KR101950718B1 - A media composition for growth of red cabbage callus and cultivation method using the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 적양배추 캘러스의 성장 유도와 항산화능 증가를 위한 배지 조성물 및 이를 이용한 배양 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 적양배추 잎의 캘러스 유도 및 성장을 향상시키고, 항산화능이 우수한 적양배추 캘러스를 유도할 수 있는 배지 조성물 및 이를 이용하여 적양배추 캘러스를 배양하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a culture composition for inducing the growth and antioxidative activity of red cabbage callus, and a culture method using the same. More particularly, the present invention relates to a composition for improving callus induction and growth of red cabbage leaves, And a method for culturing red cabbage callus using the same.
최근 의약품과 같은 효능을 나타내는 코스메슈티컬스가 글로벌 화장품 및 퍼스널 케어 마켓에서 가장 성장할 분야로 떠오르고 있는데, 그 중 세포재생을 통해 피부노화의 징후를 되돌릴 수 있는 가장 혁신적인 연구 분야가 바로 식물 줄기세포 기술이다. Cosmeceuticals, which has the same efficacy as recent drugs, is emerging as the most growth area in the global cosmetics and personal care market. Plant stem cell technology is one of the most innovative research fields that can reverse signs of skin aging through cell regeneration.
현재 화장품 산업에서의 가장 큰 문제점은 원료의 80% 이상을 수입에 의존하는 것인데, 식물 줄기세포 기술을 국내에서 개발하고 대량생산을 한다면 화장품의 원료절감에 도움이 될 것이다. The biggest problem in the cosmetics industry is that more than 80% of raw materials depend on imports. If we develop the stem cell technology in Korea and mass-produce it, it will help to reduce raw materials of cosmetics.
식물 줄기세포라고 불리는 캘러스(Callus)는 일반 식물체보다 항염, 항산화, 항노화 등에 효과적인 생리활성물질을 고농도로 함유하고 있다. Callus, called plant stem cells, contains a high concentration of physiologically active substances that are effective for anti-inflammation, antioxidant, anti-aging, etc., than general plants.
최근 건강에 대한 관심이 급증하고 화장품, 의약품 및 식품에 대한 선호도가 증가하면서 캘러스를 활용한 기술개발도 활발히 이루어지고 있다(한국등록특허 제10-1685554호, 한국등록특허 제10-1542176호, 한국공개특허 제10-2017-0123824호). Recently, interest in health has increased rapidly and preference for cosmetics, medicines and foods has been increasing, and technology using callus has been actively developed (Korean Patent No. 10-1685554, Korean Patent No. 10-1542176, Korea Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-2017-0123824).
그러나 상기 문헌에 개시된 기술은 캘러스의 배양방법이 복잡하고 캘러스의 성장이 저하되는 문제점이 있다.However, the technique disclosed in the above document has a problem that the method of culturing callus is complicated and the growth of callus is deteriorated.
본 발명은 상기 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 적양배추 캘러스의 유도 및 성장을 향상시킬 수 있는 MS modified medium 을 유효성분으로 함유하는 적양배추 캘러스의 배양을 위한 배지 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. DISCLOSURE Technical Problem The present invention aims to provide a culture composition for culturing red cabbage callus containing an MS modified medium as an active ingredient capable of improving induction and growth of red cabbage callus, do.
또한 본 발명은 상기 배지 조성물에 살균된 적양배추를 치상하고 배양하여 캘러스를 유도함으로써 항산화능이 우수한 적양배추 캘러스를 배양하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다. It is another object of the present invention to provide a method for culturing red cabbage callus having excellent antioxidant ability by inducing callus by dipping and culturing red cabbage sterilized in the medium composition.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 Ammonium nitrate 28~32중량%, Boric acid 0.1~0.3중량%, Calcium chloride anhydrous 5~7중량%, Cobalt chloride 6H2O 0.0005~0.003중량%, Cupric sulfate 5H2O 0.0005~0.003중량%, Ferric sodium EDTA 3H2O 0.6~0.9중량%, Magnesium sulfate anhydrous 2~5중량%, Manganese sulfate H2O 0.2~0.5중량%, Molybdic acid(Sodium salt) 2H2O 0.003~0.008중량%, Potassium iodide 0.01~0.03중량%, Potassium nitrate 33~37중량%, Potassium phosphate monobasic 2~5중량%, Sodium phosphate monobasic 1~4중량%, Zinc sulfate 7H2O 0.1~0.4중량%, Adenine hemisulfate 12~17중량%, Kinetin 0.1~0.3중량%, Myo-Inositol 1~3중량%, a-Naphthalene acetic acid(NAA) 0.005~0.05중량% 및 Thiamine HCl 0.5~0.9중량% 을 포함하는 MS modified medium 을 유효성분으로 함유하는, 적양배추 캘러스의 배양을 위한 배지 조성물을 제공한다.In order to achieve the above-mentioned object, the present invention provides a method for producing a ferrous sulfate-containing fermentation product, which comprises 28 to 32 wt% of ammonium nitrate, 0.1 to 0.3 wt% of boric acid, 5 to 7 wt% of calcium chloride anhydrous, 0.0005 to 0.003 wt% of Cobalt chloride 6H 2 O, 2 O 0.0005 to 0.003 wt%, Ferric sodium EDTA 3H 2 O 0.6 to 0.9 wt%, Magnesium sulfate anhydrous 2 to 5 wt%, Manganese sulfate H 2 O 0.2 to 0.5 wt%, Molybdic acid (Sodium salt) 2H 2 O 0.003 By weight of potassium phosphate monobasic, 1 to 4% by weight of sodium phosphate monobasic, 0.1 to 0.4% by weight of zinc sulfate 7H 2 O, 0.01 to 0.08% by weight of potassium iodide, 33 to 37% by weight of potassium nitrate, MS modified with 12-17% by weight of adenine hemisulfate, 0.1-0.3% by weight of kinetin, 1-3% by weight of Myo-Inositol, 0.005-0.05% by weight of a-naphthalene acetic acid (NAA) and 0.5-1.9% by weight of Thiamine HCl wherein the culture medium contains a medium as an active ingredient.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 배지 조성물의 pH 는 5~7 인 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the pH of the culture medium is 5 to 7.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 배지 조성물은 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the culture medium composition further comprises 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid).
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 배지 조성물은 한천 (agar), 수크로오스(sucrose) 및 MOPS (3-(N-morpholino)propanesulfonic acid)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the culture medium composition further comprises agar, sucrose, and MOPS (3- (N-morpholino) propanesulfonic acid).
또한 본 발명은 상기 배지 조성물에 살균된 적양배추를 치상하고 배양하여 캘러스를 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 적양배추 캘러스의 배양방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for culturing red cabbage callus comprising the step of inducing callus by germinating and cultivating red cabbage sterilized in the medium composition.
본 발명은 적양배추 캘러스의 유도 및 성장을 향상시킬 수 있는 MS modified medium 을 유효성분으로 함유하는 적양배추 캘러스의 배양을 위한 배지 조성물을 제공할 수 있다. The present invention can provide a medium composition for culturing a red cabbage callus containing an MS modified medium as an active ingredient capable of improving the induction and growth of red cabbage callus.
또한 본 발명은 상기 배지 조성물에 살균된 적양배추를 치상하고 배양하여 캘러스를 유도함으로써 항산화능이 우수한 적양배추 캘러스를 배양하는 방법을 제공할 수 있다. In addition, the present invention can provide a method for culturing red cabbage callus having excellent antioxidant ability by inducing callus by germinating and cultivating red cabbage sterilized in the medium composition.
도 1은 본 발명의 배지 성분을 나타낸다.
도 2는 배지 조성에 따른 적양배추 캘러스의 성장(Day 0, Day 4, Day 9)을 나타낸다.
도 3은 배지 조성에 따른 적양배추 캘러스의 성장(Day 14, Day 18, Day 23)을 나타낸다.
도 4는 적양배추 잎 및 적양배추 캘러스의 현미경 사진을 나타낸다. (A) 적양배추 잎, (B) MS modified medium 으로 유도 배양한 적양배추 캘러스, (C) Medium C 로 유도 배양한 적양배추 캘러스.
도 5는 배지 조성에 따른 적양배추 캘러스의 성장곡선을 나타낸다.
도 6은 배지 조성에 따른 적양배추 캘러스의 무게를 나타낸다.
도 7은 적양배추 잎 및 적양배추 캘러스의 활성산소흡수능(Oxygen Radical Absorbance Capacity, ORAC)을 나타낸다.Figure 1 shows the media components of the present invention.
Fig. 2 shows the growth of the red cabbage callus (
FIG. 3 shows the growth of red cabbage callus (
Figure 4 shows a micrograph of a red cabbage leaf and a red cabbage callus. (A) cabbage leaves, (B) red cabbage callus induced by MS modified medium, (C) cabbage callus induced by medium C induction.
5 shows the growth curve of red cabbage callus according to the composition of the medium.
6 shows the weight of red cabbage callus according to the composition of the medium.
Figure 7 shows the Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) of red cabbage leaves and red cabbage callus.
이하 실시예를 바탕으로 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명에 사용된 용어, 실시예 등은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고 통상의 기술자의 이해를 돕기 위하여 예시된 것에 불과할 뿐이며, 본 발명의 권리범위 등이 이에 한정되어 해석되어서는 안 된다.Hereinafter, the present invention will be described in detail based on examples. It is to be understood that the terminology, examples and the like used in the present invention are merely illustrative of the present invention in order to more clearly explain the present invention and to facilitate understanding of the ordinary artisan, and should not be construed as being limited thereto.
본 발명에 사용되는 기술 용어 및 과학 용어는 다른 정의가 없다면 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 나타낸다.Technical terms and scientific terms used in the present invention mean what the person skilled in the art would normally understand unless otherwise defined.
본 발명의 적양배추 캘러스의 유도를 위해 자색양배추군(Brassica oleracea var. capitata f. rubra .) 품종을 이용하여 적양배추 잎을 살균 소독하여 준비한다.For the induction of the red cabbage callus of the present invention, the purple cabbage group ( Brassica There is oleracea . capitata f. rubra. ) Varieties to prepare sterilized red cabbage leaves.
적양배추 잎을 살리실산 용액에 1~10분간 표면 소독한 후, 70% 에탄올로 5~30초간 침지한 뒤 꺼내어 1% 락스 용액에서 5~30초간 침지하면서 표면을 살균하고, 멸균수로 10~30분씩 1~5회 세척하고 1~3시간 동안 건조시켜 적양배추 잎을 살균 소독한다. 필요에 따라서는 상기 살균 소독 과정을 여러 번 반복할 수 있다.The surface of the cabbage leaves is sterilized for 1 to 10 minutes in salicylic acid solution, then immersed in 70% ethanol for 5 to 30 seconds, taken out of the solution for 1 to 10 minutes, sterilized for 5 to 30 seconds, 1 ~ 5 times for 1 ~ 3 hours and sterilize red cabbage leaves by drying for 1 ~ 3 hours. If necessary, the sterilization process may be repeated several times.
적양배추 잎의 살균 소독은 시간이 길어질 경우 조직이 파괴되고, 시간이 부족할 경우 표면 조직에 존재하는 곰팡이 및 세균이 완전히 소독되지 않아 오염이 생길 수 있으므로, 적당한 처리시간으로 살균 소독을 실시하는 것이 중요하다. Disinfection of red cabbage leaves is time-consuming, and if the time is short, it is important to disinfect the fungus and bacteria in the surface tissue, Do.
본 발명의 적양배추 잎의 살균 소독은 5 mM 살리실산 용액에 8분간 표면 소독한 후, 70% 에탄올로 20초간 침지한 뒤 꺼내어 1% 락스 용액에서 20초간 침지하면서 표면을 살균하고, 멸균수로 20분씩 3회 세척하고 2시간 동안 건조시키는 살균 소독 과정을 2회 실시하는 것이 바람직하다.The surface of the cabbage leaves of the present invention was sterilized by a 5 mM salicylic acid solution for 8 minutes, dipped in 70% ethanol for 20 seconds, immersed in a 1% lactic acid solution for 20 seconds, sterilized, Min for 3 hours and then dried for 2 hours.
본 발명에서 정의되는 ‘캘러스(callus)'란 기관, 조직 등을 조직 배양하여 형성된 무정형의 미분화 세포 덩어리를 의미하며, 캘러스는 완전한 성체로 재분화할 수 있는 전능성(totipotency)을 가지고 있다.The term "callus" as defined in the present invention means an amorphous undifferentiated cell mass formed by tissue culture of organs, tissues and the like, and the callus has totipotency capable of regeneration into a complete adult.
상기 캘러스 유도용 배지는 Murashige and Skoog medium(w/ Vitamins) 배지, Murashige and Skoog modified medium(MS modified medium) 배지, B5(Gamborg et al.) 배지, LS(Linsmaier and McCown) 배지, White 배지, SH(Schenk and Hildebrandt) 배지, WPM(McCown's Woody Plant Medium) 배지, Medium C(Carrot) 배지로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 이 중에서 MS modified medium 배지를 사용하는 것이 바람직하다.The callus induction medium was prepared by adding medium such as Murashige and Skoog medium (w / Vitamins), Murashige and Skoog modified medium, B5 (Gamborg et al.) Medium, LS (Linsmaier and McCown) medium, (Schenk and Hildebrandt) medium, WPM (McCown's Woody Plant Medium) medium, and Medium C (Carrot) medium. Of these, MS modified medium is preferably used.
배지로서 MS modified medium을 사용하는 경우, 배지 속에 포함된 식물성장 호르몬인 키네틴으로 인해 적양배추 캘러스의 성장이 매우 빨라 캘러스의 대량생산이 가능하고, 항산화 효과가 우수하며, 자외선차단제 등의 화장품으로 적용 시에 백색효과, 피부개선효과, 착색효과 등이 우수하다.In the case of using MS modified medium as a medium, growth of red cabbage callus is very rapid due to kinetin, a plant growth hormone contained in the medium, which enables mass production of callus, excellent antioxidative effect, and application to cosmetics such as sunscreen The white effect, the skin improvement effect, and the coloring effect are excellent.
상기 키네틴은 식물성장 호르몬으로서 캘러스의 성장을 촉진하며, 함량은 0.1~0.3중량% 사용되는 것이 바람직하다. The kinetin promotes the growth of callus as a plant growth hormone, and the content is preferably 0.1 to 0.3 wt%.
상기 MS modified medium 배지는 나프탈렌 아세트산(Naphthalene Acetic Acid, NAA), 질산칼륨(potassium nitrate) 및 미오이노시톨(myo-inositol)을 포함하는데, 여기서 NAA는 캘러스의 성장을 촉진하고, 질산칼륨은 식물세포의 질소 공급원으로서 세포 성장의 영양분으로 작용하며, 미오이노시톨은 세포벽의 성장을 돕는 역할을 하는 물질로서 적양배추 잎 캘러스의 유도 및 성장을 향상시킨다.The MS modified medium medium comprises naphthalene acetic acid (NAA), potassium nitrate and myo-inositol, wherein NAA promotes callus growth, potassium nitrate is a plant cell As a nitrogen source, it acts as a nutrient for cell growth, and myoinositol enhances the induction and growth of callus of red cabbage leaf as a substance that helps cell wall growth.
NAA는 0.005~0.05중량% 사용될 수 있고, 질산칼륨은 33~37중량% 사용될 수 있으며, 미오이노시톨은 1~3중량% 사용될 수 있다. NAA may be used in an amount of 0.005 to 0.05 wt%, potassium nitrate may be used in an amount of 33 to 37 wt%, and myoinositol may be used in an amount of 1 to 3 wt%.
또한 상기 배지 조성물은 캘러스를 유도할 수 있는 다른 성분을 더 포함할 수 있으며, 그 예로 옥신 및 사이토키닌으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생장조절물질이 첨가될 수 있다.In addition, the above-mentioned culture medium composition may further contain other ingredients capable of inducing callus, for example, at least one growth-regulating substance selected from the group consisting of auxin and cytokinin may be added.
상기 옥신계 물질로는 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 인돌-3-아세트산 (Indole-3-acetic acid, IAA), 인돌뷰트릭산 (Indolebutric acid, IBA) 등이 사용될 수 있으며, 사이토키닌계 물질로는 벤질아데닌 (Benzyl adenin, BA), 제아틴 (zeatin) 등이 사용될 수 있다.As the oxine-based material, 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid), indole-3-acetic acid (IAA), indolebutric acid (IBA) As the cytokinin substance, benzyl adenine (BA), zeatin and the like can be used.
옥신계 생장조절물질로 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid)가 사용되는 것이 바람직하며, 이러한 생장조절물질의 함량은 MS modified medium 배지 100중량%에 대해 0.01~0.03중량% 사용되는 것이 바람직하다. It is preferable that 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) is used as an auxin growth regulator, and the content of the growth regulator is 0.01 to 0.03% by weight based on 100% by weight of MS modified medium desirable.
사이토키닌계 생장조절물질로 제아틴이 사용되는 것이 바람직하며, 이러한 생장조절물질의 함량은 MS modified medium 배지 100중량%에 대해 0.001~0.003중량% 사용되는 것이 바람직하다. It is preferable that zeatin is used as a cytokinin growth regulator, and the content of the growth regulator is preferably 0.001 to 0.003 wt% based on 100 wt% of the MS modified medium.
아울러 상기 배지 조성물은 한천(agar), 젤란검(gellan gum), 수크로오스(sucrose), sorbitol, mannitol, fructose, glucose, MOPS (3-(N-morpholino)propanesulfonic acid) 등을 추가로 포함할 수 있다. In addition, the culture medium may further contain agar, gellan gum, sucrose, sorbitol, mannitol, fructose, glucose, MOPS (3- (N-morpholino) propanesulfonic acid) .
상기 배지 조성물의 pH는 5~7로 조정될 수 있는데, 이러한 조건에서 조직 배양 효율 및 캘러스 유도 효과가 향상될 수 있다. The pH of the medium composition can be adjusted to 5 to 7, and the tissue culture efficiency and callus inducing effect can be improved under these conditions.
상기 적양배추 잎 캘러스의 배양방법은 상기 배지 조성물에 살균된 적양배추 잎을 치상하고 실온에서 4~6주 동안 배양하여 캘러스를 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.The method for culturing the cabbage leaf callus comprises the step of inducing calli by incubating the cabbage leaves sterilized in the medium composition for 4 to 6 weeks at room temperature.
이때 조직의 세포가 세포 분열하여 세포의 덩어리인 캘러스가 형성되면, 적양배추 잎 캘러스만을 따로 분리하여 상기 배지 조성물과 동일한 조건의 새로운 배지 위에 치상하여 배양할 수도 있다.At this time, if the cell of the tissue divides into cells and a callus, which is a mass of cells, is formed, the callus of the cabbage leaves alone can be separated and cultured on a new medium having the same conditions as the medium composition.
이렇게 유도 배양된 적양배추 캘러스는 성장이 빠르고, 항염, 항산화, 항노화 특성이 우수하여 식품, 화장품 및 의약품 분야에 다양하게 사용될 수 있다. The red cabbage callus which is cultivated in this way is fast growing and has excellent anti-inflammation, antioxidant and anti-aging properties and can be used in various fields such as food, cosmetics and pharmaceuticals.
상기 적양배추 캘러스 배양물은 감압 및 농축 과정을 거쳐 추출물의 형태 또는 동결건조 후 분말 상태로 사용될 수 있다. The red cabbage callus culture may be used in the form of an extract after being subjected to a decompression and concentration process or in a powder state after lyophilization.
상기 적양배추 캘러스 배양물은 1~50중량%로 조성물 내에 포함될 수 있고, 인체에 무해하면서도 제형 안정성이 우수하고, 피부 보습, 항산화, 항염, 항노화 특성이 우수하다.The red cabbage callus culture can be contained in the composition in an amount of 1 to 50% by weight, and is harmless to human body, excellent in formulation stability, and excellent in skin moisturizing, antioxidant, anti-inflammation and anti-aging properties.
일예로서, 본 발명의 적양배추 캘러스 배양물을 함유하는 화장품 조성물은 용액, 겔, 크림류, 로션류, 파우더, 화장수류, 파운데이션류 또는 고체화된 비누류 등의 화장품 제형으로 제제화될 수 있다. As an example, the cosmetic composition containing the red cabbage callus culture of the present invention can be formulated into cosmetic formulations such as solutions, gels, creams, lotions, powders, lotions, foundations or solidified soaps.
화장품 조성물의 원료로 사용되는 일반적인 성분들이라면 함께 특정 제형의 제조를 위해 사용될 수 있으며, 구체적으로 용매, 용해제, 보습제, 겔화제, 점증제, 연화제, 안정화제, 유화제, 계면활성제, 항산화제, 방부제, 살균제, 비타민, 향료, 오일, 염료 등의 화장품 조성물 원료가 첨가될 수 있다.The general ingredients used as raw materials for the cosmetic composition can be used together for the preparation of a specific formulation and specifically include solvents, solubilizers, moisturizers, gelling agents, thickeners, softeners, stabilizers, emulsifiers, surfactants, antioxidants, A raw material for cosmetic compositions such as a bactericide, a vitamin, a fragrance, an oil, and a dye may be added.
이하 실시예 및 비교예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 실시를 위하여 예시된 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples and Comparative Examples. The following examples are intended to illustrate the practice of the present invention and are not intended to limit the scope of the present invention.
(실시예 1) 적양배추 캘러스 유도(Example 1) Red cabbage callus induction
적양배추 캘러스의 유도를 위해 자색양배추군(Brassica oleracea var. capitata f. rubra .) 품종을 이용하였다.For the induction of red cabbage callus, the purple cabbage group ( Brassica There is oleracea . capitata f. rubra. ) Were used.
적양배추 잎을 5 mM 살리실산 용액에 8분간 표면 소독한 후, 70% 에탄올로 20초간 침지한 뒤 꺼내어 1% 락스 용액에서 다시 20초간 침지하면서 표면을 살균하고, 멸균수로 20분씩 3회 세척하고 2시간 동안 건조하였다.The cabbage leaves were surface-sterilized in 5 mM salicylic acid solution for 8 minutes, then immersed in 70% ethanol for 20 seconds, then taken out and immersed in 1% lactic acid solution for 20 seconds, and the surface was sterilized and washed three times with sterilized water for 20 minutes And dried for 2 hours.
건조 후 이러한 살균 소독 과정을 한 번 더 반복하였다. After drying, this sterilization process was repeated one more time.
MS(Murashige and Skoog) medium(w/ Vitamins), MS(Murashige and Skoog) modified medium, Medium C 배지를 아래 도 1에 기재된 성분대로 준비하였다.MS (Murashige and Skoog) medium (w / Vitamins), MS (Murashige and Skoog) modified medium and Medium C medium were prepared as shown in FIG.
준비된 각 배지에 한천(agar), 수크로오스(sucrose) 및 MOPS를 추가하여 pH를 5.7로 조정한 후 121℃에서 15분간 고압 멸균하여 petri dish에 분주하여 적양배추 캘러스 유도 배지로 사용하였다. Agar, sucrose and MOPS were added to each prepared medium to adjust the pH to 5.7, sterilized at 121 ° C for 15 minutes at high pressure, and the resulting mixture was divided into petri dishes and used as red cabbage callus induction medium.
살균 소독한 적양배추 잎 조직을 1cm×1cm 크기로 자른 뒤 각각의 캘러스 유도용 배지 위에 치상한 후, 실온에서 4주 동안 배양하여 적양배추 캘러스를 유도하였다.The red cabbage leaf tissue was cut into 1 cm × 1 cm pieces, and then wounded on each callus induction medium. Then, the cabbage callus was induced by culturing at room temperature for 4 weeks.
(실시예 2) 적양배추 캘러스의 성장 측정(Example 2) Growth of red cabbage callus
각각의 배지에서 유도된 적양배추 캘러스를 4~5일 간격으로 자를 이용하여 캘러스의 크기를 측정하였다. 잎의 네 모서리로부터 형성된 캘러스를 측정하여 평균값을 구하였다.The size of the callus was measured using a red cabbage callus derived from each medium at intervals of 4 to 5 days. The callus formed from the four corners of the leaves was measured and the average value was determined.
그 결과, 모든 배지에서 적양배추 캘러스가 유도되었으나, 통상적인 MS medium에 비해 MS modified medium과 Medium C에서 유도가 빠르게 진행되었으며, 특히 MS modified medium에서 현저하게 빠른 적양배추 캘러스의 유도와 향상된 성장 속도를 확인할 수 있다(도 2 내지 6).As a result, red cabbage callus was induced in all media, but induction was faster in MS-modified medium and medium C than in normal MS medium. In particular, in MS-modified medium, induction of remarkably quick cabbage callus and enhanced growth rate (Figs. 2 to 6).
MS modified medium 에서 배양된 캘러스는 배양 7일 후부터 잎 절편으로부터 유도되며, 배양 9일후에는 다량 증식되는 것을 확인할 수 있다. 그에 비해 Medium C 에서는 3일 후부터 캘러스가 유도되었으나 성장속도가 MS modified medium 보다 현저히 낮은 경향을 나타낸다. The callus cultured in MS modified medium was derived from the leaf slice 7 days after culturing, and it was confirmed that the callus was proliferated after 9 days. On the other hand, in Medium C, callus was induced from 3 days, but the growth rate tended to be significantly lower than that of MS modified medium.
이러한 결과는 배지에 포함된 생장조절물질(Kinetin, NAA)에 기인하는 것으로 판단된다. These results are considered to be due to the growth regulator (Kinetin, NAA) contained in the medium.
또한 MS Modified Medium에서의 캘러스 색깔은 처음에는 투명하고 연두색을 띠었으나 시간이 경과할수록 갈변됨을 볼 수 있다. Medium C 에서의 캘러스 역시 처음에는 투명하고 약간 붉은 색을 띠었으나 시간이 경과할수록 갈변됨을 볼 수 있다. In addition, the callus color in MS Modified Medium was transparent and greenish in color at first but browned over time. The callus in Medium C was also transparent and slightly reddish at first, but it was browned over time.
MS Modified Medium 및 Medium C 에서의 캘러스 유도과정에서 뿌리 생장의 차이가 관찰되었다. MS Modified Medium 배지에서는 11일부터 뿌리 생장이 관찰되는 반면 Medium C 배지에서는 뿌리가 관찰되지 않았다.Differences in root growth were observed during callus induction in MS Modified Medium and Medium C. Root growth was observed in MS Modified Medium medium from day 11, but no root in medium medium medium.
또한 MS Modified Medium 에서 유도된 적양배추 캘러스는 Medium C 에서 유도된 캘러스에 비해 초록색이고 동그란 특성을 가지고 있어, 캘러스 분화를 빨리 유도할 수 있다는 것을 알 수 있다.In addition, the red cabbage callus induced by MS Modified Medium was green and rounded in comparison with the medium C-induced callus, indicating that callus differentiation can be induced quickly.
(실시예 3) 항산화능 측정(Example 3) Measurement of antioxidant activity
적양배추 잎과 각각의 배지에서 유도된 캘러스를 40℃에서 2시간 동안 인큐베이터에서 70% 에탄올로 추출하였다. The callus induced in red cabbage leaves and each medium was extracted with 70% ethanol in an incubator at 40 ° C for 2 hours.
추출액을 원심분리(4℃, 8,000 rpm, 30분)한 후 여과하여 회전감압농축기로 60℃에서 농축한 다음, 농축된 추출물은 동결 건조하였다.The extract was centrifuged (4 ° C, 8,000 rpm, 30 minutes), filtered, concentrated by rotary evaporator at 60 ° C, and the concentrated extract was lyophilized.
항산화능 측정을 위해 ORAC(Oxygen Radical Absorbance Capacity) 분석을 수행하였다. ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) analysis was performed to measure antioxidant activity.
96 well black plate의 각 well에 75 mM phosphate buffer에 녹인 80 nM fluorescein solution 100 ㎕와 phosphate buffer를 사용하여 희석한 각 측정 시료 50 ㎕를 첨가하고, 산화물질로 2,2’-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride(AAPH) 50㎕를 첨가한 후, GENios fluorescence plate reader(TECAN Trading AG, Switzerland)를 이용해 37℃ 에서 2분 간격으로 100 cycle 동안 형광 값을 측정하였다.100 μl of 80 nM fluorescein solution dissolved in 75 mM phosphate buffer and 50 μl of each diluted sample were added to each well of a 96 well black plate using phosphate buffer, and 2,2'-Azobis (2-amidinopropane ) dihydrochloride (AAPH), fluorescence values were measured for 100 cycles at 2 minutes intervals at 37 ° C using GENios fluorescence plate reader (TECAN Trading AG, Switzerland).
측정 결과, 적양배추 캘러스는 배양하지 않은 적양배추 잎에 비해 항산화능이 다소 낮았으며, Medium C 에서 유도된 캘러스가 MS Modified Medium 에서 유도된 적양배추 캘러스에 비해 더 우수한 항산화능을 나타내었다(도 7). The results showed that the red cabbage callus had a somewhat lower antioxidant capacity than the non-cultivated cabbage leaves, and the medium C-induced callus had a better antioxidative capacity than the red cabbage callus induced in the MS Modified Medium (FIG. 7) .
따라서 MS Modified Medium 에서 유도된 적양배추 캘러스는 일정 정도의 항산화능을 나타내면서 캘러스 분화를 빨리 유도할 수 있으므로, 화장품, 의약품, 식품 등에 적용이 가능하다. Therefore, the red cabbage callus induced by MS Modified Medium has a certain antioxidative ability and it can induce callus differentiation quickly, so it can be applied to cosmetics, medicines and food.
통상 적양배추 잎은 항산화능이 우수하지만 성장속도 면에서는 단점이 있었으나, MS Modified Medium 에서 유도된 적양배추 캘러스는 성장속도가 빨라 대량생산이 가능하고, 항산화능이 우수하여 식품 및 화장품 분야에서 사용이 가능하다. Common cabbage leaves have excellent antioxidant ability but have disadvantages in terms of growth rate. However, the red cabbage callus derived from MS Modified Medium has a high growth rate and can be mass-produced and has excellent antioxidant ability, so it can be used in food and cosmetic fields .
(실시예 4)(Example 4)
MS Modified Medium 배지 100중량%에 대하여 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 0.02중량%를 추가로 사용한 것을 제외하고는 실시예 2 및 3과 동일한 방법으로 적양배추 캘러스의 특성을 분석하였다. The characteristics of red cabbage callus were analyzed in the same manner as in Examples 2 and 3 except that 0.02 wt% of 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) was added to 100 wt% of the MS Modified Medium medium .
(실시예 5)(Example 5)
MS Modified Medium 배지 100중량%에 대하여 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 0.005중량%를 추가로 사용한 것을 제외하고는 실시예 2 및 3과 동일한 방법으로 적양배추 캘러스의 특성을 분석하였다. The characteristics of red cabbage callus were analyzed in the same manner as in Examples 2 and 3, except that 0.005 wt% of 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) was added to 100 wt% of MS Modified Medium medium .
(실시예 6)(Example 6)
MS Modified Medium 배지 100중량%에 대하여 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 0.04중량%를 추가로 사용한 것을 제외하고는 실시예 2 및 3과 동일한 방법으로 적양배추 캘러스의 특성을 분석하였다. The characteristics of red cabbage callus were analyzed in the same manner as in Examples 2 and 3 except that 0.04% by weight of 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) was added to 100% by weight of MS Modified Medium medium .
(실시예 7)(Example 7)
MS Modified Medium 배지 100중량%에 대하여 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 0.02중량% 및 제아틴 0.002중량%를 추가로 사용한 것을 제외하고는 실시예 2 및 3과 동일한 방법으로 적양배추 캘러스의 특성을 분석하였다. Except that 0.02% by weight of 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) and 0.002% by weight of zeatin were further added to 100% by weight of MS Modified Medium medium, The characteristics of callus were analyzed.
(mm)Size of callus (after 14 days)
(mm)
(Trolox equivalents, μM)Antioxidant activity (50 μM)
(Trolox equivalents, μM)
상기 표 1의 결과로부터, 실시예 4 및 7은 MS Modified Medium 배지에 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 제아틴을 추가함으로써, 캘러스의 성장이 촉진되고, 항산화능도 향상됨을 알 수 있다. From the results shown in Table 1, Examples 4 and 7 show that the addition of 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) and zeatin to the MS Modified Medium medium promotes callus growth and enhances antioxidant activity Able to know.
Claims (5)
Ammonium nitrate 28 ~ 32 wt%, Boric acid 0.1 ~ 0.3 weight%, Calcium chloride anhydrous 5 ~ 7 wt%, Cobalt chloride 6H 2 O 0.0005 ~ 0.003 wt.%, Cupric sulfate 5H 2 O 0.0005 ~ 0.003 wt.%, Ferric sodium EDTA 0.6 to 0.9% by weight of 3H 2 O, 2 to 5% by weight of magnesium sulfate anhydrous, 0.2 to 0.5% by weight of manganese sulfate H 2 O, 0.003 to 0.008% by weight of molybdic acid 2H 2 O, 0.01 to 0.03% by weight of potassium iodide Potassium carbonate monobasic 1 to 4 wt.%, Zinc sulfate 7H 2 O 0.1 to 0.4 wt.%, Adenine hemisulfate 12 to 17 wt.%, Potassium nitrate 0.1 to 0.4 wt.%, Potassium nitrate 33 to 37 wt.%, Potassium phosphate monobasic 2 to 5 wt. Which contains, as an active ingredient, an MS modified medium containing 1 to 3% by weight of glycerol, 0.3 to 3% by weight of glycerin, 1 to 3% by weight of Myo-Inositol, 0.005 to 0.05% by weight of a- ≪ / RTI >
상기 배지 조성물의 pH 는 5~7 인 것을 특징으로 하는, 적양배추 캘러스의 배양을 위한 배지 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the pH of the medium composition is from 5 to 7. < RTI ID = 0.0 > 11. < / RTI >
상기 배지 조성물은 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 적양배추 캘러스의 배양을 위한 배지 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the culture medium composition further comprises 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid).
상기 배지 조성물은 한천 (agar), 수크로오스(sucrose) 및 MOPS (3-(N-morpholino)propanesulfonic acid)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 적양배추 캘러스의 배양을 위한 배지 조성물.
The method according to claim 1,
Characterized in that the medium composition further comprises agar, sucrose and MOPS (3- (N-morpholino) propanesulfonic acid).
A method for cultivating a cabbage callus, characterized in that it comprises the step of inducing a callus by chewing and culturing the killed cabbage sterilized in the medium composition of any one of claims 1 to 4.
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