 PA가 공동배양된 경우(LP177+ RS)에 비해 E.coli의 생균수가 감소되는 것으로 확인되었다.
따라서, 유산균에 소수성 잔기를 가지는 다당류를 제공할 경우, 소수성 잔기를 가지는 다당류가 유산균에 경미한 스트레스를 일으켜 유산균의 방어기작이 활성화되어 페디오신과 같은 항균성 단백질의 발현을 향상시키는 것으로 유추할 수 있다.

Claims (11)

  1. 소수성 잔기를 가지는 다당류가 함유된 배지에서 항균성 단백질을 생산하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 항균성 단백질의 생산 증강방법으로,
    상기 소수성 잔기는 아세테이트, 프로피오네이트, 부틸레이트, 프탈레이트, 콜레스테롤, 메르캅토숙신산 및 메틸 글루타르산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고,
    상기 항균성 단백질은 페디오신(pediocin), 니신(nisin), 플란타리신(plantaricin) 또는 플란타신(plantacin)이며,
    상기 항균성 단백질을 생산하는 미생물은 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici), 락토바실러스 락티스 속(Lactobacillus lactis subsp.), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 또는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)인 항균성 단백질의 생산 증강방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 미생물은 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)인 항균성 단백질의 생산 증강방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 다당류는 셀룰로오스, 이눌린, 풀루란, 전분, 덱스트란 및 펙틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 항균성 단백질의 생산 증강방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 소수성 잔기를 가지는 다당류는
    (a) 반응기에 유기용매에 용해된 다당류 및 소수성 물질, 촉매제를 투입한 후 질소 분위기 하에서 30 내지 50℃에서 12 내지 36시간 동안 반응시켜 반응액을 제조하는 단계;
    (b) 상기 반응액을 1차 투석튜브에 주입한 후 증류수에서 1차 투석하는 단계;
    (c) 상기 1차 투석하여 얻은 1차 반응물질을 동결건조하는 단계;
    (d) 상기 동결건조된 1차 반응물질을 유기용매에 용해하고, 이를 2차 투석튜브에 주입한 후 증류수에서 2차 투석하는 단계; 및
    (e) 상기 2차 투석하여 얻은 2차 반응물질을 동결건조하는 단계
    를 포함하는 공정을 통해 얻은 것인 항균성 단백질의 생산 증강방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서, 다당류와 소수성 물질을 1:0.1 내지 10의 몰비로 혼합하는 것인 항균성 단백질의 생산 증강방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 단계는 배지에서 미생물을 30 내지 40℃에서 8 내지 24시간 배양하는 것인 항균성 단백질의 생산 증강방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
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