KR101919364B1 - 결핵균 ＣｌｐＣ１ 결합용 펩타이드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 결핵균의 단백질 항상성에 중요한 역할을 하는 효소인 ClpC1의 활성을 증가시키는 구형 펩타이드에 관한 것으로, 상기 구형 펩타이드의 ClpC1의 ATPase 활성 효과 및 ClpP1/P2 저해 효과를 확인함으로써 펩타이드의 결핵 예방 또는 치료용 의약품, 의약외품, 동물 사료, 동물 의약품 등의 용도에 관한 것이다.

Description

결핵균 ＣｌｐＣ１ 결합용 펩타이드{Cyclic peptides for activation of Mycobacterium tuberculosis Caseinolytic protease C1}

본 발명은 결핵균 ClpC1 결합용 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

결핵은 결핵 병원체인 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, MTB)에 의해 발병되는 병으로, 그 흔적이 발견된 이래 인류역사상 가장 많은 생명을 앗아간 감염질환으로 알려져 있으며, 현재도 매년 세계 여러 지역에 대략 2백만명 정도의 사상자를 발생시키는 심각한 질병이다.

항결핵제 개발은 1940년대 스트렙토마이신을 시작으로 아이나(아이소니아지드), 리팜피신, 에탐부톨 등 스트렙토마이신 보다 더 강력한 결핵약이 속속 등장하였고 이로 인해 인류 최대의 질병 결핵을 퇴치하는 듯하였다. 그러나 1980년대 ‘다제내성 결핵(Multi drug resistance(MDR)-TB)'의 발생과 함께 기존의 항생제로 통제할 수 없는 내성 균주의 등장으로 인하여 새로운 항생제의 개발을 요구하고 있다. 현재 내성 결핵균에 대한 대처는 기존 치료제의 복합적인 사용을 통해 임상 치료 효과를 증진시키는 방향으로 집중되어 있을 뿐 새로운 치료제 개발은 미미하며 따라서 새로운 항생제의 개발은 현재 의약시장의 가장 큰 부분을 차지하고 있다.

다제내성 결핵균의 효과적인 치료를 위한 새로운 항생제의 타겟으로서 ClpC1은 결핵균 내 단백질 항상성 유지에 중요 역할을 하는 효소로서 Heat Shock Protein 100 family (HSP 100)에 속한다. 사람이나 포유류의 경우 ClpC1을 가지고 있지 않으며, 다른 종류의 Charperone을 이용 단백질의 항상성을 유지한다. 이러한 특징으로 인해 ClpC1을 타겟으로 하는 결핵 치료제는 동물 내에서 적은 부작용을 가질 것으로 보고되고 있다. 또한, 이를 타겟으로 하는 저해제의 경우 균 내의 단백질 불균형 및 단백질의 침전 등의 효과 등을 유발하여 균의 효과적 저해를 보일 수 있다. 이런 특징은 ClpC1이 항결핵제 개발의 표적효소로서 다른 효소와 구별이 되는 중요한 역할을 한다.

현재 결핵을 치료하는 1차 치료제로 아이소니아지드(isoniazid), 리팜피신(rifampin)이 가장 강력한 치료제로 사용되고 있고, 이에 내성이 생기면 2차 항 결핵제로 카나마이신(kanamycin), 아미카신(amikacin) 등을 사용하고 있다.

아이소니코티닐하이드라진(isonicotinyl hydrazine) 또는 아이나(INAH)라고도 불리는 결핵 치료제 아이소니아지드는 결핵약 중 가장 효과 있고 내성이 생기지 않는 것으로 알려져 있으며 보통 1차 치료제로써 스트렙토마이신·파스와 겸용한다. 아이나는 결핵균에서 생성되는 KatG 라는 효소에 의해 활성을 가지는 프로드러그로 NADH(Nicotinamide adenine dinucleotide)와 결합함으로써 활성을 가지게 되며, 활성을 가지게 된 아이나는 결핵균의 세포벽을 이루는 Mycolic acid의 생합성을 저해함으로 결핵균을 저해한다. 불안·불면·근육통 등과 같은 다소의 부작용이 있으나 심하지는 않으며 안테베인·이스코틴·다이아지드·나이아지드·하이코지드 등의 제품 등으로 상용화 되어 있다.

리팜피신은 방선균(Streptomyces mediterranei)이 생산하는 나프토히드로퀴논을 포함하는 안사마이신(ansamycin)계 항생물질 리파마이신 SV(rifamycin SV)의 유도체로 결핵균에 대한 강력한 항균작용을 나타낸다. 이 결핵 치료제는 세균의 RNA중합효소와 같은 몰 비율로 결합하여 RNA 합성 개시를 저해하지만, 동물의 RNA중합효소에는 거의 작용하지 않는다.

이러한 기존 치료제는 18-24개월의 장기 복용이라는 문제점과 이미 내성을 지닌 결핵균에는 약효가 떨어진다는 문제가 제기되고 있다.

이렇게 항생제의 계속적인 사용으로 인해 항생제 저항성을 가지는 새로운 내성균주가 발생하고 있으며 그로 인한 기존 항생제의 치료효과가 급감하고 있는 상황이다.

세계 여러 국가에서 이러한 문제점을 극복하기 위해 새로운 저해 목표를 가지는 결핵치료제를 개발하기 위한 연구를 지속적으로 하고 있는 실정이며 이러한 연구를 통한 여러 물질들의 개발이 이루어지고 있는 상황이지만 이러한 물질들의 사용 효과와 부작용 등의 문제에 대하여 확실하지 않은 상황으로 결핵치료제로서 실용화가 되는 물질은 극히 드물다.

따라서, 이러한 문제점을 극복하고자 다제내성 및 광범위내성 결핵균의 치료를 위한 새로운 화합물을 발굴하여 기존의 내성을 지닌 약제를 대체할 수 있는 치료제 개발이 시급하다. 결핵균 내 단백질 항상성에 중요한 역할을 하는 효소인 ClpC1을 타겟으로 하는 저해제는 기존 항생제의 내성 문제와 부작용 문제를 우회할 수 있는 물질로서 각광을 받고 있다.

Antimicrob. Agents Chemother. Feb 2015, Vol.59, No.2, pp880-889 Chem&Bio., Vol. 21, Issue 4, pp509-518, 2014

이에, 본 발명자들은 결핵균에 대한 저항성을 가지고 있는 기존 치료제에 대하여 대체 가능한 새로운 저해제를 발굴하기 위하여 연구 노력한 결과, 표적물질인 결핵균 ClpC1을 타겟으로 하여 ATPase 활성을 촉진하며, ClpP1/P2의 활성을 저해하여 결핵균의 저해를 보이는 새로운 작용기전의 치료 후보 물질로 선별함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) ClpC1 결합용 구형 펩타이드 및 이를 이용한 결핵 예방 또는 치료용 의약품, 의약외품, 동물 사료 및 동물 의약품을 제공하는데 목적이 있다.

본 발명은 결핵균의 단백질 항상성에 중요한 역할을 하는 효소인 ClpC1(Caseinolytic protease C1)의 활성을 증가시키는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) ClpC1 결합용 구형 펩타이드에 관한 것이다.

상기 결핵균 ClpC1 결합용 구형 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 펩타이드(CBP1), 서열번호 2로 표시되는 펩타이드(CBP2)이다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 두 펩타이드의 ClpC1의 ATPase 활성 효과 및 ClpP1/P2 저해 효과를 확인하였다.

본 발명에서 발굴한 상기 두 가지 펩타이드의 구조는 기존 ClpC1을 타겟으로 하는 물질인 Cyclomarine A, Lassomycin, Ecumicin과는 다른 서열을 가지며, 구조적으로도 다른 구조를 토대로 되어있어 기존 저해제와 다른 약동학 및 약리학적 특성을 가질 것으로 보이며 결핵균 치료제로서 보고되어 있지 않은 구조로 그 희소가치 또한 클 것이다. 결핵균 ClpC1에 대한 강한 ATPase 촉진 효과를 보이는 새로운 구조의 펩타이드를 개발함으로써 다제내성 및 광범위내성 결핵의 치료 가능성이 기대된다.

특히, CBP1과 CBP2 펩타이드는 본 발명의 실시예 3에 따른 활성 검사 방법에 의해 ATPase활성 촉진 효과를 나타내었으며, 구체적으로 CBP1은 Arg8 잔기와 수소결합을 보였으며, Leu47, Leu141, Ser143, Tyr145잔기와 소수성 결합을 나타냈다. CBP2의 경우 Asn26, Gln122 잔기와 수소결합을 나타내었으며, His25, Tyr27, His32, Iso67, Thr81, Arg83, Val119 잔기와 소수성 결합을 통해 ClpC1과 결합을 하고 있는 것을 확인하였다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 펩타이드는 결핵균 ClpC1에 대한 강한 ATPase 촉진 효과를 보이고, 동물 세포에 대한 독성도 없어 큰 부작용 없이 결핵균 감염에 의한 결핵 발병을 예방 또는 치료할 수 있다.

아울러, 기존 ClpC1을 타겟으로 하는 물질에 비해 펩타이드가 짧은 서열로 이루어져 있어 합성이 용이할 뿐만 아니라, 에쿠마이신은 불용성인데 반해, 본 발명의 펩타이드는 용해성을 가지므로 약동학에 유리한 효과를 가질 수 있다.

하나의 양태로서, 본 발명은 결핵균 ClpC1 결합용 구형 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 결핵 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "결핵(tuberculosis)"은 결핵균 감염 환자로부터 호흡기를 통해 나온 미세한 침방울 혹은 비말에 의해 직접 감염되며 그 정의상 결핵균에 의한 감염 때문에 발생하는 질환이다. 현재, 결핵균은 공기를 통해서 감염되기 때문에 폐 조직에서 결핵이 잘 생긴다. 따라서 보통 결핵이라고 하면 폐결핵을 의미하지만 결핵균은 폐 외에도 흉막, 림프선, 척추, 뇌, 신경, 신장, 위장관, 뼈 등 대부분의 조직이나 장기에도 침입해 증상을 일으킬 수 있다.

결핵균에 감염된 장기에 따라 고관절결핵, 골결핵, 골반결핵 같은 골관절 결핵과 고환결핵, 방광결핵, 신장결핵 같은 비뇨 생식계 결핵, 장결핵 같은 소화기계 결핵과 결핵성 뇌막염 같은 중추신경계 결핵 등의 다양한 감염질환으로 나뉠 수 있다. 결핵균은 숙주의 몸속 영양분을 이용해 천천히 증식하며 결핵에 걸리면 기운이 없고 쉽게 피로를 느끼며 체중이 감소하는 등의 증상이 주로 나타난다. 또한 결핵균에 감염된 장기에 따라서 증상이 다르게 나타나는데 폐결핵의 경우에는 기침과 가래, 흉통 등의 증상이 생기며 비뇨 생식계 결핵에서는 빈뇨, 배뇨곤란, 혈뇨 등이 나타나고 골관절 결핵에서는 해당 부위 뼈에 통증이 유발되며 림프선 결핵이면 전신, 특히 목 위나 겨드랑이의 림프절이 커지면서 통증과 압박감이 유발된다. 또한 척추 결핵의 경우 허리통증을, 중추신경계 결핵에서는 두통과 구토 등의 증상이 나타난다. 사람의 몸이 결핵균에 감염되면 면역세포와의 염증반응에 의해 아주 느린 속도로 몸의 정상조직을 파괴시키며 치즈 같은 형태의 고름이 형성되고 그 주위에 육아종(Granuloma, 덩어리로 된 혹)이 발생하게 된다.

본 발명의 약학적 조성물로 예방 또는 치료가 가능한 결핵은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 폐결핵일 수 있으며, 보다 바람직하게는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 의하여 발생하는 감염성 결핵일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "결핵균(mycobacterium tuberculosis)"는 다제내성 결핵균(Multi drug resistance tuberculosis, MDR-TB) 또는 광범위내성 결핵균(extensively drug resistant tuberculosis, XDR-TB)일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 상기 조성물의 섭취 또는 투여로 상기 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며 "치료"는 상기 조성물의 섭취 또는 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란 상기 조성물을 섭취 또는 투여함으로서 상기 질환의 발병 또는 증상을 완화시키거나 결핵균의 성장 및 분열증식을 억제 또는 감소시키는 효과를 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 다음과 같다.

본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 덱스트로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트 및 광물유를 들 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 아미노산제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 에멀젼, 멸균된 수용액, 비수성용제, 동결건조제제 및 좌제, 에어로졸로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 성인 기준으로 0.0001-100 mg/kg(체중)일 수 있으나, 그 투여용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간의 간격으로 수회 투여할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 결핵균 ClpC1 결합용 구형 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 결핵균의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다. 상기 사료 조성물은 바람직하게는 결핵균에 대한 항균 효과를 가짐으로써 달성되는 것일 수 있으며, 이에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 조성물을 사료 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 사료 성분과 함께 혼합하여 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용목적에 따라 적합하게 결정될 수 있으며 본 발명의 조성물은 혼합량에 큰 제한은 없다.

본 발명의 사료의 종류에는 특별한 제한은 없으며 상기 조성물은 보조 성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항산화, 미생물 제제 등과 같은 각종 보조제 및 분쇄 또는 파쇄된 밀, 보리, 옥수수 등의 식물성 단백질사료, 혈분, 육분, 생선분 등의 동물성 단백질 사료, 동물성 지방 및 식물성 지방과 같은 주성분 이외에도 영양 보충제, 성장 촉진제, 소화 흡수 촉진제, 질병 예방제와 함께 사용될 수 있다. 상기 사료의 투여 형태, 방법 및 제형은 다양하게 할 수 있으며, 이는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 사료 조성물은 포유류, 가금류, 어류 및 갑각류를 포함하는 다수의 동물식이 즉, 사료에 적용할 수 있다. 상업용 가축으로 중요한 소, 돼지, 말, 사슴, 염소 등의 가축을 포함하는 포유류, 코끼리, 낙타, 기린, 원숭이 등의 동물원 동물, 개, 고양이 등의 애완동물에게 사용할 수 있으며, 닭, 오리, 거위, 비둘기 등의 가금류 및 붕어, 잉어, 송어, 숭어, 새우와 같은 상업적으로 사육되는 어류 및 갑각류에 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 결핵균 ClpC1 결합용 구형 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 결핵의 치료, 개선 또는 예방용 동물의약품 조성물에 관한 것이다. 즉, 본 발명의 조성물은 결핵의 치료, 개선 또는 예방을 목적으로 동물의약품 조성물로 사용될 수 있다.

상기 조성물은 바람직하게는 결핵균에 대한 항균효과를 가짐으로써 달성되는 것일 수 있으며, 이에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 조성물을 동물의약품 조성물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 사용하거나 다른 의약품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있으며 이에 제한되는 것은 아니다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강, 개선 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

또한, 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 결핵균 ClpC1 결합용 구형 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 결핵의 개선 또는 예방용 의약외품 조성물에 관한 것이다. 즉, 본 발명의 조성물은 결핵의 개선 또는 예방을 위한 의약외품 조성물에 첨가될 수 있다.

상기 조성물은 바람직하게는 항결핵 효과를 가짐으로써 달성되는 것일 수 있으며, 이에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있으며 이에 제한되는 것은 아니다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강, 또는 개선)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 본 발명의 의약외품 조성물의 종류에는 제한은 없으나 바람직하게는 소독 청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 스프레이, 핸드워시, 연고제, 도포제, 크림제, 가습기 충진제, 코팅제, 위생패드, 생리대, 밴드, 또는 마스크의 제조에 사용될 수 있다.

본 발명은 기존의 결핵치료제로 사용되는 항생제의 저항성 및 부작용 발생 등과 같은 문제점을 극복할 수 있는 신개념 결핵치료제 물질로서의 신규한 구형 펩타이드 서열을 제공한다. 결핵균 ClpC1을 타겟으로 함으로써, 즉 ClpC1에 결합되어 ATPase 활성을 촉진시키고, ClpP1/P2 complex의 활성을 저해시키는 신규 펩타이드 서열은 기존 타겟과는 다른 새로운 타겟에 영향을 미치는 물질로서 Chaperone의 일종인 ClpC1에 영향을 미치므로 결핵균 내 단백질 항상성의 파괴를 유발함으로 결핵균을 사멸시킬 수 있다. 이러한 신규 펩타이드는 현재 상용화된 저해제에 대한 내성을 가지는 결핵균의 생장을 저해할 수 있는 치료제로서의 가능성을 제시할 수 있다.

도 1은 친화성 크로마토그래피를 통해 얻은 단백질의 12% SDS-PAGE 전기영동 확인한 것이다[M: Protein marker, BI: ClpC1 발현 전 E.coli, AI: ClpC1 발현 후 E.coli, BB: Ni resin 결합 전 lysate, AB: Ni resin 결합 후 lysate, 1~14: 크로마토그래피 프랙션. 93.5 kDa의 크기를 가지는 결핵균 ClpC1 발현 및 정제를 확인 후 3번 프랙션부터 취하여 결핵균 ClpC1을 확보함].
도 2는 결핵균 ClpC1 단백질과 결합하는 페이지 펩타이드를 스크리닝하기 위한 M13 페이지 스크리닝 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 페이지 디스플레이의 각 라운드에 대한 조건을 나타낸 것이다.
도 4는 스크리닝 과정을 통해 확보된 ClpC1 단백질에 결합하는 총 27개의 페이지 플라그에서 분류된 5 종의 펩타이드를 나타낸 표이다.
도 5는 결핵균 ClpC1에 대한 CBP1과 CBP2의 ELISA 기반 결합력을 측정한 결과이다.
도 6은 결핵균 ClpC1에 대한 CBP1과 CBP2의 ATPase 활성 촉진 효과를 검정한 것이다.
도 7은 동물세포에 대한 발굴된 저해제의 RAW 264.7 cell에 대한 독성 분석 결과를 확인한 것이다
도 8은 결핵균 ClpC1에 대한 두 펩타이드(CBP1, CBP2)의 결합 구조를 분석한 것이다.

이하, 본 발명의 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식이 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

실시예 1: 결핵균 ClpC1 클로닝 및 정제

결핵균 ClpC1을 타겟으로 저해제 스크리닝에 앞서 결핵균 ClpC1 단백질 (서열번호 6)에 대한 유전자 클로닝 및 단백질 정제를 실시하였다. 결핵균 ClpC1 유전자 절편 (서열번호 7)을 PCR (Denaturation: 95 ℃, 1 min, Annealing: 55 ℃, 1 min, Polymerization: 72 ℃, 1 min, 25cycle) 을 통해서 확보한 뒤, pET 28a 벡터 (Invitrogen Co, Carlsbad, USA)에 삽입하였다. 단백질 발현을 위해 Escherichia Coli (E.coli) BL21(DE3)에 형질전환시킨 뒤 LB 배지를 이용하여 배양하고, 0.5mM IPTG의 첨가 후 18 ℃에서 24시간 동안 단백질을 발현시켰다.

발현된 ClpC1은 Ni-Sepharose column을 이용 친화성 크로마토그래피를 통하여 정제하였으며, 500 mM 이미다졸(imidazole) 선형 구배(linear gradient) 하에 용출시켰다. 얻어낸 단백질은 투석을 이용하여 과량의 이미다졸 및 염을 제거하였고, 이를 통해 얻은 정제 단백질을 12% SDS-PAGE 전기영동을 통하여 확인하였다 (도 1).

실시예 2: ClpC1을 인지하는 M13 페이지 펩타이드 라이브러리 스크리닝(Phage Display)과 이로부터 얻은 페이지 펩타이드의 결합력 분석

페이지 디스플레이(Phage display)란 박테리오페이지(bacteriophage)의 캡시드 단백질에 외래 펩타이드와 단백질을 삽입 및 융합시켜 페이지 표면에 외래 단백질을 발현되도록 하는 기술이다.

본 발명자들은 현재 상용되고 있는 여러 박테리오페이지 중에서 M13(New England BioLabs, MA, USA)을 페이지로 사용하여 ClpC1에 결합하는 펩타이드를 선별 후 이들의 결합력을 분석하여 탐침으로서의 수행력을 확인하였다. 페이지 디스플레이를 통한 M13 페이지 펩타이드 라이브러리 스크리닝법은 도 2에서 보이는 바와 같이 진단 대상 단백질을 플레이트 표면에 고정시킨 후, M13 페이지 펩타이드 라이브러리(9개의 아미노산 서열을 가지도록 제작된 구형 펩타이드 라이브러리-Ph.D^TM phage display peptide lirary kit, New England Biolabs(NEB). 약 2.7 × 10⁹ 개의 아미노산 서열을 지님.)를 넣어주어 타겟 단백질에 결합하는 페이지 펩타이드를 선별해 내는 것으로서 이 스크리닝법을 ClpC1에 적용시켰다.

우선, 플레이트의 각 well에 ClpC1을 고정시키고(도 2의 (a)), M13 페이지 표면에 9개의 아미노산으로 이루어진 원형 펩타이드들이 발현된 페이지 라이브러리를 첨가하였다(도 2의 (b)). 이에 다양한 세척 조건과 결합 시간의 조절(도 3)을 적용시켜(도 2의 (c)) 추출해 내면 ClpC1에 특이적으로 결합하는 페이지 펩타이드가 웰에 남아 페이지 펩타이드만이 최종적으로 확보되었다(도 2의 (d)). 도 2의 (a)에서 (d)까지를 한 단계(round)라고 보고, 세척 용액의 NaCl의 농도를 높이고, 이에 반면 결합 시간은 각 단계마다 더 짧게 하여 마지막 단계(4 round)에서 극한 조건에서도 ClpC1에 가장 높은 결합력을 나타내는 페이지 펩타이드를 확보하였다. 상기와 같은 과정의 반복을 바이오 패닝(biopanning)이라 칭한다.

바이오 패닝을 통해 얻어진 페이지 펩타이드를 숙주세포인 대장균 ER2738 세포(New England BioLabs, MA, USA)에 감염시키고 LB 배지에 증폭시켜서 페이지플라그를 얻었다. 그 후, 페이지 플라그의 M13 페이지 게놈성 DNA(단일 스트랜드화 원형 DNA)를 분리 정제하여 유전자 염기서열을 확인한 다음, ClpC1과 결합하는 페이지 표면 단백질(gp3 minor coat)에 발현된 9개의 아미노산 염기서열로 이루어진 원형펩타이드 서열을 규명하였다 (도 3). 이와 같이 스크리닝하여 얻어진 ClpC1 결합 펩타이드의 결합력 분석을 위해 ClpC1을 고정시킨 각 well에 바이오틴이 연결되어 있는 펩타이드를 농도별로 희석시켜 넣어주어 결합한 펩타이드의 양을 측정함으로써 각 펩타이드의 결합력을 추론했다. 구체적으로, ClpC1(5 ug/well)을 clear bottom 96-well polystyrene plate에 고정시킨 후 세척용액(0.05 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.01% Tween-20 in dH₂O, pH 7.4)으로 3번 세척해 준 뒤, ClpC1 단백질이 코팅이 안 된 부분을 메우기 위해 TBST에 녹인 2% BSA, 100 ul/well을 넣어주었다. 1시간 후 5번 세척을 해 준 뒤 펩타이드를 넣어주어 다시 1시간 동안 ClpC1과의 결합반응을 시켰다. 그 후 5번의 세척 과정을 거치고 바이오틴에 결합하는 항체(Streptavidin-HRP, TBST에 1:4000으로 희석, Santacruz)를 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 5번의 세척 작업을 거친 다음 TMB 기질 용액(3,3’ 5,5’-tetramethylbenzidine(TMB) /H₂O₂, Chemicon)을 넣고 15분 뒤 1M 황산을 넣어 반응을 종결시켰다. 이 전체 과정을 항체를 이용한 ELISA(Enzyme-linked immunosorbant assay)라 칭하고 이 실험의 결과로 얻는 K_d값은 각 well의 고정된 단백질에 반응시킨 펩타이드의 해당 농도에 따른 ELISA 신호 강도를 450 nm에서 측정하여 나타낸 포화곡선으로 정해진다. 그 결과, 두 가지 펩타이드 서열 (CBP1: CTVRTSADC과 CBP2: CNWGDGILC)이 micromolarity(10^-6M) 수준으로 MTB ClpC1과의 높은 결합력 (CBP1: 6.31 μM, CBP2: 6.28 μM)을 나타내었다(도 4).

실시예 3: ClpC1 결합 펩타이드의 ClpC1 ATPase 활성 촉진 검사

Biomol green^® assay를 이용한 Free phosphate 검출을 통하여 ClpC1의 ATPase 활성을 검사하였다. 구체적으로 96well plate의 각 well에 90 ㎕의 assay buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 10% glycerol, 5% DMSO, 8 mM MgCl₂)를 넣은 후 1 μM의 ClpC1을 각 well에 처리하였다. 그 후 0, 0.312, 0.625, 1.25, 2.5, 5 μM 농도의 CBP1 및 CBP2를 넣은 후 2시간 동안 37 ℃에서 반응시켰다. 2시간 후 각 well에 50 μM의 ATP를 처리하여 ATPase 활성을 개시하였고 1시간 동안 37 ℃에서 반응시켰다. 그 후 각각의 well에 생성된 Free phosphate를 검출 하기 위해 100 μL의 Biomol green^® reagent를 넣어 30분 동안 상온에서 반응시켰다. Free phosphage는 산화환원 반응을 통해 Biomol green^® reagent를 청록색을 나타내게 하며, 이는 620 nm의 파장에서 흡광도를 측정함으로 ATPase 활성을 측정할 수 있다. CBP1과 CBP2의 ATPase활성 촉진 효과를 검사한 결과 두 펩타이드 모두 ClpC1의 ATPase 효과를 촉진하며, 각각 0.39, 0.48 μM의 ATPase에 대한 K_d 값을 보임을 확인할 수 있었다 (도 5).

실시예 4: CBP1과 CBP2의 동물세포(macrophage cell)에 대한 독성 검사

RAW 264.7 cell을 이용한 MTT(dimethyl thiazolyl diphenyl tetrazolium salt) assay를 통하여 동물세포(macrophage cell)에 대한 펩타이드의 독성을 검사하였다. 구체적으로 96 well plate의 각 well에 10⁵개의 세포를 처리하여 24시간 배양시킨 후 배지의 교체와 동시에 각각의 펩타이드를 0.312 μM, 0.625 μM, 1.25 μM, 2.5 μM, 5 μM, 10 μM의 농도로 처리하였다. 6시간 추가 배양 후 배지를 제거하고 세포의 생존을 측정하기 위하여 MTT 용액을 처리하여 4시간 동안 반응시켰다. 반응 후 생성된 formazan 결정을 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 이용하여 녹인 후 570 nm의 흡광도를 측정함으로 저해제의 독성을 측정하였다. 이를 통하여 발굴한 2종의 펩타이드 모두 RAW 264.7 cell에 대하여 10 μM의 농도까지 독성을 나타내지 않는 것을 확인할 수 있었다 (도 6).

실시예 5: 분자 도킹을 통한 CBP1과 CBP2의 결합 자리 규명

Autodock 4.0을 이용하여 결핵균 ClpC1 N-terminal domain(NTD)의 결정구조와 CBP1, CBP2의 분자 도킹을 실시하여 결합구조를 분석하였다. 결핵균 ClpC1 NTD의 결정구조에 극성 수소와 Kollman charge의 첨가 후 Auto Dock Tools(ADT)를 이용하여 101Å×101Å×101Å의 Grid point와 0.357Å의 공간을 설정하여 준비되어 있는 펩타이드 구조를 분자 도킹을 실시하였다.

CBP1은 -5.2kcal/mol의 결합에너지를 보였으며 Arg8 잔기와 수소결합을 보였으며, Leu47, Leu141, Ser143, Tyr145 잔기와 소수성 결합을 나타냈다. 또한, CBP2의 경우 -6.9 Kcal/mol의 결합에너지를 보였다. Asn26, Gln122 잔기와 수소결합을 나타내었으며, His25, Tyr27, His32, Iso67, Thr81, Arg83, Val119 잔기와 소수성 결합을 통해 ClpC1과 결합을 하고 있는 것을 확인했다. 이를 통하여, CBP2가 CBP1에 비하여 낮은 결합에너지를 보임으로 위 결합력 및 ATPase 활성 촉진 결과와 일치하는 결과를 나타냈다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> Cyclic peptides for activation of Mycobacterium tuberculosis Caseinolytic protease C1 <130> P16U10C1605 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CBP1 <400> 1 Cys Thr Val Arg Thr Ser Ala Asp Cys 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CBP2 <400> 2 Cys Asn Trp Gly Asp Gly Ile Leu Cys 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CBP3 <400> 3 Cys His Ser Asn Met Tyr Ser Phe Cys 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CBP4 <400> 4 Cys Ser Leu Thr His His Ser Met Cys 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CBP5 <400> 5 Cys Arg Trp Ala Arg Pro Met Ser Cys 1 5 <210> 6 <211> 848 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 6 Met Phe Glu Arg Phe Thr Asp Arg Ala Arg Arg Val Val Val Leu Ala 1 5 10 15 Gln Glu Glu Ala Arg Met Leu Asn His Asn Tyr Ile Gly Thr Glu His 20 25 30 Ile Leu Leu Gly Leu Ile His Glu Gly Glu Gly Val Ala Ala Lys Ser 35 40 45 Leu Glu Ser Leu Gly Ile Ser Leu Glu Gly Val Arg Ser Gln Val Glu 50 55 60 Glu Ile Ile Gly Gln Gly Gln Gln Ala Pro Ser Gly His Ile Pro Phe 65 70 75 80 Thr Pro Arg Ala Lys Lys Val Leu Glu Leu Ser Leu Arg Glu Ala Leu 85 90 95 Gln Leu Gly His Asn Tyr Ile Gly Thr Glu His Ile Leu Leu Gly Leu 100 105 110 Ile Arg Glu Gly Glu Gly Val Ala Ala Gln Val Leu Val Lys Leu Gly 115 120 125 Ala Glu Leu Thr Arg Val Arg Gln Gln Val Ile Gln Leu Leu Ser Gly 130 135 140 Tyr Gln Gly Lys Glu Ala Ala Glu Ala Gly Thr Gly Gly Arg Gly Gly 145 150 155 160 Glu Ser Gly Ser Pro Ser Thr Ser Leu Val Leu Asp Gln Phe Gly Arg 165 170 175 Asn Leu Thr Ala Ala Ala Met Glu Gly Lys Leu Asp Pro Val Ile Gly 180 185 190 Arg Glu Lys Glu Ile Glu Arg Val Met Gln Val Leu Ser Arg Arg Thr 195 200 205 Lys Asn Asn Pro Val Leu Ile Gly Glu Pro Gly Val Gly Lys Thr Ala 210 215 220 Val Val Glu Gly Leu Ala Gln Ala Ile Val His Gly Glu Val Pro Glu 225 230 235 240 Thr Leu Lys Asp Lys Gln Leu Tyr Thr Leu Asp Leu Gly Ser Leu Val 245 250 255 Ala Gly Ser Arg Tyr Arg Gly Asp Phe Glu Glu Arg Leu Lys Lys Val 260 265 270 Leu Lys Glu Ile Asn Thr Arg Gly Asp Ile Ile Leu Phe Ile Asp Glu 275 280 285 Leu His Thr Leu Val Gly Ala Gly Ala Ala Glu Gly Ala Ile Asp Ala 290 295 300 Ala Ser Ile Leu Lys Pro Lys Leu Ala Arg Gly Glu Leu Gln Thr Ile 305 310 315 320 Gly Ala Thr Thr Leu Asp Glu Tyr Arg Lys Tyr Ile Glu Lys Asp Ala 325 330 335 Ala Leu Glu Arg Arg Phe Gln Pro Val Gln Val Gly Glu Pro Thr Val 340 345 350 Glu His Thr Ile Glu Ile Leu Lys Gly Leu Arg Asp Arg Tyr Glu Ala 355 360 365 His His Arg Val Ser Ile Thr Asp Ala Ala Met Val Ala Ala Ala Thr 370 375 380 Leu Ala Asp Arg Tyr Ile Asn Asp Arg Phe Leu Pro Asp Lys Ala Ile 385 390 395 400 Asp Leu Ile Asp Glu Ala Gly Ala Arg Met Arg Ile Arg Arg Met Thr 405 410 415 Ala Pro Pro Asp Leu Arg Glu Phe Asp Glu Lys Ile Ala Glu Ala Arg 420 425 430 Arg Glu Lys Glu Ser Ala Ile Asp Ala Gln Asp Phe Glu Lys Ala Ala 435 440 445 Ser Leu Arg Asp Arg Glu Lys Thr Leu Val Ala Gln Arg Ala Glu Arg 450 455 460 Glu Lys Gln Trp Arg Ser Gly Asp Leu Asp Val Val Ala Glu Val Asp 465 470 475 480 Asp Glu Gln Ile Ala Glu Val Leu Gly Asn Trp Thr Gly Ile Pro Val 485 490 495 Phe Lys Leu Thr Glu Ala Glu Thr Thr Arg Leu Leu Arg Met Glu Glu 500 505 510 Glu Leu His Lys Arg Ile Ile Gly Gln Glu Asp Ala Val Lys Ala Val 515 520 525 Ser Lys Ala Ile Arg Arg Thr Arg Ala Gly Leu Lys Asp Pro Lys Arg 530 535 540 Pro Ser Gly Ser Phe Ile Phe Ala Gly Pro Ser Gly Val Gly Lys Thr 545 550 555 560 Glu Leu Ser Lys Ala Leu Ala Asn Phe Leu Phe Gly Asp Asp Asp Ala 565 570 575 Leu Ile Gln Ile Asp Met Gly Glu Phe His Asp Arg Phe Thr Ala Ser 580 585 590 Arg Leu Phe Gly Ala Pro Pro Gly Tyr Val Gly Tyr Glu Glu Gly Gly 595 600 605 Gln Leu Thr Glu Lys Val Arg Arg Lys Pro Phe Ser Val Val Leu Phe 610 615 620 Asp Glu Ile Glu Lys Ala His Gln Glu Ile Tyr Asn Ser Leu Leu Gln 625 630 635 640 Val Leu Glu Asp Gly Arg Leu Thr Asp Gly Gln Gly Arg Thr Val Asp 645 650 655 Phe Lys Asn Thr Val Leu Ile Phe Thr Ser Asn Leu Gly Thr Ser Asp 660 665 670 Ile Ser Lys Pro Val Gly Leu Gly Phe Ser Lys Gly Gly Gly Glu Asn 675 680 685 Asp Tyr Glu Arg Met Lys Gln Lys Val Asn Asp Glu Leu Lys Lys His 690 695 700 Phe Arg Pro Glu Phe Leu Asn Arg Ile Asp Asp Ile Ile Val Phe His 705 710 715 720 Gln Leu Thr Arg Glu Glu Ile Ile Arg Met Val Asp Leu Met Ile Ser 725 730 735 Arg Val Ala Gly Gln Leu Lys Ser Lys Asp Met Ala Leu Val Leu Thr 740 745 750 Asp Ala Ala Lys Ala Leu Leu Ala Lys Arg Gly Phe Asp Pro Val Leu 755 760 765 Gly Ala Arg Pro Leu Arg Arg Thr Ile Gln Arg Glu Ile Glu Asp Gln 770 775 780 Leu Ser Glu Lys Ile Leu Phe Glu Glu Val Gly Pro Gly Gln Val Val 785 790 795 800 Thr Val Asp Val Asp Asn Trp Asp Gly Glu Gly Pro Gly Glu Asp Ala 805 810 815 Val Phe Thr Phe Thr Gly Thr Arg Lys Pro Pro Ala Glu Pro Asp Leu 820 825 830 Ala Lys Ala Gly Ala His Ser Ala Gly Gly Pro Glu Pro Ala Ala Arg 835 840 845 <210> 7 <211> 2546 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 7 atgttcgaac gatttaccga ccgtgcccgc agggtcgtcg tcctggctca ggaagaggcc 60 aggatgctca accacaacta catcggcacc gagcacattc ttttaggcct gatccatgaa 120 ggggaaggcg ttgccgccaa gtcactggag tcgttgggga tctcgctgga aggtgtgcgc 180 agtcaggtcg aggagatcat cggccagggc cagcaggcgc cgtctgggca cattccgttt 240 accccccgcg ccaaaaaggt cctcgagctg agcttgcgtg aagcgctgca gcttggccac 300 aactacatcg ggaccgaaca cattttgctg ggcctcatcc gagagggtga aggcgtggcc 360 gcccaggtgc tggtcaagct gggcgccgag ctgacccggg tgcgccagca ggtgatccag 420 ctgctctccg gttaccaagg caaggaggcc gccgaagccg gcaccggcgg ccgcggggga 480 gagtccggct ctccgtctac gtccttggtg ctcgaccagt tcggccgcaa cctcacggcg 540 gcggcgatgg aaggcaaact ggacccggtc atcggccgcg agaaggaaat cgagcgggtc 600 atgcaggtgc tctctcggcg caccaagaac aacccggtgc tgatcggcga gcccggcgtc 660 ggcaagaccg cggtcgtcga aggactggcg caggccatcg tgcacggcga ggtgcccgag 720 acgctcaagg acaagcagct ctacacgctg gatctgggat cgctggtggc gggtagccgc 780 taccgcggtg acttcgagga acgcctcaag aaggtgctca aggagatcaa cacccgcggt 840 gacatcatcc tgtttatcga cgagctgcac accttggtcg gtgctggagc cgccgagggc 900 gcgatcgacg ccgcctcgat cctgaaaccg aagctcgctc gcggtgaact gcaaacgatc 960 ggcgccacca cgctcgacga ataccgcaag tacatcgaga aggacgccgc gctggagcgc 1020 cgcttccagc cggtgcaggt gggtgagccg acggtggagc acaccatcga gatcctcaag 1080 ggcctgcggg accggtacga ggcgcaccac cgggtgtcga tcaccgatgc ggcgatggtg 1140 gccgccgcga ccctggccga ccgctacatc aacgaccggt tcctgcccga caaggcgatc 1200 gacctgatcg acgaggcggg tgctcggatg cggattcgtc gcatgaccgc accgccagac 1260 ctacgcgagt tcgatgagaa gatcgccgag gctcgtcggg agaaggaatc ggctatcgac 1320 gcccaggact tcgagaaggc cgccagcctg cgcgaccggg agaagacact ggtcgcacag 1380 cgtgctgagc gcgaaaagca gtggcgttca ggcgatcttg acgtggtcgc ggaggtcgac 1440 gacgagcaga tcgccgaggt gctgggcaac tggaccggta tcccggtgtt caagctcacc 1500 gaggccgaga ccacccggct gttgcggatg gaagaagagc tgcacaagcg gatcatcggg 1560 caagaggacg ccgtcaaggc cgtttccaag gccatccggc gtacccgggc cgggctgaaa 1620 gaccccaagc gcccgtcggg ctcgttcatc ttcgccggcc cgtccggtgt cggtaagacc 1680 gaactgtcca aggcgctggc caacttcttg ttcggtgacg acgacgcgct tattcagatt 1740 gacatgggtg aattccacga ccggttcacc gcgtcgcggc tattcggcgc gccgcccgga 1800 tacgtcggct acgaggaggg cggccaactc accgagaagg tgcggcgcaa gccgttctcg 1860 gtggtgctgt tcgacgagat cgagaaggcg catcaggaga tctacaacag cctgctgcag 1920 gtgctcgagg atggccggct caccgacggg cagggccgca cggtggactt caagaacacc 1980 gtgctgatct ttacgtccaa tctgggcacc tccgacatct ctaagccggt cggtctgggc 2040 ttttccaagg gcggcggtga gaacgactac gagcggatga aacagaaggt caacgacgag 2100 ctgaagaaac acttccgccc ggagttcctc aaccgcatcg acgacatcat cgtcttccac 2160 cagctgaccc gcgaggagat catccggatg gtcgacctga tgatcagccg ggtcgccggc 2220 cagctcaaga gcaaggacat ggcgctggtg ctgaccgatg cggccaaggc gctgctggcc 2280 aagcgtggct tcgacccggt gttgggggcc cgcccgttgc ggcgcaccat ccagcgtgag 2340 atcgaagatc agctctcgga gaagatcctc ttcgaggagg tcgggccggg tcaggtggtc 2400 accgtcgacg tggacaactg ggacggtgaa ggtcccggcg aggacgcggt gttcaccttc 2460 accggtaccc gcaagccgcc ggccgagccg gatctggcca aggctggagc gcacagcgcg 2520 ggcggcccgg agccggccgc gcggta 2546

Claims (11)

1. 삭제
2. 서열번호 2로 표시되는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) ClpC1 결합용 구형 펩타이드.
   
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 결핵균은 다제내성 결핵균 또는 광범위내성 결핵균인 펩타이드.
   
4. 서열번호 1로 표시되는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) ClpC1 결합용 구형 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 결핵 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
5. 청구항 2의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 결핵 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
6. 서열번호 1로 표시되는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) ClpC1 결합용 구형 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 결핵 예방 또는 개선용 사료 조성물.
   
7. 청구항 2의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 결핵 예방 또는 개선용 사료 조성물.
   
8. 서열번호 1로 표시되는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) ClpC1 결합용 구형 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 결핵 예방 또는 치료용 동물의약품 조성물.
   
9. 청구항 2의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 결핵 예방 또는 치료용 동물의약품 조성물.
   
10. 서열번호 1로 표시되는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) ClpC1 결합용 구형 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 결핵의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
    
11. 청구항 2의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 결핵의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.

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