KR101966361B1

KR101966361B1 - 비오틴이 결합된 헥사펩타이드-２ 유도체를 포함하는 지방세포 분화 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR101966361B1
Application number: KR1020180115474A
Authority: KR
Inventors: 임채진; 박기돈
Original assignee: 주식회사 인코스팜
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2018-09-28
Publication date: 2019-04-08

Abstract

본 발명은 비오틴이 결합된 헥사펩타이드-２ 유도체를 포함하는 지방세포 분화 촉진용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 탁월한 지방세포 분화의 촉진으로 지방세포 분화 촉진, 피하지방　감소 개선 및 피부 볼륨 또는 탄력 증진을 위한 화장료　또는 약학 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

Description

비오틴이 결합된 헥사펩타이드-２ 유도체를 포함하는 지방세포 분화 촉진용 조성물{Composition for promoting a differentiation of adipocyte comprising biotin-conjugated hexapeptide-2 analogue}

본 발명은 비오틴이 결합된 헥사펩타이드-２ 유도체를 포함하는 지방세포 분화 촉진용 조성물에 관한 것이다.

우리의 피부는 인체가 생존하는 데 있어 필수적인 다양한 기능을 수행하고 있다. 환경 변화에 대응하여 인체 내부의 항상성을 유지하기 위한　장벽 기능, 외부 변화를 인지하기 위한 감각기능, 체온 조절기능 등이 가장 대표적인 피부의 기능에 속하며 이들은 모두 외부 환경의 변화에 대응하여 인체 내부의 기능을 유지할 수 있는 항상성을 유지하는 역할을 한다.

이러한 피부의 기본적인 구조는 피하지방조직에 의해 유지되며, 이러한 피하지방 조직은 피부의　볼륨과 강도를 좌우하는 역할을 한다. 이에, 피부 외곽층에 있는 진피나 표피에 탄력을 부여하는 방법보다　피하지방조직의 부피를 증가시키는 것이 피부의　볼륨　및 탄력을 유지할 수 있는 좋은 해결책이 될 수 있다.

특히, 얼굴 부위의 피부는 노화가 진행됨에 따라 두께가 감소하여 주름이나 탄력저하의 원인이 된다. 그리고, 폐경기 여성에게 나타나는 호르몬, 혈액, 지방, 뼈 등의 대사 이상으로 인한 체내 지방의 재분포는 피부미용에 부정적으로 작용할 뿐만 아니라, 대사성 질환의 발병율을 높인다는 보도도 있다.

현재까지의 주름개선이나 피부의 탄력 증진을 기대하는 화장품은 진피의 콜라겐을 증가시키거나, 콜라겐을 분해하는 효소를 억제하거나, 세포외기질(extracellular matrix)의 항상성을 조절하는데 초점을 둔 것들이 대부분이었다.

그러나, 본 발명자들은 피부의 기본적인 구조가 피하지방조직의 부피에 의해 유지되는 것을 고려할 때, 지방조직의 볼륨을 증가시켜 피부의 볼륨 및 탄력을 유지하는 것이 또 다른 해결책이 될 수 있을 것이라는 점에 착안하여, 새로운 원료에 대한 연구를 심화하였다. 그 결과, 비오틴이 결합된 헥사펩타이드-２ 유도체가 지방세포 분화 촉진에 탁월한 효능·효과를 나타냄을 규명하여 본 발명을 완성하였다.

Ezure and Amano. Biofactors. 2007, 31:229-236.

본 발명의 목적은 우수한 지방세포 분화 촉진용, 피하지방　감소 개선용 및 피부 볼륨 또는 탄력 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 과제의 해결을 위하여, 하기 화학식1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 지방세포 분화 촉진용 조성물이 제공된다.

[화학식1]

또한, 상기 화학식1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피하지방　감소 개선용 조성물이 제공된다.

또한, 상기 화학식1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 볼륨 또는 탄력 증진용 조성물이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은, 지방조직을 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 레티놀, 레티닐팔미테이트, 아데노신 및 폴리에톡실레이티드레틴아마이드 등에서 선택되는 하나 이상의 원료를 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 조성물에 있어서, 상기 유효성분은 총 중량에 대하여, 0.0001 내지 10중량%로 포함되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 피부 외용제 조성물로서, 화장료 조성물 또는 약학 조성물 일 수 있다.

본 발명에 따르면, 지방세포의 분화를 촉진하는 효과에 탁월함을 나타낸다. 이에 따라서 피하지방 조직의 지방세포를 분화하게 하며, 이를 통해 피부의 볼륨 또는 탄력을 증진시킬 수 있는 효과를 나타낸다.

따라서 본 발명에 따른 조성물은 지방세포 분화 촉진, 피하지방　감소 개선 및 피부 볼륨 또는 탄력 증진을 위한 화장료　또는 약학 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

도 1은 제조예1(LiftDerm, Hybrid Peptide BIO; biotinoyl hexapeptide2)의 aP2 유전자의 전사를 증가시키는 실험 결과를 보여주는 것이고,
도 2는 제조예1(LiftDerm, Hybrid Peptide BIO; biotinoyl hexapeptide2)의 aP2 단백질 발현을 증가시키는 실험 결과를 보여주는 것이고,
도 3은 제조예1(LiftDerm, Hybrid Peptide BIO; biotinoyl hexapeptide2)처리에 의한 지방형성 촉진에 대한 실험 결과를 보여주는 것이다.

본 발명에 따른 비오틴이 결합된 헥사펩타이드-２ 유도체를 포함하는 지방세포 분화 촉진용 조성물에 대하여 이하 설명하나, 이때 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

본 명세서의 용어, "비오틴이 결합된 헥사펩타이드-２ 유도체"는 후술되는 본 발명에 따른 화학식1로 표시되는 화합물을 의미한다.

또한 본 명에서의 용어, "지방세포 분화"는 동물, 인간 등 포유동물의 지방전구세포(pre-adipocytes)가 지방세포로 분화하는 것을 의미한다

또한 본 명세서의 용어, "약학적 허용 가능한 염"은 약학적으로 허용가능한 무기산, 유기산 또는 염기로부터 유도된 염을 의미한다. 일 예로, 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 인산 등의 무기산; 및 푸마르산, 말레산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등의 유기산; 등과의 염을 들 수 있다.

앞서 언급한 바와 같이, 본 발명자들은 피부 본연의 기능을 향상시킬 수 있는 새로운 원료에 대한 연구를 거듭하던 중, 비오틴이 결합된 헥사펩타이드-２ 유도체의 새로운 효능·효과를 규명하여 본 발명을 완성하였다.

먼저, 본 발명에 따른 용도는 지방세포 분화 촉진용일 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따르면 생체외(ex　 vivo) 또는 시험관내(in vitro) 조건에서　지방전구세포를 지방세포로 분화되는 것을 촉진한다. 이와 같은 효과는 주름 개선을 위한 용도에 있어서, 통상의 섬유아세포에서 콜라겐 합성을 촉진하는 작용 또는 섬유아세포에서 엘라스틴 생성을 촉진하는 작용과는 다른 양태의 해결책임에 주목하였다.

다음으로, 본 발명에 따른 용도는 피하지방　감소 개선용일 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따르면 피부의 지방세포의 활성 감소를 효과적으로 억제함은 물론 피부의 피하지방조직 부피를 향상시켜, 피부의 탄력 저하 현상을 억제시키고 피부 본연의 구조를 유지할 수 있도록 돕는다.

다음으로, 본 발명에 따른 용도는 피부 볼륨 또는 탄력 증진용일 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따르면 지방세포의 분화 촉진으로 지방구(lipid droplet) 생성을 효과적으로 향상시켜, 피부 볼륨 또는 탄력을 증진시킬 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 조성물에 대하여 설명한다.

본 발명에 따른 조성물은, 구체적으로 피부 외용제 조성물일 수 있다.

본 발명의 일 양태는 지방세포 분화 촉진용, 피하지방　감소 개선용 및 피부 볼륨 또는 탄력 증진용 화장료 조성물일 수 있다.

본 발명의 일 양태는 지방세포 분화 촉진용, 피하지방　감소 개선용 및 피부 볼륨 또는 탄력 증진용 약학 조성물일 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 외용제 조성물은 하기 화학식1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 것일 수 있다.

[화학식1]

본 발명의 일 실시예에 따른 피부 외용제 조성물은 지방조직을 증가시키는 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 외용제 조성물은 지방전구세포(pre-adipocytes)의 지방세포로의 분화를 효과적으로 촉진시킨다. 지방세포로의 분화 촉진 작용은 생체내(in　 vivo), 생체외(ex　 vivo) 또는 시험관내(in vitro)　조건 등에서 일어날 수 있으며, 이와 같은 작용을 통해 미용 또는 성형 목적의 지방조직 증가에 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 외용제 조성물은 피부에 도포시, 피하지방　감소를 효과적으로 개선시키고, 피부 볼륨 또는 탄력을 증진시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기 유효성분은 총 중량에 대하여, 0.0001 내지 10중량%로 포함되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 유효성분은 0.001 내지 1중량%로 포함될 수 있으며, 보다 구체적으로 0.005 내지 0.5중량%로 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 외용제 조성물은, 레티놀, 레티닐팔미테이트, 아데노신 및 폴리에톡실레이티드레틴아마이드 등에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 혼합된 원료를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 원료를 더 포함함에 따라 피부 볼륨 또는 탄력 증진 효과에 놀랍도록 향상된 시너지를 부여할 수 있다.

일 예로, 상기 피부 외용제 조성물은 상기 레티놀을 1,000 내지 2,500 IU/g로 포함하는 것일 수 있다.

일 예로, 상기 피부 외용제 조성물은 상기 레티닐팔미테이트를 5,000 내지 10,000 IU/g로 포함하는 것일 수 있다.

일 예로, 상기 피부 외용제 조성물은 상기 아데노신을 0.01 내지 0.04중량%로 포함하는 것일 수 있다.

일 예로, 상기 피부 외용제 조성물은 상기 폴리에톡실레이티드레틴아마이드를 0.05 내지 0.2중량%로 포함하는 것일 수 있다.

일 예로, 상기 피부 외용제 조성물은 상술된 범위의 조건으로 둘 이상의 혼합된 원료를 포함하는 것일 수 있다.

언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 상기 원료의 각 활성 농도 대비 낮은 사용량에도 불구하고, 피부 볼륨 또는 탄력 증진 효과에 향상된 효과를 부여할 수 있다. 또한, 상기 피부 외용제 조성물은 지방세포의 분화 촉진에 탁월한 효과를 나타낼 수 있다.

상기 피부 외용제 조성물은 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형 등으로 제형화될 수 있다.

일 예로, 상기 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물로서, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이 크림, 영양 크림, 마사지 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 파우더, 에센스, 팩 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제형화되는 것일 수 있다.

이때, 상기 화장료 조성물은 목적하는 바에 따라 적절하게 추가의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 일 예로, 상기 첨가제는 안정화제, 유화제, 점증제, 보습제, 액정 막강화제, pH 조절제, 항균제, 수용성 고분자, 피막제, 금속 이온 봉쇄제, 아미노산, 유기 아민, 고분자 에멀션, pH조정제, 피부 영양제, 산화 방지제, 산화 방지조제, 방부제, 향료 등에서 선택되는 하나 이상의 수성 첨가제; 및 유지류, 왁스류, 탄화 수소유, 고급 지방산유, 고급 알콜, 합성 에스테르유 및 실리콘유 등에서 선택되는 하나 이상의 유성 첨가제; 등을 들 수 있다.

이때, 상기 각 첨가제는 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 20 중량%로 포함될 수 있으며, 구체적으로는 0.01 내지 10중량%, 0.05 내지 10중량%로 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 피부 외용제 조성물은 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 제형화될 수 있다.

일 예로, 상기 피부 외용제 조성물은 약학 조성물로서, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취, 분무제 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제형화되는 것일 수 있다.

이때, 상기 약학 조성물은 목적하는 바에 따라 적절하게 추가의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 일 예로, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 또는 미네랄 오일 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 담체 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제 또는 보존제 등의 담체를 더 포함할 수 있다.

이때, 상기 각 담체는 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 20 중량%로 포함될 수 있으며, 구체적으로는 0.01 내지 10중량%, 0.05 내지 10중량%로 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상술한 바와 같이, 상기 피부 외용제 조성물은 지방조직을 이루는 지방세포의 분화를 촉진시킴으로써 근본적으로 피부의 볼륨 또는 탄력을 증진시킬 수 있다. 이에, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 피부 미용 목적의 지방조직 증가에 유용하며, 피부의 볼륨감 및 탄력을 증가시키고 피부 주름을 개선시키는데 도움이 된다.

이하, 실시예를 통해 본 발명의 일 예에 따른 비오틴이 결합된 헥사펩타이드-２ 유도체를 포함하는 지방세포 분화 촉진용 조성물에 대하여 더욱 상세히 설명한다. 다만 하기 실시예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 하나의 참조일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 여러 형태로 구현될 수 있다. 또한 명세서에서 특별히 기재하지 않은 첨가물의 단위는 중량%일 수 있다.

(평가방법)

1. 세포독성 평가

본 발명에 따른 제조예1(비오틴이 결합된 헥사펩타이드-２ 유도체, LiftDerm, Hybrid Peptide BIO; biotinoyl hexapeptide2)의 시료를 이용하여, 하기와 같이 세포독성 평가를 수행하였다. 세포독성은 MTT assay를 이용하여 측정하였고, 대조군으로 시료를 첨가하지 않은 것을 100%로 하여 상대적인 세포독성을 계산하였다. 상세한 실험방법은 다음과 같다.

구체적으로, 사람의 정상 섬유아세포(Human Dermal Fibroblast neonatal)를 세포 배양용 96웰 플레이트에 3,000개의 세포수로 일정하게 분주하여 10% FBS(Fetal bovine serum)가 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media, Gibco BRL)에서 24시간 동안 37℃, 5% CO₂　조건으로 인큐베이터에서 배양하였다. 각 시료를 각각 10mM의 농도로 물로 녹여 농축액으로 하고, 이를 0.5% FBS가 함유된 DMEM으로 희석하여 200uM, 20uM, 2uM의 농도로 희석한 후 각 well에 100ul의 배지가 우선 들어있는 상태에 각 희석액을 100ul씩 넣어 처리한 후 48 시간 동안 배양하였다.

세포 독성 측정을 위한 MTT assay의 경우에는, 배양액이 제거된 각 well에 10% FBS가 포함된 DMEM 배지를 90ul 첨가하고, 5mg/ml로 PBS에 녹여져있는 3-(4,5-dimethylthiazo1-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)를 각각 10ul씩 첨가하고, 37℃, 5% CO₂　조건에서 3시간 동안 반응시켰다. 이후 상층액을 조심스럽게 제거하고, 세포 내 침전된 MTT formazan을 100ul DMSO 로 녹인 후 ELISA reader기를 이용하여 OD570에서의 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 본 발명에 따른 제조예1의 시료는 세포에 대한 독성이 전혀 없음을 확인하였다.

2 aP2 ( adipocyte fatty acid-binding protein 2) 전사 증가 측정

본 발명에 따른 제조예1(비오틴이 결합된 헥사펩타이드-２ 유도체, LiftDerm, Hybrid Peptide BIO; biotinoyl hexapeptide2) 의 시료가 aP2의 전사 증가에 미치는 영향을 아래와 같이 확인하였다.

구체적으로, 10% NBCS가 포함된 DMEM 배지에서 키우던 지방전구세포를 60ø 디쉬(dish)에 깔아준 후, 500uM IBMX, 1uM dexamethasone, 1ug/ml insulin, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지로 옮겨 배양하면서, 제조예1의 시료를 100uM의 농도로 처리한 후 6일간 배양하고, 배양 종료 후 배지를 제거한 후 RNeasy mini kit (Qiagen)을 이용하여 RNA를 추출하고, cDNA 합성 kit(Toyobo)를 이용하여 cDNA를 합성한 뒤, 아래의 각 프라이머 및 Power SYBR master mix (Thermo)와 권장 비율로 혼합하고 quantstudio 3 장비 (Thermo)를 이용하여 qPCR을 수행하였다. 이때, 대조군은 무처리군이다.

상기 방법으로 얻어진 결과는, 하기 도1에 도시하였다.

유전자 명 : aP2

프라이머 서열 : F: GGTCACCATCCGGTCAGAGA, R: CGGTGATTTCATCGAATTCCA

3. 단백질 발현 변화 측정

본 발명에 따른 제조예1(비오틴이 결합된 헥사펩타이드-２ 유도체, LiftDerm, Hybrid Peptide BIO; biotinoyl hexapeptide2)의 시료를 이용하여, 하기와 같이 세포 내 aP2 유전자 전사 증가가 단백질 발현 증가로 나타나는지를 확인하기 위하여 western blot을 수행하였다.

구체적으로, 10% NBCS가 포함된 DMEM 배지에서 키우던 지방전구세포를 60ø 디쉬(dish)에 깔아준 후, 500uM IBMX, 1uM dexamethasone, 1ug/ml insulin, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지로 옮겨 배양하면서, 제조예1의 시료를 100uM의 농도로 처리한 후 6일간 배양하고, 배양 종료 후 배지를 제거한 후 protease inhibitor cocktail이 포함된 RIPA lysis buffer를 넣어 전체 세포 파쇄액을 수득하였다. 이후 microBCA assay를 통해 총 단백질 정량을 수행하고, SDS-PAGE gel에 20ug의 각 세포 파쇄액을 로딩하고 전기영동으로 각 단백질을 분리한 후, nitrocellulose membrane에 이동하고 블로킹 버퍼를 이용해 비특이적 결합을 없애고, anti-aP2 항체(Cell signaling) 및 anti-βactin(Sigma) 항체 및 이에 대한 HRP 결합된 이차항체(Sigma)를 반응시킨 후 enhanced ECL system을 이용하여 단백질의 존재 및 정량을 수행하였다. 이때, 대조군은 무처리군이다.

상기 방법으로 얻어진 결과는, 하기 도2에 도시하였다.

4. 지방전구세포 의 　지방세포로의 분화촉진 효능 평가

본 발명에 따른 제조예1(비오틴이 결합된 헥사펩타이드-２ 유도체)의 시료를 이용하여, 하기와 같이 지방세포 분화 촉진 효능·효과를 평가하였다. 이때, 대조군으로 무처리군을 사용하였으며, 양성 대조군으로 로지글리타존을 사용하였다.

구체적으로, 지방전구세포(pre-adipocytes)인 3T3-L1 세포를 10% 소혈청(bovine calf serum)이 들어있는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Hyclone Lab., USA)에서 배양한 후, 24-웰 플레이트에 1×10⁴세포/웰의 밀도로 37℃, 5% 농도의 CO₂　배양기에서 48시간 배양하였다. 48시간 동안 배양 한 다음, 10μg/mL 인슐린(insulin), 0.5 mM 3-아이소부틸-1 메틸잔틴 (isobutylmethylxanthine), 0.25 μM 덱사메타손(dexamethasone), 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 포함된 DMEM 배지로 갈아주고 성숙한 지방세포로의 분화를 유도하였다. 이때 실험군으로는 상기 제조예1을 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)에 녹인 후 농도별로 처리하였으며, 대조군은 DMSO를 처리하였다. 분화유도를 시작하고 48시간 후에 10μg/mL 인슐린(insulin)이 포함된 10% FBS/DMEM 배지로 교환하면서 추출물 시료도 다시 처리하였다. 72시간 후 추출물 시료가 포함된 10% FBS/DMEM 배지로 교환하고, 지방세포로의 분화를 시작한지 7일이 되었을 때, 지질 성분만을 선택적으로 빨간색으로 염색시키는 Oil-red O 염색을 통해 생성된 지방을 확인하였다. 즉, 세포배양액을 제거하고 세포를 PBS로 세척한 후 10% 포르말린(formalin)을 넣고 실온에서 1시간 동안 고정시켰다. 1시간 후 10% 포르말린(formalin)을 제거하고 증류수로 두 번 세척한 뒤 Oil-red O 염색 시약을 넣고 실온에서 1시간 동안 염색하였다. 염색 후 염색시약을 걷어낸 후, 증류수로 세척한 뒤, 이미지를 스캔하고, 염색된 세포에 100% 이소프로판올(isopropanol)을 넣고 염색된 Oil-red O을 용출시켜 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 지방축적 정도를 평가하였다.

상기 방법으로 얻어진 결과는, 하기 도3에 도시하였다.

(제조예1)

펩타이드 합성방법으로 Fmoc(9-luorenylmethoxycarbonyl)을 Nα-아미노산의 보호기로 사용하는 고상 합성법을 이용하여, 비오틴이 결합된 헥사펩타이드-２ 유도체를 수득하였다.

구체적으로, Amine레진 (1.1 mmol/g, Novabiochem Corporation)의 1 mmol에 대한 양을 측량하여 반응 용기에 넣은 다음, MC 30 ml을 첨가하여, 10분 동안 레진을 팽윤(swelling) 시켰다. 감압 하에서 용매를 제거하고, DMF 용매에 녹인 Fmoc-라이신(4 eq.), DIC (2 eq.; Diisopropylcarbodiimide) & DMAP (0.1 eq.; 4-Dimethylaminopyridine) 혼합 용액을 용기에 첨가하여, 4시간 동안 반응을 시켰다. 다음으로, Amine 레진에 로딩한 아미노산 용액을 감압 하에서 제거하고, 레진을 디메틸포름아마이드(DMF)와 디클로로메탄(MC)으로 각각 30 ml Ⅹ 5회 세척하였다. Fmoc-라이신이 로딩된 레진을 20 % (v/v%) 피페리딘으로 희석된 DMF 용액으로 10 분 동안 반응하여 탈 보호 시킨 다음, DMF와 MC로 각각 30 ml Ⅹ 5회 세척하였다.

이후, Fmoc 보호기가 제거된 레진에, DMF 용매에 녹인 Fmoc 펩타이드 및 비오틴(Fmoc-D-페닐알라닌, Fmoc-트립토판, Fmoc-알라닌, Fmoc-D-트립토판, Fmoc-히스티딘, 비오틴의 순서로 사용) (각각4 eq.), DIC (4 eq.; Diisopropylcarbodiimide), HOBt (4 eq.; N-hydroxybenzotriazole) 커플링 용액을 첨가하고, 각각 4 시간 동안 실온(25℃)에서 반응을 시켜 아미노산 커플링 반응을 유도하였다. 아미노산 커플링 반응 후, 세척한 소량의 레진에 카이저 테스트 용액A, B, C[시약 A: 에탄올(100 ml) 내 닌하이드린 5 g), 시약 B: 에탄올(20 ml) 내 페놀 (80 g), 시약 C: 피리딘 (98 ml) 내 0.1M KCN (2 ml)]를 2-3 방울 첨가한 후, 100℃를 유지하면서 10분 동안 레진의 색깔 변화를 관찰하였다. 레진의 색깔 변화가 없는 경우, 커플링 반응이 진행된 것으로 간주하고 다음 반응을 진행하였으며, 레진 색깔이 푸른색을 나타내면 미반응한 부분이 남아 있는 것으로 간주하여 아미노산 커플링 반응을 다시 진행하였다.

이와 같은 과정으로, 합성된 펩타이드를 레진에서 제거하고 아미노산 사이드 체인 보호기를 탈보호화 시키기 위하여 TFA(trifluoroacetic acid), TIS(triisopropylsilane), 사이오아니졸(thioanisole), H₂O, EDT(ethanedithiol)로 구성된 혼합물을 90:2.5:2.5:2.5:2.5 비율로 첨가하여 침전된 고형물을 생성시켰고, 이렇게 얻어진 침전물을 원심분리시켜, 여액의 TFA, TIS, 사이오아니졸, H₂O, EDT 등을 제거하고, 3회 이상 반복하여, 고형화된 비오틴이 결합된 헥사펩타이드-２ 유도체를 얻었다(수율=98%).

수득된 비오틴이 결합된 헥사펩타이드-２ 유도체의 분석을 위해 RP-HPLC 및 LC-MS 분석을 수행하였다. RP-HPLC의 경우에 A 버퍼를 0.1% TFA가 함유된 물, B 버퍼를 0.1% TFA가 함유된 아세토니트릴로하고, 30분에 걸쳐 B 버퍼의 농도를 5%에서 65%로 끌어올리는 농도 구배를 통해 분석하였다. 그 결과 Rt는 약 25.808분 이었다. LC-MS의 경우에는 예측치 1099.3 Da, 실측치 1099.1Da의 결과를 얻을 수 있었다.

(실시예1 내지 6 및 비교예1 내지 2)

하기 표1의 유상성분과 수상성분을 포함하는 화장료 조성물(크림 제형)을 제조하였다.

성분(원료명)	실시예(중량%)						비교예
성분(원료명)	1	2	3	4	5	6	1	2
화학식1의 화합물	0.01	0.01	0.01	0.01	0.001	0.1	-	-
레티닐팔미테이트	-	5,000^*	-	5,000^*	-	-	-	-
아데노신	-	-	0.01	0.01	-	-	-	0.01
스테아린산	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
알란토인	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
글리세린	10	10	10	10	10	10	10	10
메칠글루세스-20	2	2	2	2	2	2	2	2
세테아릴알코올	2	2	2	2	2	2	2	2
글리세릴스테아레이트	1	1	1	1	1	1	1	1
세테스-20	2	2	2	2	2	2	2	2
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5	5	5	5	5	5	5	5
사이클로펜타실록산	5	5	5	5	5	5	5	5
쉐어버터	5	5	5	5	5	5	5	5
토코페릴아세테이트	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
소듐아크릴레이트/소듐아크릴로일디메칠타우레이트코폴리머	2	2	2	2	2	2	2	2
달팽이점액여과물	6	6	6	6	6	6	6	6
서양장미꽃수	5	5	5	5	5	5	5	5
카프릴하이드록사믹애씨드/카프릴릴글라이콜/글리세린	1	1	1	1	1	1	1	1
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량
* 레티닐팔미테이트의 사용량 5,000^*은 5,000IU/g에 해당함.

(실시예7)

하기 표2의 성분을 포함하는 약학 조성물(연고 제형)을 제조하였다.

구분	성분(원료명)	함량(중량%)
1	정제수	잔량
2	화학식1의 화합물	0.50
3	카프린/카프릴트리글릭세리드	2.00
4	액상파라핀	1.50
5	솔비탄세스퀴올리에이트	0.50
6	옥틸도데세스-25	0.50
7	세틸에틸헥사노에이트	2.00
8	스쿠알란	5.00
9	살리실산	0.50
10	글리세린	10.0
11	솔비톨	2.00

하기 도1 에 도시한 바와 같이, 본 발명에 따른 유효성분은 aP2 유전자 전사를 증가시킴을 확인하였다.

또한 하기 도2 에 도시한 바와 같이, 본 발명에 따른 유효성분을 처리함에 따라 세포 내 aP2 유전자 전사 증가가 aP2 단백질 발현에 현저한 증가를 나타냄을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 유효성분의 처리는 지방전구세포의 대사에 관여함을 알 수 있다.

또한 하기 도3 에 도시한 바와 같이, 본 발명에 따른 유효성분을 처리한 경우, 지방전구세포의 지방세포로의 분화를 촉진시켰으며, 이의 효과는 대조군 대비 현저하게 향상된 효과임을 확인하였다.

더욱이, 이와 같은 효과에 있어서, 본 발명에 따른 유효성분을 처리한 경우, 양성대조군인 로지글리타존과 대비 동등 이상의 효과를 나타냄을 확인하였다. 또한, 레티닐팔미테이트, 아데노신 등의 원료와 조합됨에 따라 보다 낮은 농도에서 지방축적 촉진 효과를 나타냄을 확인하였다.

상술한 바와 같은 효과는, 본 발명에 따른 유효성분이 상기 표1의 화장료 조성물 및 상기 표2의 약학 조성물로 제형화 되는 경우에도 동일하게 구현된다.

이상과 같이 본 발명에서는 특정된 사항들과 한정된 실시예 및 도면에 의해 설명되었으나 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다.

따라서, 본 발명의 사상은 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등하거나 등가적 변형이 있는 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

Claims

하기 화학식1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 지방세포 분화 촉진용 화장료 조성물.
[화학식1]
하기 화학식1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피하지방 감소 억제용 화장료 조성물.
[화학식1]
하기 화학식1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 볼륨 또는 탄력 증진용 화장료 조성물.
[화학식1]
제 1항 내지 제 3항에서 선택되는 어느 한 항에 있어서,
상기 화장료 조성물은,
지방조직을 증가시키는 것인 화장료 조성물.
제 1항 내지 제 3항에서 선택되는 어느 한 항에 있어서,
상기 유효성분은,
총 중량에 대하여, 0.0001 내지 10중량%로 포함되는 것인 화장료 조성물.
제 1항 내지 제 3항에서 선택되는 어느 한 항에 있어서,
상기 화장료 조성물은,
레티놀, 레티닐팔미테이트, 아데노신 및 폴리에톡실레이티드레틴아마이드에서 선택되는 원료를 더 포함하는 것인, 화장료 조성물.
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