KR102184663B1 - 계혈등 추출물을 유효성분으로 포함하는 최종당화산물 억제 효능을 갖는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 계혈등 추출물을 유효성분으로 포함하는 최종당화산물 억제 효과를 갖는 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 계혈등 추출물을 유효성분으로 포함하는, 최종당화산물 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 및 최종당화산물 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다. 본 발명의 계혈등 추출물은 최종당화산물의 생성 및 축적 억제 활성이 우수하고 동시에 최종당화산물의 교차결합 억제 및 절단 효과가 우수하여 최종당화산물로 유발되는 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 의약품 및 건강기능식품의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

계혈등 추출물을 유효성분으로 포함하는 최종당화산물 억제 효능을 갖는 조성물{Composition comprising a extract of Spatholobus suberectus dunn having Advanced Glycation End product inhibitory activity effects}
본 발명은 계혈등 추출물을 유효성분으로 포함하는 최종당화산물 억제 효능을 갖는 조성물에 관한 것이다.
단백질의 비효소적 당화반응(Nonenzymatic glycation reaction)이란, 단백질의 리신 잔기 등의 아미노산 그룹과 환원당이 효소의 작용 없이 일어나는 마이얄 반응(Maillard reaction)으로, 이 반응의 결과로 최종당화산물(Advanced glycation end products, AGEs)이 형성된다. 단백질의 비효소적 당화반응은 단백질의 유리 아미노기인 리신 (lysine)이나, 알기닌(arginine)과 환원당의 카르보닐기 (carbonyl group)가 반응하여 초기 당화반응 생성물인 쉬프 염기(Shciff base)를 형성하고 이때 형성된 화합물들이 계속적으로 축합, 재전위, 산화, 분열, 고리화 등의 일련의 복잡한 반응을 통하여 갈색의 화합물 (melanoidine)을 만들어 총체적인 개념의 비가역적 최종당화산물을 형성하는 반응이다.
최종당화산물은 비가역적인 반응산물이므로 일단 생성되면 혈당이 정상적으로 회복되어도 분해되지 않고 단백질의 생존기간 동안 조직에 축적되어 조직의 구조와 기능을 비정상적으로 변화시킨다. 비교적 반감기가 긴 콜라겐(collagen)은 쉽게 당화반응이 일어나고 이미 형성된 최종당화산물과 콜라겐의 교차결합 (cross-linking)을 형성하여 체내의 구조 및 기타 단백질 결합 조직 등의 비정상적인 물리화학적 변화를 초래한다. 또한, 다양한 세포 타입에 대한 특이적 수용체에 의해 인식되어 당뇨병성 망막병증(retinopathy), 당뇨병성 신경병증(diabetic neuropathy) 당뇨병성 백내장 (cataract), 당뇨병성 신증 (nephropathy) 등과 같은 당뇨합병증과 당뇨, 만성 신장질환, 심장질환, 혈관질환 및 노화 등 각종 질병을 일으키는 원인이 된다.
따라서 최종당화산물을 억제하여 최종당화산물로 기인하는 질병을 치료하고자 하는 연구가 시도되고 있고, 종래 개발된 대표적인 최종당화산물의 억제제로는 아미노구아니딘 (aminoguanidine) 및 ALT-711이 있다.
합성의약품인 아미노구아니딘 (aminoguanidine)은 친핵성 히드라진 (hydrazine)으로 축합반응의 산물과 결합하여 최종당화산물의 생성을 억제하여 합병증으로 진전되는 것을 방지한다. 아미노구아니딘은 당뇨합병증의 예방 및 치료에 가장 유망한 의약품으로 제 3상 임상시험까지 진행되었으나, 장기간 투여 시 독성이 유발되는 문제점이 있어 더욱 안전한 약제의 개발이 필요한 실정이다.
또한, ALT-711은 이미 형성된 최종당화산물의 교차결합을 분해하는 약물로 개발되었고, 친핵성 물질로서 이미 형성된 최종당화산물 교차결합의 친전자성인 디카르보닐기 (dicarbonyl group) 등을 공격한다. 스트렙토조토신 (streptozotocin, STZ)으로 유도한 당뇨쥐에서 ALT-711을 투여하면 당뇨로 인한 합병증을 완화해준다는 보고가 있다.
그러나 종래 개발된 최종당화산물 억제제들은 대부분 합성 화합물로서 체내 부작용이 초래되는 등 장기적 복용에 안정성 문제가 대두되고 있어, 체내 부작용이 없는 천연소재의 새로운 최종당화산물 억제제의 개발이 필요한 실정이다.
한편, 계혈등(Spatholobus suberectus Dunn)은 콩과(Leguminosae family)에 속하는 식물로서, 혈류 개선, 불규칙적인 월경 개선, 월경통, 혈액양 감소 및 류마티스 치료에 사용되어 왔다. 또한, 임상적 연구를 통해 계혈등은 헵시딘(hepcidin)을 암호화하는 유전자(HAMP)에 대한 강력한 발현 저해효과를 나타내고, 젖산탈수소효소 A(lactate dehydrogenase A; LDH-A)의 저해제이며, 사람 유방암세포주인 MDA-MB-231에 항암효과를 나타냄이 보고된 바 있으며, 파골세포형성(osteoclastogenesis)을 억제하고 연골형성을 자극하는 것으로 알려져 있다.
그러나 아직까지 계혈등이 최종당화산물을 억제할 수 있다는 활성에 대한 보고가 없다.
이에 본 발명자들은 계혈등 추출물이 최종당화산물의 생성을 억제하고 동시에 최종당화산물과 콜라겐의 교차결합을 억제 및 절단하는 효능이 있음을 최초로 규명함으로써, 계혈등 추출물을 최종당화산물로 기인하는 질환들의 예방, 개선 또는 치료를 위한 의약 조성물 및 기능성 식품 조성물의 소재로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 계혈등 추출물을 유효성분으로 포함하는, 최종당화산물 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 계혈등 추출물을 유효성분으로 포함하는, 최종당화산물 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 계혈등 추출물을 유효성분으로 포함하는 최종당화산물 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 계혈등 추출물을 유효성분으로 포함하는 최종당화산물 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 계혈등 추출물은 에탄올을 이용하여 수득한 추출물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 질환은 최종당화산물의 축적; 또는 최종당화산물과 콜라겐의 교차결합에 의해 발병하는 질환일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 질환은 당뇨합병증, 알츠하이머, 동맥경화, 요독증, 미세혈관병, 거대혈관병, 백내장, 파킨슨, 노화 및 암으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 당뇨합병증은 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 백내장, 당뇨병성 신증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부궤양, 당뇨병성 심장병, 당뇨병성 골다공증 및 당뇨병성 동맥경화증으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 계혈등 추출물은 CML(Nε-carboxymethyl lysine) 및 RAGE(receptor for advanced glycation end products)의 발현은 감소시키고, Nrf2(Nuclear factor erythroid-derived 2-related factor 2) 및 NQO1(NAD(P)H Quinone Dehydrogenase 1)의 발현은 증가시키는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 계혈등 추출물을 유효성분으로 포함하는, 최종당화산물 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 계혈등 추출물은 에탄올을 이용하여 수득한 추출물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 질환은 최종당화산물의 축적; 또는 최종당화산물과 콜라겐의 교차결합에 의해 발병하는 질환일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 질환은 당뇨합병증, 알츠하이머, 동맥경화, 요독증, 미세혈관병, 거대혈관병, 백내장, 파킨슨, 노화 및 암으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 당뇨합병증은 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 백내장, 당뇨병성 신증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부궤양, 당뇨병성 심장병, 당뇨병성 골다공증 및 당뇨병성 동맥경화증으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 계혈등 추출물은 CML(Nε-carboxymethyl lysine) 및 RAGE(receptor for advanced glycation end products)의 발현은 감소시키고, Nrf2(Nuclear factor erythroid-derived 2-related factor 2) 및 NQO1(NAD(P)H Quinone Dehydrogenase 1)의 발현은 증가시키는 것일 수 있다.
나아가 본 발명은, 계혈등 추출물을 유효성분으로 포함하는 최종당화산물 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명은 계혈등 추출물을 유효성분으로 포함하는 최종당화산물 억제 효과를 갖는 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 계혈등 추출물은 최종당화산물의 생성 및 축적 억제 활성이 우수하고 동시에 최종당화산물의 교차결합 억제 및 절단 효과가 우수하여 최종당화산물로 유발되는 질환들의 예방, 개선 또는 치료를 위한 의약품 및 건강기능식품의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에서 당뇨합병증 유발 마우스의 제조 및 전반적인 실험 스케줄을 나타낸 모식도이다.
도 2는 in vitro에서 본 발명의 계혈등 추출물에 대한 최종당화산물 생성억제 활성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 in vitro에서 본 발명의 계혈등 추출물에 대한 최종당화산물과 콜라겐의 교차결합 저해 활성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 in vitro에서 본 발명의 계혈등 추출물에 대한 최종당화산물 교차결합 절단 활성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 정상군(normal), 당뇨합병증 유발 마우스 군(control), 당뇨합병증 유발 마우스에 메트포민 투여군 및 당뇨합병증 유발 마우스에 본 발명의 계혈등 추출물을 처리한 군에 대한 혈당, 체중 및 당화혈색소의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 정상군(normal), 당뇨합병증 유발 마우스 군(control), 당뇨합병증 유발 마우스에 메트포민 투여군 및 당뇨합병증 유발 마우스에 본 발명의 계혈등 추출물을 처리한 군에 대한 소변 내 알부민/크레아티닌 비율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 정상군(normal), 당뇨합병증 유발 마우스 군(control), 당뇨합병증 유발 마우스에 메트포민 투여군 및 당뇨합병증 유발 마우스에 본 발명의 계혈등 추출물을 처리한 군에 대한 지질변화 여부를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 정상군(normal), 당뇨합병증 유발 마우스 군(control), 당뇨합병증 유발 마우스에 메트포민 투여군 및 당뇨합병증 유발 마우스에 본 발명의 계혈등 추출물을 처리한 군으로부터 분리한 신장조직에서 단백질 발현 변화를 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 정상군(normal), 당뇨합병증 유발 마우스 군(control), 당뇨합병증 유발 마우스에 메트포민 투여군 및 당뇨합병증 유발 마우스에 본 발명의 계혈등 추출물을 처리한 군으로부터 분리한 각 신장조직을 PAS로 염색한 사진을 나타낸 것이다.
본 발명은 계혈등 추출물이 최종당화산물 억제 효과를 갖는 신규 용도를 규명한 것으로, 구체적으로 본 발명은 계혈등 추출물을 유효성분으로 포함하는, 최종당화산물 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공함에 특징이 있다.
최종당화산물은 글리이케이션(glycation) 반응에 의해 단백질과 당이 반응하여 여러 과정을 거치면서 형성된다. 이러한 글리케이션 반응은 에너지 공급 없이 거의 자연발생적으로 일어나며 식품이나 신체 내에서 일정단계 이후 비가역적인 특징을 가진다. 체내에서는 혈액 중 포도당이나 이의 분해 산물, 헤모글로빈, LDL, 콜라겐 등과 같은 여러 단백질 성분과 반응하여 다양한 종류의 최종당화산물을 생성하며, 최종당화산물은 일단 생성이 되면 혈당이 정상으로 회복되어도 분해되지 않고 단백질 생존 기간 동안 혈중이나 조직에 축적된다. 축적된 최종당화산물은 최종당화산물 수용체와 상호작용하여 염증세포가 축적되고, 성장촉진 사이토카인들의 분비 및 세포 사멸이 증가되며, 단백질의 생존기간 동안 조직에 축적되어 조직의 구조와 기능을 비정상적으로 변화시켜, 당뇨, 당뇨합병증, 알츠하이머, 동맥경화, 요독증, 미세혈관병, 거대혈관병, 백내장, 파킨슨, 노화 또는 암과 같은 다양한 질환을 유발한다.
특히 당뇨합병증은 질병 유발 기전으로 크게 단백질의 비효소적 당화반응(nonenzymatic glycation of protein), 폴리올 경로(polyol pathway) 및 산화적 스트레스(oxidative stress) 등으로 알려져 있고, 이러한 기전에 의해 최종적으로 여러 가지 최종당화산물(AGEs)이 생성되며, 이로 인해 각종 합병증을 유발시키는 것으로 알려져 있다.
아라서 본 발명자들은 최종당화산물을 억제할 수 있는 천연물 소재를 발굴하기 위해 연구하던 중, 계혈등 추출물이 최종당화산물의 생성을 효과적으로 억제하여 최종당화산물의 축적을 저해할 수 있음을 확인하였다.
따라서 본 발명은 계혈등 추출물을 유효성분으로 포함하는, 최종당화산물 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 "추출물"이란, 상기 계혈등을 추출 처리하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.
본 발명의 조성물에 함유된 계혈등 추출물은 종래 공지된 천연물로부터 생리활성 물질을 수득하기 위한 방법이라면 모두 사용할 수 있으며, 특히 본 발명에서는 최종당화산물의 생성 및 최종당화산물과 콜라겐의 교차결합 저해 활성이 가장 우수한 계혈등 추출물의 최적 제조 조건을 확립하였다.
따라서 본 발명에 따른 바람직한 상기 계혈등 추출물은 계혈등에 에탄올을 첨가하고 초음파를 처리한 초음파 추출물일 수 있으며, 초음파 처리 조건은 15~25kHz에서 20~30분 동안 처리할 수 있다.
종래 초음파를 이용하여 천연소재로부터 추출물을 수득하는 공정이 사용되고 있으나, 대상 물질의 특성에 따라 최적의 추출조건이 달라지므로 대상 물질에 따른 최적 추출조건의 확립이 필요하다.
이러한 점에서 본 발명에서는 최종당화산물의 억제 활성이 우수한 계혈등 추출물의 제조 공정을 확립하였고, 본 발명의 일실시예에서는 계혈등에 70%의 에탄올을 첨가하고 20kHz로 25분 동안 초음파를 처리하여, 계혈등의 초음파 에탄올 추출물을 수득하였다.
이때 상기 에탄올 이외의 다른 용매를 사용하거나, 15~25kHz의 범위를 벗어난 주파수 및 20~30분을 벗어난 시간으로 초음파를 처리하게 되면 최종당화산물의 억제 활성이 미비하므로, 상기 본 발명에서 확립한 조건으로 계혈등 추출물을 수득하는 것이 중요하다.
또한, 본 발명의 일실시예에서는, 상기 본 발명의 계혈등 추출물에 대한 최종당화산물의 생성억제 활성을 in vitro 상에서 분석하였고, 최종당화산물과 콜라겐과의 교차결합 억제 및 절단 활성에 대한 분석을 수행하였다.
그 결과, 본 발명의 계혈등 초음파 추출물은 최종당화산물의 생성을 효과적으로 억제하는 활성이 있었고(도 2 참조), 나아가 최종당화산물과 콜라겐의 비가역적 교차결합을 억제하고 절단하는 활성이 있는 것으로 확인되었다(도 3 및 도 4 참조).
또한 본 발명의 다른 일실시예에서는 최종당화산물의 억제제로 알려진 아미노구아니딘(aminoguanidine) 및 ALT-711과 본 발명의 계혈등 추출물에 대한 최종당화산물 억제 활성을 비교하였는데, 본 발명의 계혈등 추출물이 아미노구아니딘(aminoguanidine)에 비해 더 우수한 최종당화산물 생성 억제 활성이 있는 것으로 나타났고(도 2 참조), ALT-711에 비해서도 더 우수한 최종당화산물과 콜라겐과의 비가역적 교차결합 억제 및 절단 효능이 있는 것으로 나타났다(도 4 참조).
따라서 본 발명자들은 본 발명의 계혈등 추출물을 최종당화산물로 유발되는 질환들의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
나아가 본 발명자들은 본 발명의 계혈등 추출물이 최종당화산물로 유발되는 질환으로 알려진 당뇨합병증을 실제적으로 치료할 수 있는지를 확인하기 위해, 당뇨합병증 중 하나인 당뇨병성 신증이 유발된 마우스를 이용하여 본 발명의 계혈등추출물 투여에 따른 질환 증세의 개선 여부를 분석하였다.
분석 결과, 당뇨병성 신증이 유발된 마우스군은 정상 마우스에 비해 혈당, 체중 및 당화혈색소가 모두 증가되어 있었으나, 본 발명의 계혈등 추출물이 처리된 당뇨병성 신증 마우스군에서는 혈당, 체중 및 당화혈색소의 큰 변화를 유도하지는 못하는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 계혈등 추출물은 혈당에는 변화를 주지 않는다는 것을 알 수 있었다.
한편, 당뇨병성 신증 마커인 알부민/크레아틴 비율을 측정한 결과에서는 정상 마우스에 비해 당뇨병성 신증 마우스의 소변에서 현저하게 증가된 알부민/크레아틴 비율을 본 발명의 계혈등 추출물을 처리할 경우, 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 6 참조).
또한, 정상 마우스, 당뇨병성 신증 마우스, 본 발명의 계혈등 추출물을 처리한 당뇨병성 신증 마우스로부터 신장 조직을 분리한 후, PAS 염색을 통해 사구체 및 글리코겐을 포함한 신세뇨관 세포를 관찰하였는데, 그 결과, 정상 마우스에 비해 당뇨병성 신증 마우스는 신장의 사구체로부터 배출된 포도당이 세뇨관에 재흡수 되어 글리코겐을 포함한 신세뇨관 세포(renal tubular cell)가 형성되어 있는 것으로 나타난 반면, 본 발명의 계혈등 추출물을 투여한 당뇨병성 신증 마우스는 글리코겐의 형성이 정상 마우스와 유사한 수준으로 감소된 것으로 나타났다.
따라서 본 발명의 계혈등 추출물은 최종당화산물 억제를 통한 신장 보호 효능이 있음을 알 수 있었고, 당뇨병성 신증을 효과적으로 치료할 수 있음을 동물 실험을 통해 확인할 수 있었다.
또한 본 발명자들은 최종당화산물에 의한 당 독성을 억제하는 기전에 관여하는 Nrf2 신호기전에 본 발명의 계혈등 추출물이 관여하는지 확인하기 위해, 본 발명의 계혈등 추출물을 투여한 당뇨합병증 마우스의 신장 조직을 분리하고, Nrf2 신호기전 관련 단백질들의 발현 변화 여부를 분석하였다.
그 결과, 최종당화산물 중 하나인 CML(Nε-carboxymethyl lysine) 및 최종당화산물의 수용체인 RAGE(receptor for advanced glycation end products)의 발현은 계혈등 추출물의 처리에 의해 감소되는 것으로 나타났고 반면 Nrf2(Nuclear factor erythroid-derived 2-related factor 2) 및 NQO1(NAD(P)H Quinone Dehydrogenase 1)의 발현은 증가되는 것으로 나타났다.
상기 Nrf2 신호기전은 최종당화산물에 의한 당 독성을 억제하는데 중요한 기전으로 알려져 있으며, Nrf2의 발현 및 활성이 증가되면 최종당화산물에 의한 당 독성을 저해할 수 있다. 또한 상기 NQO1은 항산화 효소로 알려져 있다.
이상의 결과를 통해 본 발명자들은 계혈등 추출물이 Nrf2의 발현 또는 활성을 증가시켜 최종당화산물에 의한 당 독성을 저해할 수 있음을 알 수 있었다.
그러므로 이상의 실험 결과를 토대로 볼 때, 본 발명의 계혈등 추출물은 최종당화산물의 생성 억제, 최종당화산물과 글리코겐의 교차결합 억제 및 절단, 최종당화산물에 의한 당 독성 저해 활성을 모두 가지고 있음을 확인함으로써, 본 발명의 계혈등 추출물을 최종당화산물로 발병하는 질환들의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
그러므로 본 발명은 계혈등 추출물을 유효성분으로 포함하는, 최종당화산물 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 상기 "약제학적으로 허용 가능한"이란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여활성 물질의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 최종당화산물로 유발되는 질환의 증상을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 최종당화산물로 유발되는 질환의 증상을 호전 또는 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 이때, 개체는 본 발명의 조성물을 투여하여 최종당화산물로 유발되는 질환의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.
본 발명에서 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 본 발명의 계혈등 초음파 추출물 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 본 발명의 계혈등 초음파 추출물 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 계혈등 초음파 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 ~ 99중량%로 포함될 수 있다.
본 발명의 계혈등 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물이 예방, 개선 또는 치료하고자 하는 질환인 “최종당화산물로 관련 질환”은 최종당화산물로 인해 발병될 수 있는 질환이라면 모두 포함할 수 있고, 구체적으로 이에 제한되지는 않으나, 당뇨합병증, 알츠하이머, 동맥경화, 요독증, 미세혈관병, 거대혈관병, 백내장, 파킨슨, 노화 또는 암일 수 있다.
상기 당뇨합병증에 속하는 질환으로는 이에 제한되지는 않으나, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 백내장, 당뇨병성 신증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부궤양, 당뇨병성 심장병, 당뇨병성 골다공증 또는 당뇨병성 동맥경화증일 수 있다.
상기 당뇨합병증은 당뇨병이 장기간 지속되는 경우 유발되는 증상을 의미하는 것으로, 당뇨합병증은 당뇨병의 발병 기준 및 판단 기준과 상이하며, 당뇨합병증 치료제는 당뇨병 치료제와는 별개로 사용되고 있다. 당뇨합병증 유병의 원인은 최종당화산물(advanced glycation endproducts, AGEs) 및, 알도스환원효소(aldose reductase)의 비정상적인 활성과 가속화된 산화성 스트레스에 의해 유발되므로, 최종당화산물 억제 또는 최종당화산물과 콜라겐의 교차결합 저해 활성이 있는 물질은 당뇨합병증의 치료제로 사용할 수 있다.
동맥경화증은 혈관내피 장애로서 혈중의 단핵구가 최종당화산물의 자극에 의해 혈관내피세포에 부착되고, 연접 부위를 침투하여 동맥내경이 좁아지며 혈류의 장애가 오래되어 발생할 수 있는 질환이며 이는 협심증, 심근경색, 뇌졸중 등의 심각한 심혈관계 장애를 일으키기도 한다. 따라서 최종당화산물을 억제할 경우 동맥경화증을 치료할 수 있다.
또한, 최종당화산물은 콜라겐 등의 단백질과의 교차결합에 의해 체내의 구조 및 기타 단백질 결합 조직 등의 비정상적인 물리화학적 변화를 초래하여 알츠하이머, 동맥경화, 요독증, 미세혈관병, 거대혈관병, 백내장, 파킨슨, 노화 또는 암의 질병을 유발한다고 알려져 있다. 따라서 최종당화산물의 단백질과의 교차결합 저해제는 이들 질환을 예방 또는 치료를 위한 용도로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 계혈등 추출물을 유효성분으로 포함하는 최종당화산물로 유발되는 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 "식품 조성물"이라는 용어는, 그를 섭취하는 대상체에 제공되는 영양소에 관계없이, 그 생물의 하나 이상의 기능에 유리하게 작용하여 보다 나은 건강 상태를 제공하는 식품을 의미한다. 결과적으로, 상기 식품 조성물은 질병 또는 질병-유발 인자의 예방, 개선 또는 치료를 위해 사용될 수 있다.
따라서 본 발명의 "식품 조성물"이라는 용어는 기능성 식품 또는 특정 영양 목적을 위한 식품 또는 의약 식품의 동의어로서 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 본 발명의 계혈등 추출물 이외에 통상적인 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이 외에도 바인더, 분해제, 코팅제, 윤활제 등과 같은 제약학적으로 통상적으로 사용되는 다양한 첨가제와 제형화되어 조제될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 계혈등 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 ~ 99중량%로 포함될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 본 발명의 계혈등 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 식품 조성물은 본 발명의 계혈등 추출물 이외에 추가로 식품학적으로 허용 가능하거나 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 식품 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 식품 조성물의 제제 형태는 정제, 캡슐제, 분말, 과립, 액상, 환, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 또는 점적제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
상기와 같은 방식으로 제제화된 본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가될 수 있다.
본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 계혈등 추출물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 유효성분인 계혈등 추출물은 화학약품과 같은 부작용이 거의 없이 당뇨병성 신증 개선을 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.
따라서 본 발명은 계혈등 추출물을 유효성분으로 포함하는 최종당화산물로 유발되는 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품은 최종당화산물로 유발되는 질환의 예방 또는 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
본 발명에서 ‘건강기능식품’이라 함은 건강기능식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 ‘식품 첨가물 공전’에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.
예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 상기 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
나아가 본 발명은 계혈등 추출물을 유효성분으로 포함하는, 최종당화산물의 억제용 조성물을 제공할 수 있다.
또한 본 발명은 계혈등 추출물을 유효성분으로 포함하는, 최종당화산물과 콜라겐의 교차결합 억제제, 교차결합 분해제(절단제) 또는 최종당화산물 생성 억제제를 제공할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 준비예 >
시료 준비 및 실험방법
<1> 계혈등 추출물의 제조
계혈등(Spatholobus suberectus Dunn.)의 중량 대비 10 배 중량에 해당하는 70% 에탄올을 계혈등에 첨가하고 초음파 추출기를 이용하여 20kHz에서 20분간 초음파 추출물을 수행하여 계혈등의 에탄올 초음파 추출물을 수득하였다. 이후 추출물을 Whatman NO. 1로 여과하는 과정을 2번 반복한 후, 여과액을 회전식 진공 증발기(rotary vaccum evaporator; 일본 eyela사 제조)를 사용하여 회전속도 60 rpm 및 37℃에서 용매를 증발시키고, 여기에 물을 첨가하여 혼탁시킨 뒤 동결 건조하여 하기 실험들에 사용하였다.
<2> In vitro 에서 최종당화산물 생성 저해 효능 분석
10 mg/ml의 BSA를 50 mM 인산화 버퍼(phosphate buffer 700 μl; pH 7.4)에 녹이고, 0.2 M의 프락톡스(fructose)와 글루코스(glucose)를 각각 100 μL씩 첨가하였다. 또한 0.02% sodium azide를 첨가하여 반응 기간 동안 미생물의 오염을 방지하였다. 이 혼합물에 시험 시료 또는 in vitro 표준 최종당화산물 생성 억제제인 AG를 200 μL 첨가하고 최종부피가 1mL가 되도록 한 후, 37℃에서 14일 동안 반응 시켰다. 반응 14일 후 Cellbio labs의 키트를 이용하여 최종당화산물(AGEs)의 생성 억제 정도를 분석하였다. 구체적으로, 96 웰 플레이트에 시료를 1차 항체와 1:1비율로 혼합하여 최종 부피가 100 μL가 되도록 한 후, 37℃에서 2시간 방치하였고, 이후, 0.05% PBST로 세 번 세척한 후 1% BSA/PBS로 블록킹 하였으며, 1시간 방치한 후 0.05% PBST로 세 번 세척하였다. 0.05% PBST로 세 번 세척한 후 HRP-conjugate 2차 항체를 100 μL 첨가하여 1시간 반응시켰다. 그런 뒤 0.05% PBST로 세 번 세척하고 100 μL의 기질 용액을 첨가하였다. 5분 방치 후, 반응 정지 용액(1M H2SO4)을 100 μL 첨가하고 ELISA 리더기로 흡광도를 측정하였다.
<3> 최종당화산물의 cross-linking 억제 및 절단 효과 분석
최종당화산물의 교차결합 억제 및 절단 효능 분석을 위해 AGE-BSA는 horseradish peroxidase (HRP) 라벨이 부착된 Kit-NH2 Unit (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Tokyo, Japan)를 사용하였다.
최종당화산물 교차결합 억제 효능 분석은 1.0 μg AGE-BSA와 AG 또는 시료를 콜라겐이 코팅된 96-웰 microtiter 플레이트에 분주한 뒤, 37℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 이후 0.05% PBST에 3번 세척하고 TMB를 기질로 하여 발색한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 최종당화산물(AGE)-BSA의 교차결합 억제율(cross-linking inhibtion %)은 다음과 같은 계산식을 통해 계산하였다.
AGE-BSA (%)=(약물을 첨가한 well의 흡광도/약물을 첨가하지 않은 well의 흡광도) × 100
또한, 최종당화산물 교차결합 절단 효능분석은 1.0 μg AGE-BSA를 콜라겐이 코팅된 96-웰 microtiter 플레이트에 분주한 후, 37℃에서 4시간 동안 배양하여 AGE-BSA와 콜라겐을 교차 결합 시켰다. 이후 0.05% PBST에 3번 세척하고 교차결합 억제제로 알려진 약물인 ALT-711을 1 mg/mL 또는 시료를 각 웰에 분주하고 18시간 동안 배양하였다. 이후 각 웰을 0.05% PBST로 3번 세척하고 TMB를 기질로 하여 발색한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하고 다음과 같이 계산하였다.
AGE-BSA (%)=(약물을 첨가한 well의 흡광도/약물을 첨가하지 않은 well의 흡광도)× 100
<4> 당뇨합병증 마우스 모델 제조
당뇨합병증(당뇨병성 신증)이 유발된 마우스는 유전자가 변형된 6주령의 C57BLks/J db/db 마우스로서 (주) 중앙실험동물 (Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 당뇨병성 신증 유발 마우스를 1주일간 일반식이로 적응시킨 후 실험을 시작하였는데, 실험 시작 시 정상 마우스의 평균체중은 25.8 g, 당뇨병성 신증 마우스는 35g 이었다. 동물 실험은 정상군(Normal group), 실험대조군 (Control group; 당뇨병성 신증 유발 마우스), 양성대조군 (당뇨병성 신증 유말 마우스에 Amioguanidine를 200 mg/kg 처리군), 시료군 (당뇨병성 신증 유발 마우스에 계혈등 추출물을 200 mg/kg 처리군)으로 총 4군으로 하였고, 각 군당 실험동물은 10마리씩을 사용하였으며, 케이지 당 2 마리씩 사육하였다. 이때 사육실 온도는 20±2℃, 습도 50±10%, 명암 사이클은 12시간(20:00~08:00 light)이 되도록 자동조절 하였다. 식이와 물은 제한 없이 자유롭게 공급하며 6주 동안 경구 투여하였다.
<5> 체중, 혈당 및 당화혈색소(hemoglobin A1c)측정
상기 마우스 실험군들을 대상으로 체중, 혈당 및 당화혈색소의 측정은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 체중변화는 식이 개시일을 시작하여 정상군, 당뇨병성 신증 유발군, 양성대조군, 시료군으로 나누어 충분한 양의 사료와 물을 공급하면서 2주에 한번 총 4번 측정하였다. 실험기간 동안 동일시간에 2주에 한번 실험동물을 12시간 절식시킨 후, 미정맥에서 혈액을 채취하여 혈당계 (Accu-chek, Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)로 혈당을 측정하였고 HbA1c의 함량 측정은 HbA1c analyzer (Infopia Inc., Anyang, Korea)를 이용하여 측정하였다.
<6> 혈중 지질 지표 및 생화학적 분석
당뇨 유발 6주 후 실험 마우스를 18시간 절식시킨 후 마취하여 심장에서 혈액을 채취하였으며 3,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청은 분석 전까지 -70℃ 냉동고에 보관하였다. 혈청 내 중성지방(TG), 유리지방산 (FFA), 총 콜레스테롤 (TC), LDL-콜레스테롤 (LDL-C), 혈액요소질소 (BUN) 함량은 Cell Biolabs, Inc. (Beverly, MA, USA)사의 키트를 사용하여 측정하였다. 소변의 단백질 및 크레아티닌 함량은 Albumin-to-Creatinine Ratio (ACR) Assay Kit (Biovision, Milpitas, CA, USA) 을 표준용액으로 사용하여 분석하였다.
<7> 웨스턴블럿을 통한 단백질 발현 분석
해당 시료를 western blot ice cold homogenizing media(154 mM KCl, 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA buffer, pH 7.4)에 넣고 4℃에서 glass teflon homogenizer로 균질화한 다음 4℃, 12,000×g에서 20분간 고속원심분리기로 원심 분리하였다. 이중 상등액을 취해 다시 4℃ 105,000×g에서 초고속원심분리기로 60분간 다시 원심분리한 후 cytosol분획과 microsome 분획으로 각각 분리하여 사용하였다. 당뇨 관련 바이오마커의 분석을 위하여 마우스의 각 조직은 protease inhibitor가 포함된 용해버퍼(lysis buffer)를 첨가한 후, 균질화하여 10,000×g로 5 분간 원심 분리하여 상층액을 얻었다. 정량한 단백질은 10% 또는 12% SDS-polyacrylamide gel(Bio-Rad, CA, USA)을 사용하여 전기영동 후, PVDF membrane(Bio-Rad, CA, USA)에 transfer하였다. 5% skim milk(0.1% Tween 20 containing PBS, PBST) 용액에서 nonspecific binding site를 blocking 한 후, 1차 항체[anti-β-actin, anti-RAGE anti-CML anti-NQO1, anti-CML, anti-GLO-1, anti-Nrf2, anti-Lamin (1:1000), Cell signaling Technology]로 4℃에서 overnight 후, 2차 항체[anti-rabbit IgG or anti-mouse IgG linked with horseradish peroxidase, Santa Cruz Biotechnology, Inc., USA]로 상온에서 1시간 incubation 하였고, streptavidin-horseradish peroxidase와 chemiluminescence detection system(Amersham Bioscience, NJ, USA)을 이용하여 image analyzer(LAS-3000, Fujifilm, Tokyo, Japan)에서 검출하였고, Image J software(NIH, MD, USA)를 이용하여 발현된 단백질의 양을 측정하였다.
<8> 마우스 신장 조직의 병리학적 분석
신장 조직을 2 등분 한 뒤 4%의 파라포름알데히드(paraformaldehyde) (pH 7.4)를 이용하여 24시간 동안 고정시킨 후 파라핀에 포매한 다음, 5 μm 두께로 세절하여 periodic acid-Schiff (PAS) 시약으로 염색한 후, 광학현미경(CX-40, Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
최종당화산물(AGEs)에 대한 분석은 4㎛의 두께의 신장조직을 젤라틴으로 코팅된 슬라이드에 부착시킨 후 xylene에 담가 파라핀을 제거하고, 100%, 95%, 80%, 70% 에탄올 및 증류수에 차례로 담가 재수화(rehydration)시켰다. 1% H2O2 in methanol에 15분간 반응시킨 후 1% bovine serum albumin과 10% normal horse serum을 혼합하여 만든 protein blocking agent를 분주하고 1시간동안 배양하였다. 재수화 및 blocking agent의 처치과정을 거친 slide상 조직절편에 해당하는 각각의 primary antibody를 분주하고 실온에서 overnight 시켰다. 50 mM PBS로 3회 세척한 후 secondary antibody와 1시간 동안 반응 시키고 다시 50 mM PBS로 3회 세척한 후 vecta stain ABC ELITE kit를 분주하고 1시간 동안 반응시켰다. Diaminobenzidine(DAB)을 이용하여 갈색으로 염색하고 hematoxylin으로 대조 염색한 후 증류수,70%, 80%, 95%, 100%에탄올, xylene에 차례로 담가 탈수화 (dehydration)시키고 permount로 mounting하여 컴퓨터와 연결된 high-resolutioncamera부착 광학 현미경을 이용하여 각각의 디지털 영상을 얻었다.
<9> 통계처리
모든 실험 결과는 평균±표준편차로 나타내었으며 실험군 간의 통계학적 분석은 GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)를 이용하여 one-way analysis of variance (ANOVA) 분석을 실시하였으며, 유의차가 있은 항목에 대해서는 Tukey’s multiple range test로 p<0.05의 수준에서 통계적 유의성을 검정하였다.
< 실시예 1>
계혈등 추출물의 최종당화산물 생성 억제 효능 분석
상기 준비예 <2>의 실험을 통해, 본 발명의 계혈등 추출물에 대한 최종당화산물(AGE) 생성 억제 효능 여부를 분석하였다. 즉 프락토스와 글루코스가 함유된 용액에 본 발명의 계혈등을 50ug/ml 및 200ug/ml의 농도로 각각 처리하였고, 이때 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 군(AGEs)을 사용하였으며, 양성대조군으로는 최종당화산물의 생성을 저해하는 것으로 알려진 아미노구아니딘(1mM) 처리군을 사용하였다.
분석 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 군(AGEs)의 AGE를 100%로 하였을 때 본 발명의 계혈등 추출물 처리군은 모두 AGE의 생성을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났으며, 아미노구아니딘(1mM) 처리군(AG)에 비해서도 더 우수하게 AGE의 생성을 억제하는 것으로 나타났다. 구체적으로 계혈등 추출물 50μg/m 처리군은 85%의 생성억제 효과를 보였고, 계혈등 추출물 200 μg/mL 처리군은 91%의 최종당화산물 생성억제 효과를 보이는 것으로 나타났다.
< 실시예 2>
계혈등 추출물의 최종당화산물 교차결합 억제 및 절단 효능 분석
본 발명의 계혈등 추출물이 최종당화산물과 콜라겐의 비가역적 교차결합을 억제하는지를 알아보기 위하여 최종당화산물 교차결합의 억제 효능을 상기 준비예 <3>의 방법과 같이 in vitro에서 평가 하였다.
분석 결과, 최종당화산물 교차결합 억제제로 알려져 있는 아미노구아니딘(1mM) 처리군(AG)은 교차결합 억제효능이 1 mg/mL에서 70%로 나타났고, 본 발명의 계혈등 추출물은 200 μg/mL에서 30%의 효능을 나타내었다(도 3 참조).
또한, 최종당화산물과 콜라겐 사이에 이미 형성된 비가역적 교차결합을 본 발명의 계혈등 추출물이 절단하는 효능이 있는지 확인한 결과, 최종당화산물 교차결합 절단약물로 알려져 있는 ALT-711는 1 mg/mL에서 50% 절단효능을 보였다. 반면 본 발명의 계혈등 추출물은 50 μg/mL, 200 μg/mL에서 각각 85%, 92%의 우수한 교차결합 절단효능을 나타내었다(도 4 참조).
< 실시예 3>
당뇨합병증 유발 마우스에서 계혈등 추출물 처리에 개선 및 치료 효과 확인
<3-1> 혈당, 체중 및 당화혈색소 변화 측정
당뇨합병증인 당뇨병성 신증이 유발된 마우스에 본 발명의 계혈등 추출물을 처리한 경우 혈당, 체중 및 당화혈색소에 변화가 나타나는지 확인하기 위한 실험을 상기 준비예 <5>의 방법을 통해 수행하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 당뇨병성 신증이 유발된 마우스군(실험대조군) 및 본 발명의 계혈등 추출물을 처리한 군의 혈당은 증가한 것으로 나타나, 본 발명의 계혈등 추출물의 투여가 혈당 변화에는 영향을 주지 못하는 것으로 나타났다. 또한, 체중변화는 정상군에 비해 당뇨병성 신증 마우스군, Metformin 처리군, 계혈등 추출물 처리군 모두에서 체중이 증가하는 것으로 나타났다. 또한, HbA1c의 변화 여부도 측정하였는데, HbA1c는 고혈당이 헤모글로빈과 비효소적 당화반응과 산화과정을 거쳐 형성되는 것으로 장기적인 당뇨 및 2차 질환의 개선지표로 사용된다. 본 분석 결과, HbA1c는 6주차에 정상군 (4.7%)에 비해 당뇨병성 신증 유발 마우스(실험대조군)군에서 8.2%로 증가하였고, 본 발명의 계혈등 추출물 처리군은 7.8% 로 약간 감소하는 것으로 나타났다.
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 계혈등 추출물이 당뇨병성 신증동물 모델에서 혈당 감소, 체중 감소, HbA1c 감소 효과를 보이지는 않음을 확인하였다.
<3-2> 본 발명의 계혈등 추출물 처리에 따른 소변 알부민/크레아티닌 변화측정
당뇨병성 신증의 마커로 알려진 소변 내 알부민/크레아티닌 비율을 측정하였다. 측정 결과, 정상 마우스 군은 소변 내 알부민/크레아티닌 값이 20 μg/mg인 것으로 나타났으나 당뇨병성 신증 마우스 군(Control)은 240 μg/mg으로 현저하게 증가한 것으로 나타났다. 반면 본 발명의 계혈등 추출물(50mg/kg)을 처리한 군은 95 μg/mg으로 당뇨병성 신증 마우스 군에 비해 알부민/크레아티닌 비율을 약 2.5 배로 현저하게 감소시켰다(도 6 참조).
<3-3> 본 발명의 계혈등 추출물 처리에 따른 혈중 지질변화 측정
상기 제2형 당뇨병성 신증이 유발된 마우스군 및 질환유발 마우스에 본 발명의 계혈등 추출물을 투여한 군에서의 혈중 유리지방산 및 지질대사의 함량 분석을 위해, 혈청의 FFA, TG, TC, LDL-C, BUN함량을 측정하였다. 이는 지질대사의 이상은 총 중성지방의 증가와 HDL-C의 감소현상을 유발하며 이외 콜레스테롤 농도가 증가되어 관상동맥질환이 당뇨병의 주요 합병증 중 하나로 보고되어 있어, 본 발명의 계혈등 추출물이 당뇨 합병증을 개선 및 치료할 수 있는지를 확인하였다.
분석 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 혈청의 FFA(free fatty acid) 수준은 정상군(N) 646μEq/L에 비해 당뇨병성 신증 마우스군(C)이 919μEq/L로 높게 나타났으며, 본 발명의 계혈등 추출물 처리군은 656μEq/L로 거의 정상군과 유사한 수치를 나타내었다.
또한, 혈중 내 TG(triglyceride) 수준은 정상군 보다 당뇨병성 신증 마우스군(C)이 높은 수치인 113 mg/dL를 보였고 계혈등 추출물 처리군은 68 mg/dL로 당뇨병성 신증 마우스군에 비해 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다. 총 콜레스테롤(TC)의 경우, 당뇨병성 신증 마우스군에서 73 mg/dL로 나타났지만 계혈등 추출물 처리군은 62 mg/dL로 총 콜레스테롤 함량이 감소된 것으로 나타났다.
LDL-C 혈중농도는 당뇨병성 신증 마우스군(C)(15.2 mg/dL)이 정상군(4.2 mg/dL)에 비해 증가한 것으로 나타났고, 메트포민 처리군은 6.3 mg/dL로 나타났으며 본 발명의 계혈등 추출물 처리군은 8.6 mg/dL으로 나타나 당뇨병성 신증 마우스군에 비해 유의하게 감소된 것을 확인할 수 있었다.
뿐만 아니라 신장 기능을 나타내는 지표인 BUN을 측정한 결과, 정상군 9.3 mg/dL에 비해 당뇨병성 신증 마우스군(C)은 13.1 mg/dL로 정상군에 비해 현저하게 증가되어 있는 것으로 나타났으며, 본 발명의 계혈등 추출물 처리군의 경우 12.4 mg/dL로 당뇨병성 신증 마우스군에 비해 감소된 것으로 나타났다.
이러한 결과를 통해 본 발명의 계혈등 추출물은 혈중 지질을 감소시키는 활성이 있어 당뇨합병증을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
<3-4> 마우스 신장 조직에서 계혈등 추출물 처리에 따른 단백질 발현변화 측정
정상마우스 군, 제2형 당뇨병성 신증 마우스군, 제2형 당뇨병성 신증 마우스에 메트포민을 투여한 군 및 제2형 당뇨병성 신증 마우스에 본 발명의 계혈등 추출물을 투여한 군으로부터 신장 조직을 추출한 후, 각 신장조직에서 RAGE, CML, NQO1, Nrf2 단백질 발현 변화를 웨스턴 블럿을 통해 확인하였다. 여기서 CML은 대표적인 비형광성 최종당화산물이고, RAGE는 AGEs 수용체이며, NQO1는 항산화 효소이고, Nrf2는 NQO1 및 GLO-1의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다.
분석 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, RAGE 및 CML은 당뇨병성 신증 유발 마우스군이 정상 마우스군에 비해 현저하게 증가되어 있는 것으로 나타난 반면, 본 발명의 계혈등 추출물 처리 군은 RAGE 및 CML의 발현을 유의적으로 억제하는 것으로 나타났다.
또한, AGEs에 의한 당독성을 억제하는데 중요한 기전 중 하나인 Nrf2 신호전달의 변화를 확인한 결과, 항산화 효소인 NQO1 및 최종당화산물 분해효소인 GLO-1의 발현은 당뇨병성 신증 마우스에서 정상마우스에 비해 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었고, 이는 계혈등 추출물의 투여로 회복되는 것을 확인할 수 있었다. NQO1 및 GLO-1의 발현을 조절한다고 알려진 항산화 단백질 Nrf2 역시 본 발명의 계혈등 추출물 투여 시, 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다.
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명의 계혈등 추출물이 최종당화산물을 저해하는 활성이 있으며, 최종당화산물에 의한 당독성을 억제하는 활성이 있어, 최종당화산물로 유발될 수 있는 질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
<3-5> 마우스 신장 조직에서 계혈등 추출물 처리에 따른 병리학적 분석
신장 조직의 병리학적 변화는 신장 기능손실과 큰 상관관계를 갖는다. 고혈당 등의 여러 원인에 의한 메산지움 기질의 팽창이나 사구체 경화 등은 신실질의 감소를 야기시키며, 이는 곧 여과능력의 감소로 이어져, 결국 당뇨병성 신증이 발병되고 나아가 말기 신부전이 유발된다.
본 발명의 계혈등 추출물이 당뇨합병증의 하나인 당뇨병성 신증의 개선 효과가 있는지를 in vivo 실험을 통해 확인하고자, 상기 실험에 사용된 각 마우스 군으로부터 신장 조직을 수득한 후, PAS 염색을 시행하였다. 이때 제2형 당뇨병성 신증 마우스의 혈당은 400 mg/dL 이며, 이러한 고혈당 상태에서 신장의 사구체로부터 배출된 포도당은 세뇨관에서 재흡수 되어 글리코겐을 포함한 신세뇨관 세포를 (renal tubular cell) 형성하게 한다.
PAS 염색 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 당뇨병성 신증 마우스군(control)에서 사구체의 크기는 정상군에 비해 증가하지 않았지만 원위세뇨관에서 글리코겐을 다량 포함한 것을 확인할 수 있었다. 한편 본 발명의 계혈등 추출물 처리군에서는 글리코겐의 형성이 정상군과 비슷한 수준으로 감소된 것으로 나타났다. 또한, IHC 염색을 통해 당뇨합병증 마우스의 사구체에는 AGEs의 축적이 증가되어 있는 것으로 나타난 반면, 본 발명의 계혈등 추출물 투여 군은 투여량에 비례하여 AGEs의 축적이 감소되어 있는 것을 확인하였다.
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명의 계혈등 추출물이 최종당화산물의 생성억제, 최종당화산물과 콜라겐의 교차결합 억제 및 절단, 최종당화산물에 의한 당독소 억제 효능이 우수하여 당뇨합병증을 포함하는 최종당화산물로 유발되는 질환들의 예방, 개선 및 치료에 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (13)

  1. 계혈등(Spatholobus suberectus Dunn)의 에탄올 초음파 추출물을 유효성분으로 포함하는, 당뇨합병증, 알츠하이머, 동맥경화, 요독증, 백내장 및 파킨슨으로 이루어진 군 중에서 선택되는 최종당화산물 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 질환은 최종당화산물의 축적; 또는 최종당화산물과 콜라겐의 교차결합에 의해 발병하는 질환인 것을 특징으로 하는, 최종당화산물 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 당뇨합병증은 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 백내장, 당뇨병성 신증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부궤양, 당뇨병성 심장병, 당뇨병성 골다공증 및 당뇨병성 동맥경화증으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 최종당화산물 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 CML(Nε-carboxymethyl lysine) 및 RAGE(receptor for advanced glycation end products)의 발현은 감소시키고, Nrf2(Nuclear factor erythroid-derived 2-related factor 2) 및 NQO1(NAD(P)H Quinone Dehydrogenase 1)의 발현은 증가시키는 것을 특징으로 하는, 최종당화산물 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 계혈등(Spatholobus suberectus Dunn)의 에탄올 초음파 추출물을 유효성분으로 포함하는, 당뇨합병증, 알츠하이머, 동맥경화, 요독증, 백내장 및 파킨슨으로 이루어진 군 중에서 선택되는 최종당화산물 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  8. 삭제
  9. 제7항에 있어서,
    상기 질환은 최종당화산물의 축적; 또는 최종당화산물과 콜라겐의 교차결합에 의해 발병하는 질환인 것을 특징으로 하는, 최종당화산물 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  10. 삭제
  11. 제7항에 있어서,
    상기 당뇨합병증은 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 백내장, 당뇨병성 신증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부궤양, 당뇨병성 심장병, 당뇨병성 골다공증 및 당뇨병성 동맥경화증으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 최종당화산물 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 추출물은 CML(Nε-carboxymethyl lysine) 및 RAGE(receptor for advanced glycation end products)의 발현은 감소시키고, Nrf2(Nuclear factor erythroid-derived 2-related factor 2) 및 NQO1(NAD(P)H Quinone Dehydrogenase 1)의 발현은 증가시키는 것을 특징으로 하는, 최종당화산물 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  13. 삭제
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