KR101969070B1 - 항산화 활성을 갖는 삼나무 잎 추출물 및 그의 용도 - Google Patents
항산화 활성을 갖는 삼나무 잎 추출물 및 그의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 클로로겐산을 포함하는 삼나무 잎 열수추출물 또는 상기 삼나무 잎 열수추출물을 크로마토그래피로 분획한 분획물 중 이동상으로 아세트산:메탄올(10:1, v/v)을 사용하여 전개한 박막 크로마토그래피 상 Rf값 0.3 내지 0.5에 상응하는 클로로겐산 고함량 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화제, 항산화 건강기능식품, 피부노화 방지용 화장료 조성물 및 염증성 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
Description
본 발명은 삼나무 잎 추출물 및 그의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 항산화 활성을 갖는 삼나무 잎 열수추출물, 그의 크로마토그래피 분획물 및 상기 열수추출물 및 분획물의 용도에 관한 것이다.
산화방지제의 원료로는 대부분 부틸하이드로아니솔(butylated hydroxyanisole, BHA), 부틸하이드로톨루엔(butylated hydroxytoluene, BHT), 부틸하이드로퀴논(butylated hydroquinone), 갈산(gallic acid) 등과 같은 합성 원료가 이용되고 있는데, 이들의 인체 유해성과 많은 부작용이 보고됨에 따라 대체제가 필요한 실정이다. 자연주의 영향으로 인하여 합성 산화방지제를 대체할 수 있는 부작용이 적고 효과적인 천연 항산화 물질에 관심이 높아지고 있다.
화장품 시장은 매년 성장하고 있으며 이들 중 주름개선 및 미백과 같은 항산화와 관련한 기능성 화장품의 점유율이 높아지고 있다. 이에 따라 새로운 화장품 소재 개발의 필요성이 대두되고 있으며, 천연소재, 친환경, 인체에 무해한 소재에 대한 관심이 높아지고 있다. 원료의 수입 의존도가 높은 화장품 산업에서 국내 소재의 개발은 화장품 산업에서 경쟁력을 증가시킬 것으로 사료된다.
현재 항산화, 항노화에 관련된 천연 기능성 성분으로는 소나무 수피 추출물인 피크노제놀(pycnogenol), 폴리페놀(polyphenol), 베타카로틴(β-carotene), 프로폴리스(propolis) 등이 알려져 있으며, 현재 식품 또는 화장품 원료로 이용되고 있다. 하지만 수목 추출물과 항산화 유효 페놀산에 관한 기술은 부족한 실정이다.
한편, 본 발명자들은 삼나무 정유 추출물 성분에 항산화 활성이 있음을 확인한 바 있다(특허 제1240816호).
그러나, 상기 삼나무 정유 추출물은 유효성분이 보르네올(borneol) 및 네주콜(nezukol) 성분으로 상기 두 성분이 주성분인 박막 크로마토그래피(TLC) 분획의 항산화 활성은 양성대조군인 알파-토코페롤의 절반 정도로 낮았고, 상당한 고농도(1,000 ppm 이상)에서 활성이 나타났기 때문에, 산업성이 다소 떨어지는 문제점을 가지고 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 삼나무 성분 중 항산화 활성이 더 높은 성분을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 클로로겐산을 함유하는 삼나무(Cryptomeria japonica) 잎의 열수추출물 또는 상기 삼나무(Cryptomeria japonica) 잎의 열수추출물을 크로마토그래피로 분획한 분획물 중 이동상으로 아세트산:메탄올(10:1, v/v)을 사용하여 전개한 박막 크로마토그래피 상 Rf값 0.3 내지 0.5에 상응하는 클로로겐산 고함량 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화제가 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 클로로겐산을 함유하는 삼나무(Cryptomeria japonica) 잎의 열수추출물 또는 상기 삼나무(Cryptomeria japonica) 잎의 열수추출물을 크로마토그래피로 분획한 분획물 중 이동상으로 아세트산:메탄올(10:1, v/v)을 사용하여 전개한 박막 크로마토그래피 상 Rf값 0.3 내지 0.5에 상응하는 클로로겐산 고함량 활성 분획물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품첨가제를 포함하는 항산화 건강기능식품이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 클로로겐산을 함유하는 삼나무(Cryptomeria japonica) 잎의 열수추출물 또는 상기 삼나무(Cryptomeria japonica) 잎의 열수추출물을 크로마토그래피로 분획한 분획물 중 이동상으로 아세트산:메탄올(10:1, v/v)을 사용하여 전개한 박막 크로마토그래피 상 Rf값 0.3 내지 0.5에 상응하는 클로로겐산 고함량 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지용 화장료 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 클로로겐산을 함유하는 삼나무(Cryptomeria japonica) 잎의 열수추출물 또는 상기 삼나무(Cryptomeria japonica) 잎의 열수추출물을 크로마토그래피로 분획한 분획물 중 이동상으로 아세트산:메탄올(10:1, v/v)을 사용하여 전개한 박막 크로마토그래피 상 Rf값 0.3 내지 0.5에 상응하는 클로로겐산 고함량 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 삼나무(Cryptomeria japonica) 잎을 열수로 추출하여 삼나무 잎 열수추출물을 제조하는 열수추출단계; 상기 삼나무 잎 열수추출물을 크로마토그래피로 분획하는 크로마토그래피 단계; 상기 크로마토그래피로 분획된 분획물에 대하여 이동상으로 아세트산:메탄올(10:1, v/v)을 사용하여 전개하는 박막 크로마토그래피를 수행하는 박막 크로마토그래피 단계; 및 상기 박막크로마코그래피 상 Rf 값 0.3 내지 0.5에 상응하는 분획물을 수집하는 활성분획 수집단계를 포함하는 삼나무 잎 열수추출물로부터 클로로겐산 고함량 항산화 활성분획을 제조하는 방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 항산화 활성이 뛰어는 클로로겐산의 함량이 높은 삼나무 잎 열수추출물 및 상기 삼나무 잎 열수추출물의 크로마토그래피 분획물의 생산을 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 삼나무 잎 열수추출물 및 그의 크로마토그래피 활성분획의 제조공정을 나타내는 공정도를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 삼나무 잎 열수추출물과 양성대조군으로서 알파-토코페롤, 카테킨, 갈산, 퀘르세틴, 및 알파-토코페롤의 농도에 따른 DPPH 소거활성 분서결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 삼나무 잎 열수추출물을 크로마토그래피로 분획한 7가지 분획물의 농도에 따른 DPPH 소거활성 분석결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 삼나무 잎 열수추출물을 크로마토그래피로 분획한 7가지 분획물의 FRAP 활성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 삼나무 잎 열수추출물을 HPLC로 분석한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 삼나무 잎 열수추출물의 크로마토그래피 분획물(HW-F1 내지 HW-F5)에 대한 GS-MS 분석 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 삼나무 잎 열수추출물의 크로마토그래피 3번 분획(HW-F3)를 HPLC로 분석한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 8a 내지 8e는 상기 삼나무 잎 열수추출물의 크로마토그래피 3번 분획(HW-F3)를 LC-MS/MS로 분석하여 구체적인 화합물을 동정한 결과를 나타내는 크로마토그램 및 동정된 화합물의 구조식을 나타낸다. 도 8a는 프로시아니딘 B2를 나타내고, 도 8b는 카테킨을 나타내며, 도 8c는 클로로겐산을 나타내고, 도 8d는 로비닌을 나타내며, 도 8e는 델피니딘-3-O-글루코사이드를 나타낸다.
도 9는 클로로겐산과 본 발명의 일 실시예에 따른 클로로젠 고함량 활성 분획(HW-F3 및 HW-F4)의 농도에 따른 DPPH 소거능을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 삼나무 잎 열수추출물과 양성대조군으로서 알파-토코페롤, 카테킨, 갈산, 퀘르세틴, 및 알파-토코페롤의 농도에 따른 DPPH 소거활성 분서결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 삼나무 잎 열수추출물을 크로마토그래피로 분획한 7가지 분획물의 농도에 따른 DPPH 소거활성 분석결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 삼나무 잎 열수추출물을 크로마토그래피로 분획한 7가지 분획물의 FRAP 활성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 삼나무 잎 열수추출물을 HPLC로 분석한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 삼나무 잎 열수추출물의 크로마토그래피 분획물(HW-F1 내지 HW-F5)에 대한 GS-MS 분석 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 삼나무 잎 열수추출물의 크로마토그래피 3번 분획(HW-F3)를 HPLC로 분석한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 8a 내지 8e는 상기 삼나무 잎 열수추출물의 크로마토그래피 3번 분획(HW-F3)를 LC-MS/MS로 분석하여 구체적인 화합물을 동정한 결과를 나타내는 크로마토그램 및 동정된 화합물의 구조식을 나타낸다. 도 8a는 프로시아니딘 B2를 나타내고, 도 8b는 카테킨을 나타내며, 도 8c는 클로로겐산을 나타내고, 도 8d는 로비닌을 나타내며, 도 8e는 델피니딘-3-O-글루코사이드를 나타낸다.
도 9는 클로로겐산과 본 발명의 일 실시예에 따른 클로로젠 고함량 활성 분획(HW-F3 및 HW-F4)의 농도에 따른 DPPH 소거능을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "클로로겐산(chlorogenic acid)"는 하기의 화학식을 가진 화합물로서 종래에 커피 추출물에 상당량 함유되어 있는 폴리페놀 중의 하나이다:
상기 클로로겐산은 커피산(caffeic acid) 및 (-)-퀸산(quinic acid)의 에스터로서 리그닌 생합성의 중간체(intermediate)로 기능을 하는 것으로 알려져 있으며(Boerjan et al., Ann. Rev. Plant Biol., 54: 519-546, 2003), 에탄올과 아세톤에 자유롭게 용해된다. 최근 연구에 따르면 클로젠산은 식품에 포함되어 식이시 혈압을 다소 낮춰주는 것으로 알려지고 있고(Zhao et al., Hypertens. Res., 35(4): 370-374, 2011; Onakpoya et al., J. Hum. Hypertens., 29(2): 77-81, 2014), 잠재적인 항-염증 효과에 관하여 연구가 지속되고 있다(Tajik et al., Eur. J. Nutr., 2017).
본 명세서에서 사용된 용어 "식품"이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성식품 및 음료를 모두 포함하는 의도이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분(이하 기능성원료)을 사용하여 제조한 식품으로 건강을 유지하는데 도움을 주는 식품을 의미한다.
특히 본 문서에서 사용되는 "항산화 건강기능식품"은 항산화에 도움을 줄 수 있는 건강기능식품을 의미하며, 항산화에 도움을 준다는 의미는 활성산소종의 생성을 억제하거나 생성된 활성산소종을 신속하게 제거하는 역할을 수행하거나, 기타 산화적 스트레스에 의한 손상을 예방하거나 억제하는 역할을 수행하는 것을 의미한다. 이러한 항산화 활성은 궁극적으로 산화적 스트레스에 의해 발생하는 다양한 질환, 예컨대, 치매, 당뇨, 류마티스성 관절염, 퇴행성 운동신경계 질환 등의 발병을 예방하거나 억제하는데 효과적일 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "염증"은 생체조직의 유해한 자극, 예컨대, 병원균, 손상된 세포, 자극원에 대한 생체반응 중 하나로 면역세포, 혈관, 분자생물학적 중간체들이 관여되어 있는 보호반응이다. 비정상적인 염증반응은 질병으로 간주되는데 이러한 "염증성 질환"에는 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis), 알르레기(allergy), 근증(myophathy), 천식(athma), 전립선염(prostatitis), 과민반응(hypersentivity reaction), 자가면역질환(autoimmune disease), 염증성 대장질환(infammatory bowel disease), 만성 소화 장애증(coeliac disease), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골반염(pelvic inflammatory disease), 사구체신장염(glomerulonephritis), 혈관염(vasculitis), 전관류 손상(preperfusion injury), 이식거부반응(transplant rejection), 간질성 방광염(interstitial cystitis) 등이 포함된다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 클로로겐산을 함유하는 삼나무(Cryptomeria japonica) 잎의 열수추출물 또는 상기 삼나무(Cryptomeria japonica) 잎의 열수추출물을 크로마토그래피로 분획한 분획물 중 이동상으로 아세트산:메탄올(10:1, v/v)을 사용하여 전개한 박막 크로마토그래피 상 Rf값 0.3 내지 0.5에 상응하는 클로로겐산 고함량 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화제가 제공된다.
상기 항산화제에 있어서, 상기 삼나무 잎 열수추출물은 삼나무 잎을 물에 담지한 후 100℃로 10 내지 30시간 가열하여 얻은 액상을 건조하여 제조될 수 있다. 상기 항산화제에 있어서, 상기 크로마토그래피는 칼럼 크로마토그래피 또는 박막 크로마토그래피일 수 있고, 상기 칼럼 크로마토그래피는 가스 클로마토그래피 또는 액체 크로마토그래피일 수 있고, 상기 액체 크로마토그래피의 고정상으로는, 실리카겔, Sephadex 또는 아가로스겔이 사용될 수 있다. 상기 항산화제에 있어서, 상기 박막 크로마토그래피의 고정상은 실리카겔, 알루미나 또는 셀룰로오스 시트일 수 있다.
상기 항산화제에 있어서, 상기 삼나무 잎 열수추출물은 지표성분으로 클로로겐산을 10 mg/g 이상, 바람직하게는 12 mg/g, 더욱 바람직하게는 15 mg/g 이상을 포함할 수 있고 상기 클로로겐산 고함량 활성 분획물은 상기 클로로겐산을 30 mg/g 이상, 바람직하게는 40 mg/g 이상, 더욱 바람직하게는 45 mg/g 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 클로로겐산을 함유하는 삼나무(Cryptomeria japonica) 잎의 열수추출물 또는 상기 삼나무(Cryptomeria japonica) 잎의 열수추출물을 크로마토그래피로 분획한 분획물 중 이동상으로 아세트산:메탄올(10:1, v/v)을 사용하여 전개한 박막 크로마토그래피 상 Rf값 0.3 내지 0.5에 상응하는 클로로겐산 고함량 활성 분획물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품첨가제를 포함하는 항산화 건강기능식품이 제공된다.
상기 항산화 건강기능식품에 있어서, 상기 삼나무 잎 열수추출물은 삼나무 잎을 물에 담지한 후 100℃로 10 내지 30시간 가열하여 얻은 액상을 건조하여 제조될 수 있다. 상기 항산화제에 있어서, 상기 크로마토그래피는 칼럼 크로마토그래피 또는 박막 크로마토그래피일 수 있고, 상기 칼럼 크로마토그래피는 가스 클로마토그래피 또는 액체 크로마토그래피일 수 있고, 상기 액체 크로마토그래피의 고정상으로는, 실리카겔, Sephadex 또는 아가로스겔이 사용될 수 있다. 상기 항산화제에 있어서, 상기 박막 크로마토그래피의 고정상은 실리카겔, 알루미나 또는 셀룰로오스 시트일 수 있다.
상기 항산화 건강기능식품에 있어서, 상기 삼나무 잎 열수추출물은 지표성분으로 클로로겐산을 10 mg/g 이상, 바람직하게는 12 mg/g, 더욱 바람직하게는 15 mg/g 이상을 포함할 수 있고 상기 클로로겐산 고함량 활성 분획물은 상기 클로로겐산을 30 mg/g 이상, 바람직하게는 40 mg/g 이상, 더욱 바람직하게는 45 mg/g 이상을 포함할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "식품첨가제"는 "식품첨가물"이라고도 불리우며, 식품을 제조 ㅇ가공 또는 보존을 함에 있어 식품에 첨가·혼합·침윤, 기타의 방법으로 사용되는 물질을 의미한다. 상기 식품첨가제에는 보존료, 살균제, 산화방지제, 착색제, 발색제, 표백제, 조미료, 감미료, 향료, 팽창제, 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등이 포함되며, 식품첨가물공전에 규정되어 있다.
상기 건강기능식품은 식품 첨가제 외에, 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있으며, 통상적인 건강기능식품의 제형인 정, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 및 바의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실,채소류 음료, 두유류, 발효 음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)를 포함하는 다양한 식품에 첨가될 수 있다.
상기 건강기능식품에 포함되는 유효성분의 함량은 건강기능식품의 제형, 복용자의 나이, 건강, 성별, 1일 복용횟수에 따라 달라지나, 건강기능식품 100 중량부당 0.01 내지 50 중량부 범위에서 선택될 수 있다.
항산화에 도움을 주는 건강기능식품에 있어서, 상기 삼나무 잎 열수추출물 또는 상기 분획물은 전체 식품중량의 약 0.01 내지 50 중량%, 약 0.1 내지 40 중량%, 약 1% 내지 30%, 약 1% 내지 20%, 약 1% 내지 15%, 약 1% 내지 12%, 약 1% 내지 10%의 범위로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 클로로겐산을 함유하는 삼나무(Cryptomeria japonica) 잎의 열수추출물 또는 상기 삼나무(Cryptomeria japonica) 잎의 열수추출물을 크로마토그래피로 분획한 분획물 중 이동상으로 아세트산:메탄올(10:1, v/v)을 사용하여 전개한 박막 크로마토그래피 상 Rf값 0.3 내지 0.5에 상응하는 클로로겐산 고함량 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지용 화장료 조성물이 제공된다.
상기 피부노화 방지용 화장료 조성물에 있어서, 상기 삼나무 잎 열수추출물은 삼나무 잎을 물에 담지한 후 100℃로 10 내지 30시간 가열하여 얻은 액상을 건조하여 제조될 수 있다. 상기 항산화제에 있어서, 상기 크로마토그래피는 칼럼 크로마토그래피 또는 박막 크로마토그래피일 수 있고, 상기 칼럼 크로마토그래피는 가스 클로마토그래피 또는 액체 크로마토그래피일 수 있고, 상기 액체 크로마토그래피의 고정상으로는, 실리카겔, Sephadex 또는 아가로스겔이 사용될 수 있다. 상기 항산화제에 있어서, 상기 박막 크로마토그래피의 고정상은 실리카겔, 알루미나 또는 셀룰로오스 시트일 수 있다.
상기 피부노화 방지용 화장료 조성물에 있어서, 상기 삼나무 잎 열수추출물은 지표성분으로 클로로겐산을 10 mg/g 이상, 바람직하게는 12 mg/g, 더욱 바람직하게는 15 mg/g 이상을 포함할 수 있고 상기 클로로겐산 고함량 활성 분획물은 상기 클로로겐산을 30 mg/g 이상, 바람직하게는 40 mg/g 이상, 더욱 바람직하게는 45 mg/g 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 상기 삼나무 잎 열수추출물 또는 상기 분획물 외에도 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 예컨대, 안정화제, 용해화제, 계면활성제, 비타민, 색소 및 항료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 상기 삼나무 잎 열수 추출물 또는 상기 클로로겐산 고함량 활성 분획물을 항산화 성분으로 포함하는 것을 제외하고 당업계에 통상적으로 행하여지는 화장료 조성물의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
상기 화장료 조성물에 포함되는 유효성분의 함량은 화장료 조성물의 제형, 이용자의 나이, 건강, 성별, 1일 도포횟수에 따라 달라지나, 화장료 조성물 100 중량부당 0.01 내지 20 중량부 범위에서 선택될 수 있다.
상기 화장료 조성물에 있어서, 상기 삼나무 잎 열수추출물 또는 상기 클로로겐산 고함량 활성 분획물은 전체 화장료 조성물의 약 0.01 내지 20 중량%, 약 0.1 내지 18 중량%, 약 1% 내지 15%, 약 1% 내지 12%, 약 1% 내지 10%, 약 1% 내지 7%, 약 1% 내지 5%의 범위로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 클로로겐산을 함유하는 삼나무(Cryptomeria japonica) 잎의 열수추출물 또는 상기 삼나무(Cryptomeria japonica) 잎의 열수추출물을 크로마토그래피로 분획한 분획물 중 이동상으로 아세트산:메탄올(10:1, v/v)을 사용하여 전개한 박막 크로마토그래피 상 Rf값 0.3 내지 0.5에 상응하는 클로로겐산 고함량 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 삼나무 잎 열수추출물은 삼나무 잎을 물에 담지한 후 100℃로 10 내지 30시간 가열하여 얻은 액상을 건조하여 제조될 수 있다. 상기 항산화제에 있어서, 상기 크로마토그래피는 칼럼 크로마토그래피 또는 박막 크로마토그래피일 수 있고, 상기 칼럼 크로마토그래피는 가스 클로마토그래피 또는 액체 크로마토그래피일 수 있고, 상기 액체 크로마토그래피의 고정상으로는, 실리카겔, Sephadex 또는 아가로스겔이 사용될 수 있다. 상기 항산화제에 있어서, 상기 박막 크로마토그래피의 고정상은 실리카겔, 알루미나 또는 셀룰로오스 시트일 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 삼나무 잎 열수추출물은 지표성분으로 클로로겐산을 10 mg/g 이상, 바람직하게는 12 mg/g, 더욱 바람직하게는 15 mg/g 이상을 포함할 수 있고 상기 클로로겐산 고함량 활성 분획물은 상기 클로로겐산을 30 mg/g 이상, 바람직하게는 40 mg/g 이상, 더욱 바람직하게는 45 mg/g 이상을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 적합한 1일 투여량은, 100 μg/kg 내지 1 mg/kg(체중)이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 몇 주간 수회 나누어 투여할 수 있다.
또한, 상기 본 발명의 일 실시예에 따른 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분(corn starch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘, 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스(tragacanth), 젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린, 펙틴(pectin) 등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수 있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의(糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수 있다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 삼나무(Cryptomeria japonica) 잎을 열수로 추출하여 삼나무 잎 열수추출물을 제조하는 열수추출단계; 상기 삼나무 잎 열수추출물을 크로마토그래피로 분획하는 크로마토그래피 단계; 상기 크로마토그래피로 분획된 분획물에 대하여 이동상으로 아세트산:메탄올(10:1, v/v)을 사용하여 전개하는 박막 크로마토그래피를 수행하는 박막 크로마토그래피 단계; 및 상기 박막크로마코그래피 상 Rf 값 0.3 내지 0.5에 상응하는 분획물을 수집하는 활성분획 수집단계를 포함하는 삼나무 잎 열수추출물로부터 클로로겐산 고함량 항산화 활성분획을 제조하는 방법이 제공된다.
상기 방법에 있어서, 상기 크로마토그래피는 칼럼 크로마토그래피 또는 박막 크로마토그래피일 수 있고, 상기 캄럼 크로마토그래피는 가스 크로마토그래피 또는 액체 크로마토그래피일 수 있으며, 상기 액체 크로마토그래피는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)일 수 있다. 아울러, 상기 박막 크로마토그래피는 고정상으로 실리카겔, 알루미나 또는 셀룰로오스 시트를 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 다른 경우를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 경우 "포함한다(comprise)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 하나 이상의 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 삼나무 잎 열수추출물 및 그의 크로마토그래피 활성분획의 제조공정을 나타내는 공정도를 나타낸다. 도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 삼나무 잎 열수추출물은 삼나무 잎을 물에 침지한 후 100℃에서 24시간 끓인 후 고형분을 제거하고 남은 액상을 동결건조하여 분말화함으로써 제조될 수 있다. 이렇게 제조된 삼나무 잎 열수추출물은 DPPH 소거 활성 분석을 수행한 결과 31.25 ppm라는 비교적 낮은 농도에서 40% 이상의 활성을 나타냈고, 125 ppm에서는 93.9%의 매우 높은 활성을 나타냈다. 특히, 62.5 ppm 이상의 농도에서는 양성대조군인 알파-토코페롤과 유사한 활성을 나타냈다(도 2 참조). 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 삼나무 잎 추출물과 양성대조군으로서 알파-토코페롤, 카테킨, 갈산, 퀘르세틴, 및 알파-토코페롤의 농도에 따른 DPPH 소거활성 분석결과를 나타내는 그래프이다.
이에, 본 발명자들은 상기 삼나무 잎 열수추출물의 강력한 항산화 활성이 어떤 유효성분에 의한 것이었는지 확인하기 위하여, 상기 삼나무 잎 열수추출물을 칼럼 크로마토그래피를 통해 분획하였고, 각각의 분획에 대하여 DPPH 소거활성 분석 및 FRAP(ferrinc reducing ability of plasm) 활성을 측정하였다(도 3 및 4 참조). 그 결과, 세 번째 분획(HW-F3) 및 네 번째(HW-F4)가 다른 분획에 비해 낮은 농도에서부터 매우 높은 항산화 활성을 가짐을 확인하였다. 다음으로, 본 발명자들은 상기 삼나무 잎 열수추출물에 포함된 성분이 무엇인지 확인하기 위해, HPLC 분석을 수행하였다(도 5 참조). HPLC 분석 결과, 클로로겐산(chlorogenic acid)이 주성분임을 확인하였다.
이어, 본 발명자들은 상기 삼나무 잎 추출물의 분획물의 성분분석을 위하 TMS 유도체화(trimethylsilylation)한 후 GS-MS 분석을 수행하였다(도 6 참조). 그 결과, 도 6에서 나타난 바와 같이, 분획 1(HW-F1) 및 분획 2(HW-F2)는 페놀 화합물의 전구체인 쉬킴산(shikimic acid)와 당성분인 피니톨(pinitol), 포도당 및 만노스 등이 검출되었으며, 항산화 활성이 가장 높았던 분획 3(HW-3)의 주요성부은 쉬킴산, 퀸산(quinic acid), 카테킨(catechin), 및 클로로겐산(chlorogenic acid)이었고, 항산화 활성이 두 번째로 높았던 분획 4(HW-F4)의 주요성분은 말산(malic acid), 퀸산, 및 클로로겐산이었다. 다른 분획들(HW-F5 내지 HW-F7)에서는 클로젠산이 발견되지 않았다(표 2 참조). 클로로겐산은 상술한 바와 같이, 커피산과 퀸산의 에스터 화합물로서 분획물의 퀸산은 TMS 유도체화 과정에서 열에 의해 클로로겐산의 에스터 결합이 파괴되어 생성된 부산물로서, 클로로겐산으로부터 유래한 것으로 추정된다. 따라서, 상기 결과로부터 클로로겐산과 그외 페놀산들이 삼나무 잎 열수추출물 및 크로마토그래피 활성분획물의 항산화 활성의 지표물질이라고 추정하였다.
| No. | HW-F1 | HW-F2 | HW-F3 | HW-F4 | HW-F5 |
| 1 | Shikimc acid | Shikimc acid | Shikimc acid | Malic acid | Malic acid |
| 2 | D-Pinitol | D-Pinitol | Quinic acid | Quinic acid | Quinic acid |
| 3 | Mannopyranose | Quinic acid | Catechin | Chlorogenic acid | |
| 4 | Acrylic acid | Mannopyranose | Chlorogenic acid | ||
| 5 | Glucopyranose | Acrylic acid | |||
| 6 | Glucopyranose | ||||
| 상기 번호는 도 6에서 각 분획에서 나타난 피크의 번호임 | |||||
더 나아가, 본발명자들은 정확한 구조분석을 위해, 가장 황산화 활성이 높았던 분획 3(HW-F3)에 대한 LC-MSMS 분석을 수행하였다(도 7 참조). 그 결과 도 7에서 나타난 바와 같이, 프로시아니딘 B2(procyanidin B2), 카테킨(catechin), 클로로겐산, 로비닌(robinin) 및 델피니딘(delphinidin)이 주요성분으로 검출되었다.
이와 같이 삼나무 잎 열수추출물의 주성분은 클로젠산이며 본 발명를 통해 삼나무 잎으로부터 클로로겐산 함유 활성 분획을 제조하는데 성공하였다고 판단된다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예
1: 삼나무 잎
열수추출물의
제조
본 발명에 사용된 수종은 천연목인 삼나무(Cryptomeria japonica)로 삼나무 잎을 대상으로 추출을 수행하였으며, 생재상태의 삼나무 잎 600 g(전건무게: 284.28 g)을 열수 추출 방법으로 100℃에서 24시간 가열하여 액상을 얻은 후, 동결건조하여 파우더 형태로 시료 25.67 g을 수득하였다(수율 생재 대비 4.28%, 전건 대비 9.03%).
실시예
2: 삼나무 잎
열수추출물의
크로마토그래피
분획물
제조
상기 실시예 1에서 제조된 삼나무 잎 열수추출물에 대하여 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 구체적으로, 고정상인 Sephadex LH-20을 칼럼(지름 9 cm X 높이 30cm) 내에 24시간 동안 메탄올과 물(10:1)의 용매로 충진시켰고, 상기 실시예 1에서 제조된 삼나무 잎 열수추출물을 20 g을 용매(메탄올과 물의 부피 비율 10:1 5 ml)에 용해시킨 후 상기 컬럼에 적재한 후, 전개 용매로는 메탄올과 물의 부피비율을 10:1, 8:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:10 각각 2 L씩을 순차적으로 사용했고, 그 후에는 물로 분획을 실시하였다. 용매의 전개속도는 20 mL/min으로 하여 50 mL씩 분취하였다. 각각의 분취물은 셀룰로오스 F sheet를 고정상으로 하는 박층 크로마토그래피 양상에 따라 7개의 분획물로 나누었고, 분획물은 HW-F1~HW-F7로 명명하였다. 상기 박막 크로마토그래피의 구체적인 조건은 하기와 같다:
이동상: 아세트산:메탄올(10:1, v/v)
발색시약: 바닐린:HCl:에탄올(4.8:12:480, w/v/v)
상기 발색시약을 뿌린 후, 열을 가해 건조하여 같은 위치에 점을 갖는 분취물을 모아 분획물로 나누었다.
상기 TLC 결과 추후 활성분석으로 확인된 3번 분획(HW-F3) 및 4번 분획(HW-F4)는 Rf 값이 각각 0.422 및 0.36으로 확인되었다.
실험예
1: 삼나무 잎 열수추출물의 항산화 활성 분석
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제조된 삼나무 잎 열수추출물의 항산화 활성을 DPPH 라디칼 소거능 분석방법을 이용하여 측정하였다. 구체적으로, 각 추출물 당 여러 농도 별 시료를 준비하고 시료 1 mL와 1.5×10-4 mol/L의 DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) 용액 1 mL를 혼합하여 10초간 진탕한 후, 상온에서 30분간 암반응시켜 색변화 관찰을 통해 라디칼 소거 활성을 평가하였다. 이 때 양성 대조군으로는 대표적인 항산화 물질인 카테킨, 갈산, 퀘르세틴 및 알파-토코페롤을 사용하였다. 안정한 자유라디칼인 DPPH의 색변화를 통해 활성을 평가할 수 있으며, 이는 UV-Visible 분광광도계(Shimadzu, Japan)를 이용하여 517 nm에서의 흡광도를 측정한 후, 하기의 식으로 DPPH 라디칼 소거 활성을 계산하였다:
DPPH 라디칼 소거 활성(%)= [1-(A/B)]X100
A: 시료의 517 nm에서의 흡광도;
B: 대조군(빈시료) 517 nm에서의 흡광도.
그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 삼나무 잎 열수추출물은 31.25 ppm에서 40% 이상의 활성을 나타냈고 62.5 ppm 이상에서는 87.3%로 높은 활성을 나타냈으며, 125 ppm에서는 93.9%로 매우 높은 활성을 나타냈다. 특히, 62.5 ppm 이상의 농도에서 대조군으로 사용된 알파-토코페롤과 유사한 활성을 나타냈다(도 2). 삼나무 잎 열수추출물의 유효농도(EC50)은 약 40 ppm인 것으로 확인되었다. 본 발명의 일 실시예에 따른 삼나무 잎 열수추출물은 카테킨, 갈산, 및 퀘르세틴 보다는 낮은 활성을 보였지만 125 ppm의 낮은 농도에서 100%에 가까운 활성을 나타냈기 때문에 본 발명의 일 실시예에 따른 삼나무 잎 열수추출물은 항산화 유효성이 있다고 판단된다.
실험예 2: 삼나무 잎 열수추출물의 크로마토그래피 분획물의 항산화 활성 분석
2-1: DPPH 라디칼 소거활성 분석
본 발명자들은 상기 실시예 2에서 제조된 삼나무 잎 열수추출물의 크로마토그래피 분획물 1 내지 7에 대하여 상기 실험예 1과 마찬가지로 DPPH 소거활성을 분석하였다. 사용된 방법은 시료를 삼나무 잎 열수추출물 대신 크로마토그래피 분획물들을 사용하였다는 점을 제외하고는 동일하였다.
그 결과 도 3에서 나타난 바와 같이, 12.5 ppm의 농도에서 3번 분획(HW-F3)은 79.9%, 4번 분획(HW-F4)은 81.8%의 높은 라디칼 소거활성을 나타냈다. 25 ppm 이상의 농도에서는 두 분획물 모두 90% 이상의 활성으로 높은 라디칼 소거 효과를 나타냈다(도 3). 대조군과 비교했을 때, HW-F3와 HW-F4는 알파-토코페롤 및 카테킨과 유사한 효과를 나타내며, 낮은 농도에서 우수한 라디칼 소거활성을 보였다. 이는 삼나무 열수추출물의 활성 분획물이 보편적인 항산화 물질과 유사한 효과를 가진다는 결과로서, 삼나무 잎 열수추출물이 항산화제 원료로써 가치가 있다는 것을 입증하는 것이다. 많은 연구에서 활성반수영향농도(The term half maximal effective concentration, EC50)를 평가하곤 한다. 본 발명에서는 유효 분획물인 HW-F3와 HW-F4는 각각 6 ppm 및 8 ppm의 EC50을 나타내 매우 효과적인 항산화물질임이 확인되었다. 종래 연구에 따르면, 국내 자생하는 솔잎의 에탄올 추출물의 라디칼 소거 활성은 95.12 ppm에서 EC50을 나타낸 것으로 보고된 바 있고(Kwak et al., Nutr. Cancer, 56(2): 162-171, 2006), 솔잎의 열수추출물의 경우 250∼500 ppm에서 라디칼 소거 활성을 나타낸다고 보고된 바 있으며(Park et al., Nutr. Res. Parct. 5(4): 281-287, 2011), 편백 잎의 아세톤추출물 중, 에틸아세테이트 분획물이 126.4 ppm에서 EC50을 나타낸다고 보고된 바 있다(Lee et al., Appl. Chem. Eng. 23(1): 93-99, 2012). 이는 위와 같은 수목 추출물들이 삼나무 잎 열수추출물보다 높은 농도에서 라디칼 소거 활성을 나타내는 것을 의미하므로 삼나무 잎 열수추출물은 효과적인 항산화 원료로의 적용이 가능할 것으로 사료된다.
2-2: FRAP 활성 분석
FRAP(ferrinc reducing ability of plasma) 활성은 특정 물질의 환원력 평가방법 중의 하나로, 3가 철 이온(Fe3+)을 2가 철 이온(Fe2+)으로 환원시키는 능력을 평가하는 방법이다. 본 발명자들은 Benzie and Strain의 방법을 변형하여 측정하였다(Benzie & Strain, Anal. Biochem. 239(1): 70-76, 1996). 구체적으로 300 mM의 아세테이트 버퍼(pH 3.6)와 40 mM의 염산용액에 10 mM TPTZ(2,4,6-tripyridyl-s-triazine)을 혼합한 용액, 20 mM의 3가 염화철(iron (III) chloride, 6수화물)을 혼합하여 모액(stock solution)으로 준비했다. 모액은 부피 비 10:1:1 비율의 250 mL 아세테이트 버퍼, 25 mL TPTZ 용액, 25 mL 염화철 용액의 혼합액으로 37℃에 보관하였다. 각 분획물 150 μL(12.5 ppm)와 모액 2,850 μL를 혼합한 후, 상온에서 30분 동안 암반응시켰다. 그 후, UV-Visible 분광광도계(Shimadzu, Japan)를 이용하여 593 nm에서 흡광도를 측정했다. 각각의 흡광도는 Trolox의 표준곡선에 의해 μM TE/μg fresh mass로 나타냈다.
그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이, 상기 실험예 2-1과 유사하게 분획물 중 3번 분획(HW-F3) 및 4번 분획(HW-F4)이 높은 FRAP 활성을 나타냈다. HW-F3은 0.85 μM TE/μg, HW-F4는 0.84 μM TE/μg을 나타내며 다른 분획물보다 높은 환원력을 나타냈다(도 4). 대조군인 카테킨, 갈산, 퀘르세틴 및 알파-토코페롤 보다는 낮은 활성을 나타냈지만 종래 연구 결과에 따르면 허브, 수목, 과실 등의 30종의 식물 추출물의 FRAP 활성은 1 μM TE/μg 미만이었다(Dudonnㅹ et al., J. Agric. Food Chem. 57(5): 1768-1774, 2009). 따라서 삼나무 잎 열수추출물의 크로마토그래피 활성 분획물은 유효 항산화 식물 추출물과 유사한 FRAP 활성을 가지므로 천연 항산화 추출물로의 적용이 가능하다고 사료된다.
실험예
3: 성분분석
3-1: HPLC 분석
이에 본 발명자들은 삼나무 잎 열수추출물의 성분분석을 위해 하기와 같이 HPLC를 수행하였다.
HPLC 분석은 Ultimate3000 HPLC(Dionex) 기기를 이용하였고, 소프트웨어는 chromeleon 6.8을 기반으로 수행하였다. 이동상은 0.8 mL/min의 속도로 주입하였고, 이동상 A는 0.3%의 트리플루오로아세트산, 이동상 B는 아세토니트릴을 이용하였다. 이동상의 비율은 하기 표 1의 (A)와 같다. 컬럼은 VDSpher C-18 column(VDSoptilab Germany 4.6*250, 5 μm)을 사용하였고, 검출기로는 UV 검출기를 사용하여 280 nm와 360 nm 190-400 nm DAD scanning)의 파장의 흡광도를 이용하여 검출하였다.
| (A) | ||||||
| 시간(분) | 0 | 25 | 30 | 35 | 36 | 40 |
| A % | 90 | 40 | 0 | 0 | 90 | 90 |
| B % | 10 | 60 | 100 | 100 | 10 | 10 |
| (B) | ||||||
| 시간(분) | 0 | 2 | 17 | 20 | 21 | 23 |
| A % | 65 | 65 | 0 | 0 | 65 | 65 |
| B % | 35 | 35 | 100 | 100 | 35 | 35 |
그 결과 도 5에 나타난 바와 같이, 클로로겐산의 표준물질로 성분분석을 한 결과 주성분이 클로로겐산인 것으로 확인되었다. 한편, 삼나무 잎 열수추출물의 클로로겐산의 함량은 16.2 mg/g인 것으로 확인되었다.
3-2:
GC
-MS 분석
이어 본 발명자들은 상기 삼나무 잎 열수추출물의 크로마토그래피 분획물의 성분분석을 위해 TMS 유도체화(trimethylsilylation) 후 GS-MS 분석을 수행하였다.
GC-MS를 위해서 TMS 유도체화(Trimethylsilylation) 반응을 하기와 같이 수행하였다. TMS는 피리딘(JUNSEI, Japan)과 Sylon BFT 용액(BSTFA + TMCS (99:1), SUPELCO)을 1:1의 비율로 시료에 첨가하여 105℃에서 2시간 반응시켜 실시하였다. GC 분석은 Agilent사의 GC 분석기기(model-Agilent 6890, USA) 및 DB-5(25 m×0.32 mm×0.52 μm) 칼럼을 사용하여 수행하였다. 운반기체(carrier gas)로는 헬륨을 사용하였고, 온도조건으로는 주입기(injector) 260℃, 검출기(detector) 280℃을 사용하였다. 오븐 온도는 초기온도 50℃에서 5분간 유지한 후 3℃/min의 속도로 온도를 상승시키고 최종온도 320℃에서 5분간 유지하여 분석하였다. 질량분석(MS analysis)은 Agilent사의 질량분석기(model Agilent 5973. USA)를 사용하였고 EI 모드로 분석하여 얻어진 시료 피크의 질량데이터(mass data)와 표준 라이브러리 데이터(library data, Willy 7th ed)를 비교하여 피크의 화합물 구조를 동정하였다(도 6).
그 결과, 도 6에서 나타난 바와 같이, 각 분획들의 주성분은 대부분 당 성분과 페놀산으로 검출되었다. 낮은 활성을 나타낸 1번 및 2번 분획(HW-F1, 2)는 페놀 화합물의 전구체인 쉬킴산(shikimic acid)와 당성분인 피니톨(pinitol), 포도당 및 만노스 등이 검출되었다. 항산화 활성이 가장 뛰어났던 3번 분획(HW-F3)의 주성분은 쉬킴산, 퀸산(quinic acid), 카테킨(catechin), 클로로겐산(chlorogenic acid)으로 확인되었고, 항산화 활성이 두 번째로 높았던 4번 분획(HW-F4)의 주성분은 말산, 퀸산, 및 클로로겐산으로 확인되었다. 5번 분획(HW-F5)의 주성분은 말산과 퀸산으로 확인되었다. 6번 분획(HW-F6)과 7번 분획(HW-F7)의 경우 특별한 유효성분이 검출되지 않았다. 클로로겐산은 커피산과 퀸산의 에스터 화합물로서, 분획물 내에 포함된 퀸산은 TMS 유도체화 과정에서 열에 의해 에스터 결합이 절단되었기 때문에 생성된 것으로서, 이는 결국 클로로겐산으로부터 유래한 것으로 추정되었다. 이에 따라 활성이 높았던 3번 분획(HW-F3)과 4번 분획(HW-F4)의 공통의 유효성분은 클로로겐산과 그 외 퀸산과 같은 페놀산인 것으로 확인되었다.
3-3: LC-MS/MS 분석
이에 본 발명자들은 활성 분획에 포함된 유효성분의 정확한 구조분석을 위해, 항산화 활성이 가장 높았던 3번 분획(HW-F3)을 대상으로 LC-MS/MS 분석을 수행하였다.
구체적으로, LC-MS/MS 분석을 위해 자동 샘플러(auto-sampler), 다이오드 어레이 검출기(diode array detector), 이원펌프(binary pump)가 부착된 Ultimate 3000 RSLC HPLC 시스템(Thermo Fisher Scientific Inc., MA, USA)과 Triple TOF 5600 Q-TOF LC-MS/MS 시스템(ABSciex, CA)을 이용하여 분석하였다(도 6). LC 분리는 이동상 A(물 + 0.1% 포름산)와 이동상 B(아세토니트릴 + 0.1% 포름산)를 사용했다. 컬럼은 Kinetex 2.6 μm F5 100A (100×2.1 mm, phenomenex, 00D4723AN)를 사용했으며, 유량은 0.25 mL/min이었다. 이동상의 비율은 상기 표 1의 (B)와 같다. 자동 샘플러의 온도는 4℃로 맞추었고, 주입 용량은 1∼5 μL이었다. 질량 스펙트럼은 5,500 V의 이온 분무 전압의 양전자 분무이온화(positive electrospray ionization, ESI)를 통해 수득하였다. 온도 조건은 500℃이었으며, 커튼 가스, 이온원 가스 1과 이온원 가스 2는 각각 35, 65, 55 psi의 압력으로 주입되었다. 질량 스펙트럼은 MS 모드에서 50∼2,000 m/z에서 얻어졌다. 데이터는 TF 1.7 소프트웨어를 이용하여 수집되고 PeakView 2.2.0을 사용하여 분석하였다(도 8a 내지 8e).
그 결과, 도 7 및 도 8a 내지 8e에서 확인되는 바와 같이, 상기 3번 분획의 주요 성분은 1) 프로시아니딘 B2(procyanidin B2, RT: 4.18, m/z [M-H]- = 579.15; MS-MS fragments of m/z 579.15 = 517.15, 427.10, 409.09, 301.07, 291.09, 289.07, 287.06, 271.06, 247.06, 163.04, 139.04, 127.04), 2) 카테킨(catechin, RT: 5.07, m/z [M-H]- = 291.09; MS-MS fragments of m/z 291.09 = 291.09, 273.08, 249.08, 207.07, 1655, 139.04, 123.05), 3) 클로로겐산(chlorogenic acid, RT: 5.35, m/z [M-H]- = 323.25; MS-MS fragments of m/z 323.25 = 163.04, 145.03, 135, 114.04), 4) 로비닌(robinin, RT: 6.33, m/z [M-H]- = 741.18; MS-MS fragments of m/z 741.18 = 741.18, 571.12, 451.10, 433.09,289.07, 259.06, 231.07, 179.04, 153.02), 및 5) 텔피니딘-3-O-글루코사이드(delphinidin-3-O-glucoside, RT: 7.099, m/z [M-H]- = 465.10, MS-MS fragments of m/z 465.10 = 465.10, 303.05)인 것으로 확인되었다.
상기 5 가지 성분 중 로비닌을 제외한 모든 성분들이 항산화 유효성이 알려진 성분이다. 프로시아니딘 B2는 두 개의 에피카테킨이 결합된 성분으로(도 8a 참조), 과일의 껍질, 씨앗 등에 많이 함유되어 있고, 높은 항산화 활성을 나타낸다고 알려져 있으며, 인간 세포 DNA의 산화 손상을 억제하여 암과 같은 질병을 억제한다고 보고된 바 있다(Orozco et al., J. Nutr. Biochem. 14(2): 104-110, 2003). 카테킨은 녹차 잎에 많이 함유된 플라보노이드로서 항산화뿐만 아니라 건강 증진에 효과적인 성분으로 높은 항산화 활성을 가지고 있다고 알려져 있으며, 많은 식물 추출물의 주요 플라보노이드 성분으로 알려져 있으며, 다양한 차 잎의 성분으로 알려짐에 따라 차 섭취의 건강 증진에 대한 연구가 보고된 바 있다(Higdon & Frei, J. Nutr. 133(10): 3275S-3284S, 2003). 클로로겐산은 많은 식물, 과일, 채소 등에 함유되어 있는 성분으로 다양한 항산화 활성 평가에 이용되며 높은 항산화 효과가 규명되었다. 클로로겐산을 섭취할 수 있는 주요 공급원은 커피콩으로 알려져 있고 이렇게 섭취된 클로로겐산은 활성산소종의 생성을 억제한다고 보고된바 있다(Sato et al., Int. J. Pharm. 403(1-2): 136-138, 2011). 캠페롤(Kaempferol) 배당체인 로비닌은 캠페롤에 3개의 당이 결합된 구조로서 로비닌의 세 개의 당은 전자의 공여 반응에 방해되는 성분이기 때문에 비배당체인 캠패롤에 비해 항산화 활성이 낮다고 보고된 바 있다(de Souza Gil et al., Electroanalysis 24(7): 1576-1583, 2012). 한편, 델피니딘-3-O-글루코사이드(delphinidin-3-O-glucosie)는 안토시아니딘 배당체(anthocyanidin glycoside)로서 로비닌과는 달리 비배당체인 델피니딘에 비해 활성이 많이 떨어지지 않는다고 보고된 바 있고, 안토시아니딘(anthocyanidin) 중 활성이 가장 높은 성분은 델피니딘으로, 델피니딘 배당체 또한 항산화 활성이 높다고 보고된 바 있다(Kㅴhkㆆnen & Heinonen, J. Agric. Food Chem., 51: 628-633, 2003). 따라서 로비닌을 제외한 이들 성분들에 의해 삼나무 잎 열수추출물 크로마토그래피 활성분획(HW-F3)의 높은 항산화 활성이 나타난 것이라 판단된다.
한편, 상기 HW-F3 및 HW-F4의 분석 결과 클로로겐산의 함량은 각각, 61.7 mg/g, 47.2 mg/g인 것으로 확인되어, 삼나무 잎 열수추출물에 비해 클로로겐산이 대폭 농축된 것임을 확인하였다.
3-4: 클로로겐산과의 비교분석
상기 LC-MS/MS 분석결과 클로로겐산이 HW-F3와 HW-F4의 주성분으로 확인되었기 때문에, 실제 HW-F3 및 HW-F4의 항산화 활성이 클로로겐산에 의한 것인지 확인하기 위해, 상기 실시예 1-2에서 제조된 삼나무 잎 열수추출물의 활성 분획(HW-F3 및 HW-F4)과 표준물질로서 클로로겐산의 농도에 따른 DPPH 소거능을 상기 실험예 2-1에서 사용한 방법을 이용하여 분석하였다(도 9)
그 결과, 도 9에서 나타난 바와 같이, 3.13 ppm이라는 매우 낮은 농도에서 HW-F3 및 HW-F4는 약 27%의 활성을 나타냈고, 클로로겐산은 17.8%의 활성을 나타냈다. 12.5 ppm의 농도에서 HW-F3 및 HW-F4는 각각 79.83%, 81.78%의 항산화 활성을 나타냈고, 클로로겐산은 69.45%를 나타내, 낮은 농도에서는 삼나무 잎 열수추출물의 활성 분획이 더 높거나 비슷한 항산화 활성을 나타냈다. 25 ppm 이상에서는 세 물질 모두 높은 활성을 나타냈다. 따라서 본 발명의 일 실시예에 따른 삼나무 잎 열수추출물의 크로마토그래피 활성분획은 비록 주요 성분이 클로로겐산이었으나, 동일 농도에서 클로로겐산 단독보다도 더 높은 항산화 활성을 나타낸 것으로 확익되었으며, 이는 클로로겐산 이외의 다른 성분들과의 상승작용에 의한 것임을 시사하는 것이다.
본 발명에서의 특이한 사항은 클로로겐산으로서, 다른 성분들은 많은 추출물에 함유되어 있는 일반적인 플라보노이드 화합물이다. 그러나, 클로로겐산이 삼나무 잎에 상당량 포함되어 있다는 사실은 본 발명에서 처음으로 규명된 것으로서, 본 발명은 강력한 항산화 성분인 클로로겐산을 삼나무로부터 고수율로 추출해 낼 수 있는 기술에 대한 기반을 마련한 것으로 판단된다.
또한, 삼나무 잎 열수추출물의 주성분이 클로로겐산이였으며, 유효 분획물의 주성분 또한 클로로겐산인 것으로 보아, 향후 삼나무 잎 열수추출물을 항산화 소재로 개발함에 있어서, 상기 클로로겐산을 삼나무 잎 열수추출물 및 그의 활성분획의 지표물질로 활용할 수 있을 것이라 사료된다.
본 발명은 상술한 실시예, 실험예 및 도면을 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예 및 실험예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
Claims (15)
- 클로로겐산을 함유하는 삼나무(Cryptomeria japonica) 잎 열수추출물 또는 상기 삼나무(Cryptomeria japonica) 잎 열수추출물을 크로마토그래피로 분획한 분획물 중 이동상으로 아세트산:메탄올(10:1, v/v)을 사용하여 전개한 박막 크로마토그래피 상 Rf값 0.3 내지 0.5에 상응하는 클로로겐산 고함량 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화제.
- 제1항에 있어서,
상기 삼나무 잎 열수추출물은 클로로겐산을 10 mg/g 이상 포함하는, 항산화제. - 제1항에 있어서,
상기 클로로겐산 고함량 활성 분획물은 클로로겐산을 40 mg/g 이상 포함하는, 항산화제. - 제1항에 있어서,
상기 크로마토그래피는 칼럼 크로마토그래피 또는 박막 크로마토그래피인, 항산화제. - 제4항에 있어서,
상기 칼럼 크로마토그래피는 가스 크로마토그래피 또는 액체 크로마토그래피인, 항산화제. - 클로로겐산을 함유하는 삼나무(Cryptomeria japonica) 잎 열수추출물 또는 상기 삼나무(Cryptomeria japonica) 잎 열수추출물을 크로마토그래피로 분획한 분획물 중 이동상으로 아세트산:메탄올(10:1, v/v)을 사용하여 전개한 박막 크로마토그래피 상 Rf값 0.3 내지 0.5에 상응하는 클로로겐산 고함량 활성 분획물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품첨가제를 포함하는 항산화 건강기능식품.
- 제6항에 있어서,
상기 크로마토그래피는 칼럼 크로마토그래피 또는 박막 크로마토그래피인, 항산화 건강기능식품. - 제7항에 있어서,
상기 칼럼 크로마토그래피는 가스 크로마토그래피 또는 액체 크로마토그래피인, 항산화 건강기능식품. - 클로로겐산을 함유하는 삼나무(Cryptomeria japonica) 잎 열수추출물 또는 상기 삼나무(Cryptomeria japonica) 잎 열수추출물을 크로마토그래피로 분획한 분획물 중 이동상으로 아세트산:메탄올(10:1, v/v)을 사용하여 전개한 박막 크로마토그래피 상 Rf값 0.3 내지 0.5에 상응하는 클로로겐산 고함량 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지용 화장료 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 크로마토그래피는 칼럼 크로마토그래피 또는 박막 크로마토그래피인, 피부노화 방지용 화장료 조성물. - 제10항에 있어서,
상기 칼럼 크로마토그래피는 가스 크로마토그래피 또는 액체 크로마토그래피인, 피부노화 방지용 화장료 조성물. - 클로로겐산을 함유하는 삼나무(Cryptomeria japonica) 잎 열수추출물 또는 상기 삼나무(Cryptomeria japonica) 잎 열수추출물을 크로마토그래피로 분획한 분획물 중 이동상으로 아세트산:메탄올(10:1, v/v)을 사용하여 전개한 박막 크로마토그래피 상 Rf값 0.3 내지 0.5에 상응하는 클로로겐산 고함량 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 치료용 약학적 조성물.
- 제12항에 있어서,
상기 크로마토그래피는 칼럼 크로마토그래피 또는 박막 크로마토그래피인, 염증성 질환 치료용 약학적 조성물. - 제13항에 있어서,
상기 칼럼 크로마토그래피는 가스 크로마토그래피 또는 액체 크로마토그래피인, 염증성 질환 치료용 약학적 조성물. - 삼나무(Cryptomeria japonica) 잎을 열수로 추출하여 삼나무 잎 열수추출물을 제조하는 열수추출단계;
상기 삼나무 잎 열수추출물을 크로마토그래피로 분획하는 크로마토그래피 단계;
상기 크로마토그래피로 분획된 분획물에 대하여 이동상으로 아세트산:메탄올(10:1, v/v)을 사용하여 전개하는 박막 크로마토그래피를 수행하는 박막 크로마토그래피 단계; 및
상기 박막 크로마토그래피 상 Rf 값 0.3 내지 0.5에 상응하는 분획물을 수집하는 활성분획 수집단계를 포함하는 삼나무 잎 열수추출물로부터 클로로겐산 고함량 항산화 활성분획을 제조하는 방법.
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| KR20210104441A (ko) | 2020-02-17 | 2021-08-25 | 우석대학교 산학협력단 | N-아세틸펜에틸아민, 펜에틸아민 및 이들의 염으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 동물의 수명연장용 조성물 |
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| 김선홍, 삼나무 잎 추출물의 항산화 활성과 플라보노이드의 화학적 구조에 따른 항산화 상관관계 구명, 농학박사학위논문, 서울대학교(2017.02.) |
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