KR101962641B1 - 밤나무총포 추출물을 유효성분으로 함유하는 항균 및 항바이러스 활성을 가지는 조성물 및 이를 포함하는 여성청결제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항균 및 항바이러스 활성을 가지는 천연 추출물을 함유하는 조성물 및 이를 포함하는 여성청결제 조성물에 관한 것으로, 밤나무총포 추출물을 포함하는 본 발명의 조성물은 가드네렐라 바지날리스와 클라미디아 트라코마티스의 감염으로부터 질을 보호하고, 인간유두종바이러스의 감염을 억제함을 통해 질염 유발의 효과적인 억제 및 질환유발을 예방하는 효과를 가진다. 또한, 상기 밤나무총포 추출물은 인체점막에 대한 부작용이 없으므로, 질 내부의 사용에 있어 안전하게 사용할 수 있다.

Description

밤나무총포 추출물을 유효성분으로 함유하는 항균 및 항바이러스 활성을 가지는 조성물 및 이를 포함하는 여성청결제 조성물 {A antibacterial and antivirus composition containing the extracts of chestnut tree involucre and the feminine cleanser composition comprising the same}

본 발명은 항균 및 항바이러스 활성을 가지는 천연 추출물을 함유하는 조성물 및 이를 포함하는 여성청결제 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 여성 질염을 유발하는 균주인 가드네렐라 바지날리스 (Gardnerella vaginalis) 및 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis)에 대한 항균 활성 및 인간 유두종바이러스 (human papillomavirus, HPV)에 대한 항바이러스 활성을 가지는 조성물 및 이를 포함하는 여성청결제 조성물에 관한 것이다.

여성의 질에 발생하는 염증은 질내부 염증으로 인해 비정상적인 질분비물이 나오는 상태를 말한다. 일반적인 분비물은 산성, 무색, 무취의 점성이 있는 액체이나, 질염에 의한 질 분비물은 노란색 또는 진한 회색을 띄며 악취가 나며 분비물의 양도 증가하게 된다. 이러한 질염은 크게 세균성 질염, 칸디다 질염, 트리코모나스 질염으로 나뉜다. 그 중 세균성 질염은 일반적인 감염성 질염 중 가장 흔한 원인이다. 세균성 질염을 유발하는 균주에는 혐기성 세균인 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis)가 대표적이다. 정상적인 질 내에는 유산균 간균인 락토바실러스(Lactobacillus)속 세균들이 질 내 산도를 4.5 이하로 유지시키는 역할 뿐만 아니라 병원성 세균의 성장을 억제하는 물질을 생성하여 질 내 환경을 유지한다. 세균성 질염은 가드네렐라 바지날리스가 과다 증식하면서 질 내 정상균총인 락토바실러스를 대체하여 질 내 pH를 증가시킴으로써 염증반응을 일으키게 된다. 세균성 질염을 유발하는 가드네렐라바지날리스는 인간 유두종바이러스 (human papillomavirus, HPV)의 발현을 자극하는 것으로 알려져 있어 증상이 없어도 치료할 것이 권장된다.

이러한 세균성 질염을 치료하는데 사용되는 약물은 혐기성 균주에 감수성이 있는 메트로니다졸(Metronidazole)과 클린다마이신(Clindamycin)이 흔하게 사용된다. 그러나, 메트로니다졸은 혐기균의 DNA 복제기전에 클린다마이신은 단백질 합성과정에 영향을 주어 균이 증식하지 못하게 한다. 또한, 가드네렐라 바지날리스의 경우 메트로니다졸에 대한 내성 균주가 이미 있는 것으로 알려져 있다. 세정제의 경우 의약품으로 분류된 지노베타딘, 솔박타의 주성분은 포비돈 요오드 또는 트리클로카반으로 이 두 가지는 살균소독제로 유익균인 유산균의 생존에도 영향을 미치며, 특히 트리클로카반은 트리클로산과 유사한 물질로 독성이 있는 것으로 알려져 있다.

클라미디아는 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis)라는 세균에 감염되어 세포내 서식으로 발생하는 성매개성 질환이다. 25세 미만의 젊은 나이대의 사람에게서 감염위험이 높고 나타나고 특히, 여성에 있어서 감염에 대한 위험이 높다. 증상은 감염된 지 1 ~ 3주 후에 나타나고, 배뇨 중 작열감, 음경 또는 질에서의 분비물, 하복부 통증, 여성 성교 통증, 남성 고환 통증 등이 나타나며, 많은 환자들은 클라미디아의 증상을 알지 못하는 경우가 있다고 한다. 발병 후 오랜 시간 치료를 하지 않은 경우 여러 가지 합병증을 동반할 수 있다고 한다. 일부 여성에 있어서는 자궁, 자궁경부를 손상시킬 수 있는 감염인 골반염증 질환 (PID)에 걸릴 수 있으며, 나팔관에 흉터가 형성될 수 있으므로 임신을 할 수 없게 될 수도 있다. 또한 클라미디아에 걸려있는 동안 임신한 여성은 분만중에 아이에게 세균을 옮길 수 있으므로, 신생아에게 눈 감염과 폐렴을 일으킬 수 있다.

인간 유두종바이러스 (HPV)는 피부와 성기 사마귀의 원인으로 알려진 이중 나선 DNA 바이러스로, 현재 100여종 이상의 아형이 동정되어 있으며, 아형 중 약 15종이 종양 형성과 관련된 고위험군으로 분류되었다. 알려진 인간 유두종 바이러스 중 대부분은 사람들에게 어떠한 징후를 나타내지 않지만, 일부의 인간 유두종바이러스 (HPV)의 경우, 사람에게 유두종(papilloma)을 발생시킬 수 있다. 또한 소수의 인간 유두종 바이러스의 경우, 자궁경부암, 고환암과 같은 암을 발생시킨다. 인간 유두종 바이러스 16(HPV 16)과 인간 유두종바이러스 18(HPV 18)의 경우, 전 세계 자궁경부암 환자의 70%에서 발견되고 있다. 인간 유두종바이러스(HPV)의 DNA는 8000개의 염기쌍을 포함하고 있고 지질막이 아니라 오량체의 캡시드 단백질에 둘러싸여 존재한다. 캡시드 단백질은 2개의 구조 단백질인 L1과 L2로 이루어졌고 이 단백질은 바이러스 복제 사이클의 후기에서 발현된다. 바이러스의 복제에 필요한 유전자인 E1-E7 , 비리온(virion)을 구성하는 구조 단백질을 발현하는 유전자 L1-L2, 마지막으로 바이러스의 복제와 전사를 조절하는 LCR로 구성된다. 이와 같은 인간 유두종 바이러스는 고위험군으로 분류된다.

최근 식물유래의 독성이 없는 천연물질에 대한 관심이 높아지는 경향에 맞춰, 여성세정제에 식물유래 성분을 함유한 제품 또는 특허가 발표되고 있다. 대표적인 예로 한국 공개특허 10-2017-0123291에는 와송, 사자발, 한련초, 황칠, 마치현, 고장초 등 다양한 약초추출물을 포함하는 여성추출물 제조에 대하여 게시하였고, 한국 등록특허 10-0862211에서는 다시마 추출물을 함유하는 질염 예방 및 치료용 조성물에서 세균성 질염 유발 균주인 가드네렐라 바지날리스에 대한 항균활성을 발표하였다. 또한 솔잎 추출물을 이용한 인간 유두종바이러스에 대한 특허가 등록 되어 있다 (등록번호:10-1440853). 하지만 본 연구에서 사용된 밤나무총포 추출물을 이용한 연구는 아직 보고되지 않았다.

한편, 총포는 꽃자루의 기부에는 보통 포가 있는데, 몇 개에서 다수의 꽃이 모인 꽃차례에서는 꽃자루가 현저하게 단축되었기 때문에 포가 함께 밀집하는 수가 있다. 이 밀집된 것을 총포라고 하며, 각 편을 총포편이라고 한다. 가장 전형적인 것은 국화과에서 볼 수 있다. 국화과에서는 총포의 형태, 총포편의 수나 성질이 분류하는 데 좋은 특징이 되고 있다. 총포편이 적은 것은 크기 ㅇ모양 ㅇ성질 등이 일정하게 되어 있으나, 엉겅퀴의 무리에서는 수도 많아지고 외편 ㅇ중편 ㅇ내편에서는 모양이나 성질도 매우 다르며, 도꼬마리는 총포가 단지 모양으로 되어 있다. 또 산딸나무나 풀산딸나무에서의 총포편은 4개이고 대형이며 백색 꽃잎 모양으로 되어 있다. 참나무과 식물에서도 밤나무속과 같이 총포가 발달하여 가시돋힌 덧껍데기가 되는 것도 있다.

이중 밤나무 총포는 밤나무의 암꽃이 개화시에 총포 속에 있는데 이 총포의 외측에 가시가 자라면서 우리가 흔히 알고 있는 밤송이가 된다. 밤나무 과수는 밤 과육, 율피, 외피, 밤송이로 구분되는데 본 발명에서는 밤송이를 사용하였다. 이러한 밤송이는 밤이 수확되고 나서는 밤송이는 따로 사용되지 않아 폐기된다. 2015년 기준 국내 밤 생산량은 약 5.5만톤에 달한다. 이전 연구자료에 따르면 연간 밤송이 발생율은 밤 생산 중량의 25%를 차지하는 것으로 알려져 있다. 따라서 연간 생산되는 밤송이는 약 1.4만톤에 이르는 것으로 추정된다. 이러한 밤송이를 활용하기 위한 몇몇 선행연구로는 한국 공개특허 제2012-0048718 밤송이 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에서 다양한 용매를 활용하여 추출한 밤나무총포 추출물이 미백, 항염, 항산화, 주름개선에 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 또한 한국 공개특허 제 2015-0128373에서 유산균을 이용한 밤송이 발효추출물이 피부주름 방지 및 항균활성이 있는 것으로 발표되었다.

하지만 밤나무총포의 여성 질염과 관련하는 효능에 대한 연구는 아직까지 진행되지 않았다.

이에 본 발명자들은 항균 및 항바이러스, 특히 여성 질염과 관련된 세균 및 바이러스에 대해 세균 감염억제 효능을 가지면서도 유산균과 같은 유익균에는 영향을 미치지 않으면서 인체 부작용이 전혀 없는 새로운 천연물질을 개발하기 위해 계속 연구를 진행한 결과, 밤나무총포 추출물이 여성 질염와 관련된 세균 및 바이러스에 대하여 우수한 항균 및 항바이러스 효능을 가지면서도 유익균에는 전혀 영향을 미치지 않는다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 항균 및 항바이러스 효능을 가짐으로써 감염물질로부터 여성의 질을 보호하고, 안전성이 높아 피부 부작용이 없는 천연물질을 제공하고자 한다.

상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 밤나무총포 추출물을 유효성분으로 포함하는 밤나무총포 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항균 및 항바이러스 활성을 가지는 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 상기 항균 및 항바이러스 활성을 가지는 조성물을 포함하는 여성청결제 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 밤나무총포 추출물은 여성 질염을 유발하는 가드네렐라 바지날리스의 생육을 저해하면서 여성 질내 유익균의 생육에 영양을 미치지 않으며, 클라미디아 감염증을 일으키는 클라미디아 트라코마티스균의 감염을 억제하고, 또한 자궁경부암을 일으키는 인간 유두종바이러스의 감염을 억제하는 물질로, 점막자극 시험인 HET-CAM test에서 자극이 없는 것으로 나타나 안전성 측면에서도 인체에 해를 미치지 않는 것으로 나타났다.

본 발명의 용어 "추출물(extract)"은 생약을 적절한 침출액으로 짜내고 침출액을 증발시켜 농축한 제제를 의미하는 것으로, 이에 제한되지는 않으나, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물일 수 있다.

본 발명의 밤나무총포 추출물은 당분야에 공지된 통상적인 추출용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 추출한 액은 액체 형태로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 이때, 상기 추출용매는 예를 들어, (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름 또는 (g) 1,3-부틸렌글리콜을 추출 용매로 하여 수득할 수 있다. 바람직하게는, 메탄올, 에탄올 또는 부탄을 이용하여 추출하는 것이 좋다. 추출용매에 따라 추출물의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 추출용매를 선택하여 사용하도록 한다. 상기 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다.

또한, 상기 밤나무총포 추출물은 상기 추출용매에 의하여 추출하는 방법 외에 통상적인 정제과정을 거쳐서도 수득할 수 있다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제방법을 통해 얻어진 분획을 통하여서도 밤나무총포 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명의 실시양태에 따르면, 밤나무총포 추출물은 밤알을 제외한 겉껍질인 밤나무총포 중량의 약 0.5 내지 20배, 바람직하게는 약 1 내지 15배 분량의 물, 에탄올, 메탄올 등과 같은 C₁ 내지 C₄의 저급 알코올 또는 약 1:0.1 내지 1:10, 바람직하게는 1:0.2 내지 1:9의 혼합비(㎏/ℓ)를 갖는 물과 메탄올의 혼합용매로, 실온에서 약 0.5 내지 48시간, 바람직하게는 1 내지 30시간 동안 교반추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여, 바람직하게는 초음파 추출한 후 수득한 추출액을 여과, 감압농축 또는 건조하여 본 발명의 밤나무총포 추출물을 수득할 수 있다.

상기 용매로 추출한 추출물은 이후, 부탄올, 헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름, 물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 분획과정을 더욱 실시할 수 있다.

상기 밤나무총포 추출물은 수득된 추출액을 농축 및 동결건조를 통하여 수분을 완전히 제거시킨 것일 수 있으며, 상기 수분을 완전히 제거시킨 밤나무총포 추출물은 분말형태로 사용하거나 상기 분말을 증류수 또는 통상의 용매에 녹여 사용할 수 있다.

본 발명은 상기 제조방법으로 얻어지는 밤나무총포 추출물을 유효성분으로 함유하는 항균 및 항바이러스 활성을 가지는 조성물 및 이를 포함하는 여성청결제 조성물을 제공한다.

본 발명의 항균 및 항바이러스 활성을 가지는 조성물에서 밤나무총포 추출물의 양은 전체 조성물에 대하여 0.0001 내지 10 중량%, 보다 바람직하게는 밤나무총포 추출물은 전체 조성물에 대하여 0.001 내지 5 중량%이 포함될 수 있다. 이때 밤나무총포 추출물 함량이 0.0001 중량% 미만인 경우에는 항균 및 항바이러스 활성이 미약하고, 10 중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 미비하여 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.

본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 상기 항균 및 항바이러스 활성을 가지는 조성물은 여성청결제 조성물 전체 중량에 대하여 1 내지 20중량%의 양으로 포함되는 것을 특징으로 한다. 이때 항균 및 항바이러스 활성을 가지는 조성물이 1 중량% 미만인 경우에는 여성 질염 개선에 대한 효과가 너무 미약하고, 20 중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 미비하여 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.

본 발명의 밤나무총포 추출물을 함유하는 조성물은 항균 및 항바이러스 효과를 나타내며, 천연 물질로서 세포독성이 거의 없다.

본 발명의 하나의 실시양태에 따른 항균 및 항바이러스 활성을 가지는 조성물은 밤나무총포 추출물 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여, 보다 바람직하게는 여성청결제로서 국부 투여(topical application) 방식으로 적용된다.

본 발명의 항균 및 항바이러스 활성을 가지는 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 항균 및 항바이러스 활성을 가지는 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 또한 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

본 발명의 항균 및 항바이러스 활성을 가지는 조성물은 당분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑시르제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 상기 항균 및 항바이러스 활성을 가지는 조성물을 포함하는 여성청결제 조성물은 세정제용, 약제용, 화장료용, 물티슈용으로 적용되는 것일 수 있다.

본 발명에 의한 항균 및 항바이러스 활성을 가지는 조성물은 그 사용에 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면 질염 예방 또는 치료를 위한 여성청결제 조성물 등에 사용될 수 있다. 또한, 상기 여성청결제 조성물은 세정제용, 약제용, 화장료용, 물티슈용 등으로 사용될 수 있다.

상기 세정제용은 스프레이형, 액상형, 젤형, 분말, 고형의 비누, 거품타입 등으로 제형화된 것일 수 있다.

한편, 본 발명의 밤나무총포 추출물은 천연물질로서 인체에 무해하며, 독성 및 부작용이 거의 없으므로 장기간 사용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 밤나무총포 추출물을 포함하는 조성물이 여성 질염을 유발하는 가드네렐라 바지날리스에 대한 항균활성을 나타내며, 클라미디아 트라코마티스 감염을 억제하는 효과를 가진다. 또한 상기 추출물은 인간 유두종바이러스로부터 감염을 억제하여, 여성의 질로부터 감염되는 질병의 예방효능을 가진 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다. 또한 상기 천연 추출물은 인체 점막에 대한 부작용이 거의 없으므로 안전하게 사용할 수 있다.

도 1은 밤나무총포 추출물에 의한 클라미디아 트라코마티스 감염억제 효과를 보여주는 그림이다.
도 2는 밤나무총포 추출물에 의한 점막자극실험 결과를 나타내는 그림이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

제조예 1 : 추출물의 제조

밤나무 총포는 제주도 제주시에서 자생하는 밤나무에서 채취하여 이용하였다. 위의 원물 40 g에 정제수 2 L를 넣고 멸균기에서 열수 추출하였다. 상층액은 농축기를 이용하여 농축한 뒤, 동결 건조하여 파우더화 하였다. 파우더화된 추출물을 100 mg/mL의 농도로 멸균된 증류수에 녹인 뒤, 0.2 μm pore size의 수용성 시린지 필터를 거친 뒤 실험에 사용하였다.

준비예 1 : 실험균주의 배양 및 HPV 16 슈도바이러스의 생산

1-1. 실험균주의 배양

가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis, ATCC14018) 균주는 American Type Culture Collection에서 분양 받아 사용하였다. 락토바실러스 애씨도필러스(Lactobacillus acidophilus, KCTC3164), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus, KCTC3174), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri, KCTC3163)는 한국생명공학연구원 미생물자원센터에서 분양 받아 사용하였다.

가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis)는 Brain Heart Infusion 배지에 10% FBS가 포함된 배지에서 37℃, 혐기배양팩(Anaerobic gas pack; Thermo scientific)을 이용하여 혐기조건에서 배양하였다. 유산균 3종은 MRS broth/agar에서 37℃, 혐기배양팩을 이용하여 혐기조건에서 배양하였다.

1-2. HPV 16 슈도바이러스의 생산

인간유두종바이러스 HPV 16의 슈도바이러스 (pseudovirus)를 생산하기 위해 다음의 문헌을 참고하였다 (Curr Protoc Cell Biol. 2007 Dec;Chapter 26:Unit 26.1.).

293TT 세포에 10% FBS가 포함된 DMEM 배지가 들어 있는 75cm² 플라스크에 7.5 X 10⁶ 개의 세포가 되도록 접종시키고 5% 농도의 CO₂ 배양기에 37℃로 24시간 동안 배양하여 하였다. HPV16L1/L2 발현 플라스미드인 p16L1L2 (Addgene)와 루시퍼레이즈 플라스미드인 pGLuc(NEB)를 리포펙타민(Lipofectamine^ㄾ, Thermo Fisher)을 이용하여 293TT 세포에 공감염시킨 후 48시간 동안 배양하였다. 48시간 배양 뒤 세포를 트립신을 이용하여 떼어내어 원심분리기를 이용하여 4℃에서 200 X g 로 10분간 원심분리하여 세포를 회수하였다. 회수한 세포를 실리콘 튜브에 옮기고 DPBS-Mg로 분산하여 Brij^ㄾ 58 (Sigma, 최종농도 0.35%)와 RNase A/T1 cocktail (Thermo Fisher)를 처리한 뒤 37℃에서 24시간 동안 반응시켜 캡시드를 성숙화 시킨다. 성숙시킨 캡시드를 얼음에서 10분간 반응시킨 뒤, 4℃에서 5,000 X g로 10분간 원심분리하여 p16L1L2가 포함된 상등액을 회수하여 -80℃에 보관하였다.

실시예 1: 밤나무총포 추출물이 가드네렐라 바지날리스( Gardnerella vaginalis )의 생장저해효과 측정

상기 제조예 1의 밤나무총포 추출물이 질염 유발 균주의 생장 저해 효과가 있는지 여부를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험하였다. 먼저 10% 송아지혈청이 포함된 BHI 아가 플레이트에 접종한 가드네렐라 바지날리스를 루프로 긁어 10% FBS가 포함된 BHI 배양배지에 넣어 혐기조건에서 정치배양 하였다. 96-웰 마이크로플레이트에 추출물을 농도별로 처리하고 최종 균수가 10⁵ CFU/well(10⁶ CFU/ml)이 되도록 접종한 뒤, 24시간 동안 혐기 조건으로 배양하였다. 무처리군을 음성 대조군으로 사용하였으며, 배양이 끝난 균주는 육안으로 최소저해농도를 확인하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

처리물질	최소억제농도 (μg/ml)
밤나무총포 추출물	500

상기 표 1에서 보듯이, 밤나무총포 추출물은 가드네렐라 바지날리스에 대하여 우수한 항균활성을 나타내었다.

실시예 2: 밤나무총포 추출물이 유산균 3종의 생존에 미치는 영향 조사

밤나무총포 추출물이 인체에 유익한 균인 유산균의 생장에 영향을 나타내는지를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 진행하였다. MRS 플레이트에 배양한 유산균 3종 (락토바실러스 애씨도필러스, 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 가세리)을 MRS broth에 혐기조건으로 배양하였다. 96-웰 마이크로 플레이트에 농도별로 밤나무총포 추출물을 처리하고 최종균수가 10⁶ CFU/ml이 되도록 접종한 뒤, 혐기조건에서 24시간 배양하였다. 육안으로 균주의 사멸여부를 확인한 뒤, 600 nm의 파장에서 각 농도별 흡광도를 측정하였다. 무처리군인 대조군의 흡광도를 100%로 두고 밤나무총포 추출물에 의한 유산균의 생육정도를 비교하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

유산균	처리물질	생장률 (%)
락토바실러스 애씨도필러스	무처리군	100%
	밤나무총포 추출물 (500ppm)	98%
락토바실러스 크리스파투스	무처리군	100%
	밤나무총포 추출물 (500ppm)	102%
락토바실러스 가세리	무처리군	100%
	밤나무총포 추출물 (500ppm)	101%

표 2에서 보듯이, 밤나무총포 추출물을 처리한 군과 비교군의 생장률에 큰 차이가 없는 것으로 보아 유산균의 생존에는 영향을 미치지 않는 것으로 판단되었다.

실시예 3. 밤나무총포 추출물에 의한 클라미디아 감염 저해능 확인

밤나무 총포추출물의 클라미디아 (Chlamydia trachomatis) 감염에 대한 저해효과를 확인하기 위해 숙주세포에 감염시킨 뒤 세포내에서의 증식정도를 관찰하였다. 숙주세포로 인간의 HeLa 세포를 10% FBS가 포함된 DMEM 배지가 들어 있는 96-웰 마이크로 플레이트에 약 1 X 10⁴ 개의 세포가 되도록 접종시키고, 5% 농도의 CO₂ 배양기에 37℃로 24시간 동안 배양하여 하였다. 그 후 10% FBS, 20mM HEPES, 2mM 글루타민, 1ug/mL, 젠타미신(gentamicin) 8ug/ml, 암포테리신(amphotericin) B 1ug/ml 이 포함된 DMEM 배지로 교체하고 밤나무총포 추출물을 1시간 동안 전처리하였다. 그 후 클라미디아 (Chlamydia trachomatis serovar D, ATCC)를 각 웰에 처리하여 원심분리기로 3000 X g 로 1시간 동안 동작하여 감염을 유도하였다. 48시간 동안 배양후 4 % 포름알데히드로 고정시키고, 클라미디아-FITC 항체로 감염된 클라미디아의 봉입체를 형광염색하여 공초점 현미경(confocal microscope, IN Cell Analyzer 1000, GE)로 관찰하였다. 클라미디아 감염 저해효과 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에서 보듯이, 밤나무총포를 처리한 조건에서는 클라미디아 감염에 따른 세포내 증식이 65% 이상 저해하는 결과를 나타내었다.

실시예 4. 밤나무총포 추출물에 의한 인간유두종 바이러스 저해능 확인

밤나무 총포추출물의 인간유두종바이러스 (human papilloma virus) 감염에 대한 저해효과를 확인하기 위해 숙주세포에 슈도바이러스를 감염시킨 뒤 감염정도를 관찰하였다.

293TT 세포를 10% FBS가 포함된 DMEM 배지가 들어 있는 24-웰 마이크로 플레이트에 1 X 10⁵ 개의 세포가 되도록 접종시키고 5% 농도의 CO₂ 배양기에 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 그 후 밤나무총포 추출물을 농도별로 4시간 동안 전처리 후 슈도바이러스를 293TT에 감염시켜 5% 농도의 CO₂ 배양기에 37℃로 48시간 동안 배양한 뒤 세포 배양 상층액을 취하여 루시퍼라제(lucifease) 활성을 측정하였다. 밤나무총포 추출물을 처리하지 않은 군과 처리한 군의 루시퍼라제 활성을 비교하여, 인간유두종 바이러스에 대한 감염 저해효과를 판단하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

처리 물질	인간 유두종바이러스 감염저해율 (%)
비교예 (증류수)	0
밤나무총포 추출물 (10 ppm)	13%
밤나무총포 추출물 (100 ppm)	45%

상기 표 3에서 보듯이, 밤나무총포 추출물을 처리한 조건에서는 인간 유두종바이러스에 대해 45% 이상 감염 저해효과를 나타내었다.

실시예 5. 밤나무총포 추출물에 의한 점막자극 확인

밤나무총포 추출물의 점막에 대한 자극을 확인하기 위해 in-vivo 대체 시험인 HET-CAM test를 수행하였다. HET-CAM test는 풀무원에서 판매하는 수정된 brown Hy-line egg를 이용하였으며, 37.5℃, 습도 50%에서 9일간 배양하였다. 배양기간 동안 매시간 자동으로 알을 굴려주었으며, 9일째 되는 날 알을 인큐베이터에서 꺼내 0.9%의 식염수를 이용하여 표면에 수분을 공급한 뒤 시험에 사용하였다. 알의 숨구멍에 표시를 하고, 치과용 톱을 이용하여 내막은 파괴하지 않고 주변 외피를 벗겨냈다. HET-CAM 분석에서 자극을 유발하는 것으로 알려진 0.1 N 수산화나트륨과 1% 도데실 설페이트 나트륨을 농도별로 처리하여 일어나는 출혈, 용해, 응고 정도를 보고 자극의 강도 기준을 정하였고. 밤나무총포 추출물은 1%의 농도로 사용하였다. 0.3 ml의 시험물질을 CAM에 적용한 후, 5분간 관찰하여 출혈과 융해, 응고반응을 관찰하고, 기준물질을 처리하였을 때와 비교하여, 하기 수학식 1을 이용하여 점수화하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

반응도에서 0은 자극없음, 1은 약한 자극, 2는 평범한 자극, 3은 심한 자극을 나타낸다.

도 2에서 보듯이, 시험군을 처리한 조건에서는 반응도가 0이므로, 밤나무총포 추출물은 점막에 대한 자극이 없는 안전한 물질로 판정되었다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

제제예 1 : 여성청결제제

1-1. 거품 타입

성분	중량%
밤나무총포 추출물	1.00
부틸렌글라이콜	2.00
글리세린	1.00
디소듐이디티에이	0.02
피이지-60 하이드로제네이티드캐스터오일	1.00
코카미도프로필베타인	4.00
라우릴 글루코사이드	6.00
폴리소르베이트 20	1.00
소듐벤조에이트	0.40
카프릴릭글라이콜	0.20
소듐락테이트	0.50
정제수	82.88
총계	100

1-2. 젤 타입

성분	중량%
밤나무총포 추출물	1.00
부틸렌글라이콜	2.00
글리세린	1.00
디소듐이디티에이	0.02
피이지-60 하이드로제네이티드캐스터오일	1.00
코카미도프로필베타인	4.00
라우릴 글루코사이드	6.00
폴리소르베이트 20	1.00
소듐벤조에이트	0.40
카프릴릭글라이콜	0.20
소듐락테이트	0.50
하이드록시에틸셀룰로오스	0.7
정제수	82.18
총계	100

Claims (8)

1. 밤나무총포 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항균 및 항바이러스 활성을 가지는 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 항균 활성이 가드네렐라 바지날리스 (Gardnerella vaginalis) 및 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis)에 대한 항균활성인 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 항바이러스 활성이 인간 유두종바이러스 (human papillomavirus, HPV)에에 대한 항바이러스 활성인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 밤나무총포 추출물이 항균 및 항바이러스 활성을 가지는 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 항균 및 항바이러스 활성을 가지는 조성물을 유효성분으로 포함하는 여성청결제 조성물.
6. 제 5 항에 있어서,
   상기 항균 및 항바이러스 활성을 가지는 조성물은 여성청결제 조성물 전체 중량에 대하여 1 내지 20중량%의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 여성청결제 조성물.
7. 제 5 항에 있어서,
   상기 여성청결제 조성물이 세정제용, 약제용, 화장료용 또는 물티슈용인 것을 특징으로 하는 여성청결제 조성물.
8. 제 7 항에 있어서,
   상기 세정제용은 스프레이형, 고형, 액상형, 젤형의 비누 또는 거품타입의 세정제인 것을 특징으로 하는 여성청결제 조성물
   

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