KR101933152B1 - 석류 농축물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 석류 농축물을 유효성분으로 하는 조성물에 관한 것으로서, 전분분해효소를 처리하고 가열농축 공정을 거쳐 제조된 엘라그산 함량이 0.8 mg/g 이상, 폴리페놀 함량이 8 mg/g 이상인 석류 농축물이 히알루론산 합성 촉진 효과를 가지는 것을 특징으로 한다. 이에, 본 발명에 따르면, 피부 보습 효과가 탁월한 식품 조성물, 약학 조성물 등으로 사용할 수 있다.

Description

석류 농축물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물{Composition for improving skin condition comprising pomegranate concentrate as active ingredient}

본 발명은 천연 식물 소재를 유효성분으로 포함하는 히알루론산 합성 증가용 조성물 및 이를 포함하는 피부 보습, 주름 개선, 미백 또는 각질 개선 등 피부 개선용 조성물에 관한 것이다.

히알루론산(hyaluronic acid)은 동물 등의 피부에 많이 존재하는 생체 합성 천연 물질이다. 히알루론산(hyaluronic acid)은 히알루로난(hyaluronan)이라고 칭하기도 한다. 수산화기(-OH)가 많기 때문에 친수성 물질이며, 동물 등의 피부에서 보습 작용을 한다. 다양한 상피세포에서 발현되어 있는 CD44 단백질과 반응하여 다양한 생리적 작용을 조절한다.

한편, 피부는 외부와 항상 접하고 있는 기관으로서, 외부에서부터 순서대로 표피, 진피, 피하지방 조직의 3개 층으로 크게 구분되며, 인체를 외부의 물리적 및/또는 화학적 자극으로부터 보호해 주는 기능을 한다. 특히, 피부는 인체가 갖고 있는 약 65 - 70%의 수분, 즉 인체에 필요한 각종 생리활성물질을 운반하며 부드럽고 촉촉한 상태를 유지할 수 있도록 수분이 체외로 증발되는 것을 조절해 주는 중요한 역할을 한다.

그러나 피부는 나이가 들어감에 따라, 내적으로는 노화의 진행으로 인해 신진 대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소함과 동시에, 면역 세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되어 생체에 필요한 면역 및 생체 단백질의 생합성이 줄어들게 되며, 외적으로는 오존층 파괴로 인하여 태양 광선에 자외선의 함량이 증가하게 되고 환경 오염이 더욱 심화됨에 따라 자유 라디컬 및 유해 활성 산소 등이 증가함으로써, 피부의 기능이 저하될 뿐만 아니라 시각적인 아름다움이 감소하게 된다.

이에, 피부 개선의 유효성과 함께 안전성이 우수한 물질을 탐색하는 연구가 많이 행해지고 있으며, 해결 방안으로 화장품과 같은 외용적 방법에 의한 피부 상태 개선과 함께, 식이 섭취에 의한 피부 개선 효과를 나타내는 물질에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.

이러한 연구의 일환으로, 피부 개선 효과를 보이는 천연 식물 소재에 관한 관심이 꾸준히 증가하고 있다. 전통적으로 수백년간 사용되어 오면서 안전성이나 효과 측면에서 입증이 된 물질들이 다수이므로, 안전하고 자연 친화적이다.

이에, 피부 개선에 효과적이면서도 안전한 물질에 대한 필요성이 제기되어 오고 있다.

한국특허 등록번호 제 10-1222708 호 (등록일: 2013.01.09) 한국특허 공개번호 제 10-2008-0090808 호 (공개일: 2008.10.09)

Biosci, Biotechnol, Biochem., 69(12), 2368-2373, 2005 Exp Dermatol. 2009 June ; 18(6): 553-561

따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 히알루론산 합성에 효과적인 천연 식물 소재를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 히알루론산 합성에 효과적인 천연 식물 소재를 유효성분으로 포함하는 피부 개선, 특히 보습용 조성물 및 이를 이용하여 피부 개선, 특히 보습 효과를 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 히알루론산 합성 효과를 향상시키는 천연 식물 소재 조성물의 가공방법을 제공하는 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 일 양태로 본 발명은 석류 농축물을 유효성분으로 포함하는 히알루론산 합성 촉진용 조성물을 제공한다.

바람직하게, 상기 석류 농축물 내 엘라그산 함량이 0.8 mg/g 이상인, 더욱 바람직하게 0.8 - 3 mg/g일 수 있다.

또한, 바람직하게 상기 석류 농축물 내 폴리페놀 함량이 8 mg/g 이상인, 더욱 바람직하게 8 - 15 mg/g일 수 있다.

본 발명자들은 석류 원과에 전분분해효소를 처리한 석류 분해물을 가열농축하는 공정을 거쳐 제조되는 석류 농축물에는 히알루론산 합성을 촉진시키는 효과가 있으며, 이러한 석류 농축물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 탁월한 피부 보습 효과를 나타낸다는 놀라운 발견을 하였으며, 이러한 석류 농축물은 피부 보습 효과와 함께 피부 탄력 향상, 색소 침착 개선, 미백, 피부 당김 개선, 피부결 개선, 피부톤 밝아짐 및/또는 피부 각질 감소 등의 피부 개선에 우수한 효과를 보인다는 것을 발견하였다.

석류(Punica granatum L.)는 아시아 서남부, 인도 북서부 및 미국 캘리포니아의 자생 식물로서, 현재는 아열대 및 열대 각지에 널리 퍼져있는 식물이다. 예로부터 석류, 특히 적석류는 강장제로 알려져 왔으며, 특히 고혈압과 동맥경화 예방에 좋은 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 또한, 수용성 당질이 38 내지 47%로 다량 포함되어 있으며, 다양한 비타민과 미네랄을 포함한다.

본 발명에 따른 석류 농축물은 석류 원과에 전분분해효소를 처리한 석류 분해물을 가열농축하는 공정을 거쳐 제조되는 것을 의미하며, 바람직하게 40 - 65 ℃에서 전분분해효소를 처리할 수 있으며, 더욱 바람직하게 45 - 60 ℃에서 전분분해효소를 처리할 수 있다. 또한, 바람직하게 3회 이상 가열농축하는 단계를 거칠 수 있다. 보다 바람직하게, 3회 이상 40 - 110 ℃ 범위 내에서 가열농축하는 단계를 거칠 수 있다. 또한, 이용된 석류의 산지 및 수확 시기 등에 따라 차이가 있을 수 있으나, 최종 석류 농축물의 총 중량 g 당 엘라그산 함량이 0.8 mg 이상, 바람직하게 0.8 mg - 3 mg, 보다 바람직하게 1.8 mg - 3 mg, 보다 더 바람직하게 2.4 mg - 3 mg, 가장 바람직하게 2.7 mg - 3 mg가 될 수 있는 석류를 이용할 수 있다. 또한, 최종 석류 농축물의 총 중량 g 당 폴리페놀 함량이 8 mg 이상, 바람직하게 8 mg - 15 mg, 보다 바람직하게 11.5 mg - 13 mg, 보다 더 바람직하게 11.79 mg - 12.59 mg가 될 수 있는 석류를 이용할 수 있다. 엘라그산의 농도가 0.8 mg/g 미만 또는 폴리페놀의 농도가 8 mg/g 미만일 경우에는 히알루론산 합성 촉진 효과가 미약하며, 엘라그산의 농도가 3 mg/g 초과 또는 폴리페놀의 농도가 15 mg/g 초과하는 경우에는 조성물을 섭취하였을 때 간기능 수치인 GOT와 GPT가 정상범위에서 벗어나는 등 부작용이 발생할 우려가 있다.

상기와 같이, 히알루론산 합성 촉진능을 갖는 석류 농축물을 이용할 수 있는 이유는 후술하는 특정 제조방법, 특히, 전분분해효소의 처리방법, 석류 농축물의 농축방법, 가열온도 및 압력 등에 기인한 것이라고 추측되나, 본 발명은 이러한 사항에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 본 발명의 구체적 실시예에 따르면, 석류 원과를 압착하여 수득한 석류 주스와 비교해 석류 원과의 압착 후 전분분해효소를 처리한 후 가열농축하는 단계를 거친 석류 농축물의 경우 히알루론산 합성 촉진 효과 면에서 월등히 우수함을 알 수 있었다. 천연의 석류 원과에 존재하는 다양한 당 또는 같은 구조가 반복적으로 붙어있는 구조의 성분들이 전분분해효소 처리 및/또는 가열농축에 따른 화학적 처리 공정에 의해 비배당체로 전환되어 이들 전환된 성분들에 의한 복합 기전에 따른 효과인 것으로 추측되나, 본 발명은 이러한 사항에 한정되는 것은 아니다. 일례로, 본 발명에 따른 석류 농축물의 폴리페놀류 함량은 같은 농축배수의 석류 주스의 폴리페놀류 함량에 비해 현저히 다량 포함되어 있다.

본 발명에서의 석류는 예컨대, 이란산 석류, 터키산 석류, 미국산 석류 또는 이들의 혼합물을 이용할 수 있으며, 예컨대 터키산 석류 품종에는 Hicaznar pomegranate cv., Cekirdeksiz VI pomegranate cv., Silifke Asisi pomegranate cv., Katirbasi pomegranate cv. 또는 Lefan pomegranate cv. 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 석류 농축물을 제조하기 위해 석류 과피와 씨를 포함하지 않은 석류 과육만을 이용할 수 있다. 석류의 과피와 씨는 부작용을 초래할 수 있는바, 예컨대 석류 과피에 포함된 알칼로이드는 신체 기능을 저하시킬 수 있고, 호흡계와 근육에 영향을 미치기 때문에 중독되면 발작, 경련, 혼수 상태 등이 일어날 위험이 있다. 또한, 석류 씨 농축물 복용시 일부 사람에게는 알러지인 혀 부음 등의 부작용이 일어날 수 있다.

본 발명에 따른 석류 농축물은 다음과 같은 방법으로 제조될 수 있다. 석류 원과에 전분분해효소를 처리하는 단계 및 석류 분해물을 가열농축하는 단계를 포함하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 먼저 석류를 세척한 후, 껍질과 씨를 완전히 제거하고, 단시간 내에 살균하고, 전분분해효소를 첨가하여 석류에 포함되어 있는 전분 등 다당류를 분해한다. 그 후, 선택적으로 젤라틴, 실리콘 디옥사이드, 벤토나이트, 실리카솔(silicasol), 탄닌, 셀룰로오스 또는 칼륨 카제이네이트(casseinate) 등의 첨가제를 첨가하여 석류 농축물의 탁도, 색상, 점도 등을 조절하고, 가열농축하여 석류 농축물을 제조할 수 있다. 아울러, 추가로 각 단계 사이에 여과하는 단계를 포함할 수 있는바, 예컨대 껍질과 씨 제거하는 단계 다음 고온 살균하는 단계 전, 전분분해효소를 처리하는 단계 다음 농축 단계 전, 또는 농축 단계 다음 중 어느 하나 이상의 단계에서 여과하는 공정을 추가로 포함할 수 있다.

석류 원과에 전분분해효소를 처리 한 석류 분해물을 수득하는 공정은 보다 구체적으로 하기와 같은 단계를 포함할 수 있다:

S1) 이란산 석류, 터키산 석류, 미국산 석류 또는 이들의 혼합물에서 껍질과 씨를 제거하고 석류 과육만을 수득하는 단계

일 실시예에 따르면, 석류 껍질과 과씨를 포함하지 않은 석류 과육만을 이용한 농축물을 제공한다.

S2) 석류 과육을 살균하는 단계

석류 과육은 순차적으로 살균하는 단계를 거친다. 살균은 고온살균 또는 저온살균할 수 있으며, 단시간 (예컨대, 50 - 80초) 동안 실시하는 것이 바람직하다.

S3) 살균한 석류 과육에 전분분해효소를 처리하는 단계

살균된 석류 과육에 전분분해효소를 처리하는 단계를 거친다. 바람직하게 40 - 65 ℃에서 전분분해효소를 처리할 수 있으며, 더욱 바람직하게 45 - 60 ℃에서 전분분해효소를 처리할 수 있다. 또한, 효소처리시간은 바람직하게 60분 이내로, 거욱 바람직하게 10 - 60분간 실시할 수 있다. 이용가능한 전분분해효소로는 특별히 제한되지 않고 당업계 공지된 다양한 전분분해효소가 이용될 수 있으며, 예를 들어 펙틴아제(pectinase), 프로테인아제(proteinase), 아밀라제, 셀룰라제 등을 이용할 수 있으나, 바람직하게 펙틴아제를 이용할 수 있다.

석류 분해물을 가열농축하는 공정은 바람직하게 3회 이상 반복적으로 가열농축하며, 40 - 110 ℃ 범위 내에서 실시할 수 있다. 보다 구체적으로 하기와 같이 2가지 방식으로 가열농축할 수 있다:

S4-1) 석류 과육 분해물을 순차적으로 70 - 100 ℃ 및 400 - 850 mbar에서 가온가압하여 2회 이상 가열농축하고, 40 - 80 ℃ 및 100 - 350 mbar에서 감온감압하여 1회 이상 가열농축하는 단계에 따라 가열농축할 수 있다.

석류 과육 분해물을 순차적으로 가온가압하여 가열농축하고, 감온감압하여 가열농축하는 단계를 거친다.

바람직하게, 가온가압하여 2회 이상, 더욱 바람직하게 3회 이상 가열농축하고, 감온감압하여 1회 이상, 더욱 바람직하게 2회 이상 가열농축할 수 있고, 총 3회 이상 가열농축할 수 있다.

가온가압하여 가열농축하는 것은 온도 조건 70 - 100 ℃ 및 압력 조건 400 - 850 mbar 범위 내에서 이뤄지며, 가열농축 차수(횟수)별로 온도 및 압력을 달리하되 상기 온도 및 압력 범위 내에서 온도를 가온하고 압력을 가압하는 것이라면 제한되지 않고 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 바람직하게, 70 - 85℃ 에서 400 - 550 mbar로 1차 가열농축, 85 - 92℃에서 550 - 750 mbar로 2차 가열농축, 및 92 - 100℃에서 750 - 850 mbar에서 3차 가열농축할 수 있다. 더욱 바람직하게, 78 - 82℃ 에서 450 - 500 mbar로 1차 가열농축, 85 - 90℃에서 600 - 650 mbar로 2차 가열농축, 및 92 - 98℃에서 800 - 850 mbar에서 3차 가열농축할 수 있다.

감온감압하여 가열농축하는 것은 온도 조건 40 - 80 ℃ 및 압력 조건 100 - 350 mbar 범위 내에서 이뤄지며, 가열농축 차수(횟수)별로 온도 및 압력을 달리하되 상기 온도 및 압력 범위 내에서 온도를 감온하고 압력을 감압하는 것이라면 제한되지 않고 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 바람직하게, 60 - 80℃에서 250 - 350 mbar에서 4차 가열농축 및 40 - 60℃에서 100 - 250 mbar에서 5차 가열농축할 수 있다. 더욱 바람직하게, 65 - 72℃에서 300 - 330 mbar에서 4차 가열농축 및 45 - 55℃에서 100 - 150 mbar에서 5차 가열농축할 수 있다.

또는,

S4-2) 55 - 90℃에서 1차 가열농축, 105 - 110℃에서 2차 가열농축, 및 100 - 105℃에서 3차 가열농축할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 석류 농축물은 히알루론산 합성을 촉진시키는 효과를 갖는바, 히알루론산 합성 증가에 따른 유리한 생리적 효과를 기대할 수 있다.

이에, 일 양태로 피부 보습용 조성물을 제공할 수 있다. 보다 구체적으로, 석류 농축물을 유효성분으로 포함하는 히알루론산 합성 촉진용 조성물을 포함하는 피부 보습용 조성물을 제공할 수 있다. 또한, 일 양태로 석류 농축물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 피부에 도포하여 피부 보습을 향상시키는 방법을 제공할 수 있다.

또한, 일 양태로 석류 농축물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 분리된 세포에 인 비트로(in vitro) 처리하여 히알루론산 합성을 촉진시키는 방법을 제공할 수 있다. 또한, 일 양태로 석류 농축물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 피부에 도포하여 히알루론산 합성을 촉진시키는 방법을 제공할 수 있다.

상기 세포는 예컨대 설취류, 포유류 등을 포함하는 동물에서 유래된 세포이며, 바람직하게 인간에서 유래된 것일 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명자들은 석류 농축물은 상술한 히알루론산 합성 촉진능 외에도 MMP-1 및 엘라스타제(elastase)를 농도 의존적으로 감소시켜 주름을 개선하는 효과가 있으며, 멜라닌을 농도 의존적으로 감소시켜 미백에 우수한 효과가 있음을 확인하였다. 또한, 임상평가를 통해, 피부색, 주름, 미백 등의 전반적인 피부 개선에 탁월한 효과가 있음을 확인하였다.

이에, 본 발명에 따른 조성물은 피부 보습 외에 전반적인 피부 개선을 위해 사용될 수 있는바, 예컨대 피부 탄력 향상, 색소 침착 개선, 미백, 피부 당김 개선, 피부결 개선, 피부톤 밝아짐 및/또는 피부 각질 감소, 바람직하게 보습 외에 주름 개선, 미백 및 각질 개선으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 피부 개선 효 과를 위해 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 상술한 효과를 목적으로 하는 다양한 용도로 활용될 수 있으며, 예컨대 식품(건강기능식품 포함) 조성물, 약학 조성물 또는 화장료 조성물로 이용될 수 있다.

이에, 본 발명은 상술한 조성물을 포함하는 식품(건강기능식품 포함) 조성물, 약학 조성물 또는 화장료 조성물을 제공한다.

일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 석류 과육 농축물을 1일에 10 ㎖ 복용하는 경우에는 이의 복용 이후에도 인체의 건강 지표들(예를 들어, 적혈구 수(RBC), 혈액 요소 질소(BUN) 수치, 아스파테이트 아미노 트랜스퍼라아제(AST) 수치, 알라닌 아미노 트랜스퍼라아제(ALT) 수치, 크레아틴 수치, 글루코오스 수치, S-G 수치 등)이 모두 정상 범위 이내에 있어, 생체에 부작용이 없이 안전하게 보습을 포함한 피부 개선의 효과가 달성될 수 있다.

본 발명에 따른 식품은 1회 복용량을 개별 용기에 분별 충전하여 제공할 수 있으며, 1회 복용량으로 석류 농축물 1 ㎖ - 10 ㎖, 바람직하게 10㎖, 5 ㎖, 4㎖, 3 ㎖, 2 ㎖ 또는 1 ㎖ 중 어느 하나의 용량을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 식품은, 석류 농축물 이외에, 천연 식물 농축물, 예컨대 백작약, 산수유, 가시오가피, 영지버섯, 진피, 초두충, 당귀, 치자, 황기, 맥아, 탱자; 및 비타민C, 프락토올리고당, 스테비오사이드, 정제수, 또는 말토덱스트린 등을 본 발명의 목적으로 저해하지 않는 범위 내에서 단독으로 또는 혼합하여 더 포함할 수 있으나, 본 발명의 식품이 추가로 포함할 수 있는 다른 약효 성분 및/또는 첨가제는 상기 예들에 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 본 발명에 따른 식품은 수용성 비타민으로서 티아민(비타민B1), 리보플라빈, 아스코르브산, 니아신, 및 비타민B6를 포함할 수 있고, 지방산으로서 미리스틴산, 팔미트산, 스테아린산, 올레인산, 리놀레인산 등을 포함할 수 있으며, 약산 성분으로서는 글리콜산 및 초산을 포함할 수 있고, 아미노산으로서 트레오닌, 발린, 메티오닌, 이소루신, 루신, 페닐알라닌, 트립토판, 및 리신의 필수아미노산 8종을 비롯하여, 아스파르트산, 세린, 글루탐산, 프롤린, 글리신, 알라닌, 시스테인, 티로신, 히스티딘, 알지닌 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면, 석류 농축물을 통해 히알루론산 합성 촉진 효과를 기대할 수 있으며, 탁월한 피부 보습 효과는 물론이고 이외에도 피부 주름 개선, 미백 및 각질 제거 등에 우수한 효과를 기대할 수 있다.

도 1은 석류 농축물의 HaCaT 세포에 대한 독성 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 석류 농축물의 히알루로난 생성능 시험을 이용한 보습 효능을 평가한 결과를 나타낸 것이다. (^*P <0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.005)
도 3은 석류 농축물의 HDF-N 세포에 대한 독성 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 석류 농축물의 melan-a 세포에 대한 독성 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 프로콜라겐 합성능 시험을 이용한 주름 개선 효능을 평가한 결과를 나타낸 것이다. (^*P <0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.005)
도 6은 MMP-1 억제능 시험을 이용한 주름 개선 효능을 평가한 결과를 나타낸 것이다. (^*P <0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.005)
도 7은 엘라스타제 억제능 시험을 이용한 주름 개선 효능을 평가한 결과를 나타낸 것이다. (^*P <0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.005)
도 8은 티로시나제 억제 활성 분석을 통한 미백 효능을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 멜라닌 합성 억제능 시험을 이용한 미백 효능을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 멜라닌 합성 억제 시험을 통한 멜라닌 세포 관찰 결과를 도시한 것이다.
도 11은 시점별 눈가주름 육안평가 결과를 도시한 것이다.
도 12는 제품복용에 따른 피험자의 눈가주름 정도 변화를 도시한 것이다.
도 13은 시점별 제품복용에 따른 피부 수분량 변화를 도시한 것이다.
도 14는 시점별 제품복용에 따른 경피수분손실량 변화를 도시한 것이다.
도 15는 시점별 제품복용에 따른 피부 각질량 변화를 도시한 것이다.
도 16은 제품복용에 따른 피험자의 얼굴 및 전박 부위 피부 각질량 변화를 도시한 것이다.
도 17은 시점별 제품복용에 따른 눈가주름(레플리카)의 변화를 도시한 것이다.
도 18은 제품복용에 따른 피험자의 눈가 피부주름 정도 변화를 도시한 것이다.
도 19는 시점별 제품복용에 따른 피부탄력 파라미터들의 변화를 도시한 것이다.
도 20은 시점별 제품복용에 따른 피부색 밝기의 변화를 도시한 것이다.
도 21은 제품복용에 따른 피험자의 피부색 밝기 정도 변화를 도시한 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 제조예 > 석류 농축물의 제조

시험예 1. 가열 농축 공정을 거친 석류 농축물의 제조

(1) 12NK26의 제조

먼저 터키산 석류 1000kg 의 이물질을 제거하고, 깨진 과일을 분리 및 세척하였다. 분류한 원과를 절단하여 껍질을 제거하고, 압착하여 씨를 분리하여 석류 과육 450kg을 수득하였다. 여과 후, 100 - 105 ℃에서 60초 동안 살균하고, 48 - 55 ℃로 다시 냉각하였다. 펙틴아제를 석류 주스 1000 L 당 70~100 ml 투입하여 48 - 55 ℃에서 1시간 동안 전분분해하였다. 이후 탁도 및 색상의 유지, 복용이 유리한 점도 생성 등을 위하여 석류 주스 10000 L 당 벤토나이트 900 g을 투입하고, 48 - 55℃에서 10분간 교반하였다. 이후 1.5 mm 및 1mm 진공 여과하고, 가열 농축(순차적으로, 70 - 85℃ 에서 400 - 550 mbar로 12 brix까지, 85 - 92℃에서 550 - 750 mbar로 17brix 까지, 92 - 100℃에서 750 - 850 mbar로 31 Brix 까지, 60 - 80℃에서 250 - 350 mbar로 43 Brix 까지 그리고 40 - 60℃에서 100 - 250 mbar로 65 Brix 까지 총 5차 가열 농축)한 뒤 다시 0.15 mm 여과하여 엘라그산 1.8-3.0 mg/g 및 폴리페놀 12.59 mg/g (gallic acid 발색법에 의해 분석한 수치임)을 함유한 석류 농축물을 제조하였다. 석류 농축물의 원과 : 농축물의 중량비는 10 : 1 이였다. 상기 석류 농축물을 시료 12NK26으로 명명하였다.

(2) 12910910의 제조

먼저 이란산 석류의 이물질을 제거하고, 깨진 과일을 분리 및 세척하였다. 분류한 원과를 절단하여 껍질을 제거하고, 160bar로 압착하여 씨를 분리하였다. 이후 저온 살균하고, 펙틴아제(pectinase)를 석류 주스 6000 L 당 100-150 gr 투입하여 48-60℃에서 1시간 전분분해하였다. 이후 탁도 및 색상의 유지, 복용이 유리한 점도 생성 등을 위하여 석류 주스 6000 L 당 젤라틴 1200-1800 gr, 실리콘 디옥사이드 6000 gr, 및 석류 주스 10000 L 당 벤토나이트 14 kg을 투입하고, 50-60℃에서 30분간 교반하였다. 이후 진공 여과하고, 가열 농축(순차적으로, 55-90℃(3분), 105-110℃(90초), 및 100-105℃(90초))하여 엘라그산 0.8-1.4 mg/g 및 폴리페놀 11.79 mg/g (gallic acid 발색법에 의해 분석한 수치임)을 함유한 석류 농축물을 제조하였다. 원과 : 석류 농축물의 중량비는 5 : 1 이였다. 상기 석류 농축물을 시료 12910910으로 명명하였다.

비교예 1. 석류 주스(921217)의 제조

먼저 터키산 석류 1000kg 의 이물질을 제거하고, 깨진 과일을 분리 및 세척하였다. 분류한 원과를 절단하여 껍질을 제거하고, 압착하여 씨를 분리하여 석류 과육 450kg을 수득하였다. 여과 후, 90-94 ℃에서 20초 동안 살균하고, 15-20 ℃로 다시 냉각하여 엘라그산 함량 0.2-0.32 mg/g 및 폴리페놀 함량 0.7-1.55mg/g (gallic acid 발색법에 의해 분석한 수치임)를 함유한 석류 주스를 제조하였다. 석류 주스의 원과 : 주스의 중량비는 2 : 1 이였다. 상기 석류 주스를 시료 921217이라고 명명하였다.

< 실시예 2> 석류 농축물의 히알루로난 합성 촉진 효과 평가

1. 시험 재료

상기 시료 12NK26, 12910910, 921217의 액상 원액을 100%로 간주하고 세포 배지에 알맞은 농도로 희석하여 검액을 제조하였다. 또한, WST-1 assay를 통하여 예비실험을 진행한 후 세포독성을 나타내지 않는 농도를 설정하여 검액의 피부 관련 효능을 평가하였다. 양성 대조군 역시 세포 배양 배지로 희석하여 처리하였다.

2. 세포주 및 배양

보습 효능시험에서 사용되는 세포주는 human 각질 세포인 HaCaT cell(Human Keratinocyte, HaCaT,ATCC) 로 배양접시 바닥에 접종한 후 페니실린 (100 IU/ml), 스트렙토마이신 (10㎍/ml), 10% FBS 를 함유하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Welgene, Korea) 를 넣고 37℃를 유지하여 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다.

3. 세포 독성 시험

검액의 독성을 확인하기 위해, HaCaT cell 에서의 세포독성을 측정하였다. HaCaT cell 을 96 well plate 에 각각 5x10⁴ cells/well 로 분주한 다음 세포 배양조건에서 24 시간 배양하였다. 배양 후, 12 시간의 기아상태를 유지한 뒤, 검액 및 새로운 배지(media supplement 제외) 를 넣고, 24 시간 동안 배양하였다. 24 시간후, 세포의 생존율을 측정하기 위해 WST-1 반응액을 supplement 가 제외된 배지에 1/10 로 희석하고 이를 각 well 당 100㎕ 씩 처리하여 1 시간 동안 반응시킨 후, 450nm 에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, HaCaT 세포에 대해 시료 3 종 중 12NK26 은 0.5% 이하에서 80% 이상의 세포 생존율을 보였으며, 921217 은 1% 이하에서 80% 이상의 세포 생존율을, 그리고 12910910 은 0.5% 이하에서 80% 이상의 세포 생존율을 보였다.

4. 히알루로난 ( hyaluronan ) 합성 증가 시험

각질세포에서 히알루로난의 합성정도를 ELISA 로 측정함으로서 시료의 보습효능을 평가하였다. 이를 위해 HaCaT cell 을 플레이트에 5X10⁴cells/well 로 분주하고 24 시간 배양하였다. 24 시간 후, 시험 물질을 세포 배양 배지인 DMEM(media supplement 제외) 에 희석하여 농도별로 세포에 처리한 후 24 시간 배양하였다. 이후 배양된 세포의 배지를 수거하여 히알루로난 ELISA(R&D system, DY3614) 를 사용하여 히알루로난 양을 측정하였다. 한편, 바닥에 부착되어 있는 세포는 PBS 로 세척한 후, 1N NaOH 로 lysis 시켜 총 단백질 양을 측정하여 일정 단백질 당 히알루로난 합성 양을 계산하였다.

* 단백질 양 측정법

단백질 측정법 중 Lowry method를 기본으로 한 Bio-rad DC protein kit를 사용하여 측정하였다.

(1) cell lysate(상층액) 을 각각 5㎕씩 96-well plate 에 넣는다.

(2) protein standard 제조

1.5mg/ml 농도의 Bovine Serum Albumin(BSA, Bio-Rad, 500-0007)을 cell lysis buffer에 8 가지 농도로 희석하여 5㎕씩 96-well plate 에 넣는다.

(3) Kit 에 포함된 reagent A 와 reagent S 를 40:1 의 비율로 섞어서 각 well 에 25㎕씩 넣는다.

(4) Kit 에 포함된 reagent B 를 각각 200㎕ 씩 넣는다.

(5) 상온에서 15 분간 반응시킨 뒤 750nm 에서 흡광도를 측정한다.

(6) BSA 검량선에 따라 cell 의 총 단백질 양을 계산한다.

5. 통계

모든 자료는 mean ± SD 로 나타내었고, 통계처리는 Student's t-test 를 사용하였으며 유의확률 P<0.005, 양측검정을 사용하였다.

6. 결과

본 시험은 ELISA 를 이용하여 히알루로난 합성 양상을 측정함으로서 시료 12NK26, 921217, 129109103 종이 히알루로난 합성에 미치는 영향을 평가하고자 하였다. 이를 위해 시료를 처리한 후, 히알루로난 ELISA kit(R&D system, DY3614) 로 측정하였다. 그 결과, 12NK26 은 대조군에 비해 0.01%, 0.05%, 0.1% 농도에서 각각 179.6%, 214.4%, 305.1%의 히알루로난이 측정되었으며, 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였다. 특히, 세 농도 모두 통계적으로 유의하게 히알루로난 합성을 증가시켰다. 반면, 921217 은 0.1%, 0.5%, 1% 농도에서 대조군 대비 각각 84.0%, 98.3%, 106.2% 의 히알루로난 이 측정되었으며, 세농도 모두 통계적 유의차는 보이지 않았다. 또한, 12910910 은 대조군에 비해 0.01%, 0.05%, 0.1% 농도에서 각각 162.4%, 262.4%, 298.2% 의 히알루로난이 측정되었으며, 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였다. 특히, 세 농도 모두 통계적으로 유의하게 히알루로난 합성을 증가시켰다. 이어, 양성대조군으로 사용한 NAG 는 20mM 을 처리 시, 대조군에 비해 224.8% 의 히알루로난의 양이 생성됨을 통해 HaCaT 세포는 NAG 에 의해서 히알루로난 생합성이 촉진됨을 알 수 있었다(표 3 및 도 2 참고).

< 실시예 3> 석류 농축물의 피부 생리 활성 효과 평가

1. 시험 재료

본 시험에서 사용되는 검액은 상술한 <시험예 1>에 기재된 방법으로 제조된 석류농축물(즉, 시료 12NK26)의 액상 원액을 100%로 간주하고 세포 배지에 알맞은 농도로 희석하여 제조하였다. 또한, WST-1 assay를 통하여 예비실험을 진행한 후 세포독성을 나타내지 않는 농도를 설정하여 검액의 피부 관련 효능을 평가하였다. 양성 대조군 역시 세포 배양 배지로 희석하여 처리하였다.

이외 본 시험에서 사용한 시험 재료는 하기와 같다.

2. 세포주 및 배양

세포주는 시험항목에 따라 알맞게 선별하여 사용하였다. 주름개선 시험에서는 Human neonatal foreskin에서 유래한 Normal Human Primary Dermalfibroblasts-Neonatal(HDF-N)를 사용하였으며, 배양 접시 바닥에 접종한 후 0.1% Insulin, 0.1% rhFGF, 0.1%gentamicin, 2% FBS 를 함유하는 Fibroblast Basal Medium(FBM, lonza, CC-3131) 배지를 넣고, 37℃를 유지하여 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다.

미백 효능 평가에서 사용되는 Melan-a 세포는 C57BL/6J(black, a/a) mouse 에서 유래한 immortalized cell line 으로서(Bennett DC, Cooper PJ, Hart IR. A line of non-tumorigenic mouse melanocyte,syngeneic with the B16 melanoma and requiring a tumor promoter for growth. Int J Cancer 1987;39:414-418) Dr. Dorothy C Benette (St George's Hospital, London, UK) 로부터 제공받아 사용하였다. 세포는 RPMI 1640 medium 에 fetal bovine serum 10 %, 50 U/ml penicillin, 50 ug/ml streptomycin, 200 nM phobol 12-myristate 13-acetate(PMA) 를 첨가한 배지로 37℃, 10 % CO₂ 조건 하에서 배양하였다.

3. 세포 독성 시험

검액의 독성을 확인하기 위해, HDF-N cell 및 melan-a cell 에서의 세포독성을 측정하였다.HDF-N cell 및 melan-a cell 을 96 well plate 에 각각 6x10³ cells/well, 9x10³ cells/well 로 분주한 다음 세포 배양조건에서 24 시간 배양하였다. 배양 후, 12 시간의 기아상태를 유지한 뒤, 검액 및 새로운 배지(media supplement 또는 FBS 제외) 를 넣고, 24 시간 동안 배양하였다. 24 시간 후, 세포의 생존율을 측정하기 위해 WST-1 반응액을 supplement 가 제외된 배지에 1/10 로 희석하고 이를 각 well 당 100㎕ 씩 처리하여 1 시간 동안 반응시킨 후, 450nm 에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, HDF-N 세포에 대해 시료 석류농축액은 0.1% 이하 농도에서 80% 이상의 세포 생존율을 보였으며(표 5), melan-a 세포에 대해 0.05% 이하에서 80% 이상의 세포 생존율을 보였다(표 6).

4. 주름개선 효능 평가

4-1. 프로콜라겐 ( Procollagen ) 증가 시험

검액의 프로콜라겐 합성능을 평가하기 위해 HDF-N cell 을 48 well plate 에 1X10 4cells/well로 분주하고 세포배양 조건에서 24 시간 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고, 24 시간 세포의 기아상태를 유지하며 이 후 시험 물질을 세포 배양 배지인 FBM(media supplement 제외) 에 희석하여 농도별로 세포에 처리한 후 24 시간 배양하였다. 이후, 배양된 세포의 배지를 수거하여 procollagen typeI c-peptide(PIP) EIAkit(TAKARA, MK101)를 사용하여 프로콜라겐 양을 측정하였다. 한편, 바닥에 부착되어 있는 세포는 PBS로 세척한 후, 1N NaOH 로 lysis시켜 총 단백질 양을 측정하여 일정 단백질 당 프로콜라겐 합성 양을 계산하였다.

그 결과, 양성대조군으로 사용한 TGF-β는 10ng/ml을 처리한 결과 대조군에 비해 150.8%의 프로콜라겐의 양이 생성됨을 통해 HDF-N 세포는 TGF-β에 의해서 프로콜라겐 생합성이 촉진됨을 알 수 있었다. 한편, 시료를 0.01%, 0.05%, 0.1% 농도로 처리한 후 프로콜라겐 합성능을 평가한 결과 각각 96.3%, 53.3%, 53.0%의 procolagen 생성을 보였으며, 대조군에 비하여 통계적 유의차는 보이지 않았다(표7).

4-2. 자외선에 의한 MMP -1 발현 억제시험

본 시험을 통해 검액이 자외선에 의한 MMP-1 발현에 미치는 영향을 평가하였다. MMP-1(Matrix metaloproteinases)의 활성 정도를 immuno ELISA asay를 이용하여 측정함으로서 시료의 주름개선효능을 평가하기 위함이다. HDF-Ncell 을 24 well plate에 2X10⁴ cells/well 로 분주한 다음 세포배양 조건에서 24 시간 배양하였다. 24 시간 이후 배지를 버리고 DPBS로 세척한 다음, DPBS 200㎕ 를 첨가하여 UV-A 5J/cm²를 조사하였다. 시료를 배지에 적당한 농도로 희석한 후 세포에 처리하여 세포 배양 조건에서 24 시간 배양하였다. 이 후, 배양액을 취하여 Human total MMP-1 ELISA kit(R&D system, DY901) 로 MMP-1 양을 측정하였고, 측정된 MMP-1 양은 총 단백질 양으로 보정하였다.

그 결과, UVA 조사군은 비조사군에 비해 MMP-1 양이 240.2% 생성되었으며, 이를 통해 HDF-N세포는 UVA 5J/cm²에 의해서 MMP-1 발현이 유도됨을 알 수 있었다. 한편, HDF-N cel에 석류농축액을 0.001%, 0.005%, 0.01% 농도로 처리한 후 Human total MMP-1 ELISA kit(R&D system, DY901)로 측정한 결과, UV 비조사군에 비하여 각각 137.1%, 69.3%, 7.1%의 MMP-1 생성양을 나타내었으며, 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보였으며, UV 조사군에 비해 통계적으로 유의하게 감소하였다. 또한, 본 시험에서 사용된 양성 대조군인 retinoic acid는 UV 비조사군과 대비하여 171.6%의 MMP-1 생성양을 나타내어 UV조사군과 대비하여 통계적으로 유의하게 감소하였다.

4-3. 엘라스타제 억제 분석( Elastase inhibition assay)

본 시험은 검액의 엘라스타제 활성을 측정하기 위해 피부 fibroblast 인 HDF-N cell 을 효소 엘라스타제로 사용하였다. 이를 위해 배양된 HDF-N 세포에 0.1% triton X-100 이 함유된 0.2M Tris-HCl (pH 8.0)을 첨가한 후 초음파 분쇄기를 통하여 녹인 다음 3,000rpm 에서 20 min 동안 원심분리하여 상층액을 취한 후, 이를 정량하여 총 단백질 양으로 효소의 활성을 측정하였다.

시료의 엘라스타제 활성 측정을 위해 균질화된 섬유아세포 엘라스타제 200㎍/ml 과 0.2M Tris-HCl 완충액 및 시료를 농도별로 첨가한 후 엘라스타제 특이적인 기질인 50mM STANA 를 넣고 37℃에서 배양한 후 405nm 에서 흡광도를 측정하였다. 효능은 검액이 들어가지 않은 대조군 대비 엘라스타제 활성 억제정도를 계산하였다. 양성대조군으로는 phosphoramidon을 사용하였다.

석류농축액을 0.05%, 0.1%, 1% 농도로 반응시킨 후 405nm에서 측정한 결과, 대조군에 비하여 각각 92.3%, 89.5%, 63.6%의 엘라스타제 활성이 측정되었으며, 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보였다. 특히, 세 농도 모두 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 감소하였다. 또한, 본 시험에서 사용된 양성 대조군인 phosphoramidon은 대조군과 대비하여 74.9%의 엘라스타제 활성이 측정되었으며, 통계적으로 유의하게 감소하였다.

5. 미백 효능 평가

5-1. 티로시나제 억제 분석( Tyrosinase inhibition assay)

검액을 에탄올이나 적당한 용매에 녹여 타이로시나제 활성을 억제하기 위한 적당한 농도범위로 희석한 것을 시료액으로 하였다. 시험관에 0.1M 인산염완충액 220 ㎕ 와 시료액 20 ㎕ 그리고 머쉬룸 타이로시나제(1500U/mL~2000U/mL) 액 20 ㎕ 를 순서대로 넣고, 이 용액에 1.5 mM 타이로신 액 40 ㎕를 넣고 37℃ 에서 10~15 분 동안 반응시켰다. 그리고 이것을 ELISA reader 를 이용하여 490 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 공시료액으로 시료액 대신 0.1 M 인산염완충액(pH 6.5) 을 넣는다. 활성저해율이 50 % 일 때의시료의 농도(IC₅₀) 를 적절한 프로그램을 이용하여 산출하였다.

0.1% 농도 이하 타이로시나아제 효소 활성 억제율을 측정한 결과, 석류 농축액은 농도 0.1% 까지 타이로시나아제 효소의 활성을 억제시키지 못했다. 반면, 또한 양성대조군으로 사용한 Kojic acid의 IC₅₀ 값은 3.634ppm으로 측정되었다.

5-2. 멜라닌 합성 저해 시험

Melan-a 세포를 3X10 ⁴cells/well 이 되도록 24 well plate 에 분주한 후, 24 시간 동안 세포가 plate 에 잘 붙도록 세포배양기에 배양한 뒤, 각 well 당 다양한 농도로 희석된 검액이 들어있는 배지를 넣어주었다. 실험 시료는 농도별로 배지에 녹여 사용한다. 위와 같은 방법으로 실험 시료를 3일에 한번씩, 6 일 동안 처리하였다. 세포 내의 멜라닌은 광학 현미경(bright field microscope) 으로 확인하였다. 이후 세포는 cell lysis buffer 에 녹인 후 원심분리를 통해 상층액을 분리하여 단백질 정량하고 melanin 은 1N NaOH를 첨가하여 405nm 에서 흡광도를 측정하여 측정한 단백질 양에 대한 멜라닌 양으로 환산하였다.

그 결과, 검액을 처리하지 않은 대조군(control)에 비해 각각 95.4%, 86.3%, 67.1%의 멜라닌 합성이 측정되었고, 이는 통계적으로 유의하게 농도 의존적으로 감소하였다. 이어, 양성 대조군으로 사용한 Arbutin을 10μM 처리한 결과 농도 의존적인 멜라닌 합성 억제 효능을 나타내었다.

6. 통계

모든 자료는 mean ± SD 로 나타내었고, 통계처리는 Student's t-test 를 사용하였으며 유의확률 P<0.005, 양측검정을 사용하였다.

< 실시예 4> 석류 농축물의 피부 생리활성 효과에 대한 임상 평가

< 실시예 4-1> 실험 방법

1. 피험자 선정

건성피부이면서 눈가주름, 색소침착이 생성되기 시작하거나 이미 생성된 25세~60 세의 여성 피험자 62 명을 대상으로 시험을 진행하였다. 선정된 피험자들에게 상술한 <시험예 1>에 기재된 방법으로 제조된 석류 농축물(즉, 시료 12NK26) 함유 음료(시험제품)과 석류 농축물 미함유 음료(대조제품)을 이중 맹검 무작위로 할당하여 8주간 매일 1포씩(50 ml/포) 복용하도록 한 후 시험제품 복용 전, 복용 4주후, 8주후 각 시점에 육안평가, 피부 수분량, 피부 각질량, TEWL. 눈가주름(레플리카), 피부탄력, 피부색 밝기(L*value) 및 설문평가, 안전성 평가, 식이조사, 체중(BMI 포함) 조사를 실시하여 피부 개선 효과를 평가하였다. 또한 제품복용 전과 복용 8주후 시점에 혈액검사를 실시하였다.

석류 농축물(즉, 시료 12NK26) 함유 음료(시험제품)과 석류 농축물 미함유 음료(대조제품)에 포함된 성분 및 함량은 다음과 같다:

2. 측정 및 평가

피험자들은 block randomization 을 통해 대조제품 그룹과 시험제품 그룹으로 나누었으며, 피험자의 얼굴, 전박 좌 또는 우측을 측정부위로 정하였다. 측정부위는 얼굴은 피험자 얼굴의 눈꼬리와 코끝이 만나는 뺨 부위(수분량, 각질, TEWL, 탄력, 피부색 측정), 색소침착부위(피부색 측정), 눈가 Crow's feet 부위(주름측정)를 대상으로 하였고, 전박내측은 전박내측의 굴측 부위에서 5cm 떨어진 부위를 대상으로 하였다. 피험자들은 세안을 한 다음 공기의 이동과 직사 광선이 없으며 항온항습조건(22±2℃, 50±5%)이 유지되는 공간에서 30 분간 피부 안정을 취한 후 육안평가, 기기 측정(피부 수분량, 각질량, 경피수분손실량, 피부탄력, 피부색, 눈가주름-레플리카), 설문평가, 체중(BMI)측정, 식이조사 및 안전성 평가에 참여하도록 하였다.

3. 육안평가

육안평가는 피험자의 눈가 주름 정도를 2명의 시험자가 2005.7 식품의약품안전처 기능성화장품의 유효성 평가를 위한 가이드라인 Ⅱ에 개시된 육안 평가기준에 의거하여 0~9단계로 평가하였다. 시점별 눈꼬리 부위의 주름 상태는 안면 촬영장치(VISIA,Canfield Imaging System, USA)를 이용하여 촬영(FL mode)하였다.

Grade	Description	Grade	Description
0	피부에 주름이 없으며 피부결이 섬세하다.	5	얕은 주름이 선명해졌으나 깊은 주름은 없다.
1	피부에 잔주름이 보이기 시작한다.	6	얕은 주름이 깊은 주름으로 진행하고 있다.
2	피부에 잔주름이 약간 생성되었다.	7	깊은 주름이 약간 생성되었다.
3	잔주름이 많고 얕은 주름으로 진행하고 있다.	8	주름이 깊고 많다.
4	얕은 주름이 약간 생성되었다.	9	주름이 매우 깊고 많다.

4. 기기측정 기기측정은 제품복용 전, 복용 4 주 후, 복용 8 주 후 시점에서 각각 피험자들의 좌측 혹은 우측뺨의 피부 수분량, 경피수분손실량, 각질량, 피부탄력, 피부색 각각을 측정하였으며 좌측 혹은 우측 눈가 주름(Crow’s feet)을 측정하였다.

(1) Corneometer ® CM825 를 이용한 피부 수분량 측정

Corneometer ® CM825(Courage+ Khazaka GmbH , Germany)는 전기용량(capacitance)을 측정하는 원리로 피부 각질층 아래 30~40 ㎛의 수분량을 측정하는 기기로 Probe 에서 전류를 보내면 피부의 수분 함유량에 따른 피부의 전기 전도도에 따라 probe head 에 남아 있는 절연이온 값이 수치화(AU: arbitrary unit)되어 나타나므로, 따라서 피부에 수분함량이 많을수록 측정값은 높아진다. 본 시험에서는 정확한 측정치를 얻기 위해 평가시점 마다 시험부위(뺨, 전박내측)를 각각 3 회 반복 측정하여 그 평균값을 분석하였다.

(2) Vapometer ® 를 이용한 경피수분손실량 측정

경피수분손실은 피부로부터 발산되는 수분을 말하며 보습기능과 밀접한 관계를 가지고 있다. 건조함이 악화될 경우 TEWL값이 증가하기 때문에 보습력의 유무는TEWL측정 정도로 판단할 수 있다. 측정기기인 Vapometer ®( Delfin , Finland)는 온도와 습도 sensor가 측정 부위의 단위 면적 당 시간 경과에 따른 수분 증발량(g/㎡h)을 측정한다. 본 시험에서는 각 평가시점 마다 시험부위(뺨, 전박내측)를 측정하여 수분 증발량을 분석하였다.

(3) D- squame ®을 이용한 피부 각질량 측정

피부수분 정도를 평가하는 또 다른 지표인 각질량 측정은 D- squame ® Black Tape을 이용하여 시험부위(뺨, 전박내측)의 각질을 채취한다. 본 시험에서는 D500 D-squame®Disc Applicator로 약 5초간 225g/cm2 의 압력으로 피부에 부착한 후 떼어낸다. 채취한 각질표본은 Charm view( Moritex , Japan)로 700배 확대하여 촬영한 후 이미지 프로그램(Image-Pro®plus)을 이용하여 각질의 면적을 분석하였다.

(4) Visioline ® VL - 650 을 이용한 눈가 주름(Replica) 측정

Visioline ®, VL650 (Courage+ KhazakaGmbH , Germany)은 제작된 Replica의 주름의 깊이, 길이 등을 측정하는 장비이다. 특별한 광원이 통과되도록 제작된 표준 카트리지에 Replica를 끼우고 광원을 통과시켜 그림자 명암 영상을 CCD Camera를 이용하여 파일화 한 후 Max wrinkle depth(가장 굵은 주름의 깊이)를 분석하였다.

(5) Cutometer ® 를 이용한 피부 탄력 측정

피부탄력은 Cutometer ® MPA 580 (Courage+ Khazaka , Germany)를 사용하여 측정한다. 최근 가장 많이 사용되는 방법은 흡입강(음압)을 이용한 것으로 재현성이 높은 방법이다. Cutometer의 측정값은 0∼1 사이의 값(㎜, 비율)으로 표시된다. 본 시험에서는 각 평가시점 마다 시험부위 (빰 정면)을 3 회 측정하여 각 피라미터들(R0~R9)의 평균값을 분석하였다. 탄력 파라미터의 해석은 다음과 같은 표에 따라 실시하였다.

(6) Spectrophotometer® CM-700d 를 이용한 피부색 측정

Spectrophotometer®CM-700d는 물체색의 분광반사율을 측정하는 장비로서 tristimulus values를 측정하여 CIELAB의 표색계인 L*, a*, b*로 계산해준다. L*a*b* 표색계에서는 명도는 L*로 표시하고, 색상과 채도를 표시하는 색도는 a*, b*로 표시한다. a*, b*는 색의 방향을 표시하고 있고, a*는 적색 방향, a*는 녹색 방향, b*는 황색 방향, -b*는 청색 방향을 표시하고 있다. L*, a*, b* 수치가 중앙으로 됨에 따라 무채색을 나타내고, 반대가 되면 색도가 높아짐을 나타낸다. 본 시험에서는 시험부위(뺨정면, 색소침착 부위)를 3회 측정하고 피부색 밝아짐(L*value)의 평균값을 취하여 분석하였다.

5. 혈액분석

시험제품 복용 전과 복용 8주 후 피험자들의 혈액을 검사하여 시험제품에 의한 인체 대사에 영향을 미치지 않았음을 확인하였다.

6. 식이조사 및 체중측정

피험자들의 식습관 변화가 실험결과에 영향을 미치지 않았음을 확인하고자 시험제품 복용 전, 복용 4주 후 시점, 8주 후 시점에서 체중을 측정하고, 식이조사를 실시하여 시험기간 동안에 식습관이 평소처럼 유지되었는지를 확인하였다. 피험자들은 제공받은 식이조사 평가지에 본인이 식사량 정도를 자가평가 하도록 하고 방문 시에 가져오도록 하여 시험자는 확인 및 기록하였다.

※식이량 정도: (안먹음:0, 적음:1, 보통:2, 많음:3)

7. 설문평가

시험제품 복용 4 주 후, 복용 8 주 후에 피험자가 작성한 답변을 토대로 시험제품의 효능과 복용성에 대한 만족도를 평가하였다.

8. 안전성 평가

시험제품 복용 4 주 후, 복용 8 주 후 시험자가 피험자의 피부 상태를 관찰하고 피험자와의 질의 응답을 통해 피부상태와 전신적 상태, 제품의 자극 유무를 확인하여 기록, 평가하였다.

9. 데이터 분석

시험제품 복용 전, 복용 4 주 후, 복용 8 주 후 시점에 기기 측정값의 평균 및 표준편차 값(S.D)을 각각 구하고, 측정값의 시점별, 군간별 차이유무를 통계분석하였다. 제품복용 시점별 비교는 Paired t-test (p<0.05)에 의하고, 제품의 군간 비교는 Independent t-test (p<0.05)에 의해 분석하였으며, 통계 분석 프로그램은 SPSS® 20.0 을 사용했고, 설문조사 결과는 빈도분석 하였다.

< 실시예 4-2> 실험 결과

1. 육안평가

시점별 제품복용 전, 후 눈가주름 육안평가 분석 결과, 제품복용 전과 비교시 제품복용 8 주 후 시점에서 시험제품(B 제품)의 눈가주름의 육안평가 점수가 통계적으로 유의하게 감소(개선)하였다(p<0.05) (표 14, 도 11-12).

2. 피부 수분량

분석결과, 제품복용 4주후, 8주 후 모두 얼굴 및 전박 부위에서 대조군(A 제품)에 비해 시험군(B 제품)에서 통계적으로 유의하게 피부 수분량이 증가(개선)되었다(p<0.05) (표 15, 도 13).

3. 경피수분손실량 ( TEWL , Trans-epidermal water loss)

분석결과, 제품복용 4 주 후, 8 주 후 시점 모두 전박부위에서 A 제품(대조군)에 비해 B 제품(시험군)에서 통계적으로 유의하게 TEWL이 감소(개선)하였다(p<0.05) (표 16, 도 14).

4. 피부 각질량

분석결과, 제품복용 전과 비교시 제품복용 4주후 시점에 시험군의 얼굴부위에서, 제품복용 8주후 시점에서는 얼굴 및 전박 부위에서 피부 각질량이 통계적으로 유의하게 감소(개선)하였다(p<0.05). 피부 각질량 최대 감소율은 제품복용 8주후 시점에서 얼굴부위에서는 A제품(대조군)이 1.84%, B 제품(시험군)은 6.12% 감소율을 나타냈으며 전박부위에서는 A제품이 0.37%, B제품은 4.09%의 감소율을 나타냈다(p<0.05) (표 17).

또한, 얼굴 및 전박 부위 모두 제품복용 8주후 시점에서 A제품에 비해 B 제품에서 통계적으로 유의하게 피부 각질량이 감소(개선)하였다(p<0.05) (표 18, 도 15-16).

5. 피부 눈가주름( 레플리카 )

분석결과, 제품복용 전과 비교 시 제품복용 8 주 후에 B 제품(시험군)에서 파라미터들 중 Max wrinkle depth(최대주름깊이)가 유의하게 감소(개선)하였다(p<0.05) (표 19, 도 18).

6. 피부 탄력

분석결과, 군간비교시 파라미터들 중 R1(Ability to return to its original state)과 R4(마지막 curve 의 가장 낮은 점)는 제품복용 8 주 후 시점에서 A 제품(대조군)에 비해 B 제품(시험군)에서 통계적으로 유의하게 감소(개선)하였고, R5(Net elasticity)와 R7(biologic elasticity)는 유의하게 증가(개선)하였다. 또한 R2(gross elasticity)는 제품복용 4 주 후, 8 주 후 모든 시점에서 A 제품에 비해 B 제품에서 통계적으로 유의하게 증가(개선)하였다(p<0.05) (표 20, 도 19).

7. 피부색 밝기

제품복용 4주후 시점에 뺨 부위에서, 제품복용 8주후 시점에는 뺨, 색소침착부위 모두에서 A제품(대조군)에 비해 B제품(시험군)에서 통계적으로 유의하게 피부색 밝기값이 증가(개선)하였다(p<0.05) (표 21, 도 20-21).

8. 혈액 분석

분석결과, 군간 비교시 모든 파라미터에서 두 그룹간의 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다(p<0.05) (표 22).

9. 식이조사 및 체중조사

분석결과, 제품복용 전과 비교 시 제품복용 4 주 후, 8 주 후 시점, A 제품과 B 제품 모두에서 식이조사, 체중, BMI 지수의 유의한 차이가 없었다(p<0.05) (표 23).

10. 설문평가

시험제품 복용 4 주 후, 복용 8 주 후에 피험자가 작성한 답변을 토대로 시험제품의 효능에 대한 만족도를 평가하였다. 평가결과는 다음과 같다(표 24).

11. 안전성 평가

본 시험기간 동안 모든 피험자에게서 피부, 전신적 증상에 아무런 이상반응이 관찰되지 않았다(표 25).

Claims (11)

1. 엘라그산 0.8 - 3 mg/g 및 폴리페놀 8 - 15 mg/g을 포함하는 석류 과육 농축물을 유효성분으로 포함하는 히알루론산 합성 촉진용 조성물로서,
   상기 석류 과육 농축물은 석류 원과에 전분분해효소를 처리하는 단계를 포함하는 공정에 의하여 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 주름개선, 보습, 미백, 탄력향상 및 각질제거로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 효과를 추가로 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 식품인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 공정은 가열 농축하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 석류 원과에 전분분해효소를 처리하는 단계 및 석류 분해물을 농축하는 단계를 포함하는, 제1항에 따른 조성물의 제조방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 전분분해효소를 처리하는 단계는 40 - 65 ℃에서 60분 이내로 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제5항에 있어서 상기 농축은 가열 농축인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 가열 농축은 3회 이상 40 - 110 ℃ 범위 내에서 가열 농축하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제7항에 있어서, 상기 가열 농축은 순차적으로 70 - 100 ℃ 및 400 - 850 mbar에서 가온가압하여 2회 이상 가열 농축하고, 40 - 80 ℃ 및 100 - 350 mbar에서 감온감압하여 1회 이상 가열 농축하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제7항에 있어서, 상기 가열 농축은 70 - 85℃ 에서 400 - 550 mbar로 1차 가열 농축, 85 - 92℃에서 550 - 750 mbar로 2차 가열 농축, 92 - 100℃에서 750 - 850 mbar에서 3차 가열 농축, 60 - 80℃에서 250 - 350 mbar에서 4차 가열 농축 및 40 - 60℃에서 100 - 250 mbar에서 5차 가열 농축하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제7항에 있어서, 상기 가열 농축은 55 - 90℃에서 1차로 가열 농축, 105 - 110℃에서 2차로 가열 농축, 및 100 - 105℃에서 3차로 가열 농축하는 것을 특징으로 하는 방법.

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