KR101935147B1 - 프라바스타틴(pravastatin) 및 항혈소판제를 유효성분으로 함유하는 신장 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

프라바스타틴(pravastatin) 및 항혈소판제를 유효성분으로 함유하는 신장 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 프라바스타틴 및, 클로피도그렐 또는 사포그릴레이트와 같은 항혈소판제를 유효성분으로 함유하는 신장 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 프라바스타틴과 항혈소판제를 병용 투여하는 경우, 단독 투여시보다 만성 신장 병증이 유도된 노화 마우스에서 병증을 현저히 완화시킬 수 있는 바, 이러한 두 약물을 동시에 포함하는 조성물은 다양한 신장 질환을 효과적으로 예방, 개선 내지 치료할 수 있다.

Description

프라바스타틴(pravastatin) 및 항혈소판제를 유효성분으로 함유하는 신장 질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Preventing or Treating Renal Disease Comprising Pravastatin and Antiplatelet Agent}
본 발명은 프라바스타틴 및 항혈소판제를 유효성분으로 함유하는 신장 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
신장은 조직 내에 수백만 개의 혈관을 통하여 여과지 역할을 하여 우리 몸의 노폐물을 제거하는 기관으로 이러한 여과 역할에 문제가 생기면 노폐물을 제거할 수 없게 된다. 이러한 신부전증의 원인 중 하나가 당뇨병, 고지혈증과 같은 대사성 만성질환이다.
음식물을 통해 섭취된 단백질은 소화작용을 통해 노폐물을 발생시키고 이들은 혈액에 쌓이게 된다. 여과지 역할을 하는 신장은 수백만 개의 작은 모세혈관을 통해 혈액이 흐르는 동안 작은 분자의 노폐물들을 소변을 통해 배설시키지만 단백질이나 적혈구 등과 같이 분자량이 큰 물질들은 여과되지 않고 혈액 중에 머무르게 된다.
당뇨병은 이러한 신장조직에 손상을 줄 수 있는데, 높은 농도의 포도당은 신장이 과잉 혈액을 여과하게 만들고 이러한 현상이 오래 지속될 경우 신장은 여과능을 잃게 된다. 따라서, 우리 몸에 필요한 단백질들이 소변을 통해 몸 밖으로 빠져나가게 되는 것이다. 소량의 단백질이 소변으로 배설되는 경우 미세알부민뇨라 하고 다량의 단백질이 배설되는 경우를 단백뇨 혹은 마이크로알부민뇨라 부른다.
고혈당 및 고지혈증의 병적 상태에서 신장의 사구체 모세혈관은 지속적인 손상을 받게 되며, 노폐물 여과 기능을 상실하게 되어 혈액 중 노폐물 농도가 증가하게 된다. 이러한 결과 신부전증이 일어나게 되는 데 이를 말기 신장 질환이라 부른다. 특히 노화에 따른 신장 기능의 감소는 당뇨, 고지혈증과 같은 질환으로 인한 만성 신장 질환 발생 가능성을 크게 증가시키는데, 실제로 35-64세 성인에서 만성 신장 질환 환자의 비율은 2.8%이나, 65세 이상 노인인구에서는 19.8%로 나타난 바 있다. 또한 이는 만성 신장 질환 환자들 중 노인이 차지하는 비율이 35.8%라는 통계로도 확인할 수 있다. 이러한 말기 신장질환은 매우 심각한 질환으로 이 단계에 이르게 된 환자는 신장이식 수술을 하거나 신장투석을 해야만 생명을 유지할 수 있다. 즉, 만성 대사성질환에 의한 신부전증을 치료하기 위해서는 신부전 발병을 예방하는 방법 이외에는 효과적인 치료 방법이 전무한 실정이며, 인구 고령화가 급속히 진행되고 있는 시점에서 효과적인 예방 및 치료 약물 개발의 필요성이 증가하고 있다.
한편, 로바스타틴, 심바스타틴, 프라바스타틴, 플루바스타틴, 아토르바스타틴, 피타바스타틴, 로수바스타틴 등의 스타틴계 약물은 HMG-CoA 환원 억제제로서, LDL-콜레스테롤의 레벨을 낮추는 역할을 하여 죽상 경화성 플라크의 퇴행, 심혈관 질환, 고콜레스테롤혈증 등의 치료제로 사용되고 있음에도 불구하고, 최근 들어 이러한 스타틴계 약물이 당뇨를 유발할 위험성을 가지고 있다는 사실이 보고되었다. 그러나, 그중 프라바스타틴은 타 스타틴에 비하여 당뇨 유발 가능성이 가장 적은 약물로서 우수한 임상적 가치를 가지고 있는 바, 부작용이 적은 프라바스타틴을 이용하여 임상에서 적용될 수 있는 다양한 치료제를 개발하기 위한 후속 연구가 필요한 실정이다.
1. 한국등록특허 제10-1318067호(2013.10.07 등록). 2. 한국공개특허 제10-1995-0031063호(1995.12.18 공개).
본 발명의 목적은 뛰어난 신장 질환 예방 내지 치료 효과를 나타내는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 뛰어난 신장 질환 예방 내지 개선 효과를 나타내는 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프라바스타틴 및 항혈소판제를 유효성분으로 함유하는 신장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프라바스타틴 및 항혈소판제를 유효성분으로 함유하는 신장 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 프라바스타틴 및 항혈소판제를 유효성분으로 함유하는 신장 질환 예방, 개선 내지 치료용 조성물에 관한 것으로, 프라바스타틴과 항혈소판제를 병용 투여할 경우 노령 마우스의 신장질환에서 나타나는 신사구체 기저막의 비후, 세뇨관의 공포 또는 지방방울이나 콜라겐의 침착이 감소되는 것을 확인함에 따라, 본 발명은 프라바스타틴과 항혈소판제인 사포그릴레이트 또는 프라바스타틴과 항혈소판제인 클로피도그렐을 유효성분으로 함유하는 조성물을 효과적인 신장 질환 예방 또는 치료용 조성물로 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 노화-만성 신장 질환 모델 마우스에서 혈청의 저밀도 지질단백질(Low-density lipoprotein, LDL)의 농도를 측정한 결과이다.
도 2는 본 발명의 노화-만성 신장 질환 모델 마우스에서 혈청 내 총 콜레스테롤 농도를 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명의 노화-만성 신장 질환 모델 마우스에서 신장 조직의 일반적인 형태학적 변화를 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 노화-만성 신장 질환 모델 마우스에서 신장 조직의 지방 방울의 함량을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 노화-만성 신장 질환 모델 마우스에서 신장 조직의 콜라겐 섬유의 함량을 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명의 노화-만성 신장 질환 모델 마우스에서 신장 조직의 TGF-β의 발현량을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 노화-만성 신장 질환 모델 마우스에서 신장 조직의 플라스미노겐 활성화제 저해제-1(PAI-1)의 발현량을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 발명자들은 신장 질환의 치료를 위한 약제에 대하여 연구한 결과, 고지혈증 치료제인 프라바스타틴과 항혈소판제인 사포그릴레이트 또는 클로피도그렐을 병용할 경우, 약효 저하 내지 부작용의 문제가 없으며 프라바스타틴과 항혈소판제의 상승작용으로 인해 각 약물을 단독으로 사용한 경우보다 효과적으로 신장 질환을 개선 내지 치료할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 프라바스타틴 및 항혈소판제를 유효성분으로 함유하는 신장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 항혈소판제는 사포그릴레이트 또는 클로피도그렐일 수 있는 바, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 두 항혈소판제를 각각 프라바스타틴과 병용 사용했을 때, 단독 사용 시보다 신장 질환을 유발한 노화 마우스 모델에서 더 우수한 병증 완화 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
이때, 상기 신장 질환은 노화로 인한 만성 신장 질환일 수 있다.
또는, 상기 신장 질환은 당뇨병성 신증, 고혈압성 신증, 사구체신염, 간질성신염, 급성신부전 및 만성신부전으로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 보다 바람직하게는 당뇨병성 신증일 수 있으나, 노화와 함께 나타나는 신장 질환이면 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물은 프라바스타틴을 1 내지 50 중량% 및 항혈소판제를 50 내지 99 중량% 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 프라바스타틴 및 항혈소판제를 유효성분으로 함유하는 신장 질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 프라바스타틴 및 항혈소판제를 유효성분으로 함유하는 신장 질환 예방 또는 치료용 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
상기 프라바스타틴 및 항혈소판제의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
더불어, 본 발명은 프라바스타틴 및 항혈소판제를 유효성분으로 함유하는 신장 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
이때, 상기 항혈소판제는 사포그릴레이트 또는 클로피도그렐일 수 있는 바, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 두 항혈소판제를 각각 프라바스타틴과 병용 사용했을 때, 단독 사용 시보다 신장 질환을 유발한 노화 마우스 모델에서 더 우수한 병증 개선 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
이때, 상기 신장 질환은 노화로 인한 만성 신장 질환일 수 있다.
또는, 상기 신장 질환은 당뇨병성 신증, 고혈압성 신증, 사구체신염, 간질성신염, 급성신부전 및 만성신부전으로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 보다 바람직하게는 당뇨병성 신증일 수 있으나, 노화와 함께 나타나는 신장 질환이면 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물은 프라바스타틴을 1 내지 50 중량% 및 항혈소판제를 50 내지 99 중량% 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일 주스, 합성 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품 조성물은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반 시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류 첨가 알칼리제, 보존료제제, 타르색소 제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.
이때, 건강기능식품 조성물을 제조하는 과정에서 식품에 첨가되는 프라바스타틴 및 항혈소판제는 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있으며, 바람직하게는 식품 100 중량부에 1 중량부 내지 90 중량부 포함되도록 첨가될 수 있다.
더불어, 본 발명은 프라바스타틴 및 항혈소판제를 유효성분으로 포함하는, 인 비트로(in vitro)에서 TGF-β 또는 PAI-1 중 어느 하나의 단백질 발현을 억제하는 시약용 조성물을 제공한다.
이때, 상기 항혈소판제는 사포그릴레이트 또는 클로피도그렐일 수 있다.
또한, 본 발명은 프라바스타틴 및 항혈소판제를 동시에 처리하는 것을 특징으로 하는, 인 비트로(in vitro)에서 TGF-β 및/또는 PAI-1 단백질의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 즉, 본 발명에 따르면, 상기 프라바스타틴 및 항혈소판제를 동시에 처리하는 경우, TGF-β만을 억제할 수도 있고, PAI-1만을 억제할 수도 있으며, TGF-β 및 PAI-1를 모두 억제할 수도 있다.
이때, 상기 항혈소판제는 사포그릴레이트 또는 클로피도그렐일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이며 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐이므로 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<준비예 1> 물품 준비
먼저, 본 발명에서 실험에 사용할 사포그릴레이트 하이드로클로라이드는 Chemtros(안산, 한국)에서 구입하였고, 클로피도그렐과 프라바스타틴은 가톨릭대학교로부터 얻어 사용하였다. TGF-β 및 PAI-1 항체는 Abcam(Cambridge, MA, UK)에서 구입하였고, 이차 항체(염소 항-토끼 항체)는 Santa Cruz Biotechnology, Inc.(Dallas, TX. USA)에서 구입하였다.
<실시예 1> 만성 신장 병증이 유도된 노화 마우스 모델(HFD/STZ)의 확립 및 약물 처리
수컷 C57BL/6(6개월령, 오리엔트 바이오, 경기도, 한국) 마우스 33마리를 대상으로, 1주간의 환경적응을 거친 후 무특이병원균 조건에서 12시간의 낮/밤 주기로 사육하며 실험에 사용하였다. 이후, 총 33마리의 마우스에 21주간 정상식이(18% 지방, 24% 단백질, 58% 탄수화물; Harlan Laboratories, Indianapolis, IN, USA) 또는 60% 지방을 포함하는 고지방식이(60% 지방, 20% 단백질, 20% 탄수화물; Research Diets, New Brunswick, NJ, USA)를 유지하였고, 이때, 상기 생쥐들은 무작위로 다음과 같이 7개의 군으로 나뉘었다; 제1군은 정상식이군(NFD, 6마리), 제2군은 고지방식이+STZ군으로서 생리식염수 경구 투여군(HFD/STZ; Veh, 5마리), 제3군은 고지방식이+STZ군으로서 주 5회 클로피도그렐 20 mg/kg 경구 투여군(CLO, 4마리), 제4군은 고지방식이+STZ군으로서 주 5회 사포그릴레이트 50 mg/kg 경구 투여군(SAR, 5마리), 제5군은 고지방식이+STZ군으로서 주 5회 프라바스타틴 20 mg/kg 경구 투여군(PRA, 4마리), 제6군은 고지방식이+STZ군으로서 클로피도그렐+프라바스타틴 경구 투여군(PRA+CLO, 4마리), 제7군은 고지방식이+STZ군으로서 사포그릴레이트+프라바스타틴 경구 투여군(PRA+SAR, 5마리)으로 나누었다.
고지방식이를 시작한 마우스들에는 고지방식이 시작 8주 후 저용량의 STZ(30mg/kg)를 구연산나트륨(sodium citrate)에 녹여 1회 투여하였고, 정상식이군에는 STZ 대신 동량의 구연산나트륨만을 투여하였다. 이후, 전술한 바와 같이 각 약물(프라바스타틴, 사포그릴레이트 및/또는 클로피도그렐)을 마우스에 11주간 투여하였다.
이렇게 식이요법 및 약물주입을 모두 마친 마우스들을 다이에틸 에터로 마취시킨 후, 심장 천자(Cardiac puncture)의 방법으로 혈액 샘플을 채취하였다. 또한, 신장을 추출하여 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS) 관류(perfusion)한 후, 포르말린으로 고정하거나 냉동시켜 이후 실험에 사용하였다.
본 연구의 모든 동물 실험의 프로토콜은 가톨릭대 가동물실험 윤리 위원회(Institutional Ethics Committee on Animal Care and Experimentation)의 승인을 받았다.
<실시예 2> 만성 신장 병증이 유도된 노화 마우스 모델의 혈청 내 저밀도 지방단백질(LDL) 및 총 콜레스테롤 측정
상기 실시예 1에서 준비된 마우스들의 혈액 샘플을 12000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 얻은 혈청에서 Idexx사의 자동생화학 분석기(IDEXX VetTest Biochemical Analyzer Kit, IDEXX Laboratories, USA)를 사용하여 LDL 및 총 콜레스테롤을 측정하였다.
그 결과, 도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 정상식이군(NFD) 마우스보다 고지방식이(HFD)군 마우스들에서 LDL 및 총 콜레스테롤의 양이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 프라바스타틴(PRA), 클로피도그렐(CLO) 또는 사포그릴레이트(SAR)를 단독으로 처리한 경우에 비해서, 프라바스타틴 및 클로피도그렐을 병용하거나 사포그릴레이트를 병용한 경우 모두 LDL 농도를 낮췄고, 총 콜레스테롤 농도의 경우에는 프라바스타틴 및 사포그릴레이트를 병용한 경우에 더 낮아지는 결과를 보였다.
<실시예 3> 만성 신장 병증이 유도된 노화 마우스 모델에서 신장의 조직병리학적 형태 관찰
(1) 일반 조직학적 검사
상기 실시예 1에서 준비한 신장의 일부를 10% 중성 완충 포르말린(10% neutral buffered formalin)에 고정하였고, 불필요한 부분을 손질한 후 파라핀 포매를 실시하여 3~4 ㎛의 두께로 연속 절편을 제작하였다,
이후, 일반 조직학적 검사를 위해 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하여 광학현미경(Nikkon, Tokyo, Japan)으로 일반적인 조직병리학적 관찰을 수행하였다. 즉, 신장 피질(cortex)의 중심 구역(central zone) 및 사구체를 관찰하였고, 자동영상분석장치(iSolution FL ver 9.1, IMT i-solution Inc., Vancouver, Quebec, Canada)를 사용하여 공포성의 세뇨관(vacuolated renal tubules)의 수를 세었다. 또한, 이러한 조직병리학적 측정 결과를 신장 피질의 스퀘어 면적 당 퍼센트(%/mm2 or cortex)로 나타냈고, 각 군 별로 하나 혹은 두 개의 조직학적 필드를 연속적으로 분석하였다.
(2) 지질방울(lipid droplet) 및 콜라겐 섬유 관찰
일부 신장 조직은 지질방울(lipid droplet) 및 콜라겐 섬유를 관찰하기 위해, 30% 수크로오스(sucrose) 용액에서 탈수시킨 다음 동결절단하고, 오일 레드(oil red) 염색을 수행하였다.
또한, 사구체에서의 세포외기질(Extracellular matrix; ECM)의 축적은 신장 섬유화를 일으킨다. ECM의 마커 단백질인 콜라겐 섬유 관찰을 위해서는 파라핀 포매된 조직 절편을 시리어스 레드(Sirius red)로 염색하였다. 보다 명확한 조직병리학적 관찰을 위해, 신장 피질 내 콜라겐 섬유가 차지하는 비율 및 20% 이상 지질방울이 축적된 세뇨관의 수를 신장 피질의 스퀘어 면적 당 퍼센트(%/mm2 of cortex)로 나타냈고, 각 군 별로 하나 혹은 두 개의 조직학적 필드를 연속적으로 분석하였다.
(3) 실험 결과
그 결과, 도 3(조직학적 관찰), 도 4(지질 방울 관찰), 도 5(콜라겐 섬유 관찰)에 나타난 바와 같이, 노화 마우스에서 고지방식이와 STZ 단회 투여는 신장병 증을 유발하였고, H&E 방법으로 염색한 HFD/STZ 마우스 군의 신장에서 정상 NFD 마우스 군과 비교했을 때 신사구체 기저막의 비후 정도나 세뇨관에서 공포(空胞)가 현저히 높았다. 뿐만 아니라, Oil-red O 염색을 통한 신장조직의 지방 방울도 HFD/STZ 군에서 현저히 증가하였으며, 노화 마우스의 신장에서는 콜라겐 축적이 관찰되었다.
이러한 전형적인 조직학적 이상은 약물의 병용 그룹에서 유의적으로 개선되었는데, 즉, 프라바스타틴 단독 투여군에 비하여 클로피도그렐 또는 사포그릴레이트의 병용투여군은 사구체 비후화, 세뇨관손상 및 지방 축적을 현저히 감소시켰으며, 조직 섬유화 지표인 콜라겐 축적을 정상식이군 수준으로 감소시켰다. 특히 임상적 용량으로부터 변환하여 사용한 20 mg/kg의 프라바스타틴이 이들 마우스 모델에서 신장병증의 병리적 변화를 개선시키지 못한데 비해, 항혈소판 약물을 병용한 경우 큰 개선효과를 보이는 상승적 효능을 보이는 현상이 나타나는 것을 확인하였다.
<실시예 4> 만성 신장 병증이 유도된 노령 마우스 모델에서 신장 내 TGF-β 및 플라스미노겐 활성화제 저해제-1(Plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1) 발현 수준 확인
신장의 전형적인 병리조직학적 이상 및 ECM 축적이 정상 NFD 대조군보다 HFD/STZ 군에서 현저히 증가하고, 증가된 변성 사구체 및 세뇨관, 지방방울과 콜라겐 섬유가 차지하는 비율이 프라바스타틴과 클로피도그렐 및 사포그릴레이트와의 병용 투여 시 안정화되는 것을 확인한 상기 실시예 3의 결과를 토대로, 프라바스타틴과 항혈소판제를 병용 처리할 경우 신장 질환 치료에 효과적인지를 명확히 하기 위해, 병리조직학적 이상 및 ECM 축적시에 함께 발현량이 증가하는 단백질인 TGF-β 및 PAI-1의 발현량을 웨스턴블롯을 통해 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 준비한 마우스의 신장 반쪽을 단백질 가수분해효소 억제제(Protease inhibitor, Sigma Aldrich)를 포함하는 세포 용해 완충액(RIPA 완충액: 150 mM NaCl, 1 mM EDTA and 1% nonylphenoxypolyethoxylethanol)에 넣고 호모지나이저(homogenizer; IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Germany)로 조직을 갈은 다음, 4℃ 미량원심분리기에서 10000 × g로 10분간 원심분리하여 상층액을 모았다. 단백질 농도를 측정하기 위해, BCA 단백질 키트(Thermo Scientific, Waltham, MCA, USA)를 사용했으며, 이후, 상기 단백질들을 10-12%의 SDS-폴리아크릴 아마이드 겔에서 전기영동하여 니트로 셀룰로오스 막(GE Healthcare Biosciences, Pittsburgh, PA, USA)으로 전달시켰다. 상기 니트로 셀룰로오스 막을 PBS-T에 5%의 탈지유(Skim milk)를 넣거나 3%의 소혈청알부민(BSA)을 넣은 상태로 1시간 동안 차단하고 1차 항체를 넣고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음날, 상온에서 2차 항체를 넣고, 1시간 동안 반응시켰다. GE Healthcare Life Sciences사의 이미지퀀스 라스 4000 미니(GE Healthcare Life Science, Piscataway Township, NJ)를 사용하여 화학 발광 이미지를 측정하였다.
그 결과, 도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, HFD/STZ 마우스 군에서는 신장의 TGF-β 및 이의 표적 유전자인 PAI-1 모두 발현량이 현저히 증가하였다. 그러나, 클로피도그렐 및 사포그릴레이트를 단독으로 처리한 경우, TGF-β 및 PAI-1의 발현량이 감소하였고, 특히 클로피도그렐의 경우 사포그릴레이트에 비해 PAI-1의 발현량을 더욱 감소시키는 것을 볼 수 있었다. 더욱이, 프라바스타틴과 클로피도그렐 또는 프라바스타틴과 사포그릴레이트를 동시에 처리한 경우에는 정상 NFD 마우스 군과 유사하거나 더 낮게 TGF-β 및 PAI-1의 발현량을 감소시키는 것을 확인하였다.
상기 결과들을 모두 종합해보면, 클로피도그렐 및 사포그릴레이트와 프라바스타틴의 병용 처리는, 각각의 약물을 단독으로 사용할 때보다 HFD/STZ-유도 신장 병증, 특히 노령 마우스에서의 신장 병증을 더 효과적으로 방지, 개선 및 치료할 수 있는 바, 상기 항혈소판제들을 프라바스타틴과 함께 사용함으로써 신장 질환의 예방 내지 치료용 조성물로 활용할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims (10)

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  3. 프라바스타틴; 및 사포그릴레이트 또는 클로피도그렐 중 어느 하나의 항혈소판제를 유효성분으로 포함하는, 인 비트로(in vitro)에서 TGF-β 또는 PAI-1 중 어느 하나의 단백질 발현을 억제하는 시약용 조성물.
  4. 인간을 제외한 동물에, 프라바스타틴; 및 사포그릴레이트 또는 클로피도그렐 중 어느 하나의 항혈소판제를 동시에 처리하는 것을 특징으로 하는, TGF-β 또는 PAI-1 단백질 중 어느 하나 이상의 발현을 억제하는 방법.
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pharmacoepidemiology and drug safety, Volume18, Issue 5, Pages 362-369, 2009.03.02

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