KR101932847B1

KR101932847B1 - 신규한 사카로마이세스 세레비지에 knu-06 균주 및 이의 이용

Info

Publication number: KR101932847B1
Application number: KR1020170056866A
Authority: KR
Inventors: 신재호; 박영준; 박창언; 김민철; 조형우
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2017-05-04
Filing date: 2017-05-04
Publication date: 2018-12-26
Also published as: KR20180122814A

Abstract

본 발명은 신규한 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) KNU-06 균주 및 이의 이용에 관한 것으로, 구체적으로, 본 발명에 따른 사카로마이세스 세레비지에 KNU-06 균주는 식물 생장 호르몬인 옥신의 생성량이 많고 질소 고정 능력이 있으며 ACC deaminase 활성을 갖는 것으로 확인되었는바, 상기 KNU-06 균주를 이용하여 식물의 생장을 촉진시키고, 식물의 노화 및 생장저하를 방지할 수 있다. 따라서, 상기 KNU-06 균주는 친환경 비료 및/또는 농약의 제공에 이용될 수 있으며, 향후 다양한 친환경 농법으로 유용하게 이용될 것이 기대된다.

Description

신규한 사카로마이세스 세레비지에 KNU-06 균주 및 이의 이용 {Novel Saccharomyces cerevisiae KNU-06 and uses thereof}

본 발명은 신규한 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) KNU-06 균주(수탁번호 KCTC 13235BP) 및 이의 이용에 관한 것이다.

작물의 재배에 중요하게 고려되는 요인들 중 영양분 공급과 날씨 등을 포함한 환경적 요인이 있다. 특히, 불용성 영양원이 토양에 존재하게 되면 식물의 영양원 흡수가 더뎌지므로 식물의 생장이 느려지게 되고, 병원균의 침입, 환경 재해 등 다양한 요소로부터 기인하는 스트레스 역시 식물의 생장을 느리게 하는 원인이 된다. 또한, 질소는 식물의 다량원소로 알려져 있으며 필수 아미노산의 생성에 중요한 역할을 하며 질소가 부족할 경우 식물에 생리장애가 올 수 있다. 상기와 같은 외부 환경 요인에 의한 스트레스는 식물체 내에서 에틸렌 생성을 유도하며 에틸렌에 의해 식물에 노화가 야기된다. 한편, 식물생장 촉진 호르몬을 이용하여 생장을 유도함으로써 스트레스와 영양원 흡수 문제를 극복할 수 있으나 이는 간접적인 해결방법에 불과하다.

현재 사용 가능한 화학 농약 및 비료의 종류가 줄어들고 있는 실정이며, 상용화된 농업 유용 미생물은 식물 병원성 미생물에 대한 길항효과, 토양 내 무기 영양분의 가용화, 다양한 식물생장 촉진 등의 효과 등을 가지고 있으나, 향후 화학 농약 및 비료를 대체할 수 있는 미생물 제제에 대한 꾸준한 연구 개발이 필요하다. 이와 관련하여 국내 공개특허 제2015-0105546호에서는 식물생장을 촉진하는 엔테로박터 루드위지아이 SJR3 균주를 제시한 바 있다.

이에, 본 발명자들은 식물생장을 촉진하는 미생물을 분리하고, 상기 분리된 미생물에 식물생장 촉진, 식물노화 방지, 및 ACC deaminase 활성을 확인함으로써 친환경 농법 미생물로 사용될 수 있도록 하였다.

본 발명자들은 친환경적인 식물생장 촉진용 미생물 제제를 개발하고자 노력한 결과, 본 발명의 신규한 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) KNU-06 균주에 식물생장 촉진 활성, 질소 고정 활성, 및 ACC deaminase 활성이 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 식물생장 촉진효과를 갖는 세레비지에 KNU-06 균주(수탁번호 KCTC 13235BP) 및 이를 이용한 미생물 제제를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명은 상기 미생물 제제를 포함하는 식물생장 촉진용 미생물 비료 및 상기 미생물 제제를 이용한 식물생장 촉진방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 식물생장 촉진효과를 갖는 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) KNU-06 균주(수탁번호 KCTC 13235BP)을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 균주는 식물노화 방지효과를 더 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 식물생장 촉진은 옥신 생성능, 질소 고정능, 또는 ACC deaminase 활성능에 의해 달성되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 균주는 서열번호 1의 ITS 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 사카로마이세스 세레비지에 KNU-06 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 식물생장 촉진용 미생물 제제를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 미생물 제제는 식물의 노화를 방지하기 위한 용도로도 이용될 수 있는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 미생물 제제를 포함하는 식물생장 촉진용 미생물 비료를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 미생물 비료는 식물의 노화를 방지하기 위한 용도로도 이용될 수 있는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 미생물 제제를 토양, 식물, 또는 식물의 종자에 처리하는 단계를 포함하는, 식물생장 촉진방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 미생물 제제를 토양, 식물, 또는 식물의 종자에 처리하는 단계를 포함하는, 식물노화 방지방법을 제공한다.

본 발명에 따른 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) KNU-06 균주는 식물 생장 호르몬인 옥신의 생성량이 많고 질소 고정 능력이 있는 토양 미생물로써 식물의 생장을 촉진시킬 수 있으며, ACC deaminase 활성을 갖는 것으로 확인되었는바, 환경적 스트레스 하에 있는 식물의 노화 및 생장저하를 방지할 수 있다. 따라서, 상기 KNU-06 균주 및 상기 균주의 배양물을 이용한 친환경 비료 및/또는 농약을 제공할 수 있으며, 향후 상기 KNU-06 균주가 다양한 친환경 농법으로 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) KNU-06 균주의 오옥신 생성량을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 사카로마이세스 세레비지에 KNU-06 균주의 질소 고정 활성을 확인한 사진이다.
도 3은 본 발명의 사카로마이세스 세레비지에 KNU-06 균주의 ACC deaminase 활성을 확인한 사진이다.
도 4는 본 발명의 사카로마이세스 세레비지에 KNU-06 균주의 ITS 영역을 암호화 하고 있는 유전자의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 사카로마이세스 세레비지에 KNU-06 균주의 계통분류학적 모식도를 나타낸 것이다.

본 발명은 식물생장 촉진 효과를 가지는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) KNU-06 균주(수탁번호 KCTC 13235BP)를 제공한다.

상기 사카로마이세스 세레비지에 KNU-06 균주의 ITS(Internal Transcribed Spacer) 영역의 염기서열을 ITS region sequencing에서 확인하였다(도 4 및 실시예 3 참조). 상기 균주의 ITS 서열은 서열번호 1로 표시되며, 상기 염기서열이 공시 균주인 Saccharomyces cerevisiae IFO 0309와 99%의 상동성을 가지고, 양 균주간 1%의 상이성이 인정되어 신규한 균주로 판명되었다. 이에 본 발명자는 상기 수득된 신규한 균주를 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) KNU-06 균주로 명명하고, 2017년 3월 30일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 13235BP를 부여 받았다.

본 발명의 상기 KNU-06 균주는 토양시료로부터 분리 및 동정하여 얻을 수 있으며, 질산을 환원시키고, 혐기 조건하에서 포도당을 에너지원으로 사용하며, D-갈락토오스, D-라피노오스, D-글루코오스, D-말토오스, D-수크로오스 등의 탄소원을 에너지원으로 사용함을 확인하였다(표 1 참조).

한편, 식물은 생장과 발달을 조절하여 여러 환경 변화에 대처 및 적응하는 시스템을 가지고 있는데, 특히 식물의 발달 조절은 주로 외부 환경과 식물의 내재적 발달 프로그램과의 상호작용을 통해 일어나는 것으로, 다양한 식물 호르몬이 상기 상호작용에 필수적인 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. 특히 오옥신(Auxin, IAA)은 식물의 생장 및 신장에 관여하는 대표적인 식물생장 촉진 호르몬으로 알려져 있다.

이에, 본 발명의 사카로마이세스 세레비지에 KNU-06 균주가 다른 균주와 비교하였을 때 현저하게 많은 양의 오옥신을 생성하는 것을 오옥신량 측정 실험을 통해 확인하였는바(도 1 및 실시예 1-2 참조), 이는 상기 KNU-06 균주가 식물의 생장 및 신장을 촉진할 가능성이 있음을 시사한다.

한편, 질소(N)는 식물의 생장에 필수적인 원소로, 대기 중에 질소의 비율은 약 70%를 차지하지만, 식물의 경우 대기 중의 질소를 그대로 이용하지 못하므로, 식물 생존에 있어 대기 중에 질소를 토양에 고정시킬 수 있는 미생물이 필요하다. 현재 농가에서는 질소가 포함된 화학비료를 이용하여 토양에 질소를 공급하고 있으나, 이는 토양의 영양집적현상 및 환경오염의 문제가 있다. 따라서, 질소 고정능을 갖는 미생물을 이용하면 화학비료의 사용량을 줄이면서 토양의 비옥화 및 식물 생육 촉진 효과를 기대할 수 있다.

이에, 본 발명의 사카로마이세스 세레비지에 KNU-06 균주가 질소가 없는 배지에서 생존 및 생장하는 것을 관찰하여, 상기 KNU-06 균주에 질소 고정능이 있음을 확인하였는바(도 2 및 실시예 1-3 참조), 이는 상기 KNU-06 균주가 식물의 생장을 촉진하는 효과가 있음을 시사한다.

한편, 식물 호르몬의 일종인 에틸렌(ethylene)은 식물의 생장 및 신장을 조절하는 역할을 함과 동시에 식물이 환경적 스트레스에 반응하는 기작을 야기한다. 특히, 환경적 스트레스에 의한 에틸렌의 계속적인 합성은 식물의 생장을 방해하고 노화를 촉진하며, 식물체 내에 에틸렌이 과도하게 축적되는 경우 사멸을 야기하기도 한다. 따라서, 식물체 내의 에틸렌 레벨을 낮추는 것은 환경적 스트레스에 의한 식물체의 노화 및 생장저하를 막을 수 있는 방법이다. 한편, ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylate)는 에틸렌의 전구체이며, ACC deaminase에 의해 암모니아(ammonia)와 α-ketobutyrate로 분해되는데, 토양 내의 미생물 중에서는 근권에서 ACC deaminase를 합성 및 분비하여 에틸렌의 전구체인 ACC를 분해함으로써 식물의 에틸렌 합성을 방해하고, 종국적으로는 환경적 스트레스 하에 있는 식물체의 노화 및 생장저하를 방지할 수 있다. 또한, 에틸렌은 식물체가 곰팡이, 박테리아, 또는 선충 등에 감염된 경우 식물체 내에서 합성이 활성화되어 식물체의 손상 및 생장저하를 야기하는데, 이때 토양 미생물에 의해 합성 및 분비되는 ACC deaminase는 식물체의 에틸렌 합성을 방해 한다.

이에, 본 발명의 사카로마이세스 세레비지에 KNU-06 균주가 ACC deaminase 활성을 갖는 것을 ACC deaminase assay 실험을 통해 확인하였는 바(도 3 및 실시예 1-4 참조), 이는 상기 KNU-06 균주가 환경적 스트레스 하에 있는 식물체의 노화 및 생장저하를 방지하는 효과가 있음을 시사한다.

따라서, 상기 KNU-06 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 및 상기 배양물의 건조물은 식물생장 촉진용, 식물노화 방지용, 또는 식물손상 예방용 미생물 제제에 이용될 수 있으며, 상기 미생물 제제를 처리함으로써, 식물생장을 촉진하는 방법, 식물노화를 방지하는 방법, 또는 식물손상을 예방하는 방법을 제공할 수 있는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 미생물 제제는 그 사용 목적에 부합하게 미생물 비료 및/또는 농약의 유효성분으로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기에 따라, 본 발명은 사카로마이세스 세레비지에 KNU-06 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 식물생장 촉진용 미생물 제제를 제공할 수 있는 것이고, 상기 미생물 제제를 처리함으로써, 식물생장을 촉진하는 방법을 제공할 수 있는 것이다. 상기 미생물 제제는 그 사용 목적에 부합하게 미생물 비료의 유효성분으로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 배양물은 균주를 배양한 보통한천배지(또는 영양한천배지; Nutrient agar), TSA(tryptic soy agar) 배지, 또는 YPD(Yeast peptone dextrose agar) 배지로부터 분리하여 얻을 수 있고, 바람직하게는 YPD 배지로부터 분리하여 얻을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 미생물 제제는 통상적인 방법으로 식물생장 촉진용, 식물노화 방지용, 또는 식물손상 예방용으로 제형화할 수 있으며 건조분말 형태 또는 액상형태로 제조할 수 있는 것이다. 구체적으로, 본 발명에 의한 미생물 제제 조성물은 액상 비료 형태로 제조될 수 있으며, 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다. 바람직하게는 화학비료를 대체하기 위한 식물생장 촉진 생물비료로 제형화 할 수 있고, 즉 화학비료 공급이 제한된 친환경 유기농업에서 이를 극복하기 위한 생물비료로 제형화가 가능하다.

상기 미생물 제제는 상기 KNU-06 균주 또는 이의 배양물에 첨가제, 증량제, 영양제 등의 부가제를 첨가하여 제조할 수 있다. 이때, 첨가제로는 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 100, 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있고, 증량제 및 영양제로는 skim milk(배지), 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 벤토나이트(bentonite), 덱스트린, 포도당, 전분, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용하며, 붕해제로는 벤토나이트(bentonite), 탈크(talc), 다이아라이트(dialite), 카올린(kaolin), 및 칼슘 카보네이트(calcium carbonate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 미생물 제제를 토양 또는 식물에 처리함으로써 식물의 생장을 촉진하는 방법을 제공한다. 이때, 처리방법에는 일반적으로 행하고 있는 방법, 즉 살포(예를 들면 분무, 미스팅, 아토마이징, 분말 살포, 과립 살포, 수면시용, 상시용 등), 토양시용(예를 들면 혼입, 관주 등), 표면시용(예를 들면 도포, 도말법, 피복 등), 침지, 독이, 훈연 시용 등에 의해 행할 수 있으며, 그 사용량은 그 제형, 피해상황, 적용방법, 적용장소 등에 따라 적절히 결정할 수 있다.

상기 방법에 따라 처리되는 미생물 제제에 함유된 미생물의 유효량은 경작지 면적(㎡) 당 1 내지 1×10¹⁰⁰의 미생물 수로 포함될 수 있다. 또한, 상기 방법 중 살포에 의해 처리되는 미생물 제제에 함유된 미생물의 유효량은 ㎖당 1 내지 1×10¹⁰⁰의 미생물 농도로 포함될 수 있으며, 침지에 의해 처리되는 미생물 제제에 함유된 미생물의 유효량은 ㎖당 1 내지 1×10¹⁰⁰의 미생물 농도로 포함될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 사카로마이세스 세레비지에 ( Saccharomyces cerevisiae ) KNU -06 균주의 분리 및 동정

1-1. 토양으로부터 사카로마이세스 세레비지에 KNU-06 균주의 분리 및 동정

식물 생장 촉진제로써 활용 가능한 미생물을 분리하기 위해 품질이 좋은 것으로 알려진 사과 농장의 근권으로부터 토양시료를 수집하였다. 토양으로부터 미생물의 분리는 상기 수집된 토양시료 1 g을 0.85% NaCl 용액 9 mL에 넣어 충분히 교반 하고, 9 mL의 새로운 0.85% NaCl 용액을 이용하여 단계별 희석을 실시하였다. 희석의 각 단계에서 100 μL를 덜어 내어 YPD (yease peptone dextrose) agar 배지에 도말하였다. 상기 배지에서 단일 콜로니로 자란 미생물들을 외형을 이용한 형태학적 분류방법을 이용하여 분리하였고, 분리된 미생물을 이용하여 식물생장 촉진제로써의 활성을 평가하여 최종 분리균주를 선정하였다. 최종 분리된 균주는 ITS gene 영역을 증폭하여 염기서열을 분석하여 동정하였다.

1-2. 식물생장 촉진 호르몬 생성량 측정

오옥신 생성을 확인하기 위해 상기 최종 분리균주를 3 mg/mL의 L-Tryptophan이 포함된 5 mL의 YPD broth 배지에 접종한 다음 동일한 배양 조건에서 16시간 동안 배양하였다. 이 중 1 mL을 회수하여 12,000 rpm에서 5분간 원심분리 하고 상등액을 0.20 μm membrane filter로 여과하여 배양 상등액을 준비하였다. 상기 배양 상등액 500 μL를 test tube에 옮기고 1 mL의 salkowski regent와 혼합한 후 30분 동안 암조건에서 반응한 후 535 nm에서 흡광도를 측정하였다. 오옥신의 정량은 IAA 표준폼 (Sigma Aldrich, Germany)을 이용하여 제조한 검량곡선에 대입하여 계산되었다. 대조군으로 식물생장 호르몬을 생성하는 것으로 확인되었지만 동정이 완료 되지 않은 분리균주를 SF1, SE-CAS-1, Barley-1, SE-U-1, SE-LB-2, 및 SE-CAS-6로 분류하여 사용하였다.

그 결과, 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 최종 분리균주인 KNU-06 균주의 오옥신 생성량이 대조군으로 사용된 다른 분리균주들의 오옥신 생성량보다 월등히 높았다.

1-3. 질소 고정능력 측정

질소 고정능력을 확인하기 위해 상기 최종 분리균주를 YPD agar 배지에 획선도말 하고 동일한 배양조건에서 배양하여 단일 콜로니를 분리하였다. 상기 분리된 단일 콜로니를 질소원이 첨가되지 않은 nitrogen fixation agar (Sucrose 6 g, MgSO₄ _·7H₂O 0.2 g, Na₂HPO₄ 13.9 g, KH₂PO₄ 1.7 g, NaCl 2 g, FeCl₃ _·6H₂O 8 mg, Na₂MoO₄ _·2H₂O 3 mg, Thiamin 1 mg, Agar 15 g)에 멸균된 이쑤시개를 이용하여 획선도말을 실시하였고, 생육 여부를 기준으로 하여 질소 고정능을 확인하였다. 대조군으로는 질소 고정능이 없는 Lactobacillus sp.를 사용하였다.

그 결과, 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군과 달리 최종 분리균주인 KNU-06 균주가 질소 영양원이 없는 nitrogen fixation agar 배지에서도 생육하였는바, 최종 분리균주인 KNU-06 균주에 대기 중의 질소를 질소원으로 사용하는 질소 고정능력이 있는 것으로 판단된다.

1-4. ACC deaminase 활성 측정

ACC deaminase 활성 확인을 위해 상기 최종 분리균주를 YPD broth 배지에 접종하고 동일한 배양조건에서 배양하여 배양액을 획득하였다. 상기 획득된 배양액을 원심분리를 하여 배양 상등액을 회수하고 ACC deaminase 활성을 확인하였다. 구체적으로, 상기 배양 상등액과 ACC deaminase 반응 후 닌하이드린(ninhydrin) 발색시약을 첨가하였다. ACC deaminase에 의해 식물의 노화를 유발하는 에틸렌의 전구체인 ACC가 분해되어 나오는 암모니아가 닌하이드린 시약과 반응하여 보라색이 나타나므로, 보라색 발색이 일어나는 것을 기준으로 하여 ACC deaminase 활성 유무를 판단하였다. 대조군으로는 ACC deaminase 활성이 없는 대장균(E. coli) DH5α를 사용하였다.

그 결과, 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군으로 사용된 대장균 DH5α가 보라색을 띠지 않은 반면 상기 KNU-06 균주는 보라색을 띠는 바, 최종 분리균주인 KNU-06 균주에 ACC deaminase 활성이 있는 것으로 확인되었다.

실시예 2. 사카로마이세스 세레비지에 KNU-06 균주의 당 대사 특성 확인

사카로마이세스 세레비지에 KNU-06 균주의 당 대사 특성을 확인하기 위하여, 상기 KNU-06 균주의 당 대사능을 API 20 C 키트(Bio Merioux사)를 이용하여 공급회사의 실험방법에 따라 실험하였으며, 30℃ 배양기에서 48시간 동안 배양한 후 비교하였다. API 20 C 키트의 색깔 변화 및 균주 생육에 따른 혼탁도를 이용하여 결과를 작성하였고, 이의 결과를 표 1에 나타내었다.

하기 표 1에 나타낸 바와 같이 본 발명의 사카로마이세스 세레비지에 KNU-06 균주는 D-갈락토오스, D-라피노오스, D-글루코오스, D-말토오스, D-수크로오스를 에너지원으로 사용함을 확인하였다.

유효성분	결과	유효성분	결과
D-갈락토오스	+	D-만니톨	-
D-라피노오스	+	D-글루코오스	+
D-아라비노오스	-	D-멜리비오스	-
D-말토오스	+	글리세롤	-
D-자일로오스	-	D-수크로오스	+
D-프룩토오스	-	L-아라비노오스	-

실시예 3. 사카로마이세스 세레비지에 KNU -06 균주의 ITS 염기서열 및 그 계통 확인

식물 생장 촉진, 질소 고정 능력, 및 식물 노화 방지 활성이 우수한 균주의 동정을 위하여 회수한 균체로부터 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출한 후(Thompson, 1980), 추출된 유전체 DNA를 주형으로 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)에 의하여 ITS gene을 증폭하였다. 이 때 다용도 프라이머(universal primer)는 ITS1(5'-CGGGATCCTCCGTAGGTGAACCTGCG-3')와 ITS4(5'-CCCAAGCTTTCCGCTTATTGATATGC-3')을 각각 사용하였다(Lane 1991). 증폭한 PCR 산물은 PCR 정제 시스템(Solgent, Daejeon, Korea)을 이용하여 정제하였다. 정제한 PCR 산물의 전체 염기서열을 분석하기 위한 염기서열분석(sequencing)은 솔젠트(Solgent, Daejeon, Korea)에 의뢰하여 실시하였다.

분석한 염기서열 결과는 NCBI의 BLASTN을 이용하여 비교하였으며, 그 결과는 도 4에 나타내었다. 또한, 상기 KNU-06 균주의 염기서열의 상동성 및 계통발생학적 모식도(phylogenetic tree)는 Bioedit와 Mega6 프로그램을 통해 인접결합방법(neighbor-joining methods)을 사용하여 분석하였고, 이의 결과를 도 5에 나타내었다.

분리된 최종 균주는 기존에 보고된 공시 균주인 Saccharomyces cerevisiae IFO 0309와 99%의 상동성을 가지는 것으로 확인되었다. 상기 최종 분리균주는 공시 균주인 Saccharomyces cerevisiae IFO 0309과 1% 상이하기 때문에, 세레비지에 종에 속하는 신규한 균주로 인정받아, 이를 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) KNU-06으로 명명하고, 상기 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 13235BP). 또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 사카로마이세스 세레비지에 KNU-06 균주의 ITS 영역의 염기서열을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

한국생명공학연구원

KCTC13235BP

20170330

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel Saccharomyces cerevisiae KNU-06 and uses thereof <130> MP17-087 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 594 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae KNU-06 ITS region <400> 1 aagaaattta ataattttga aaatggattt tttgttttgg caagagcatg agagctttta 60 ctgggcaaga agacaagaga tggagagtcc agccgggcct gcgcttaagt gcgcggtctt 120 gctaggcttg taagtttctt tcttgctatt ccaaactgtg agagatttct gtgcttttgt 180 tataggacaa ttaaaaccgt ttcaatacaa cacactgtgg agttttcata tctttgcaac 240 tttttctttg ggcattcgag caatcggggc ccagaggtaa caaacacaaa caattttatt 300 tattcattaa atttttgtca aaaacaagaa ttttcgtaac tggaaatttt aaaatattaa 360 ccttctcaaa cattctgttt ggtagtgagt gatactcttt ggagttaact tgaaattgct 420 ggccttttca ttggatgttt ttttttccaa agagaggttt ctctgcgtgc ttgaggtata 480 atgcaagtac ggtcgtttta ggttttacca actgcggcta atctttttta tactgagcgt 540 attggaacgt tatcgataag aagagagcgt ctaggcgaac aatgttctta aagt 594

Claims

식물노화 방지 및 식물생장 촉진 효과를 동시에 갖는 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) KNU-06 균주(수탁번호 KCTC 13235BP).
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제 1 항에 있어서,
상기 식물노화 방지 및 식물생장 촉진은 옥신 생성능, 질소 고정능, 및 ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylate) 탈아미노효소(deaminase) 활성능에 의해 달성되는 것을 특징으로 하는, 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) KNU-06 균주.
제 1 항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 1의 ITS(Internal Transcribed Spacer Region) 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) KNU-06 균주.
제 1 항의 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) KNU-06 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 식물노화 방지 및 식물생장 촉진용 미생물 제제.
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제 5 항의 미생물 제제를 포함하는, 식물노화 방지 및 식물생장 촉진용 미생물 비료.
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제 5 항의 미생물 제제를 토양, 식물, 또는 식물의 종자에 처리하는 단계를 포함하는, 식물노화 방지 및 식물생장 촉진방법.
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