KR101968878B1 - 제주도 용암해수 유래 미세부착규조를 이용한 넙치의 면역력 증강용 기능성 사료첨가제 및 제조방법 - Google Patents

제주도 용암해수 유래 미세부착규조를 이용한 넙치의 면역력 증강용 기능성 사료첨가제 및 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 제주도 용암해수로부터 부착성 규조류 Melosira nummuloides, Achnanthes brevipes var. intermedia, Achnanthes sancti-pauli, Achnanthes brevipes 그리고 Melosira octogona 로 이루어진 군 중 선택된 한 종 또는 이들의 조합을 분리하는 단계; 상기 분리한 규조류를 배양장치에서 대량배양하는 단계; 상기 대량배양한 규조류로부터 실리카를 분리하는 단계; 분리된 실리카와 유산균 Lactobacillus plantarum을 1 내지 3중량% : 1중량%의 비로 접종하여 사료조성물과 혼합하여 제조되는 제주도 용암 해수로부터 분리한 부착성 규조류를 이용한 넙치의 면역증강용 사료조성물을 제공함으로써 환경, 생명산업 등 응용분야에 이용할 수 있는 산업 기초재를 제공할 수 있다.

Description

제주도 용암해수 유래 미세부착규조를 이용한 넙치의 면역력 증강용 기능성 사료첨가제 및 제조방법{Feed additive for enhancing immune response using the Bio-Silica.}
본 발명은 제주 용암해수에서 분리 배양한 해양규조에 포함된 Bio-Silica 성분을 활용하여 양식넙치의 기능성 향상 및 질병 저감 효과를 가진 친환경적인 Synbiotics 사료 첨가제에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 제주도의 해안에 분포하는 용암해수로부터 분리하여 대량배양된 부착성 규조류로부터 바이오 실리카를 분리하여 제조한 사료첨가제에 관한 것이다.
우리나라에서는 1960년대 후반부터 식물플랑크톤을 포함하는 미세조류에 대한 연구가 활발해지기 시작하여 1980년대 후반부터 생리생태학, 생화학, 유전공학 및 생물공학적인 연구로 확산되었다. 이후 환경 및 생명산업 등의 응용분야로 확대되고 있다.
미세조류는 일반적으로 해양에서 태양에너지를 이용하여 무기물로부터 유기물을 생산하는 생산자로서 동물성 플랑크톤이나 어류 등 해양의 1차 소비자의 먹이가 되며, 광합성을 통하여 해중 용존산소를 높이는 등, 해양 생태계에 중요한 위치를 차지하고 있다. 미세조류는 함유하고 있는 엽록소의 종류 등에 따라 녹조류에서 홍조류, 시아노박테리아까지 매우 다양하다.
현재 상업적으로 생산되고 있는 미세조류들은 주로 고밀도로 배양할 수 있는 광생물 반응기를 이용하여 배양된다. 일반적인 광생물 반응기는 일정한 부피의 수조에 배양하려는 미세조류의 종류에 따라 배양액을 공급하고, 미세조류를 접종한 후, 미세조류의 성장에 유해한 원생동물 및 곰팡이의 유입을 차단하여 순수배양이 이루어지도록 배양액을 여과, 살균 공급하게 된다.
배양액의 공급과 폭기, 광원을 통한 빛의 조사 및 수온 조절 등의 문제로 미세조류의 대량배양에는 많은 에너지가 소모되는 문제가 있고, 특히 사계절이 뚜렷한 우리나라의 경우, 일년내내 미세조류를 대량으로 생산하는 일은 에너지 효율 상의 어려움이 있다.
한편 용암해수란 도 1에서 보는 바와 같이 제주도의 현무암층을 뚫고 육지 지하로 흘러 들어온 바닷물이다. 용암해수는 제주도의 서부 일부지역과 동부지역을 중심으로 발견되며 고농도의 미네랄을 함유하고 있다. 제주도 서부 일부지역과 동부지역은 용암이 굳어 형성된 화산암이 지표에서부터 해수면 아래 약 150m 내외까지 두텁게 분포하며, 본암층은 지하수를 저류시킬 수 있는 공극이 차지하는 비율이 높으며, 해안과 인접하여 해수와 약간의 지하수가 혼합된 대수층이 발달하고 있다(도 1). 또한 일반해수는 생활하수, 산업폐수, 항만오염 등의 불안정한 환경에 노출되어 산업화 소재 가공에 많은 비용이 소요되는 반면, 용암해수는 화산암반층에 의한 자연정화와 여과를 거쳐 중금속 흡착 및 유해물질을 차단하기 때문에 안전성과 안정성, 경제성을 확보하고 있고, 깊은 바다에서 취수하는 해양심층수에 비해서 비교할 수 없을 정도로 취수비용이 저렴하다.
화산암 하부의 서귀포층은 저투수성 지층으로서 화산암층 내 두터운 용암해수 층을 떠받치고 있으며, 화산암층 내 유리질 쇄설성 각력암과 용암류의 경계 및 절리대는 고염분의 염지하수(이하 제주용암해수)의 부존을 용이하게 하는 부존특성을 보이고 있다. 제주 용암해수는 지하 70m 또는 그 이상의 깊이에 대량으로 매장되어 있어 세균, 바러스, 유해 화학물질 등으로부터 완전히 격리되어 있는 반면 일반 해수보다 미네랄성분이 다량으로 함유되어 있다(도 2).
도 2의 결과를 살펴보면 일반 미생물의 수는 일반해수에서 6만 CFU/ml까지 검출되나, 용암해수에서는 거의 검출되지 않는 것으로 나타났다.
본 출원의 발명자는 제주 용암해수를 이용하여 양식을 하는 과정에서 용암해수와 함께 부착성 규조류가 취수되는 것을 확인하고, 이들 부착성 규조류를 우점시켜 대량 배양하는 방법을 확립하였다. 본원 발명에서 분리 확인된 부착성 규조류는 양식 산업의 사료 대체 에너지원으로서 또는 의학, 환경, 생명산업 등 여러 산업분야의 기초재로서 가치가 높은 자원으로 활용가능하다.
한편, 실리카(silica) 또는 이산화규소(silicon dioxide)는 규소의 산화물로 주로 모래나 석영 등에서 발견되는 무수규산광물로, 유리나 콘크리트의 주성분이다. 산업적으로는 실리카는 주로 석영을 비롯한 광물로부터 얻게 되는 무수규산광물로, 일반적으로 천연의 5종 광물 즉, 석영, 트리디마이트, 크리스토밸라이트, 코자이트 및 스티쇼바이트에서 얻어지는 산업 기초재이다. 실리카는 최근에는 고분자/실리카 나노복합체의 제조 등에 사용하며 첨단소재로도 각광을 받고 있다. 이러한 실리카를 본 발명의 규조류 배양을 통해서도 수득할 수 있다.
규조류는 이러한 실리카를 생물학적으로 세포표면에 집적하여 규조껍질을 형성한다. 실리카로 구성된 규조껍질은 규조류가 죽으면 바다나 호수에서 침적되어 규조토를 형성하는데, 최근 규조토는 여과보조재, 흡착제, 충전제, 연마제 등 다양하게 이용되고 있다.
대한민국 등록특허 10-1278146호에서는 발전소나 공장으로부터 온배수를 배출하기 위한 온수배출관, 상기 온수배출관과 연결되어 온수를 이송하는 온수관, 상기 온수관이 일측에 연결되고 내부에 해조류 및 미세조류를 배양하기 위한 하나 이상의 수조장치, 및 상기 수조장치로부터 냉각수를 이송하기 위하여 상기 수조장치의 타측에 연결되는 냉각수관을 구비하는 배양시스템을 개시하고 있다. 대한민국 등록특허 10-1241393호에서는 배양공간이 마련된 배양패널본체를 갖는 광생물 반응기와, 배양패널 본체내로 배지를 공급할 수 있도록 된 배지 공급부와, 배양패널 본체로부터 배양액을 인출하여 희석액과 희석시킬 수 있도록 된 희석부와, 희석부에 의해 희석된 희석 배양액의 농도를 측정하는 농도검출부 및 희석부 및 농도검출부를 제어하여 희석 배양액의 농도 정보를 수신하고, 수신된 희석 배양액의 농도가 설정된 목표농도 이상이면 배양패널본체에 저수된 배양액을 저장라인을 통해 배출되게 하고, 배지공급부를 제어하여 배지가 배양패널본체에 공급되게 제어하면서 미세조류의 생산을 제어하는 제어유니트를 구비하는 미세조류 배양을 위한 광생물반응기 배지 공급 자동화 시스템을 개시하고 있다. 대한민국 공개특허 10-2012-0095826호에서는 세네데스무스(Scenedesmus sp.), 클로렐라(Chlorella sp.), 스피룰리나(Spirulina sp.)등과 같은 이산화탄소의 처리와 동시에 바이오디젤, 사료첨가제, 건강보조식품 등의 생산에 유용한 미세조류의 저비용, 고품질, 대량생산을 실현시킬 수 있는 미세조류 고밀도 배양용 광생물 반응기와, 이를 이용한 미세조류 배양 및 수확 방법을 개시하고 있다. 대한민국 등록특허 10-1256773호에서는 적색광과 청색광을 혼합한 혼합광을 광원으로 사용하여 미세조류를 배양하는 단계를 포함하는 하폐수 고도처리 또는 바이오매스 생산 방법에 관한 것으로, 백색광을 사용하였을 때 보다 미세조류를 이용한 바이오매스 생산량을 증대시키고 질소 및 인 제거량을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 특히, 상기 적색광원 및 청색광원으로는 저전력 소비형 LED(light emitting diode)를 이용하는 파장 선택적 LED 광 조사를 이용한 미세조류에 의한 하폐수 고도처리 및 미세조류 바이오매스 생산성증대방법을 개시하고 있다.
부착성 규조류 중, 대량배양이 용이하면서 수산양식에서 우수한 사료원으로 이용할 수 있는 종을 선택하여 배양방법의 확립함으로서 산업적으로 활용할 수 있다. 본 발명은 제주 용암해수를 이용하여 양식하는 과정에서 용암해수에 포함되어 취수되는 부착성 규조류를 확인하고 이들 부착성 규조류를 우점종시켜 대량 배양하여 수득한 미세조류로부터 실리카를 분리하여 기능성 사료첨가제로 제조하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 제주도 용암해수로부터 부착성 규조류를 분리하는 단계, 상기 분리한 규조류를 대량 배양하는 단계 및 상기 대량 배양한 규조류로부터 실리카를 분리하는 단계, 분리된 실리카에 유산균을 접종하여 이루어진 제주도 용암 해수로부터 분리한 부착성 규조류로부터 실리카를 분리하여 기능성 사료로 제조하는 방법 및 기능성 사료첨가제를 제공한다. 상기 부착성 규조류는 Melosira nummuloides, Achnanthes brevipes var. intermedia, Achnanthes sancti-pauli, Achnanthes brevipes 그리고 Melosira octogona 로 이루어진 군 중 선택된 한 종 또는 이들의 조합인 것이며, 분리한 규조류를 대량배양하는 단계는 일정 부피를 갖는 수조 바닥에 부착기질을 바닥면에 수평으로 형성하고 제주도 용암해수를 취수하여 소통시켜 부착성 규조류를 부착시키는 단계; 상기 부착성 규조류가 부착된 부착기질에 광을 조사하여 배양시켜, 회수하는 단계를 포함한다.
대량배양한 규조류로부터 실리카를 분리하는 단계는 수득한 규조류를 60~80℃의 건조기에서 건조시키는 단계; 상기 건조한 규조류를 분쇄기를 이용하여 분쇄하는 단계; 10% 염산용액에 상기의 규조류 분말을 중량비 95 : 5로 혼합한 후, 95℃에서 5시간동안 교반하여 유기물을 제거하는 단계; Glass filter를 사용하여 상층액을 제거 후 잔사를 수거하는 단계; 상기 수거한 잔사를 증류수를 사용하여 3회 세척하는 단계; 상기 세척된 잔사를 80℃에서 건조하는 단계; 상기 건조된 잔사를 650℃에서 5시간동안 가열하여 유기물을 완전히 제거하는 단계; 및 유기물이 완전히 제거 된 실리카를 수거하여 건조 회수하는 단계;로 이루어진다.
본 발명에 따른 부착성 규조류의 대량 배양방법을 통하여 제주 용암해수와 함께 취수되는 부착성 규조류를 분리하여 대량 배양하고 이를 이용하여 산업적으로 유용한 물질인 실리카를 분리하는 방법 및 대량 배양한 규조류로부터 분리한 실리카를 제공함으로써 의학, 환경, 생명산업 등 여러 산업분야의 기초재로 활용할 수 있다.
도 1은 제주도에 분포하는 용암해수의 분포 위치 및 일반적 설명을 나타낸다. (http://jejutp.or.kr/lavawater/whatis/what.htm)
도 2는 제주도에 분포하는 용암해수의 특성을 일반해수와 비교한 결과를 나타낸다. (http://jejutp.or.kr/lavawater/whatis/what.htm)
도 3은 제주도 용암해수에서 분리된 부착규조류인 Achnanthes brevipes var. intermedia(A)와 Achnanthes sancti-pauli(B) 및 Melosira octogona(C)의 광학현미경 사진이다.
도 4는 제주도 용암해수에서 분리된 부착규조류인 Achnanthes brevipes var. intermedia(A, B) 및 Melosira octogona(C)의 전자현미경 사진이다.
도 5는 제주도 용암해수에서 분리된 부착규조류인 Melosira nummuloides의 전자현미경 사진이다.
도 6은 제주도 용암해수에서 분리된 부착규조류인 Achnanthes brevipes의 전자현미경 사진이다.
도 7 제주 용암해수 규조 원통형 야외수조 미세부착규조 양성장치 자연광 배양 실험 사진.
도 8 실내 원형 아크릴 수조 인공광 실험.
도 9는 분리된 규조분말과 Melosira nummuloides 및 Achnanthes brevipes의 광학현미경사진이다. (A. 규조분말 B. Melosira nummuloides C. Achnanthes brevipes)
도 10은 규조류로부터 분리된 실리카의 사진이다.
도 11 규조추출세트 설비도식 및 사진
도 12 규조추출세트 회화 수 염산 농도별 실리카 현미경 사진 (x400)
도 13. 규조 첨가 사료 농도에 따른 넙치의 생존율 측정 결과.
도 14. 규조 첨가 사료 농도에 따른 넙치의 평균 무게 측정 결과.
도 15. 규조 첨가 사료 농도에 따른 넙치의 평균 전장 측정 결과.
도 16 규조 첨가 사료 농도에 따른 넙치의 평균 체고 측정 결과.
도 17. 규조 첨가 사료 농도에 따른 넙치의 CAT 활성 변화 실험 결과.
도 18. 규조 첨가 사료 농도에 따른 넙치의 GSH 활성 변화 실험 결과.
도 19. 규조 첨가 사료 농도에 따른 넙치의 Lysozyme 활성 변화 실험 결과.
도 20. 넙치 신장 조직에서의 3종류 primer RT-PCR 결과(1: 대조구, 2: 규조 1% 첨가 실험구, 3: 규조 2% 첨가 실험구, 4: 규조 3% 첨가 실험구).
도 21. 넙치 신장 조직에서의 lysozyme mRNA 변화량 정량 그래프.
도 22 넙치 신장 조직에서의 caspase-3 mRNA 변화량 정량 그래프.
도 23. Control(saline solution) 복강주사 넙치의 폐사율.
도 24 V. anguillarum 복강주사 넙치의 폐사율.
도 25 S. parauberis 복강주사 넙치의 폐사율.
도 26. Control(saline solution) 복강주사 넙치의 Lysozyme activity 활성 변화 실험 결과.
도 27 V. anguillarum 복강주사 넙치의 Lysozyme activity 활성 변화 실험 결과.
도 28. S. parauberis 복강주사 넙치의 Lysozyme activity 활성 변화 실험 결과.
도 29. Control(saline solution)복강주사 넙치의 Myeloperoxidase 활성 변화 실험 결과.
도 30. V. anguillarum 복강주사 넙치의 Myeloperoxidase 활성 변화 실험 결과.
도 31. S. parauberis 복강주사 넙치의 Myeloperoxidase 활성 변화 실험 결과.
도 32. A 양식장에서 사육된 넙치의 Lysozyme 활성 변화 실험 결과.
도 33. A 양식장에서 사육된 넙치의 Myeloperoxidase 활성 변화 실험 결과.
본원발명의 발명자는 용암해수를 취수하여 생물학적 검사를 실시하는 과정에서 식물성 플랑크톤이 함께 취수되는 것을 확인하고 이를 동정한 결과, 부착규조류인 Achnanthes brevipes, Melosira nummuloides, Melosira octogona, Achnanthes brevipes var. intermedia 및 Achnanthes sancti-pauli 인 것으로 특정하였다. 상기 특정된 식물플랑크톤은 국내에서 산업적 활용이 잘 알려지지 않은 종이다.
상기 Achnanthes brevipes, Melosira nummuloides, Melosira octogona, Achnanthes brevipes var. intermedia 및 Achnanthes sancti-pauli는 초기 용암해수 유입수에는 2-4cells/L 정도로 분리되는 부착성 규조류에 포함되어 있으며, 이들을 부착기질(나일론망)을 통해 5일정도 부착시키면, 육안으로 확인가능하다.
도 3은 제주도 용암해수에서 분리된 부착규조류인 Achnanthes brevipes var. intermedia(A)와 Achnanthes sancti-pauli(B) 및 Melosira octogona(C) 의 광학현미경 사진이며, 도 4 내지 도6은 이들의 전자현미경 사진이다. 도 4는 Achnanthes brevipes var. intermedia(A, B) 및 Melosira octogona(C)의 전자현미경 사진이며, 도 5는 Melosira nummuloides, 도 6은 Achnanthes brevipes의 전자현미경 사진이다. 상기 특정된 부착성규조류는 시행착오를 바탕으로 다음과 같은 방법으로 배양할 수 있었다.
< 실시예1 > 해양미세부착규조 대량생산
1. 자연광
자연광 조건에서 배양 용적의 생산 효율을 증가시킬 수 있는지 여부를 알아보기 위해 수직 스테인레스 배양틀의 미세부착규조 배양장치를 자연광 배양 실험에 용이하도록 제작하여 실험을 진행하였고, 실험 수조 조건은 표 1과 같다.
제주 용암해수 규조 원통형 야외수조 미세부착규조 양성장치 배양 수조
실험수조 크기 배양용량(㎥) 수량(ton) 1일 회전수
Φ147x185cm 3.02 3.02 26t (약 9회)
미세부착규조 배양장치는 가로부재와 세로부재 및 기둥이 연결되어 내부에 일정 공간을 형성하는 배양프레임에 의해 형성된 내부 공간에 규조류를 부착할 수 있는 부착기질을 가지며 지면에 대하여 수직으로 복수개 배치된 배양유닛 및 상기 배양유닛 하부에 지면과 평행하게 형성되어 배양유닛에 기체를 공급하는 기체공급부를 포함하여 이루어진다.
규조 접종 조건은 500g/ton (수분율 약 85% 케이크 상태)이고 규조 수확 이후 수확량 계산 방법은 접종 때와 동일 조건 (수분율 약 85% 케이크 상태)을 만들어 측정하였다. 수질정보 측정: 수온, DO(Dissolved Oxygen, 용존산소)는 UMS의 RDO-TITAN 센서로 DO, 수온 정보를 1일 24회 간격으로 전송받았다. 조도의 경우 평일 1일 2회 측정(10:00, 14:00)을 하였다.
표 2의 실험에서와 같이 일조량이 좋을 경우, 배양용적 연간 생산량이 143.01kg/㎥/year 로 생산 목표인 28.80kg/㎥/year보다 훨씬 많은 생산량을 보였다. 또한 3회 평균 배양용적 연간 생산량은 73.92kg㎥/year로 생산 목표를 도달하였다. 그러나 3회 실험에서와 같이 배양일이 길어도 일조량이 좋지 않은 경우, 배양용적 연간생산량이 15.30kg/㎥/year로 생산 목표에 못 미치는 생산량을 보였다. 따라서 위 실험 결과를 통해 미세부착규조 배양장치는 자연광 조건에서 일조량이 좋은 경우 배양용적 활용이 잘되는 것으로 판단하였다.
제주 용암해수 규조 원통형 야외수조 미세부착규조 양성장치 배양 실험 결과.
회 접종량 수거량 일조량 배양일 배양용적
(㎥)		 연간생산량
(kg/㎥/year)
1 1.5kg 3.6kg 중 4 3.02 63.45
2 1.5kg 8.6kg 상 6 3.02 143.01
3 1.5kg 2.64kg 하 9 3.02 15.30
3회 평균 73.92
※ 연간생산량 공식: (수거량-접종량) / 배양일 / 배양용량 X 365
2. 인공광
실내 원형 아크릴 수조의 인공광 조건의 규조배양 반복 실험을 진행하였다. 수조 및 광원 조건은 표 3과 같다.
수조 및 광원 조건.
구분 광원 실험수조 크기 배양용적
(㎥)		 수량(ton) 1일 회전수
루멘 셀로판지 색상
원통형아크릴수조(1) LED 100W 투광기 x4 Φ140x120cm 1.846 1.846 9
64,000 파랑
원통형 아크릴수조(2) LED 100W 투광기 x4 Φ140x120cm 1.846 1.846 9
64,000 초록
원통형 아크릴수조(3) LED 100W 투광기 x4 Φ140x98cm 1.508 1.508 9
64,000 빨강
외부 광원은 천막을 이용하여 간섭되는 빛을 차단하였고, 접종량: 250g, 445g, 440g으로 설정하였으며, 수질 측정 정보는 YSI Proffesional을 이용하여 진행하였다.
규조류와 배양시 나타나는 파래류의 발생이 종종 나타나 소기의 목적 달성에 어려움을 겪는 부분이 많은데 광질에 따라 이러한 종조성률이 달리 나타나 청색 광질에서 실험기간 동안 파래류 증식을 막고 규조류의 단일 배양이 이루어졌고 녹색 광질에서는 파래류 번무와 규조류는 소형개체들로 이루어져 초기 접종량 대비 마이너스 값을 보였다. 특히 소형개체들의 종조성은 수확시 걸러지는 20마이크로 직경의 수확망지에서 빠져나가는 요인으로 이어져 더더욱 마이너스 값을 나타나게 되는 요인이라 보여진다. 가장 장파장대의 빨강색의 광질은 규조류와 파래류의 혼합이 나타나는 특징을 보였다.
배양실험 결과
수조 접종량 수거량 배양일 배양용적
(㎥)		 연간생산량
(kg/㎥/year)
1 250g 600g 27 1.846 2.56
2 445g 280g 27 1.846 -1.20
3 440g 760g 27 1.508 2.86
※ 연간생산량 공식: (수거량-접종량) / 배양일 / 배양용량 X 365
< 실시예2> Bio -silica 생산
도 9는 수조에서 배양된 규조류의 규조분말과 Melosira nummuloides 및 Achnanthes brevipes의 광학현미경사진(A. 규조분말 B. Melosira nummuloides C. Achnanthes brevipes)이다. 상기 대량배양방법으로 배양된 분리된 부착성 규조류에서 하기의 과정을 거쳐 실리카를 분리한다.
① 수득한 규조류를 60~80℃의 건조기에서 건조시킨다.
② 상기 건조한 규조류를 분쇄기를 이용하여 분쇄한다.
③ 10% 염산용액에 상기의 규조류 분말을 중량비 95 : 5로 혼합한 후, 95℃에서 5시간동안 교반하여 유기물을 제거한다.
④ Glass filter를 사용하여 상층액을 제거 후 잔사를 수거한다.
⑤ 상기 수거한 잔사를 증류수를 사용하여 3회 세척한다.
⑥ 상기 세척된 잔사를 80℃에서 건조한다.
⑦ 상기 건조된 잔사를 650℃에서 5시간동안 가열하여 유기물을 완전히 제거한다.
⑧ 유기물이 완전히 제거 된 실리카를 수거한다.
도 10은 규조류로부터 분리된 실리카의 사진이다. 본 발명에 따라 대량배양된 규조류로부터 수득한 실리카는 규조류 생물체를 감싸고 있는 구조체 모양이 일정하게 유지된 상태로 분리되기는 것을 알 수 있다. 이는 실리카 분말입자가 일정한 형태적 균일성을 갖고 있으며, 규조류의 특성 상, 내부가 비어 있는 껍데기형태를 유지함으로써, 공극률이 획기적으로 높은 실리카분말을 얻을 수 있음을 의미한다. 따라서 모래나 석영 등의 광물로부터 얻어지는 일반적인 실리카와 물리적 특성이 상이한 입자형태의 분말을 얻을 수 있다. 규조류의 대량생산을 위한 설비 및 설비용량은 다음과 같다.s
가) 대량생산 목표 : 1kg/day (회수율 40%)
나) 건 규조 : 2.5kg/day (수분율 7% 이내), 증류수와 염산을 포함하여 50L
다) 추출 탱크 용량 : 100L (50% 사용)
라) 히터 및 교반기 : 3kw * 4
라) 여과 탱크 용량 : 50L (1차 추출용액 수용)
마) 여과 탱크 망지 : 10㎛
라) 폐액 탱크 용량 : 400L (300L 이상 필요
규조추출세트 설비의 각 구성 및 기능은 다음과 같다.
가) 컨트롤 패널: 메인 전원의 상태를 확인할 수 있는 점멸등과 수온을 체크할 수 있는 디지털 온도계, 히터의 온도를 설정할 수 있는 버튼식 조절부가 있다. 또한 교반기의 속도를 조절할 수 있는 다이얼이 있어 필요에 따라 RPM을 조절할 수 있ㄷ다 그 밑에는 메인 전원, 교반기, 히터, 진공 펌프의 스위치와 비상 정지 버튼이 있다.
나) 추출부: 도 11의 주황색 사각형이 있는 부분으로 추출탱크와 히터 교반기 온도계 외부 배출관 등으로 구성되어 있다. 추출탱크의 용량은 100L이며 추출부에 건규조 혹은 생(生)규조를 정량하여 넣은 다음 증류수와 염산을 넣어 교반기를 작동시켜 잘 용해되도록 한다. 히터의 전원을 켠 다음 목표 온도에 도달하게 되면 자동으로 전원이 꺼졌다 켜졌다 하는 자동차단장치가 설치되어 있다. 추출작업이 완료된 다음에는 여과부로 외부 노출관을 통해 용액을 내보내고 세척액 역시 외부노출관을 통해 여과부 탱크로 이동한다.
다) 여과부: 도 11의 노란색 사각형이 있는 부분으로 탱크 용량은 50L이고 추출부에서 나온 추출용액을 받아들이는 곳이다. 초기에는 10㎛ 망지를 사용하였으나 여과 속도가 상대적으로 느려서 30㎛ 망지로 교체를 하였음. 흡입부와 연결된 배관의 레버를 열어서 흡입부의 폐액통에 추출액을 집어넣고 케이크 형태의 규조만 남게 된다.
라) 흡입부: 도 11의 초록색 사각형이 있는 부분으로 탱크 용량은 400L이고 수냉식 진공 펌프가 있어 물을 넣어준 다음, 진공을 유지해 주면 추출 용액이 망지를 통과하여 서서히 폐액통에 들어가게 된다. 규조케이크의 양이 많을수록 폐액의 이동속도가 느려지게 된다. 폐액통을 비울 때에는 수냉 진공 펌프 상단에 있는 노출관에 통을 가져다 놓고 밸브를 열어 폐액을 받아낸다.
마) 규조추출세트 회화로 가동 결과 : 염산 농도 1% 이상에서 실리카 품질이 균일하게 나타났음. 적정 회화 용량은 도가니 1개당 회화 후 50g 정도 생산 가능한 용량, 회화 시간은 5시간 이상유지 해야 품질이 균일한 실리카를 얻을 수 있었음.
표 5는 상기방법으로 제주도 용암해수로부터 분리한 부착성 규조류를 대량배양하여 수득하고 여기서 분리한 규조 유래의 실리카분말을 ICP-MS(Inductively coupled plasma mass spectrometry) 분석을 통해 분석하였다. 제주 용암해수에서 추출한 규조류에 염산 및 열처리를 하여 파우더 형태로 가공하여 처리공정에 따른 총 무기원소 대비 규소함량(98% 이상), 수분(<10%), 입자도(20-60㎛) 의 고순도 실리카를 수득할 수 있었다.
구성물질(ICP-MS 분석값)
원소 7 Li 23 Na 24 Mg 27 Al 28 Si 31 P 39 K 40 Ca 45 Sc 47 Ti
정량 (mg/kg) 0.8 328.2 632.1 902.1 250308.0 272.6 340.9 665.1 25.7 121.8
비율 (%) 0.0003 0.1291 0.2486 0.3547 98.4316 0.1072 0.1341 0.2615 0.0101 0.0479
원소 52 Cr 55 Mn 56 Fe 60 Ni 63 Cu 75 As 88 Sr 90 Zr 138 Ba 208 Pb
정량 (mg/kg) 18.2 60.7 595.0 0.9 2.0 2.0 5.6 3.8 9.2 1.6
비율 (%) 0.0072 0.0239 0.2340 0.0004 0.0008 0.0008 0.0022 0.0015 0.0036 0.0006
< 실시예3> Synbiotics 사료첨가제 제조
Synbiotics에 이용된 유산균 Lactobacillus plantarum (1X109CFU/g)을 사료 1%의 농도로 첨가하여 최종 농도 1X107CFU/g 으로 제작하였다. 상기 유산균은 미생물기탁기관으로부터 분양가능한 종이다. 실험용 사료첨가제는 EP제작 사료 내에 유산균 1%+규조분말0%(대조구), 유산균 1%+규조분말1%, 유산균1%+규조분말2%, 유산균1%+규조분말 3%를 각각 제작하였으며, 최종 시제품으로는 실험 결과를 바탕으로 유산균1%+규조분말2%을 제작하였다..
1) 실험에 사용한 synbiotics 제작 사료의 영양성(일반성분) 평가
사료 제작 비율(%)
Ingredients Experimental diets
Control Diatom 1% Diatom 2% Diatom 3%
Fish meal (sardine) 60 60 60 60
Soybean meal 12 12 12 12
Corn gluten meal 3 3 3 3
Soy protein concentrate 3 3 3 3
Wheat flour 11 11 11 11
Fish oil 3.5 3.5 3.5 3.5
Lecithin 0.5 0.5 0.5 0.5
Monocalcium phosphate 0.5 0.5 0.5 0.5
Vitamin Mix 1 1 1 1
Mineral Mix 1 1 1 1
Choline 0.5 0.5 0.5 0.5
Cellulose 3 2 1 0
L. plantarum 1 1 1 1
Diatom 0 1 2 3
대조구 사료와 규조 1% 첨가구, 규조 2% 첨가구 및 규조 3% 첨가구의 일반성분 분석 결과는 아래의 표 7과 같다. 3종의 사료첨가제의 일반성분 분석 결과 수분은 대조구 사료, 규조 1% 첨가구, 규조 2% 첨가구 및 규조 3% 첨가구 사료에서 7.87 %, 8.73 %, 8.73 % 및 8.80 %로 나타났으며, 조회분은 대조구 사료, 규조 1% 첨가구, 규조 2% 첨가구 및 규조 3% 첨가구 사료에서 10.46 %, 11.21 %, 11.91 % 및 12.58 %로 나타났다(표 7).
조지방은 대조구 사료, 규조 1% 첨가구, 규조 2% 첨가구 및 규조 3% 첨가구 사료에서 8.09 %, 7.45 %, 7.58 % 및 8.12 %로 나타났으며, 조단백질은 대조구 사료, 규조 1% 첨가구, 규조 2% 첨가구 및 규조 3% 첨가구 사료에서 56.28 %, 55.81 %, 55.59 % 및 55.38 %로 나타났다.
2) 실험에 사용한 synbiotics 제작 사료의 안정성 평가
대조구 사료, 규조 1% 첨가구, 규조 2% 첨가구 및 규조 3% 첨가구 사료의 유산균 분석 결과, 각각 7.50X104, 5.50X106, 5.80X106 및 8.65X106 으로 나타났다(표 7). 또한 안정성 평가를 위해 각 사료의 살모넬라 검출여부를 분석한 결과 모든 사료에서 불검출되어 안정성을 인정받았다.
성분명(%) 수분 조회분 조지방 조단백질 유산균 살모넬라
대조군 7.87 10.46 8.09 56.28 7.50X104 불검출
규조 1% 8.73 11.21 7.45 55.81 5.50X106 불검출
규조 2% 8.73 11.91 7.58 55.59 5.80X106 불검출
규조 3% 8.8 12.58 8.12 55.38 8.65X106 불검출
<실시예4> Synbiotics 사료첨가제가 양식 넙치에 미치는 생리적 평가
본 연구에서는 양식 넙치 사료 내 규조(0 %, 1 %, 2 % 및 3 %) 첨가가 넙치의 성장, 면역반응 및 병저항성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 생존율, 성장률, 혈액생화학적 분석, 항산화 활성, 생체방어 작용 분석, 유전자 발현, 조직학적 분석 및 병원균 공격 실험을 수행하였다.
1) 사육 넙치의 사료첨가제 급이 실험 후 생존율 및 성장률의 변화
가) 넙치의 사료첨가제 급이 실험 후 생존율
각 실험구에 넙치 160마리씩 입식하여 실험을 실시하였다. 사료첨가제 급이 60일 경과, 대조구에서 96.25 %, 규조 1% 첨가 실험구에서 97.5 %, 규조 2% 첨가 실험구에서 98.125 %, 규조 3% 첨가 실험구에서 96.25 %의 생존율을 나타내었다(도 13).
나) 사료 급이에 따른 넙치의 무게 변화
넙치의 무게는 6월 21일부터 사료 첨가 급이 시작하여 사료 급이 종료일인 08월 20일에 무게 측정 결과 대조구는 평균 무게 29.79 ± 4.60 g에서 51.87 ± 9.54 g로 약 22.08 g 성장하였으며, 규조 1% 첨가 실험구는 평균 무게 29.79 ± 4.60 g에서 69.61 ± 10.28 g로 약 39.82 g 성장하였으며, 규조 2% 첨가 실험구는 평균 무게 29.79 ± 4.60 g에서 69.62 ± 11.98 g로 약 39.83 g 성장하였으며, 규조 3% 첨가 실험구는 평균 무게 29.79 ± 4.60 g에서 67.13 ± 10.51 g로 약 37.34 g 성장하였다(도 14). 사료 급이 종료일인 08월 20일의 대조구 대비 무게 증가량은 규조 1% 첨가 실험구, 규조 2% 첨가 실험구 및 규조 3% 첨가 실험구에서 34.21 %, 34.23 % 및 29.43 %로 무게가 증가하였다(도 14).
따라서 무게의 측정 결과로는 사료 급이 시작 후 약 2개월(08월 20일)까지는 규조 2% 첨가 실험구의 무게가 가장 크게 증가하였으며, 그 다음으로 규조 1% 첨가 실험구, 규조 3% 첨가 실험구, 대조 실험구 순으로 무게 성장률이 증가하는 것으로 나타났다.
다) 사료 급이에 따른 넙치의 전장 변화
넙치의 전장은 6월 21일부터 사료 첨가 급이 시작하여 사료 급이 종료일인 08월 20일에 전장 측정 결과 대조구는 평균 전장 14.64 ± 1.00 cm에서 18.19 ± 0.95 cm로 약 3.55 cm 성장하였으며, 규조 1% 첨가 실험구는 평균 전장 14.64 ± 1.00 cm에서 19.80 ± 1.09 cm로 약 5.16cm 성장하였으며, 규조 2% 첨가 실험구는 평균 전장 14.64 ± 1.00 cm에서 19.79 ± 1.04 cm로 약 5.15cm 성장하였으며, 규조 3% 첨가 실험구는 평균 전장 14.64 ± 1.00 cm에서 19.53 ± 0.94 cm로 약 4.89cm 성장하였다(도 15). 사료 급이 종료일인 08월 20일의 대조구 대비 무게 증가량은 규조 1% 첨가 실험구, 규조 2% 첨가 실험구 및 규조 3% 첨가 실험구에서 8.90 %, 8.80 % 및 7.39 %로 무게가 증가하였다.
전장 측정 결과로는 사료 급이 시작 후 약 2개월(08월 20일)까지는 규조 1% 첨가 실험구의 전장이 가장 크게 증가하였으며, 다음으로 규조 2% 첨가 실험구, 규조 3% 첨가 실험구 및 대조구 순으로 전장 성장률이 높은 것으로 나타났다.
라) 사료 급이에 따른 넙치의 체고 변화
넙치의 체고는 6월 21일부터 사료 첨가 급이 시작하여 사료 급이 종료일인 08월 20일에 체고 측정 결과 대조구는 평균 체고 4.97 ± 0.36 cm에서 5.93 ± 0.42 cm로 약 0.96 cm 성장하였으며, 규조 1% 첨가 실험구는 평균 전장 4.97 ± 0.36 cm에서 6.44 ± 0.33 cm로 약 1.47cm 성장하였으며, 규조 2% 첨가 실험구는 평균 전장 4.97 ± 0.36 cm에서 6.50 ± 0.38 cm로 약 1.53cm 성장하였으며, 규조 3% 첨가 실험구는 평균 전장 4.97 ± 0.36 cm에서 6.44 ± 0.33 cm로 약 1.47cm 성장하였다(도 16). 사료 급이 종료일인 08월 20일의 대조구 대비 무게 증가량은 규조 1% 첨가 실험구, 규조 2% 첨가 실험구 및 규조 3% 첨가 실험구에서 8.63 %, 9.52 % 및 8.53 %로 무게가 증가하였다.
따라서 전장 측정 결과로는 사료 급이 시작 후 약 2개월(08월 20일)까지는 규조 2% 첨가 실험구의 전장이 가장 크게 증가하였으며, 그 다음으로 규조 1% 첨가 실험구, 규조 3% 첨가 실험구 및 대조구 순으로 전장 성장률이 높은 것으로 나타내었다.
마) 사료 급이에 따른 넙치의 CAT 활성 변화
사료첨가제 급이 실험구의 CAT활성은 사료첨가제 급이 0일차 경과하였을 때 8.78 ± 0.86 mU/mL로 활성을 나타내었으며, 31일차 경과하였을 때 대조구에서 6.63 ± 2.40 mU/mL, 규조 1% 첨가 실험구는 4.20 ± 2.45 mU/mL, 규조 2% 첨가 실험구는 3.91 ± 1.77 mU/mL 및 규조 3% 첨가 실험구에서 4.73 ± 2.89 mU/mL로 활성을 나타내었으며, 60일차 경과하였을 때 대조구에서 5.51 ± 2.29 mU/mL, 규조 1% 첨가 실험구는 4.51 ± 2.46 mU/mL, 규조 2% 첨가 실험구는 4.81 ± 1.49 mU/mL 및 규조 3% 첨가 실험구에서 5.30 ± 1.05 mU/mL로 활성을 나타내었다(도 17).
바) 사료 급이에 따른 넙치의 GSH 활성 변화
사료첨가제 급이 실험구의 GSH활성은 사료첨가제 급이 0일차 경과하였을 때 5.78 ± 1.32 U/mL로 활성을 나타내었으며, 31일차 경과하였을 때 대조구에서 5.07 ± 1.19 U/mL, 규조 1% 첨가 실험구는 7.01 ± 2.73 U/mL, 규조 2% 첨가 실험구는 4.61 ± 1.16 U/mL 및 규조 3% 첨가 실험구에서 5.81 ± 1.71 U/mL로 활성을 나타내었으며, 60일차 경과하였을 때 대조구에서 5.02 ± 1.48 U/mL, 규조 1% 첨가 실험구는 5.52 ± 1.94 U/mL, 규조 2% 첨가 실험구는 5.79 ± 1.33 U/mL 및 규조 3% 첨가 실험구에서 6.09 ± 1.56 U/mL로 활성을 나타내었다(도 18).
2) 사육한 넙치의 생체방어 작용 반응 측정
가) 사료 급이에 따른 넙치의 Lysozyme activity 측정 결과
사료첨가제 급이 실험구의 Lysozyme activity는 사료첨가제 급이 0일차 경과하였을 때 0.046 ± 0.012 U/mL로 활성을 나타내었으며, 31일차 경과하였을 때 대조구에서 0.019 ± 0.005 U/mL, 규조 1% 첨가 실험구는 0.017 ± 0.006 U/mL, 규조 2% 첨가 실험구는 0.031 ± 0.016 U/mL 및 규조 3% 첨가 실험구에서 0.036 ± 0.008 U/mL로 활성을 나타내었으며, 60일차 경과하였을 때 대조구에서 0.012 ± 0.002 U/mL, 규조 1% 첨가 실험구는 0.023 ± 0.005 U/mL, 규조 2% 첨가 실험구는 0.024 ± 0.004 U/mL 및 규조 3% 첨가 실험구에서 0.026 ± 0.007 U/mL로 활성을 나타내었다(도 19).
3) 사육한 넙치의 면역유전자의 발현 분석 결과
넙치의 유전자 분석에 사용한 primer의 조건은 표 8과 같다. 07월 23일의 넙치 유전자 분석의 결과, lysozyme mRNA의 발현량은 규조 1% 첨가 실험구 및 규조 2% 첨가 실험구에서만 발현이 된 것을 확인할 수 있었으며, 대조구에서는 4.71 ± 0.67 %, 규조 1% 첨가 실험구에서는 48.64 ± 4.86 %, 규조 2% 첨가 실험구에서는 30.01 ± 0.95 % 및 규조 3% 첨가 실험구에서는 19.82 ± 1.78 %의 발현량을 나타내었다(도 20 21 22).
07월 23일의 넙치 유전자 분석의 결과, caspase mRNA의 발현량 또한 규조 1% 첨가 실험구 및 규조 2% 첨가 실험구에서만 발현이 된 것을 확인할 수 있었으며, 대조구에서는 4.23 ± 1.09 %, 규조 1% 첨가 실험구에서는 86.42 ± 16.71 %, 규조 2% 첨가 실험구에서는 46.34 ± 5.04 % 및 규조 3% 첨가 실험구에서는 2.04 ± 0.78 %의 발현량을 나타내었다(도 21).
08월 20일의 넙치 유전자 분석의 결과, lysozyme mRNA의 발현량은 대조구를 제외한 규조 1% 첨가 실험구, 규조 2% 첨가 실험구 및 규조 3% 첨가 실험구에서만 발현이 된 것을 확인할 수 있었으며, 대조구에서는 11.59 ± 1.65 %, 규조 1% 첨가 실험구에서는 43.84 ± 3.68 %, 규조 2% 첨가 실험구에서는 56.65 ± 4.43 % 및 규조 3% 첨가 실험구에서는 37.39 ± 5.78 %의 발현량을 나타내었다(도 22).
08월 20일의 넙치 유전자 분석의 결과, caspase mRNA의 발현량은 모든 실험구에서 희미하게 발현이 된 것을 확인할 수 있었으며, 대조구에서는 21.34 ±2.01 %, 규조 1% 첨가 실험구에서는 47.45 ± 5.74 %, 규조 2% 첨가 실험구에서는 39.19 ± 5.41 % 및 규조 3% 첨가 실험구에서는 31.78 ± 4.22 %의 발현량을 나타내었다(도 22).
RT-PCR에 사용한 넙치의 primer sequence.
RNA species Primer sequence
β-actin mRNA 5’-GAGCGTGGCTACTCCTTCAC-3’
5’-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3’
caspase-3 5’-CCTCTACGCCTTCTCCACAG-3’
5’-CTCCTTCGTCAGCATTGACA-3’
c-type lysozyme 5’-GTGGACATGTGTCCGTCTTG-3’
5’-CAGCGACTGTTGATCTGGAA-3’
4) Synbiotics 사료첨가제에 따른 넙치의 병원균 반응성 평가
가) 병원균 공격 실험에 따른 넙치 폐사율
각기 다른 농도로 첨가한 사료를 투여한 실험구와 일반사료를 투여한 대조구의 어병 세균에 대한 공격실험의 결과, Saline solution를 복강 주사하였을 시 대조구, 규조 1% 첨가 실험구, 규조 2% 첨가 실험구 및 규조 3% 첨가 실험구에서 누적 폐사율은 80 %, 20 %, 10 % 및 15 %로 나타내었다(도 23).
V. anguillarum 를 복강 주사하였을 시 대조구, 규조 1% 첨가 실험구, 규조 2% 첨가 실험구 및 규조 3% 첨가 실험구에서 누적 폐사율은 90 %, 55 %, 20 % 및 55 %로 나타내었으며, S. parauberis 를 복강 주사하였을 시 대조구, 규조 1% 첨가 실험구, 규조 2% 첨가 실험구 및 규조 3% 첨가 실험구에서 누적 폐사율은 35 %, 60 %, 0 % 및 25 %로 나타내었음(도 24 25).
5) 병원균 공격 실험에 따른 넙치의 생체방어 작용 반응 측정
가) Control(saline solution) 복강주사 넙치의 Lysozyme activity 측정 결과
Lysozyme activity는 대조구에서 0.014 ± 0.004 U/mL, 규조 1% 첨가 실험구는 0.021 ± 0.004 U/mL, 규조 2% 첨가 실험구는 0.016 ± 0.007 U/mL 및 규조 3% 첨가 실험구에서 0.022 ± 0.012 U/mL로 활성을 나타내었다(도 26).
나) V. anguillarum 복강주사 넙치의 Lysozyme activity 측정 결과
Lysozyme activity는 대조구에서 0.021 ± 0.009 U/mL, 규조 1% 첨가 실험구는 0.026 ± 0.016 U/mL, 규조 2% 첨가 실험구는 0.013 ± 0.005 U/mL 및 규조 3% 첨가 실험구에서 0.026 ± 0.018 U/mL로 활성을 나타내었다(도 27).
다) S. parauberis 복강주사 넙치의 Lysozyme activity 측정 결과
Lysozyme activity는 대조구에서 0.014 ± 0.006 U/mL, 규조 1% 첨가 실험구는 0.025 ± 0.014 U/mL, 규조 2% 첨가 실험구는 0.012 ± 0.004 U/mL 및 규조 3% 첨가 실험구에서 0.027 ± 0.015 U/mL로 활성을 나타내었다(도 28).
라) Control(saline solution) 복강주사 넙치의 Myeloperoxidase activity 측정 결과
Myeloperoxidase activity는 대조구에서 1.31 ± 0.32 mU/mg, 규조 1% 첨가 실험구는 1.38 ± 0.19 mU/mg, 규조 2% 첨가 실험구는 1.48 ± 0.21 mU/mg 및 규조 3% 첨가 실험구에서 1.50 ± 0.21 mU/mg로 활성을 나타내었다(도 29).
마) V. anguillarum 복강주사 넙치의 Myeloperoxidase activity 측정 결과
Myeloperoxidase activity는 대조구에서 1.48 ± 0.31 mU/mg, 규조 1% 첨가 실험구는 1.46 ± 0.25 mU/mg, 규조 2% 첨가 실험구는 1.50 ± 0.52 mU/mg 및 규조 3% 첨가 실험구에서 1.54 ± 0.29 mU/mg로 활성을 나타내었다(도 30).
바) S. parauberis 복강주사 넙치의 Myeloperoxidase activity 측정 결과
Myeloperoxidase activity는 대조구에서 1.25 ± 0.23 mU/mg, 규조 1% 첨가 실험구는 1.43 ± 0.14 mU/mg, 규조 2% 첨가 실험구는 1.53 ± 0.17 mU/mg 및 규조 3% 첨가 실험구에서 1.43 ± 0.20 mU/mg로 활성을 나타내었다(도 31).
이상의 결과와 같이 규조 첨가 농도에 따른 면역 활성의 증가가 나타났으며, 이에 따라 병원균 공격실험에서의 폐사율이 낮아졌다.
< 현장 적용예 1 > Synbiotics 사료급이에 따른 넙치의 현장 적용 실험의 생리적 평가
1) A 양식장에서 사육한 넙치의 사료첨가제 급이 실험 중 성장률의 변화
○ 무게의 변화
넙치의 무게는 10월 02일부터 사료 첨가 급이 시작하여 약 한 달이 경과 한 10월 29일에 무게 측정 결과 대조구는 평균 무게 376.65 ± 79.34 g에서 576.99 ± 135.17 g로 약 200.34 g 성장하였으며, 규조 2% 첨가 실험구는 평균 무게 376.65 ± 79.34 g에서 550.37 ± 98.40 g로 약 173.72 g 성장하였다
○ 전장의 변화
넙치의 전장은 10월 02일부터 사료 첨가 급이 시작하여 약 한달이 경과 한 10월 29일에 전장 측정 결과 대조구는 평균 전장 32.75 ± 2.43 cm에서 37.14 ± 2.61 cm로 약 4.39 cm성장하였으며, 규조 2% 첨가 실험구는 평균 무게 32.75 ± 2.43 cm에서 36.83 ± 2.24 cm로 약 4.08 cm 성장하였다.
2) A 양식장에서 사육한 넙치의 면역생리활성 분석 결과
○ 사료 급이에 따른 넙치의 Lysozyme activity 측정 결과
사료첨가제 급이 실험구의 Lysozyme activity는 사료첨가제 급이 0일차 경과하였을 때 0.014 ± 0.003 U/mL로 활성을 나타내었으며, 27일차 경과하였을 때 대조구 및 규조 2% 첨가 실험구에서 0.019 ± 0.009 U/mL 및 0.028 ± 0.012 U/mL로 활성을 나타내었다(도 32).
○ 사료 급이에 따른 넙치의 Myeloperoxidase activity 측정 결과
사료첨가제 급이 실험구의 Myeloperoxidase activity는 사료첨가제 급이 0일차 경과하였을 때 2.93 ± 0.30 mU/mg로 활성을 나타내었으며, 27일차 경과하였을 때 대조구 및 규조 2% 첨가 실험구에서 1.90 ± 0.34 mU/mg 및 2.19 ± 0.62 mU/mg로 활성을 나타내었다(도 33).
본 발명은 사료 첨가제의 안전성을 평가하는 지표로서 어류의 생리 기능에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과 사료 급이에 따른 넙치의 무게, 전장 및 체고 부분에서 규조 첨가 사료가 일반사료인 대조구보다 모든 성장면에서 높은 수치를 나타내었음을 알 수 있었다. 이에 따라 규조는 넙치의 속성장 및 면역 증강 물질로 기능하여 사료첨가제로서의 기능을 수행할 수 있을 것이라 판단되어진다.
면역유전자 발현 분석에서 비특이적 면역 활성을 하는 lysozyme 및 면역유전자 casepase-3 또한 규조 첨가 농도가 높아질수록 발현량이 높아지는 것을 알 수 있었으며, 이는 사료 내 규조의 첨가가 면역 활성을 증가시키는 것을 알 수 있다.
본 발명은 제주도 용암해수로부터 연중 배양이 가능한 부착성 규조류인 Melosira nummuloides, Achnanthes brevipes var. intermedia, Achnanthes sancti-pauli, Achnanthes brevipes 및 Melosira octogona를 분리하여 대량배양하고, 수득한 규조류로부터 순도 높은 실리카를 제조하여 사료첨가제로 활용하는 방법을 제공하고 있어, 환경, 생명산업 등 응용분야에 이용할 수 있으므로 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (3)

  1. 제주도 용암해수로부터 부착성 규조류 Melosira nummuloides, Achnanthes brevipes var. intermedia, Achnanthes sancti-pauli, Achnanthes brevipes 그리고 Melosira octogona 로 이루어진 군 중 선택된 한 종 또는 이들의 조합을 분리하는 단계; 상기 분리한 규조류를 배양장치에서 대량배양하는 단계; 상기 대량배양한 규조류로부터 실리카를 분리하는 단계; 분리된 실리카와 유산균 Lactobacillus plantarum을 1 내지 3중량% : 1중량%의 비로 접종하여 사료 조성물과 혼합하여 제조되며,
    상기 대량배양한 규조류로부터 실리카를 분리하는 단계는, 수득한 규조류를 60~80℃의 건조기에서 건조시키는 단계; 상기 건조한 규조류를 분쇄기를 이용하여 분쇄하는 단계;
    10% 염산용액에 상기의 규조류 분말을 중량비 95 : 5로 혼합한 후, 95℃에서 5시간 동안 교반하여 유기물을 제거하는 단계; Glass filter를 사용하여 상층액을 제거 후 잔사를 수거하는 단계; 상기 수거한 잔사를 증류수를 사용하여 3회 세척하는 단계; 상기 세척된 잔사를 80℃에서 건조하는 단계;
    상기 건조된 잔사를 650℃에서 5시간 동안 가열하여 유기물을 완전히 제거하는 단계; 및 유기물이 완전히 제거된 실리카를 수거하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 제주도 용암 해수로부터 분리한 부착성 규조류를 이용한 넙치의 면역증강용 사료조성물 제조방법.
  2. 제1항의 제조방법으로 제조된 제주도 용암 해수로부터 분리한 부착성 규조류를 이용한 넙치의 면역증강용 사료조성물
  3. 삭제
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대한민국 공개특허 10-2012-0095826호에서는 세네데스무스(Scenedesmus sp.), 클로렐라(Chlorella sp.), 스피룰리나(Spirulina sp.)등과 같은 이산화탄소의 처리와 동시에 바이오디젤, 사료첨가제, 건강보조식품 등의 생산에 유용한 미세조류의 저비용, 고품질, 대량생산을 실현시킬 수 있는 미세조류 고밀도 배양용 광생물 반응기와, 이를 이용한 미세조류 배양 및 수확 방법을 개시하고 있다.
대한민국 등록특허 10-1256773호에서는 적색광과 청색광을 혼합한 혼합광을 광원으로 사용하여 미세조류를 배양하는 단계를 포함하는 하폐수 고도처리 또는 바이오매스 생산 방법에 관한 것으로, 백색광을 사용하였을 때 보다 미세조류를 이용한 바이오매스 생산량을 증대시키고 질소 및 인 제거량을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 특히, 상기 적색광원 및 청색광원으로는 저전력 소비형 LED(light emitting diode)를 이용하는 파장 선택적 LED 광 조사를 이용한 미세조류에 의한 하폐수 고도처리 및 미세조류 바이오매스 생산성증대방법을 개시하고 있다.

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