KR101167988B1 - 진균 감염의 치료를 위한 Ｒａｓ 및 ｃＡＭＰ 신호전달경로 유전자의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항진균제의 제조를 위한 크립토코쿠스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)의 Ras1, Ras2, Cdc24, Gpa1, Cac1, Aca1, Pka1, Hsp12 및 Hsp122로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자에 대한 저해제의 용도, 상기 저해제를 포함하는 항진균용 의약 조성물, 유효량의 상기 저해제를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 진균 감염의 치료 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면 크립토코쿠스 네오포만스의 Ras 경로의 RAS1, RAS2나 CDC24, 또는 cyclic-AMP(cAMP) 경로의 GPA1, CAC1, ACA1, PKA1, HSP12 또는 HSP122가 억제되면 폴리엔계 약물이나 아졸계 약물에 대한 감수성이 증진되므로, 이들에 대한 저해제를 포함하는 항진균용 의약 조성물은 기존 항진균제의 사용 용량을 절감시키면서 효능을 상승시킬 수 있는 우수한 복합 항균치료제로서 사용할 수 있다.

항진균제, 크립토코쿠스 네오포만스

Description

진균 감염의 치료를 위한 Ｒａｓ 및 ｃＡＭＰ 신호전달경로 유전자의 용도{Use of the genes in the Ras and cAMP pathway for treatment of fungal infection}

본 발명은 진균 감염의 치료를 위한 Ras 및 cAMP 신호전달경로 유전자의 용도에 관한 것이다.

과거에 진균 감염은 건포상백선, 완선, 아구창 같은 국소적 감염이 많이 발생하였고, 전신적 진균 감염은 드물게 발생했지만, 최근 들어 전체 병원 내 감염에서 4번째 빈도를 차지할 정도로 흔하게 발생하고 있다.

현재까지 개발된 항진균제는 크게 화학적으로 아졸(azole) 구조를 갖는 항진균제와 아졸 구조를 갖지 않는 항진균제로 분류할 수 있다. 아졸 계열의 항진균제로 케토코나졸(ketoconazole), 플루코나졸(fluconazole), 이트라코나졸(itraconazole), 보리코나졸(voriconazole) 등이 있고, 비-아졸 계열의 항진균제로 테르비나핀(terbinafine), 플루사이토신(flucytosine), 암포테리신 B(Amphotericin B), 카스포푼긴(caspofungin) 등이 있다.

아졸 구조를 갖는 케토코나졸, 플루코나졸, 이트라코나졸, 보리코나졸과 알릴아민(allylamines) 계열인 나프티핀, 테르비나핀은 유사한 작용기전을 지니고 있다. 두 계열의 항진균제는 라노스테롤이 진균 세포막의 주성분인 에르고스테롤로 전환되는 과정에 필요한 효소를 억제하는 작용을 나타낸다. 아졸 계열 항진균제는 미세소체 효소를 억제하고, 알릴아민 계열의 항진균제는 스쿠알렌 에폭시데이즈(epoxidase)를 억제하여 위와 같은 효과를 나타낸다. 플루사이토신(5-FC)은 핵산합성을 억제하는 대사길항제로서 진균 RNA의 오부호전달 유발 및 DNA 합성을 비경쟁적으로 길항하여 항진균작용을 나타내며, 폴리엔(Polyenes) 구조를 가진 암포테리신 B는 진균 세포막 내부의 에르고스테롤에 결합하여 세포막의 탈분극을 유발하고, 구멍을 형성하여 세포 내 함유물의 손실을 유발하여 항진균작용을 나타낸다. 에키노칸딘(Echinocandins) 계열의 항진균제인 카스포푼긴은 진균 세포벽 형성을 가역적으로 억제하는 작용을 지니고 있으며, 세포벽에 작용한다는 점에서 위에 언급한 세포막에 작용하는 항진균제와 차이가 있다.

아졸 계열의 약물은 간기능 저하 환자에게 사용 시 간염에 의한 사망을 초래할 수도 있으므로 투여 전에 반드시 간기능 검사가 선행되어야 한다. 플루사이토신은 용량의존적으로 골수 억제 작용, 간독성이 나타나고 소장결장염이 발생 가능한 것으로 보고되었고, 이런 부작용은 신기능이 저하된 경우 더 증가하므로 환자의 신기능 모니터링이 매우 중요하다. 또한 임산부에서 금기이다. 암포테리신 B의 대표적 독성은 신동맥 수축에 따른 사구체 신독성으로, 용량 의존적이어서 평생 누적 용량이 4~5g 이상일 경우 영구적인 신기능 손실 발생률이 상승한다. 또한, 세뇨관 독성에 의한 칼륨, 마그네슘, 중탄산염의 과도한 소실 및 조혈호르몬 생산 저하 등의 신독성이 일어날 수 있다. 그 외, 급성 반응으로 혈전정맥염, 오한, 떨림, 과호흡 등의 증상이 나타날 수 있다. 이와 같이, 기존에 개발된 항진균제들은 약물의 종류에 따라 각종 부작용을 나타내고 있어, 이러한 부작용은 낮추면서도 항진균 효과는 증진시킬 수 있는 새로운 치료법의 개발이 요구되고 있다.

한편, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, 및 Cryptococcus neoformans를 포함한 전세계에 분포되어 있는 병원성 균류에서, Ras- 및 cAMP-신호전달 경로는 진화론적으로 보존되어 있으며, 아직까지도 유의한 기능적 및 구조적 차이들이 발견되고 있다 (Pukkila-Worley & Alspaugh, 2004, Rolland et al., 2002, Wang & Heitman, 1999, Thevelein & de Winde, 1999, Alspaugh et al., 1998, Lengeler et al., 2000, Bahn et al., 2007). 생명에 치명적인 진균성 뇌수막염을 일으키는 크립토코쿠스 네오포만스에서 cAMP-신호전달 경로는 병독성 인자의 생산 및 분화에 있어서 중요하다(Idnurm et al., 2005). S. cerevisiae 및 C. albicans 와 유사하게, 아데닐일 사이클라아제(adenylyl cyclase)(Cac1)의 두 개의 주요한 상위 신호전달 조절자인, Aca1 (Adenylyl cyclase-associated protein 1) 및 Ga subunit protein (Gpa1)이 크립토코쿠스 네오포만스의 cAMP-신호전달 경로를 조절함이 확인된 바 있다 (Bahn et al., 2004, Alspaugh et al., 1997). GPA1 유전자의 파괴는 다중적인 세포의 표현형을 야기하는데, 이는 숙주에서 크립토코쿠스 네오포만스의 생존 및 증식에 있어 필수적인 핵심 병독성인자인 멜라닌과 캡슐의 불완전한 생산, 및 감염성 포자의 보급에 중요한 교배의 감소를 포함한다 (Alspaugh et al., 1997). Aca1는 Cac1 아데닐일 사이클라아제와 물리적으로 상호작용하며, cAMP의 기초적인 수준을 조절하지는 않으나 cAMP의 유도를 조절하여 대부분의 cAMP-의존적 표현형을 지배한다 (Bahn et al., 2004). CAC1 의 돌연변이는 gpa1D 또는 aca1D 돌연변이에 비해 보다 심한 표현형을 생성하며, gpa1D aca1D 이중 돌연변이는 cac1D 돌연변이와 표현형상 동등하다 (Bahn et al., 2004). 이는 Cac1이 Aca1 및 Gpa1 모두에 의해 활성화됨을 나타낸다. 크립토코쿠스 네오포만스의 Cac1의 하위신호체계에는 PKA(Protein kinase A)의 두 개의 촉매성 subunit인 Pka1 및 Pka2, 및 조절 subunit인 Pkr1을 포함한다. Pka1는 항원형 A 크립토코쿠스 네오포만스 H99 균주 background에서 cAMP 신호전달에 있어 우세한 역할을 하는 반면 Pka2는 항원형 D 크립토코쿠스 네오포만스 JEC21 균주에서 그러한 역할을 한다(Hicks et al., 2004). 그럼에도 불구하고, pka1D pka2D 이중 돌연변이는 cac1D 돌연변이와 동등한 표현형을 나타내는데, 이는 Cac1으로부터의 cAMP 신호전달이 두 개의 PKA 촉매성 subunit로 갈라짐을 나타낸다 (Bahn et al., 2004). 흥미롭게도, PDE2이 아닌 PDE1의 결실은 gpa1D 돌연변이의 멜라닌 결핍과 같은 일부 표현형을 복구하는데, 이는 상이한 포스포디에스터라아제가 다양한 균류에서 작용하고 있음을 나타낸다(Hicks et al., 2005).

두 개의 Ras 단백질, Ras1 및 Ras2가 크립토코쿠스에서 발견되었으며 그들은 공유하면서도 구별되는 역할을 하는 것으로 밝혀졌다 (Alspaugh et al., 2000, D'Souza et al., 2001, Waugh et al., 2002). 그들 중에서도, Ras1은 숙주에서의 생존 및 증식에 필수적인 고온 성장 및 침범적 성장을 지탱해주고 생식적 분화를 촉진하는 주요한 크립토코쿠스 네오포만스 Ras 단백질이다(Alspaugh et al., 2000). ras2D 돌연변이가 어떠한 식별가능한 표현형을 갖는 것은 아니지만, RAS2 의 과발현은 대부분의 ras1 돌연변이 표현형을 다소 억제한다 (Waugh et al., 2002). S. cerevisiae와 유사하게, RAS1 및 RAS2 유전자의 파괴는 모든 온도에서 세포의 생존성에 영향을 미치는데, 이는 Ras 단백질이 일반적인 세포의 성장에 필수적임을 나타낸다. 다양한 Ras-관련 표현형 중에서, 오직 침범적 성장 및 교배만이 cAMP-의존적인 반면 고온에서의 성장은 cAMP-비의존적이고, Ras1-특이적인 표현형이다(Alspaugh et al., 2000, Waugh et al., 2003). 흥미롭게도, Cac1은 S. cerevisiae 에서의 GTP-결합 Ras에 대한 결합 부위인 Leucine-rich repeat(LRR) 도메인을 품고 있지 않다(Shima et al., 1997). 아데닐일 사이클라아제/사이클라아제-관련 단백질 복합체는 S. cerevisiae에서 볼 수 있는 바와 같이 그의 활성화를 위한 2차적인 Ras-결합 부위를 제공할 수 있기 때문에 (Shima et al., 2000), Ras1이 크립토코쿠스 네오포만스에서 그의 활성화를 위한 Aca1/Cac1 복합체와 상호반응이 여전히 가능하다. 최근, GEF 단백질인, Cdc24가 Ras-effector 단백질이고, Ras1의 하위체계와 Rho-유사 GTPase Cdc42의 상위체계에서 고온에서의 크립토코쿠스 네오포만스의 성장을 조절한다는 것이 보고된 바 있다 (Nichols et al., 2007). 종합해 보면, 크립토코쿠스 네오포만스 cAMP-신호전달 경로는 세 개의 다른 상위신호조절자인 Ras1, Gpa1, 및 Aca1에 의해 조절된다.

Cac1의 공통적인 상위신호 조절자(Ras1, Aca1, 및 Gpa1)의 존재에도 불구하고, 크립토코쿠스 네오포만스에서 상기 구성인자들과 각각의 조절자에 의해 조절되는 타겟 유전자와의 기능적인 연관성에 대해서는 아직까지 미지로 남아 있다.

본 발명에서는 Ras 및 cAMP 경로의 신호전달 네트워크를 조사함으로써, 항진균제 개발을 위한 새로운 타깃 유전자를 발굴하고자 하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 항진균제의 제조를 위한 크립토코쿠스 네오포만스의 Ras1, Ras2, Cdc24, Gpa1, Cac1, Aca1, Pka1, Hsp12 및 Hsp122로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자에 대한 저해제의 용도, 상기 저해제를 포함하는 항진균용 의약 조성물, 유효량의 상기 저해제를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 진균 감염의 치료 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 항진균제의 스크리닝을 위한 크립토코쿠스 네오포만스의 Ras1, Ras2, Cdc24, Gpa1, Cac1, Aca1, Pka1, Hsp12 및 Hsp122로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 용도, 상기 단백질 또는 유전자를 포함하는 항진균제 스크리닝용 조성물, 후보물질과 상기 단백질 또는 유전자를 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 단백질 또는 유전자의 활성을 저해하는지 또는 촉진하는지를 판단하는 것을 포함하는 항진균제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에서는 크립토코쿠스 네오포만스의 Ras 및 cAMP 경로의 조절에 있어서 RAS1, RAS2, CDC24, GPA1, CAC1, ACA1, PKA1, HSP12 및 HSP122 유전자들이 수행하는 역할에 대해 조사하여, 이들 유전자들이 억제되면 폴리엔계 약물이나 아졸계 약물에 대한 감수성이 증진됨을 새로이 밝혀냈다. 따라서 크립토코쿠스 네오포만스의 Ras1, Ras2, Cdc24, Gpa1, Cac1, Aca1, Pka1, Hsp12 및 Hsp122로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질에 대한 저해제를 포함하는 항진균용 의약 조성물은 기존 항진균제의 사용 용량을 절감시키면서 효능을 상승시킬 수 있는 우수한 복합 항균치료제로서 사용할 수 있다.

이하 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명은 항진균제의 제조를 위한 크립토코쿠스 네오포만스의 Ras1, Ras2, Cdc24, Gpa1, Cac1, Aca1, Pka1, Hsp12 및 Hsp122로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자에 대한 저해제를 포함하는 항진균용 의약 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 새로운 항진균제 타깃의 개발을 위해 Ras 및 cAMP 경로에 에 관여하는 유전자들의 역할에 대한 조사를 수행하였다. 그 결과, 놀랍게도 크립토코쿠스 네오포만스의 Ras 및 cAMP 경로에 있어서 RAS1, RAS2, CDC24, GPA1, CAC1, ACA1, PKA1, HSP12 또는 HSP122 유전자가 억제되면 폴리엔계 또는 아졸계 약물의 하나인 이트라코나졸 항진균제에 대한 감수성이 증진되는 것을 증진됨을 새로이 밝 혀냈다. 하기 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 유전자들을 억제하면 진균의 폴리엔계 또는 이트라코나졸 항진균제에 대한 감수성을 현저히 상승시킬 수 있게 된다. 따라서 크립토코쿠스 네오포만스의 Ras1, Ras2, Cdc24, Gpa1, Cac1, Aca1, Pka1, Hsp12 및 Hsp122로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자에 대한 저해제를 포함하는 항진균용 의약 조성물은 기존 폴리엔계 또는 이트라코나졸 항진균제의 사용 용량을 절감시키면서 효능을 상승시킬 수 있는 우수한 복합 항균치료제로서 사용될 수 있다.

그러므로 본 발명은 항진균제의 제조를 위한 크립토코쿠스 네오포만스의 Ras1, Ras2, Cdc24, Gpa1, Cac1, Aca1, Pka1, Hsp12 및 Hsp122로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자에 대한 저해제의 용도, 상기 저해제를 포함하는 항진균용 의약 조성물, 유효량의 상기 저해제를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 진균 감염의 치료 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, Ras- 및 cAMP 신호전달계의 차단을 위한 타깃으로 이용되는 RAS1, RAS2, CDC24, GPA1, CAC1, ACA1, PKA1, HSP12 또는 HSP122은 Ras1, Ras2, Cdc24, Gpa1, Cac1, Aca1, Pka1, Hsp12 또는 Hsp122 단백질을 의미하거나 RAS1, RAS2, CDC24, GPA1, CAC1, ACA1, PKA1, HSP12 또는 HSP122 유전자를 의미하는 것으로 해석된다. 따라서, RAS1, RAS2, CDC24, GPA1, CAC1, ACA1, PKA1, HSP12 또는 HSP122 저해제는 Ras1, Ras2, Cdc24, Gpa1, Cac1, Aca1, Pka1, Hsp12 또는 Hsp122 단백질에 대한 저해제 또는 RAS1, RAS2, CDC24, GPA1, CAC1, ACA1, PKA1, HSP12 또는 HSP122 유전자에 대한 저해제를 모두 포함하는 것으로 해석된다.

한 구체예에서, 크립토코쿠스 네오포만스의 Ras1, Ras2, Cdc24, Gpa1, Cac1, Aca1, Pka1, Hsp12 및 Hsp122로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질에 대한 저해제는 상기 단백질에 결합하여 활성을 저해함으로써 신호전달을 차단하는 저해제일 수 있다. 다른 구체예에서, 크립토코쿠스 네오포만스의 RAS1, RAS2, CDC24, GPA1, CAC1, ACA1, PKA1, HSP12 및 HSP122로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 저해제는 상기 유전자의 발현을 저해하여 신호전달을 차단하는 저해제일 수 있다. 본 발명에서, RAS1, RAS2, CDC24, GPA1, CAC1, ACA1, PKA1, HSP12 또는 HSP122유전자는 이들을 코딩하는 DNA 또는 이로부터 전사되는 mRNA일 수 있다. 따라서, 상기 유전자에 대한 저해제는 유전자 자체에 결합하여 전사를 방해하거나 유전자로부터 전사된 mRNA에 결합하여 mRNA의 해독을 방해하는 저해제일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 Ras1, Ras2, Cdc24, Gpa1, Cac1, Aca1, Pka1, Hsp12 또는 Hsp122 단백질은 각각 서열번호 1 내지 9의 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 상기 RAS1, RAS2, CDC24, GPA1, CAC1, ACA1, PKA1, HSP12 및 HSP122 유전자는 이에 상응하는 핵산 서열 또는 cDNA 서열을 가질 수 있으나, 이는 크립토코쿠스 네오포만스 항원형 A H99 균주의 서열을 예시한 것일 뿐, 본 발명의 RAS1, RAS2, CDC24, GPA1, CAC1, ACA1, PKA1, HSP12 또는 HSP122의 서열이 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 Ras1, Ras2, Cdc24, Gpa1, Cac1, Aca1, Pka1, Hsp12 또는 Hsp122 단백질, 상기 RAS1, RAS2, CDC24, GPA1, CAC1, ACA1, PKA1, HSP12 또 는 HSP122 유전자 등에는 이들과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 이들의 변이체 또는 단편이 포함되는 것으로 해석된다.

한 구체예에서, 상기 저해제는 Cac1 또는 Pka1 단백질 또는 유전자에 대한 저해제일 수 있다.

Ras1, Ras2, Cdc24, Gpa1, Cac1, Aca1, Pka1, Hsp12 또는 Hsp122 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 저해는 폴리엔계 또는 아졸계 항진균제에 대한 감수성을 증진시키므로, 폴리엔계 또는 아졸계 항진균제의 유효량을 감소시키면서 이들 항진균제의 살상 효능은 증가시킬 수 있게 된다. Ras1, Ras2, Cdc24, Gpa1, Cac1, Aca1, Pka1, Hsp12 또는 Hsp122의 저해에 의한 항진균 활성은 크립토코쿠스 네오포만스의 감염에 의한 크립토코쿠스증 및 뇌수막염 등을 치료할 수 있다.

따라서 본 발명의 한 구체예에서는 크립토코쿠스증 및 뇌수막염 등의 질환의 치료용 의약의 제조를 위한 Ras1, Ras2, Cdc24, Gpa1, Cac1, Aca1, Pka1, Hsp12 또는 Hsp122 저해제의 용도, Ras1, Ras2, Cdc24, Gpa1, Cac1, Aca1, Pka1, Hsp12 또는 Hsp122 저해제를 포함하는 크립토코쿠스증 및 뇌수막염 등의 질환의 치료용 의약 조성물 및 유효량의 Ras1, Ras2, Cdc24, Gpa1, Cac1, Aca1, Pka1, Hsp12 및 Hsp122 저해제를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 크립토코쿠스증 및 뇌수막염 등의 질환의 치료 방법을 제공한다.

본 명세서에서 예시한 크립토코쿠스증 및 뇌수막염 외에도, 진균 감염에 의해 나타나는 질환에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명에서 Ras1, Ras2, Cdc24, Gpa1, Cac1, Aca1, Pka1, Hsp12 및 Hsp122 단백질 또는 이를 코딩하는 유전 자의 저해가 폴리엔계 또는 아졸계인 이트라코나졸 항진균제에 대한 감수성을 증가시킴으로써 이들 항진균제의 효능을 증진시킨다는 사실을 밝힌 이상 당업자는 진균 감염과 관련된 질환의 예방 또는 치료를 위해 상기 단백질 또는 유전자들을 저해시킬 수 있을 것이다.

본 발명에 있어서, RAS 또는 cAMP 신호전달계를 차단하기 위해 사용되는 ' Ras1, Ras2, Cdc24, Gpa1, Cac1, Aca1, Pka1, Hsp12 또는 Hsp122 단백질의 저해제'는 Ras1, Ras2, Cdc24, Gpa1, Cac1, Aca1, Pka1, Hsp12 또는 Hsp122 단백질과 결합하여 신호전달을 차단하는 저해제를 모두 포함한다. 예컨대, 이러한 저해제는 Ras1, Ras2, Cdc24, Gpa1, Cac1, Aca1, Pka1, Hsp12 또는 Hsp122 단백질과 결합하는 펩타이드 또는 화합물 등일 수 있다. 이러한 저해제는 단백질 구조 분석 등의 하기 예시된 스크리닝 방법을 통해 선정될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 설계될 수 있을 것이다. 한 구체예에서, 상기 저해제는 크립토코쿠스 네오포만스의 Ras1, Ras2, Cdc24, Gpa1, Cac1, Aca1, Pka1, Hsp12 및 Hsp122로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질에 대한 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 이러한 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체는 당업계에 공지된 항체 제작 방법을 이용하여 제작할 수 있다.

본 발명에 있어서, RAS 또는 cAMP 신호전달계를 차단하기 위해 사용되는 ' RAS1, RAS2, CDC24, GPA1, CAC1, ACA1, PKA1, HSP12 또는 HSP122 유전자의 저해제'는 RAS1, RAS2, CDC24, GPA1, CAC1, ACA1, PKA1, HSP12 또는 HSP122 유전자의 발현을 저해하여 신호전달을 차단하는 저해제를 모두 포함한다. 예컨대, 이러한 저해제 는 상기 유전자에 결합하는 펩타이드, 핵산 또는 화합물 등일 수 있다. 이러한 저해제는 세포 기반 스크리닝 등의 하기 예시된 스크리닝 방법을 통해 선정될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 설계될 수 있을 것이다. 한 구체예에서, 상기 저해제는 크립토코쿠스 네오포만스의 RAS1, RAS2, CDC24, GPA1, CAC1, ACA1, PKA1, HSP12 및 HSP122로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 안티센스올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이들을 포함하는 벡터일 수 있다. 이러한 안티센스올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이들을 포함하는 벡터는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제작할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 '벡터'는 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 내로 삽입된 외부 DNA를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명과 관련된 벡터는 상기 유전자를 저해하는 핵산 서열이 게놈 내로 삽입된 벡터로서, 이들 벡터는 DNA 벡터, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 효모 벡터, 또는 바이러스 벡터를 예로 들 수 있다.

본 발명의 항진균용 의약 조성물은 단독으로 항진균 활성을 나타내는 것이 아니라, 폴리엔계 또는 아졸계 항진균제와의 복합 처리를 통해 상기 항진균제의 진균 살상능을 증진시킨다. 따라서, 본 발명의 항진균용 의약 조성물은 폴리엔계 또는 아졸계 항진균제와 순차적으로 또는 동시에 투여되는 것을 특징으로 한다. 폴리엔계 또는 아졸계 항진균제는 당업계에 공지되어 있으며, 어떠한 폴리엔계 또는 아졸계 항진균제라도 본 발명의 항진균용 의약 조성물과 함께 사용시 현저한 항진균 효과의 상승을 나타내게 된다. 한 측면에서, 상기 폴리엔계 항진균제는 암포테리신 B, 나타마이신, 리모시딘, 필리핀, 니스타틴 및 캔디신으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항진균제일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 폴리엔계 항진균제는 암포테리신 B일 수 있다. 한 측면에서, 아졸계 항진균제는 케토코나졸, 플루코나졸, 이트라코나졸, 및 보리코나졸로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항진균제일 수 있다.

다른 구체예에서, 상기 항진균용 의약 조성물은 크립토코쿠스 네오포만스의 Ssk1, Tco2, Ssk2, Pbs2 및 Hog1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질에 대한 저해제와 순차적으로 또는 동시에 투여되는 것일 수 있다. 하기 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 크립토코쿠스 네오포만스의 CAC1 또는 PKA1, 의 발현을 저해함과 동시에 HOG1의 발현을 저해할 경우 암포테리신 B에 대한 감수성이 상승적으로 증진되었다. 이는 이전 연구에서 밝힌 HOG 경로의 유전자들을 저해할 경우 에르고스테롤의 생합성이 증진되어 암포테리신 B에 대한 감수성이 증진된다(대한민국특허출원 제2009-0001947호)는 것과는 다른 메커니즘에 의해 cAMP-경로의 유전자들이 암포테리신 B에 대한 감수성을 증진시키기 때문인 것으로 나타났다.

이러한 측면에서, 본 발명은 또한 상기 본 발명의 저해제를 포함하는 항진균용 의약 조성물; 및 폴리엔계 항진균제, 아졸계 항진균제 및 크립토코쿠스 네오포만스의 Ssk1, Tco2, Ssk2, Pbs2 및 Hog1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자에 대한 저해제로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항진균제를 포함하는 항진균 복합 제제를 제공한다. 바람직 하게는, 상기 항진균 복합 제제는 본 발명의 저해제를 포함하는 항진균용 의약 조성물, 폴리엔계 항진균제, 및 크립토코쿠스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)의 Ssk1, Tco2, Ssk2, Pbs2 및 Hog1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자에 대한 저해제로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항진균제를 포함할 수 있다.

본 발명의 항진균용 의약 조성물 또는 항진균 복합 제제는 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다.

본 발명의 항진균용 의약 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 의약 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.

본 발명의 의약 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료, 또는 뼈 성장 유도 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 저해제는 1일 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 폴리펩타이드, 단백질 또는 항체일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 안티센스올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNAi, miRNA일 경우 0.01ng/kg~10g/kg의 용량으로 투여할 수 있다.

본 발명에 있어서, '대상체'는 인간, 오랑우탄, 침팬지, 마우스, 랫트, 개, 소, 닭, 돼지, 염소, 양 등을 포함하나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

또한 본 발명은 항진균제의 스크리닝을 위한 크립토코쿠스 네오포만스의 Ras1, Ras2, Cdc24, Gpa1, Cac1, Aca1, Pka1, Hsp12 및 Hsp122로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 용도, 상기 단백질을 포함하는 항진균제 스크리닝용 조성물, 후보물질과 상기 단백질을 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 단백질의 활성을 저해하는지 또는 촉진하는지를 판단하는 것을 포함하는 항진균제의 스크리닝 방법을 제공한다.

마찬가지로, 본 발명은 또한 항진균제의 스크리닝을 위한 크립토코쿠스 네오포만스의 RAS1, RAS2, CDC24, GPA1, CAC1, ACA1, PKA1, HSP12 및 HSP122로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 용도, 상기 유전자를 포함하는 항진균제 스크리닝용 조성물, 후보물질과 상기 유전자를 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 유전자의 발현을 저해하는지 또는 촉진하는지를 판단하는 것을 포함하는 항진균제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 항진균제의 스크리닝을 위하여 크립토코쿠스 네오포만스의 Gpa1과 Cac1 사이, Cac1과 Aca1 사이, 혹은 Ras1과 Cdc24 사이, Ras2와 Cdc24 단백질 사이의 물리적 접촉을 모니터링 할 수 있는 yeast two-hybrid system에 의한 항진균제 스크리닝 방법을 제공한다. 이 방법을 이용하면 대용량의 후보물질을 빠른 시간에 스크리닝할 수 있는 장점이 있다.

앞서 언급한 바와 같이, 크립토코쿠스 네오포만스의 RAS1, RAS2, CDC24, GPA1, CAC1, ACA1, PKA1, HSP12 또는 HSP122를 저해하면 RAS 또는 cAMP 신호전달계가 차단되어 폴리엔계 또는 아졸계 항진균제에 대한 감수성이 증가한다. 따라서 상 기 단백질 또는 유전자를 저해하는 것으로 스크리닝된 물질은 상기 폴리엔계 또는 아졸계 항진균제와 함께 사용하여 진균 살상능을 증진시켜주는 항진균제로서 사용될 수 있다.

상기 단백질 또는 유전자와 후보물질 간의 반응 확인은 단백질-단백질, 단백질-화합물, DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-단백질, DNA-화합물, RNA-단백질, RNA-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들면, 생체 외부에서(in vitro) 상기 유전자와 후보 물질 사이의 결합 여부를 확인하기 위한 혼성화 시험, 포유류 세포와 시험대상물질을 반응시킨 후 노던 분석, 정량적 PCR, 정량적 실시간 PCR 등을 통한 상기 유전자의 발현율 측정 방법, 또는 상기 유전자에 리포터 유전자를 연결시켜 세포 내로 도입한 후 시험대상물질과 반응시키고 리포터 단백질의 발현율을 측정하는 방법, 상기 단백질과 후보 물질을 반응시킨 후 활성을 측정하는 방법, 효모 이중 혼성법(yeast two-hybrid), Idbf 단백질에 결합하는 파지 디스플레이 펩티드 클론(phage-displayed peptide clone)의 검색, 천연물 및 화학물질 라이브러리(chemical library) 등을 이용한 HTS(high throughput screening), 드럭 히트 HTS(drug hit HTS), 세포 기반 스크리닝(cell-based screening), 또는 DNA 어레이(DNA array)를 이용하는 스크리닝법 등을 사용할 수 있다.

상기 스크리닝용 조성물은 상기 단백질 또는 유전자 외에도, 핵산 또는 단백질의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다. 또한 상기 스크리닝용 조성물은 생체 내(in vivo) 실험을 위해, 상기 단백질 또는 유전자 를 발현하는 세포, 또는 전사율을 조절할 수 있는 프로모터 하에 상기 유전자를 발현하는 플라스미드를 함유하는 세포 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에서, 시험대상물질은 통상적인 선정방식에 따라 RAS 또는 cAMP 신호전달계에 의한 신호 전달을 저해하는 의약으로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 펩타이드, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.

본 발명에서 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)) 및 프레드릭 등의 문헌(Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volume 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc. (1994))에 개시되어 있는 내용에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

[실시예]

<실험 방법>

균주 및 배양 조건

본 실시예에 사용된 크립토코쿠스 네오포만스는 표 1에 나타나 있다. 크립토코쿠스 네오포만스는 별도의 표시가 없으면 이스트 추출물-펩톤-덱스트로스(YPD) 배지에서 배양되었다.

DNA 마이크로어레이에 의한 전사체 분석

DNA 마이크로어레이 분석을 위해 전체 RNA를 다음과 같이 분리하였다. 야생형 H99, ras1D (YSB51), aca1D (YSB6), gpa1D (YSB83), cac1D (YSB42), 및 pka1D pka2D (YSB200) 돌연변이 균주들을 50 ml YPD 배지에서 30℃로 16시간 배양했다. 그 후 5 ml의 overnight 배양액을 100 ml의 신선한 YPD 배지로 접종하고, 600 nm에서 흡광도(OD)가 대략 1.0에 이를 때까지(OD_600nm = 1.0) 30℃에서 4-5시간 더 배양하였다. 그 후, 배양액을 액체 질소에서 급속히 냉각하고 밤새 동결 건조(lyophilze)하였다. DNA 마이크로어레이를 위한 생물학적 복제물로서, 각각의 균주에 대한 3개의 독립적인 컬쳐들을 전체 RNA 분리를 위해 제조하였다.

[표 1]

균주	유전자형	모균주	참고
항원형 A
H99	MATa		{Perfect, 1993 #78}
KN99	MAT a		{Nielsen, 2003 #19}
CBN45	MATa ras1D::NEO	H99	{Nichols, 2009 #906}
CBN64	MATa ras1D::NEO RAS1::NAT	CBN45	{Nichols, 2009 #906}
MWC12	MATa ras2D::URA5	H99	{Waugh, 2002 #8}
CBN32	MATa cdc24D::NEO	H99	(Alspaugh et al., 2007)
CBN33	MATa cdc24D::NEO CDC24::NAT	CBN32	(Alspaugh et al., 2007)
YSB6	MATa aca1D::NAT-STM#43	H99	{Bahn, 2004 #94}
YSB51	MATa ras1D::NAT-STM#150	H99	{Bahn, 2004 #94}
YSB53	MATa ras1D::NAT-STM#150	H99	{Bahn, 2004 #94}
YSB64	MATa hog1D::NAT-STM#177	H99	{Bahn, 2005 #167}
YSB73	MAT a ras1D::NEO	H99	{Bahn, 2004 #94}
YSB42	MATa cac1D::NAT-STM#159	H99	{Bahn, 2004 #94}
YSB83	MATa gpa1D::NAT	H99	{Bahn, 2004 #94}
YSB188	MATa pka1D::NAT	H99	{Bahn, 2004 #94}
YSB194	MATa pka2D::NAT-STM#205	H99	{Bahn, 2004 #94}
YSB200	MATa pka1D::NAT pka2D::NEO	YSB188	{Bahn, 2004 #94}
YSB174	MATa aca1D::NAT-STM#43 ras1::NEO	YSB278	{Bahn, 2004 #94}
YSB182	MATa cac1D::NAT-STM#159 ras1::NEO	H99	{Bahn, 2004 #94}
YSB156	MATa hog1D::NAT-STM#177 cac1::NEO	H99	This study
YSB112	MATa ura5 pka1::URA5 hog1::NATSTM#177	H99	{Bahn, 2005 #167}
YSB58	MAT a aca1D::NEO	KN99	{Bahn, 2004 #94}
YSB79	MAT a cac1D::NEO	KN99	{Bahn, 2004 #94}
YSB81	MAT a hog1D::NEO	KN99	{Bahn, 2005 #167}
YSB175	MATa aca1::NEO ras1::NATSTM#150	YSB58	{Bahn, 2004 #94}
YSB187	MATa cac1::NEO ras1::NATSTM#150	YSB79	This study
YSB606	MATa gre2D::NAT-STM#224	H99	This study
YSB607	MATa gre2D::NAT-STM#224	H99	This study
YSB609	MATa pkp1D::NAT-STM#224	H99	This study
YSB610	MATa pkp1D::NAT-STM#224	H99	This study
YSB599	MATa hsp12D::NAT-STM#224	H99	This study
YSB600	MATa hsp12D::NAT-STM#224	H99	This study
YSB603	MATa hsp122D::NAT-STM#224	H99	This study
YSB604	MATa hsp122D::NAT-STM#224	H99	This study

Each NAT-STM# indicates the Nat^r marker with a unique signature tag.

Total RNA 제조

Total RNA의 분리를 위하여, 동결 건조된 세포입자들에 3 ml 부피의 무균 3mm 유리구슬을 넣고(SIGMUND LINDER) 흔들어서 균질화하였으며, 4 ml의 TRizol 시약을 넣고 실온에서 5분간 배양하였다. 그리고 나서 800 ㎕ 의 클로로포름을 넣고 실온에서 3분간 배양하였으며, 15 ml의 둥근바닥 튜브(SPL)에 옮겨 4℃에서 15분간 10,000 rpm으로 원심분리하였다 (Sorvall SS-34 rotor). 2 ml의 상등액을 새로운 둥근바닥 튜브로 옮기고 2ml 이소프로파놀을 더하여 몇 번 거꾸로 뒤집은 후 실온에서 10분간 배양하였다. 그 후 혼합물을 4℃에서 10분간 10,000 rpm으로 재원심분리하였고, 그것의 침전물을 디에틸피로카보네이트(DEPC) 처리된 물로 희석한 75% 에탄올 4 ml로 씻었다. 침전물은 실온에서 건조하였고 500 ㎕ DEPC 처리된 물로 다시 씻었다. 전체 RNA 샘플의 농도와 순도는 각각 OD_260nm 와 겔 전기영동에 의해 측정하였다. 컨트롤 전체 RNA(Cy3 표지 위함)를 위해, 상기 기술한 조건에서 배양된 야생형, ras1D, gpa1D, aca1D, cac1D 및 skn7D 돌연변이 세포들로부터 제조된 모든 전체 RNAs가 pooled 되었다(pooled reference RNAs).

cDNA 합성과 Cy3/Cy5 표지

cDNA 합성을 위해 전체 RNA 농도를 DEPC 처리된 물로 1 ㎍/㎕로 조절하고, 15㎕의 전체 RNA(15㎍)과 1㎕의 5 ㎍/㎕ 올리고 dT (5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTV-3'/pdN6 (Amersham)(1:1 혼합물 10 ㎍/㎕, 각각)를 첨가하여 70℃에서 10분간 배양 한 후, 얼음에 10분 두었다. 그리고 나서 15 ㎕의 cDNA 합성 혼합물 {3㎕ 0.1 M DTT, 0.5 RNasin [Promega], 0.6 ㎕ aa-dUTP (5-(3-아미노알릴)-2'-데옥시우리딘 5'-트리포스페이트)/dNTPs [ 6 ㎕ dTTP (100 mM), 4 ㎕ aa-dUTP (100 mM), 10 ㎕dATP (100 mM), 10 ㎕ dCTP (100 mM), 10 ㎕ dGTP (100 mM) 혼합물], 1.5 ㎕ AffinityScript 역전사효소 (Stratagene), 3 ㎕ AffinityScript 버퍼, 7 ㎕ 물]을 첨가하였고 42℃에서 2시간 동안 배양하였다. 그리고 나서 10 ㎕의 1N NaOG와 10 ㎕의 0.5M EDTA(pH 8.0)을 첨가하여 65℃에서 15분 배양하였다. 배양 후에 25 ㎕의 1M HEPES 버퍼(pH 8.0)와 450 ㎕의 DEPE-처리된 물을 첨가하였고, 전체 혼합물은 미크로콘30 필터(밀리포어)를 통해 농축되어 1시간 진공건조 되었다.

준비된 cDNA의 Cy3과 Cy5 표지를 위해, Cy3과 Cy5가 10 ㎕ DMSO와 1.25 ㎕의 각 염료로 용해되어 분리된 튜브로 나누어졌다. 상기 기술된 대로 제조된 cDNA와 9 ㎕의 0.05M Na-비카보네이트(pH 8.0)를 첨가하여 실온에서 15분간 배양하였다. pooled 참조 RNAs로부터 제조된 cDNAs는 대조군으로서 Cy3과 혼합되었고 각각의 테스트 RNA(각 실험 조건)으로부터 제조된 cDNAs는 Cy5와 혼합되었다. 각 혼합물은 어두운 실온에서 1시간 더 배양되었고 QIAquick PCR 정제 키트(QIAGEN)에 의해 정제되었다.

마이크로어레이 혼성화와 세척

7,936개의 스팟을 포함하는 크립토코쿠스 네오포만스 항원형 D 70-mer 마이크로어레이 슬라이드(Duke 대학교)를 42℃에서 pre-hydridization 버퍼[42.4 ml 무 균 증류수, 2 ml 30% BSA (Sigma), 600㎕ 10% SDS, 15 ml 20x SSC]에서 반응시키고, 증류수와 이소프로파놀로 세척하고 잠시 원심분리 하였다.(110xg, 2분) Cy3와 Cy5-표지된 cDNA 샘플들이 결합되었고 마이크로콘 30 필터를 통해 농축되고 진공건조 되었다. 건조된 cDNA 샘플들은 hybridization 버퍼[250 ㎕ 50% 포름아미드, 125 ㎕ 20x SSC, 5 ㎕ 10% SDS, 120 ㎕ dH₂O, 전체 500 ㎕]로 다시 처리하고 1 ㎕ poly-A tail DNA (Sigma)를 더한 뒤 100℃에서 3분간 더 배양하고 실온에서 5분간 식혔다. 마이크로어레이 슬라이드들은 hybridization chamber(DieTech)로 정렬되었고 먼지는 제거되었으며 Lifterslips(Erie Scientific)으로 덮혔다. Cy3/Cy5-표지된 cDNA 샘플들은 Lifterslips과 슬라이드 사이에 도포되었다. 슬라이드가 건조되는 것을 막기 위해, 10 ㎕의 3x SSC 버퍼가 슬라이드에 도포되었고, 슬라이드는 이후 42℃에서 16시간 배양되었다. 배양 후, 마이크로어레이 슬라이드들은 오비탈 교반기에서 세 가지 다른 washing 버퍼 [washing 버퍼 1 (10 ml 20x SSC, 600 ㎕ 10% SDS, 189.4 ml dH₂O, 42℃에서 예열됨), washing 버퍼 2 (3.5 ml 20x SSC, 346.5 ml dH₂O), washing 버퍼 3 (0.88 ml 20x SSC, 349.12 ml dH₂O)]로 각각 2, 5, 5분 세척하였다.

각각의 전체 RNA 샘플에 대하여, 1-염료 교환(dye-swap) 실험을 포함하여, 3개의 독립적인 DNA 마이크로어레이가 3개의 독립적인 생물학적 복제물을 가지고 수행되었다.

마이크로어레이 슬라이드 스캐닝과 데이터 분석

혼성화와 세척 후에, 마이크로어레이 슬라이드들을 GenePix 4000B 스캐너 (Axon Instrument)로 스캔하였고 신호들은 GenePix Pro (버전 4.0)와 갈 파일(gal file)(http://genome.wustl.edu/activity/ma/cneoformans)로 분석하였다. 우리는 항원형 A 크립토코쿠스 네오포만스 균주로부터 단리된 전체 RNAs를 이용하였으므로, 상응하는 항원형 A 유전자 ID를 찾기 위해 blastp 조사(e값 범위: e-4)를 이용하여 항원형 D 크립토코쿠스 네오포만스 슬라이드에 프린트된 70-mer 올리고뉴클레오티드 서열을 항원형 A 크립토코쿠스 네오포만스 게놈 데이터베이스에 대해 조사하였다. 항원형 A 유전자 서열을 사용하여 각 S. cerevisiae에 유전자 이름 또는 표에 나열된 ID가 blastp 조사(e값 범위: e-4)에 의해 밝혀졌다.

계층과 통계학적인 분석을 위하여, GenePix 소프트웨어로부터 이송된 데이터는 LOWESS 표준화를 이용한 GeneSpring (Agilent), 신뢰성 높은 유전자 필터링, 클러스터링(표준 상관과 평균 연결), 제로-트랜스포메이션, ANOVA 분석으로 분석하였다 (P값<0.01).

cAMP 신호전달 의존 유전자의 파괴

유전자의 파괴를 위해, 각각의 유전자에 대한 지노믹 DNA 구조(엑손 및 인트론)의 정보를 serotype A C. neoformans 지놈 데이터베이스(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/cryptococcus_neoformans/MultiHome.html). Bahn et al., 2005, Davidson et al., 2002 에서 기술한 바와 같 이, C. neoformans 항원형 A H99 균주에서 GRE2 (CNAG_02182.2), HSP12 (CNAG_03143.2), PKP1 (CNAG_00396.2), 및 CAR1 (CNAG_06576.2) 유전자들을 split markers 및 biolistic transformation로 overlap PCR 또는 double joint PCR (DJ-PCR)에 의해 제거하였다. 각각의 유전자에 대한 5' 및 3' flanking regions의 생성을 위한 프라이머는 표 2에 기재되어 있다. 금 마이크로캐리어 비드 (0.8~1.2-mm [Bioworld Inc] 또는 0.6-mm [BioRad])를 overlap PCR에 의해 생산된 젤-추출된 제거 카세트(gel-extracted deletion cassettes)로 코팅하고 H99 균주로 형질전환하였다. nourseothricin 또는 G418을 함유하는 YPD 배지에서 선택된 안정적인 형질전환체들에 대해 표 2에 기재된 프라이머로 diagnostic PCR에 의해 일차 스크리닝을 수행하였다. 양성 돌연변이체들은 표 2에 나열된 프라이머에 의해 제조된 유전자 특이적 프로브를 이용하여 추가로 Southern blot 분석에 의해 확인하였다(도 1).

[표 2]

프라이머 명칭	서열	설명
B79	TGTGGATGCTGGCGGAGGATA	Screening primer on ACT promtre
B1026	GTAAAACGACGGCCAGTGAGC	M13 forward (extended)
B1027	CAGGAAACAGCTATGACCATG	M13 reverse (extended)
B1614	TGTTTAGCACCAGCGGAGTC	HSP12 - 5' screening primer
B1615	CACGATGAAAGTGCGTTGAAG	HSP12 - left flanking primer 1
B1616	GCTCACTGGCCGTCGTTTTACACTGTCGGTGAAAGATTGC	HSP12 - left flanking primer 2
B1617	CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAGAACGACAACCAGGAGTC	HSP12 - right flanking primer 1
B1618	GCTCTGTGCTGACATTATCTGC	HSP12 - right flanking primer 2
B1707	GAAAGTGCGTTGAAGTGATG	HSP12 - probe primer 1
B1708	AGTAGAAGCAGCGGACTAAAG	HSP12 - probe primer 2
B1619	GCGTAGTGGAGATTGGTTTC	GRE2 - 5' screening primer
B1620	ATCCCCTCCACTTTACCTCC	GRE2 - left flanking primer 1
B1621	GCTCACTGGCCGTCGTTTTACAAGTCTCCCTTAGCGATAG	GRE2 - left flanking primer 2
B1622	CATGGTCATAGCTGTTTCCTGACCACACCCCTGAAGAAAC	GRE2 - right flanking primer 1
B1623	AACTGTTTCGTCTTGTGTGC	GRE2 - right flanking primer 2
B1705	ATAGCAACTTCTTCCGTCG	GRE2 - probe primer 1
B1706	TGTTGCCTGTGCTCACTTG	GRE2 - probe primer 2
B1694	GGAAGACTTGGTAGGCAAAAC	CAR1 - 5' screening primer
B1629	CCTCTGACAGCCACATACTG	PKP1 - 5' screening primer
B1630	AATGAAGTTCCTGCGACAG	PKP1 - left flanking primer 1
B1631	GCTCACTGGCCGTCGTTTTACAATGGGATGAGAACGCAC	PKP1 - left flanking primer 2
B1632	CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAGCATTTTCCAGCATCAGC	PKP1 - right flanking primer 1
B1633	GGTGTGGAACATCTTTTGAG	PKP1 - right flanking primer 2
B1711	CTGGTTCATCTTGGGTGTC	PKP1 - probe primer 1
B1712	TCTGAGCATACCACTCCTTTAC	PKP1 - probe primer 2
B1666	TCTCATTCGCATCCTCTG	HSP122 - 5' screening primer
B1667	GTTGGGCAGATAATGTTTGTG	HSP122 - left flanking primer 1
B1668	GCTCACTGGCCGTCGTTTTACACGGCGTCAGACATTGTG	HSP122 - left flanking primer 2
B1669	CATGGTCATAGCTGTTTCCTGACAAGAGAAGTCCACTACTCAG	HSP122- right flanking primer 1
B1670	GCAAGGTAATGATGAGCG	HSP122- right flanking primer 2
B1709	GCGACTGAGATGTAGACCAAC	HSP122 - probe primer 1
B1710	CTCGGAACGACATAATAAGC	HSP122 - probe primer 2

에르고스테롤 분석

에르고스테롤 함량은 "Arthington-Skaggs BA, Jradi H, Desai T, Morrison CJ (1999) Quantitation of ergosterol content: novel method for determination of fluconazole susceptibility of Candida albicans. J Clin Microbiol 37: 3332-3337"에서 설명된 방법을 약간 변형하여 측정하였다. 간략히 설명하면, 각 크립토코쿠스 네오포르만 균주를 100 ml YPD 배지에서 30℃에서 24시간 동안 배양했다. 100 ml 배양액은 중복 측정을 위하여 두 개의 50 ml 배양액으로 분리하여 테이블탑 원심분리기에서 침전하고 증류수로 세척하였다. 세포 침전물을 액체 질소에서 냉각하고 밤새 동결건조 하였다. 건조된 세포 침전물은 에르고스테롤 함량의 표준화를 위해 무게를 재고, 5 ml의 25% 알코올성 포타슘 히드록시드를 첨가하고 무균 봉규산 유리 스크류-캡 튜브로 옮겼다. 그 후에 세포들은 80℃에서 1시간 배양되었고 실온에서 식혔다. 그리고 나서 1 ml의 증류수와 3 ml의 헵탄을 넣고 3분 동안 교반했다. 그리고 200 ㎕의 헵텐층을 샘플 추출하고 800 ㎕의 100% 에탄올과 혼합하였으며, 그것의 광학밀도(OD)를 281.5nm와 230nm 모두에서 측정하였다. 에르고스테롤 함량은 다음과 같이 계산하였다: % 에르고스테롤 = [(OD_281.5nm/290) x F]/세포침전물 무게 - [(OD_230nm/518) x F]/세포침전물 무게), 여기에서, F는 에탄올 희석 인자이고 290과 518은 각각 결정 에르고스테롤과 24(28) 데히드로에르고스테롤을 결정하는 E값(퍼센테이지/센티미터)이다.

항균제 민감도 테스트

"Bahn YS, Kojima K, Cox GM, Heitman J (2005) Mol Biol Cell 16: 2285-2300." 및 "Bahn YS, Kojima K, Cox GM, Heitman J (2006) Mol Biol Cell 17: 3122-3135"에서 기술한 방법과 같이, 각 균주를 YPD 배지에서 밤새 30℃로 배양하여 세척한 후 dH₂O에서 순차적으로 희석하고(1 내지 10⁴ 희석도), 지시된 농도의 항진균 약제 테스트를 위한 암포테리신 B, 플루코나졸, 케토코나졸, 이트라코나졸 및 플루디옥소닐을 포함한 고체 YPD 배지로 스팟팅하였다. 그런 다음, 스팟팅된 세포들을 30℃에서 2 내지 4일 동안 인큐베이션하고 사진을 찍었다.

<실시예 1> 크립토코쿠스 네오포만스의 ras1D, aca1D, gpa1D, cac1D, 및 pka1D pka2D 돌연변이의 전사체 비교 분석

Ras1-, Aca1-, 및 Gpa1-의존 신호전달 경로의 하위체계 신호전달 네트워크를 비교하기 위해, 위에서 설명한 DNA 마이크로어레이 분석방법을 사용하여 항원형 A 야생형 (WT, H99) 균주, ras1D, aca1D, gpa1D, cac1D, 및 pka1D pka2D 돌연변이의 전사체 비교분석을 수행하였다. 분석 품질의 기본적인 검증을 위해, 어레이 데이터 내의 RAS1, ACA1, GPA1, CAC1, PKA1, 및 PKA2 유전자의 발현 수준을 체크하였다. 각각 상응하는 돌연변이에서의 RAS1, ACA1, GPA1, CAC1, PKA1, 및 PKA2의 상대적인 발현은 야생형 쥰주에서의 발현에 비해 매우 낮았다 (각각 0.08, 0.03, 0.09, 0.06, 0.07, 및 0.12) (도 1A). 이는 상기 어레이의 품질을 뒷받침한다.

이 DNA 마이크로 어레이에 의해 모니터된 총 7,936 개의 유전자로부터, 565개의 유전자들이 야생형 균주와 비교하여 통계적으로 유의한 수준으로 Ras- 및 cAMP 돌연변이에서 상이한 발현 패턴을 나타냈다(ANOVA test, P < 0.05) (도 1B). Ras- 또는 cAMP-의존적 유전자의 계층적 클러스터링 분석은 몇가지 중요한 사실에 다다랐다. 첫번째, Ras1-신호전달 경로에 의해 좌우되는 전사체 패턴은 cAMP/PKA-신호전달 경로에 의해 조절되는 것과는 구별된다. 통계학적 분석은 총 400 개의 유전자의 기초 발현 수준이 야생형과 비교할 때 ras1D 돌연변이에서 유의하게 변화하였고, 반면 132개의 유전자의 발현 수준이 aca1D, gpa1D, cac1D, 및 pka1D pka2D 돌연변이에서 유의하게 변화하였다 (도 1C 및 1D). 조절되는 유전자의 수뿐만 아니라, 주요 Ras1-의존성 유전자의 발현 패턴 또한 cAMP-의존성 유전자의 발현 패턴과는 구별되었으며, 이는 C. neoformans에서 Ras1-신호전달 경로가 cAMP-신호전달 경로와는 매우 독립적임을 지지해 준다. 둘째, aca1D 및 gpa1D 돌연변이는 cac1D 및 pka1D pka2D 돌연변이와 유사한 전사체 패턴을 보였으며, 이는 Aca1 및 Gpa1이 cAMP-신호전달 경로에 있어서 두 개의 주요한 신호전달 조절자임을 나타낸다 (도 1D). aca1D 및 gpa1D 돌연변이 간에 발현이 상이하게 조절되는 소그룹의 유전자들이 있었다. 이는 Aca1 및 Gpa1이 다른 비주류의 신호전달 가지를 가질 수 있음을 나타낸다(도 1D). 기대했던 대로, cac1D 돌연변이는 pka1D pka2D 와 거의 동일한 유전체 발현 패턴을 나타냈으며, 이는 추가로 C. neoformans에서 아데닐일 사이클라제의 필요하고 충분한 단백질 키나아제 단백질 하위체계임을 제시한다(도 1D).

Ras- 및 cAMP-신호전달 경로에 의해 조절되는 유전자들은 넣고 다양한 세포 기능을 커버한다(도 2). cAMP-신호전달 의존적 유전자들은 신호 유도 메커니즘 (15.2%), 탄수화물 수송 및 대사 (9.6%), 및 아미노산 수송 및 대사(8.0%)에 연관된 것들에 대해 걸쳐 나타난다. cAMP-경로는 성장, 분화, 및 C. 네오포만스의 병독력을 조절하는 중추 신호 유도 케스케이드 중 하나이고, 글루코스 및 아미노산을 센싱하는 것으로 알려져 있었으므로 (Bahn et al., 2004, Xue et al., 2006) 이는 다소 예측된 결과였다. 유사하게, 신호 유도 메커니즘에 관련된 유전자들이 대부분 ras1D 돌연변이에서 대부분에 걸쳐 나타났다 (12.1%) (도 2). 그러나, cAMP-경로와는 대조적으로, 세포벽/막/껍질 생합성에 관련된 유전자들이 전반적으로 나타났으며 (2.9%), 이는 Ras1이 세포벽 완전성의 유지에 연관되어 있을 것임을 암시한다.

Ras- 및 cAMP-의존적 유전자 중 유의한 비율이 환경적 스트레스에 조절되는 것으로 나타났다 (도 3). 우리의 이전 분석은 크립토코쿠스 네오포만스 에서의 많은 ESR (Environmental Stress Regulated) 유전자를 발견했었다 (Ko et al., 2009). 총 1,959개의 유전자들이 삼투압 스트레스, 산화적 스트레스 또는 항진균제(플루디옥소닐) 처리에 반응하여 2배 이상 상향조절되거나 하향조절됨이 발견되었다 (Ko et al., 2009). 흥미롭게도, 우리의 금번 어레이 분석은 ESR 유전자 (총 225개의 ESR 유전자)의 한 서브세트가 야생형 균주와 비교하여 ras1D 또는 cAMP에서 발현 수준에 유의한 변화를 나타냄을 밝혔다 (ANOVA test, P < 0.05) (데이터 미도시). 이들 중, 86개의 ESR 유전자는 돌연변이에서의 2배 이상의 유도 또는 감소를 나타냈다 (도 3). 나아가, 총 55개의 CSR (Common Stress Response) 유전자가 상이하게 조절됨이 발견되었으며 (ANOVA test, P < 0.05), 그들 중 31개의 유전자가 돌연변이에서 2배 이상의 유도 또는 감소를 나타내었다 (도 3). Ras- 또는 cAMP-경로-의존적 ESR 및 CSR 유전자의 상당 비율은 유의한 상동성을 갖는 어떠한 다른 호모로그도 갖지 않았다. 그럼에도 불구하고, 이들 결과는 Ras- 및 cAMP-신호전달 경로가 크립토코쿠스 네오포만스의 다양한 스트레스 반응에 관련되어 있음을 암시했다.

<실시예 2> 크립토코쿠스 네오포만스에서의 Ras- 또는 cAMP-의존적 유전자의 확인

실시예 1의 전사체 분석에 의해 확인된 개별적인 Ras1- 및 cAMP-의존적 유전자를 조사했다.

선택된 161개의 Ras-의존적 유전자 (2-fold cutoff, 도 1C) 중에서, 그들 중 다수(101 유전자, 63%)는 다른 균류에서의 어떠한 ortholog도 갖지 않았는데, 이는 크립토코쿠스 네오포만스가 독특한 세트의Ras-의존적 유전자를 포함함을 제시한다. 진화적으로 보존된Ras-의존적 유전자 중에서, 그의 ortholog가 S. cerevisiae 에서 Rho-GTPase Cdc42의 조절에 연관되어 있는 것으로 알려진 세 개의 유전자, PXL1, RDI1, 및 BEM3는 Ras1-Cdc24 신호전달 경로가 크립토코쿠스 네오포만스 에서의 Cdc42 호모로그 중 하나에 의해 조절됨이 보고된 바 있으므로 주목할만 했다 (Nichols et al., 2007). RDI1 및 BEM3는 각각 Rho-GDP 해리 저해제 및 Rho-GTPase 활성화 단백질을 코딩한다 (Price et al., 2008, Zheng et al., 1994). 특히, 크립토코쿠스 네오포만스의 유전자독성 스트레스 반응에서의 Ras1의 역할과 잘 일치하여, DNA 손상 수복의 조절에 관련된 다수의 유전자들이 Ras-의존적 유전자로서 확인되었다. 이들은 RNR2/RNR3 (Ribonucleotide-diphosphate reductase), RAD3 (DNA helicase, a subunit of nucleotide excision repair factor 3), RAD14 (a subunit of nucleotide excision repair factor 1), MSH6 (a protein required for mismatch repair), MND1 (a protein required for recombination 및 repair of DNA double strand breaks), 및 DNA2 (ATP-의존적 뉴클레아제)를 포함한다. 최종적으로, 세포벽 완전성을 통제하는 것에 관련된 수 개의 유전자, CHS1 (Chitin synthase 1), CDA2 (Chitin deacetylase), BGL2 (glucan 1,3-b-glucosidase), 및 GSC2 (Glucan synthase)가 또한 Ras-의존적 유전자로서 확인되었으며, 이는 크립토코쿠스 네오포만스의 세포벽 완전성을 유지하는데 있어서의 Ras1의 역할을 추가로 뒷받침해준다.

cAMP 돌연변이 (aca1D, gpa1D, cac1D, 및 pka1D pka2D) 로부터 얻은 전사체 데이터와 야생형 균주(ANOVA, P < 0.05)와의 통계학적 비교 결과 163개의 유전자를 확인했다 (도 1C). 이들 중, 38개의 유전자는 CAC1, ACA1, PKA1, 및 GPA1 를 제외하고는, cAMP 돌연변이에서 보다 2배 이상의 유도 또는 감소를 나타냈다(도 4). 대다수의 cAMP-의존적 유전자 (31 유전자, 81%)는 크립토코쿠스 네오포만스에서의 어떠한 알려진 기능이나 S. cerevisiae에서의 orthorog는 갖지 않았는데, 이는 크립 토코쿠스 네오포만스가 Ras-의존적 유전자 와 유사하게 독특한 세트의 cAMP-의존적 유전자를 포함함을 나타낸다. 이러한 관찰은 추가로 크립토코쿠스 네오포만스 cAMP 돌연변이가 다른 균류에서 관찰된 적 없는 독특한 표현형적 특성을 가짐을 확증한다. 크립토코쿠스 네오포만스에서의 5개의 cAMP-의존적 유전자(GRE2, ENA1, HSP12, CAT1, 및 PKP1)가 다른 균류에서 진화적으로 보존되어 있는 것으로 나타났다. 흥미롭게도, GRE2, ENA1, 및 HSP12 유전자는 S. cerevisiae에서 환경적 스트레스에 의해 전사적으로 조절되는 것으로 알려져 있다. 크립토코쿠스 네오포만스에서, Ena1이 탄소 결핍 조건에서 삼투압 스트레스를 조절 (Ko et al., 2009) 할 뿐만 아니라, 염기성 pH 및 인 비보 독성에서의 생존을 위해 요구(Idnurm et al., 2009)되는 것으로 최근 보고된 바 있다. 포유동물 3-b-하이드록시스테로이드 디하이드로제나제의 호모로그인 GRE2 ( genes de r espuesta a e stres, stress-responsive gene)는, S. cerevisiae에서 프로모터 영역에서의 CRE (cAMP response element)에 HOG-의존적 Sko1 전사 인자가 결합할 때 삼투압 및 산화적 스트레스를 포함한 다양한 스트레스에 반응하여 강력하게 유도된다 (Garay-Arroyo & Covarrubias, 1999, Rep et al., 2001). Heat shock protein인 HSP12 (03143)는 그의 발현이 다양한 스트레스에 의해 유도되고 HOG 및 cAMP 신호전달 경로에 의해 조절되는 작은 소수성 단백질이다 (Varela et al., 1995). C. neoformans의 genome database의 분석결과 HSP12의 또 다른 homolog가 존재(여기서 HSP122로 명명, CNAG_01446.2)하고 HSP122 역시 그 본 어레이 분석과 northern 분석 결과 cAMP 및 HOG 신호전달체계에 의해 그 발현이 조절됨을 확인할 수 있었다.

<실시예3> Ras 및 cAMP-신호전달 경로의 저해에 따른 항진균제에 대한 반응 분석

GRE2는 ERG6, ERG10, 및 ERG19/MVD1을 포함한 일부 에르고스테롤 생합성 유전자의 조절에 관여한다(Warringer & Blomberg, 2006). 또한, GRE2는 S. cerevisiae에서 암포테리신 B (AmpB)에 저항하여 그의 발현이 증가되는 6개의 유전자 중 하나로 보고되었다(Anderson et al., 2009). 그러므로, 우리는 크립토코쿠스 네오포만스 Ras- 및 cAMP-돌연변이들이 야생형에 비해 AmpB 처리에 감수성이 있는지를 조사하였다.

그 결과, 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, ras1D 돌연변이는 야생형에 비해 AmpB에 대한 더 높은 감수성을 나타낸 반면, aca1D 돌연변이는 약간 더 높은 AmpB 감수성을 나타냈다(도 5A). ras1D aca1D 이중 돌연변이는 각각의 단독 돌연변이에 비해 더 높은 AmpB-민감성을 나타냈다 (도 5B). 이는 Ras1 및 Aca1이 중복적으로 또는 독립적으로 AmpB 민감성을 조절함을 나타낸다. Cdc24는 폴리엔 약물 저항성의 조절을 위해 Ras1의 다운스트림을 작동시키는 것으로 나타났다 (도 5C). 흥미롭게도, ras2D 돌연변이는 또한 야생형에 비해 약간 더 AmpB에 대해 민감성인 것으로 나타났는데, 이는 Ras 단백질들이 모두 크립토코쿠스 네오포만스에서 폴리엔 약물에 대한 저항성을 조절함을 나타낸다.

특히, gpa1D 및 cac1D 돌연변이는 야생형에 비해 훨씬 더 높은 AmpB-민감성을 나타냈으며, ras1D 또는 aca1D 돌연변이에 비해서도 더 높은 AmpB-민감성을 나 타냈다 (도 5A). Cac1 아데닐일 사이클라아제(adenylyl cyclase)의 하위체계, pka1D 돌연변이(pka2D 돌연변이는 아님)는 AmpB에 대해 증가된 감수성을 보였다 (도 5A). 이는 Gpa1-Cac1-Pka1 신호전달체계가 폴리엔 약물 민감성을 조절하기 위한 신호전달 회로의 하나임을 보여준다. ras1D cac1D 이중 돌연변이는 각각의 단독의 돌연변이에 비해 더 높은 AmpB 감수성을 나타냈는데 (도 5B), 이는 Ras- 및 Gpa1-Cac1-Pka1 경로가 AmpB 감수성과 독립적으로 연관되어 있음을 나타낸다. MAT a background (KN99 균주)에서 생성된 ras1D 및 ras1D cac1D 돌연변이는 동일한 표현형을 나타냈다(데이터 미도시).

폴리엔 민감성에 대한 Ras- 및 cAMP-경로의 관여가 에르고스테롤 생합성의 수준과 연관되어 있는지 확인하기 위해, 우리는 우리의 어레이 데이터로부터 돌연변이에서의 에르고스테롤 생합성의 발현 수준을 체크하였다. 흥미롭게도, ERG3 및 ERG25 (<2배 미만)를 제외하고는 어떠한 에르고스테롤 생합성 유전자도 ras1D, aca1D, gpa1D, cac1D, 또는 pka1D pka2D 돌연변이에서 야생형과 비교하여 에르고스테롤의 발현 수준의 변화를 나타내지 않았다. 노던 블롯 분석은 돌연변이에서의 ERG3 및 ERG25 유전자의 발현 수준이 야생형과 유의하게 다르지 않음을 보여주었다(도 5D). 우리는 또한 Ras- 및 cAMP-돌연변이에서의 세포적 에르고스테롤 함량을 조사하였고, 세포적 에르고스테롤 함량이 야생형에 비해 Ras- 및 cAMP-돌연변이에서 유의하게 증가하지 않음을 확인했다. 이는 이전의 보고에서 hog1D 돌연변이에서 에르고스테롤의 함량이 증가된 것과는 상반된다 (데이터 미도시) (Ko et al., 2009). 또한, ras1D 및 cAMP 돌연변이에서의 ERG11의 발현 수준은 야생형과 유의하 게 다르지 않았다(도 5D). 이러한 발견은, gpa1D, cac1D, pka1D, pka2D, 및 pka1D pka2D 돌연변이가 균류의 사이토크롬 P450 효소 14a-디메틸라아제를 타겟팅하고 라노스테롤의 에르고스테롤로의 전환을 저해하는 플루코나졸에 거의 저항성을 나타냈다는 점을 지지한다(데이터 미도시). 이러한 모든 데이터는 Ras 및 cAMP-신호전달 경로가 에르고스테롤 생합성에 영향을 미치지 않고 독립적으로 폴리엔 민감성에 영향을 미친다는 점을 강력하게 시사한다.

우리는 최근에 HOG 경로가 비스트레스 조건 하에서 크립토코쿠스 네오포만스의 에르고스테롤 생합성을 조절하며, HOG 경로 돌연변이는 돌연변이 내에 증가된 세포적 에르고스테롤 함량으로 인해 AmpB에 대해서는 과민감성이나, 플루코나졸에는 매우 높은 저항성을 나타냄을 보고한 바 있다 (Ko et al., 2009). 그러므로, HOG 및 cAMP 경로는 서로 다른 방식으로 폴리엔 민감성에 영향을 미친다는 것을 생각할 수 있다. 이를 뒷받침하는 것으로, 우리는 hog1D cac1D 및 hog1D pka1D 이중 돌연변이가 hog1D, cac1D, 또는 pka1D 단독의 돌연변이에 비해 AmpB 에 대해 보다 더 민감함을 발견했다 (도 5E). 예상치 못하게, hog1D cac1D 이중 돌연변이는 또한 플루코나졸, 케토코나졸 및 이트라코나졸과 같은 다양한 아졸계 약물에 대해 과민감성을 나타냈다 (도 5F). 흥미롭게도, ras1D, aca1D, gpa1D, cac1D, 및 pka1D 돌연변이는 모두 이트라코나졸에 대해 증가된 민감성을 보였다 (도 5G). 특히, Ras1 및 Ras2는 둘 다 Cdc24에 의존적인 방식으로 이트라코나졸 감수성에 관련된 것으로 나타났다(도 5H). 종합해 보면, 이들 데이터는 HOG 경로 및 cAMP-신호전달 경로가 독립적으로 폴리엔 및 아졸계 항진균제에 대한 감수성을 조절함을 나타낸다.

상기 분석 결과를 정리해 보면, 우리는 Ras- 및 cAMP-신호전달 경로가 크립토코쿠스 네오포만스에서 폴리엔계 또는 아졸계 항진균제에 대한 감수성을 조절한다는 것을 발혔다. Ras1 및 Ras2 모두 하위조절인자로서 Cdc24를 이용하여 폴리엔 감수성에 관여하는 것으로 나타났다. 흥미롭게도 ras1D aca1D 돌연변이 또한 암포테리신 B에 과민감성인 것으로 나타났다. 이는 Ras1 및 Aca1가 폴리엔계 약물에 대한 감수성에서 부차적인 역할을 할지도 모른다는 점을 제시한다. ras1 및 aca1 변이에 의해 동요된 세포골격 조절 및 세포벽 완전성이 세포를 폴리엔계 약물에 대해 보다 감수성이 있게 만들었을 가능성이 있다.

cAMP-신호전달 경로는 또한 Ras-신호전달 경로에 비해 폴리엔계 감수성에서 보다 더 유의하게 관련되어 있었다. GPA1, CAC1, 및 PKA1의 돌연변이는, 크립토코쿠스 네오포만스 세포를 암포테리신 B (AmpB)와 같은 폴리엔계 약물에 대해 과민감성이 되도록 했다. 우리는 최근에 HOG 경로의 동요가 또한 크립토코쿠스 네오포만스 세포를 AmpB에 대해 과민감성이 되도록 함을 보고한 바 있다 (Ko et al., 2009). 그러나, cAMP 및 HOG 경로는 폴리엔계 약물 감수성의 조절에 대해 상이하게 작용하는 것으로 보인다. HOG 경로는 에르고스테롤의 생합성을 증가시켜, 폴리엔계 약물의 감수성을 향상시키고 아졸계 약물의 저항성을 향상시킨다 (Ko et al., 2009). 또한, hog1D 돌연변이는 cAMP 돌연변이에 비해 AmpB에 대한 더 높은 감수성을 나타냈다.

<실시예 4> 크립토코쿠스 네오포만스의 항진균제 감수성에 대한 cAMP-의존적 유전자의 역할 분석

상기 살펴본 바와 같이, cAMP-신호전달 경로는 Ras-신호전달 경로에 비해 폴리엔계 감수성에서 보다 더 유의하게 관련되어 있는 것으로 나타났으므로, 우리는 크립토코쿠스 네오포만스의 항진균제 감수성에 대한 cAMP-의존적 유전자의 역할을 추가로 분석했다.

분석 결과, 폴리엔계 약물에 대한 cAMP 돌연변이의 과민감성은 두 개의 heat shock protein Hsp12의 C. neoformans homolog인 HSP12 (H99 gene ID: CNAG_03143.2)과 HSP122 (H99 gene ID: CNAG_01446.2)의 감소된 발현이 일부 기여하고 있는 것으로 나타났다 (도 6).

흥미롭게도, cac1D 돌연변이가 hsp12D 또는 hsp122D 돌연변이에 비해 AmpB 에 대한 감수성이 더 높긴 했으나, hsp12D 또는 hsp122D 돌연변이가 야생형에 비해 AmpB 에 대한 감수성이 약간 더 높은 것으로 나타났다 (도 6A). 그러므로, Hsp12 또는 HSP122의 감소된 발현은 AmpB에 대한 cAMP 돌연변이의 감수성에 기여할 것임을 생각할 수 있었다.

Hsp12 및 Hsp122의 조절 메커니즘을 보다 명확히 하기 위해, 우리는 cAMP-신호전달 경로가 Hsp12 및 Hsp122 유전자의 발현을 조정함을 확인하기 위해 Northern blot 분석을 수행하였다. S. cerevisiae에서, HSP12는 글루코스 풍부한 조건의 비스트레스 하에서는 발현되지 않으나, 환경적인 스트레스에 반응해 발현이 유도된다 (Praekelt & Meacock, 1990, Siderius et al., 1997). 그러나, 예기치 않게도, 크립토코쿠스 네오포만스에서 Hsp12 및 Hsp122 유전자는 글루코스가 풍부한 조건의 비스트레스 하에서 야생형 균주에서 매우 높게 발현되는 유전자로 나타났다 (도 6A). 마이크로어레이 데이터와 잘 일치하게도, Hsp12 및 Hsp122의발현은 gpa1D, cac1D, 및 pka1D pka2D 돌연변이들을 포함한 cAMP 돌연변이에서 유의하게 하향조절되었다(도 6A). aca1D 돌연변이 및 ras1D 돌연변이에서, Hsp12 및 Hsp122 유전자의 발현 수준은 약간만 영향을 받았다 (도 6A). 이들 데이터는 우리의 마이크로어레이 데이터를 확인해줄 뿐만 아니라 Hsp12 및 Hsp122가 cAMP-신호전달 경로에 의해 양성적으로 조절됨을 나타냈다.

흥미롭게도 우리의 이전 어레이 분석은 Hsp12 및 Hsp122가 HOG 경로의 조절하에 있을 수도 있음을 보여주었다. Hsp12 및 Hsp122 발현 수준은 hog1D 돌연변이 및 ssk1D 돌연변이에서 고려할만 하게 낮았으나, skn7D 돌연변이에서는 그렇지 않았다 (도 6B). 이를 확인하기 위해, 우리는 Northern blot 분석을 수행하였으며, Hsp12 및 Hsp122 의 발현 수준이 야생형 및 skn7D 돌연변이에서는 매우 높으나, hog1D 및 ssk1D 돌연변이에서는 탐지할 수 없음을 발견하였다(도 6B). 이 모든 데이터는 Hsp12 및 Hsp122 유전자가 cAMP 및 HOG 신호전달 경로에 의해 공동-조절됨을 나타낸다.

이상 살펴본 바와 같이, 폴리엔계 약물에 대한 cAMP 돌연변이의 과민감성은 heat shock protein Hsp12 및 Hsp122의 감소된 발현이 일부 기여하고 있는 것으로 나타났다. S. cerevisiae에서, Hsp12는 세포벽 유연제와 물 치환 분자로서 세포막을 안정화시키는데 역할을 하고 있으므로 (Sales et al., 2000, Shamrock & Lindsey, 2008) , S. cerevisiae에서 스트레스 조건 하에서 세포벽 완전성을 유지 하는데 관여한다 (Shamrock et al., 2009). 그러므로, hsp12D 돌연변이는 세포벽 불안정화제인 콩고 레드의 존재 하에서 자랄 수 없다 (Motshwene et al., 2004). 따라서, cAMP-신호전달 경로의 동요는 Hsp12의 기초발현 수준을 감소시키고, 이는 크립토코쿠스 네오포만스의 세포벽 완전성 및 막 유연성을 계속적으로 약화시킨다. 유사하게, 폴리엔계 약물에 대한 HOG 경로 돌연변이의 과민감성은 일부 HSP12의 감소된 발현에 기인한다. 그러나, cac1D 돌연변이가 hsc1D 돌연변이에 비해 AmpB에 대해 훨씬 더 민감성을 나타내므로, 에르고스테롤 생합성을 제외한 다른 인자들이 폴리엔계 약물에 대한 저항성에 영향을 줄지도 모른다. 이를 뒷받침하는 것으로, hog1D cac1D 또는 hog1D pka1D 이중 돌연변이는 각각의 단독의 돌연변이에 비해 훨씬 더 높은 폴리엔계 약물 민감성을 나타냈는데, 이는 두 개의 경로가 폴리엔계 약물 감수성에서 독립적인 역할을 함을 나타낸다. 특히, HOG1 및 CAC1 유전자의 이중 돌연변이는 크립토코쿠스 네오포만스 세포가 플루코나졸, 케토코나졸, 및 이트라코나졸을 포함한 대부분의 아졸계 약물에 대해 알수 없는 이유로 고민감성을 나타내도록 했다.

어떠한 경우에서도, Ras-, cAMP/PKA-, 및 HOG-신호전달 경로 (또는 그들의 조합)의 변형은 폴리엔계 및 아졸계 약물과의 배합에서의 새로운 항진균 치료 접근법을 제공할 것이다. 암포테리신 B와 같은 폴리엔계 약물로 치료할 때 cAMP 및 HOG 경로의 동시적 저해는 크립토코쿠스감염의 치료를 위한 가장 강력한 복합 요법의 하나가 될 수 있을 것이다.

도 1은 크립토코쿠스 네오포만스 ras1D, aca1D, gpa1D, cac1D, 및 pka1D pka2D 돌연변이의 전사체 분석 결과를 보여준다 (Fold 변화는 색으로 표현하였다).

도 2는 크립토코쿠스 네오포만스 ras1D, aca1D, gpa1D, cac1D, 및 pka1D pka2D 돌연변이에 의해 상이하게 조절되는 유전자들의 기능적인 카테고리를 보여준다.

도 3은 Ras- 및 cAMP-의존적 유전자 중 유의한 비율이 환경적 스트레스에 조절되는 것을 보여주는 결과이다.

도 4는 크립토코쿠스 네오포만스에서의 cAMP-신호전달 경로 의존적 유전자의 동정 결과를 보여주는 결과이다.

도 5는 Ras- 및 cAMP-신호전달 경로의 저해가 에르고스테롤 생합성과는 독립적으로 폴리엔계 또는 아졸계(이트라코나졸) 항진균제에 대한 민감성을 증가시킴을 보여주는 분석 결과이다.

도 6은 HSP12와 HSP122의 발현이 cAMP-와 HOG-신호전달 경로에 의해 양성적으로 조절되고, hsp12D와 hsp122D 돌연변이에 의해 폴리엔계 항진균제 대한 민감성을 증가시킴을 보여주는 분석 결과이다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Use of the genes in the Ras and cAMP pathway for treatment of fungal infection <130> P090999 <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 170 <212> PRT <213> Cryptococcus neoformans serotype A H99 strain <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(170) <223> an amino acid sequence of Ras1(CNAG_01672.2) <400> 1 Met Ser Gly Asn Gly His Tyr Arg Arg Asp Gln Arg Leu Val Val Val 1 5 10 15 Gly Cys Gly Ala Phe Arg Glu Tyr Asn Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr 20 25 30 Arg Lys Gln Val Val Val Asp Asn Glu Ala Thr Thr Leu Glu Ile Leu 35 40 45 Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr Ala Ala Met Ala Asp Gln Trp Tyr 50 55 60 Thr Phe Gly Ser Gly Phe Leu Leu Val Tyr Ser Leu Thr Asp Arg Ser 65 70 75 80 Ser Phe Glu Glu Ile Gln Asn Phe His Arg Glu Ile Leu Arg Val Lys 85 90 95 Asp Arg Asp Tyr Val Pro Cys Val Ile Ile Cys Asn Lys Cys Asp Leu 100 105 110 Gln Lys Tyr Arg Ser Val Gly Gln Leu Glu Gly Arg Glu Leu Ala Arg 115 120 125 Ser Val His Ala Pro Phe Ile Glu Cys Ser Ala Ala Glu Arg Val Asn 130 135 140 Val Asp Val Ala Phe Asn Glu Leu Val Lys Leu Val Arg Lys Asp Glu 145 150 155 160 Arg Val Arg Ile Asn Tyr Asp Ile Ala Phe 165 170 <210> 2 <211> 227 <212> PRT <213> Cryptococcus neoformans serotype A H99 strain <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(227) <223> an amino acid sequence of Ras2(CNAG_04762.2) <400> 2 Met Leu Phe Lys Ile Thr Val Leu Gly Asp Gly Gly Val Gly Lys Thr 1 5 10 15 Ala Ile Thr Val Gln Thr Cys Lys Thr Tyr Asp Pro Thr Ile Glu Asp 20 25 30 Cys Tyr Arg Lys Gln Trp Val Val Asp Glu Gln Pro Cys Leu Leu Glu 35 40 45 Val Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr Thr Ala Leu Arg Asp Gln 50 55 60 Trp Ile Arg Glu Gly Glu Gly Phe Leu Ile Val Tyr Ser Ile Thr Ser 65 70 75 80 Arg Pro Thr Phe Glu Arg Val Glu Arg Ile Val Glu Arg Val Leu Arg 85 90 95 Val Lys Asp Glu Ser Gly Leu Pro Leu Pro Pro Leu Ser Ser Ser Leu 100 105 110 Ser Asn Asp Pro Tyr Gly Leu Ala Thr Ser Arg Ser Thr Pro Thr Ser 115 120 125 Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Met Trp Ala Ala Arg 130 135 140 Val Pro Ile Val Ile Val Gly Asn Lys Lys Asp Met Phe His Ser Arg 145 150 155 160 Glu Val Ser Thr Asp Glu Gly Ala Ser Leu Ala Arg Arg Leu Gly Cys 165 170 175 Glu Phe Tyr Glu Ala Ser Ala Lys Thr Asn Ser Asn Val Glu Ala Ala 180 185 190 Phe Lys Cys Leu Val Lys Lys Ile Lys Leu Ala Lys Gln Gly Gly Val 195 200 205 Ala Val Gln Ala Glu Arg Val Gly Gly Arg Lys Lys Lys Gln Lys Cys 210 215 220 Val Val Leu 225 <210> 3 <211> 1112 <212> PRT <213> Cryptococcus neoformans serotype A H99 strain <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1112) <223> an amino acid sequence of Cdc24(CNAG_04243.2) <400> 3 Met Ser Val Ser Gly Pro Ile Ser Arg Arg Arg Ile Gly Ser Val Ser 1 5 10 15 Gln Arg Gly Asn Glu Ser Leu Pro Gln Leu Asp Ile Gln Ser Ile Gln 20 25 30 Met Pro Ser Asn Pro Gln Asn Ala Leu Ala Leu Lys Thr Ala Ala Leu 35 40 45 Ser Thr Ser Thr Arg Ser Leu His Gln Ile Cys Ser Ile Leu Lys Lys 50 55 60 Arg Leu Leu Cys Val Asp Gly Phe Lys Ala Phe Leu Glu Gln Pro Pro 65 70 75 80 Asn Ala Glu Pro Leu Asp Val Val Ser His Met Cys His Leu Phe Arg 85 90 95 Leu Gly Ser Pro Leu Cys His Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Pro Ser Phe 100 105 110 Val Asp Cys Leu Ser Pro Leu Tyr Ala Asp Leu Pro Ala Pro Ala Lys 115 120 125 Ile Glu Tyr Asp Phe Pro Gln Phe Tyr Asp Ser Pro Asn Gly Val Arg 130 135 140 Asn Trp Ala Lys Arg Pro Glu Asn Ala Lys Pro Cys Gln Arg Tyr Ile 145 150 155 160 Ala Ala Phe Cys Met Ala Met Lys Lys Arg Ile Glu Glu Gly Arg Trp 165 170 175 Thr Ser Asp Met Trp Ala Leu His Glu Leu Trp Gly Lys Ser Thr Gly 180 185 190 Glu Asp Ile Glu Ala Tyr Asp Ser Thr Gly Leu Met Lys Val Leu Ser 195 200 205 Thr Val Glu Glu Met Leu Asp Asn Leu Pro Glu Ser Ala Met Ser Pro 210 215 220 Ile Ser Pro Gln Thr Pro Phe Thr Ala Ser Gly Ser Ile Ala Gln Arg 225 230 235 240 Ala Gln Ser Arg Gln Ser Tyr Asp Leu Pro Phe Ser Met Gly Gly Ile 245 250 255 Gly Ser Gly Ala Ser Ala Val Ala Asn Met Ala Ala Thr Met Asn Gly 260 265 270 Gly Val His Val Glu Thr Gly Pro Ser Glu Asn Ser Pro Thr Ala Ala 275 280 285 Glu Met Gln Arg Gly Leu Ser Thr Ser Leu Ala Glu Ala Asn Ala Phe 290 295 300 Lys Ser Val Glu Glu Leu Val Ala Ser Glu Lys Ser Tyr Val Gln Glu 305 310 315 320 Leu Glu Ile Leu Val Arg Cys Ser Gln Glu Met Leu Glu Ala Gln Leu 325 330 335 Val Ser Thr Glu Thr Asn His Gln Ile Phe Ser Asn Leu Ser Lys Ile 340 345 350 Leu Asp Phe His Arg Lys Phe Leu Ile Lys Leu Glu Thr Glu Tyr Glu 355 360 365 Pro Ile Gln Glu Arg Gly Pro Gly Ala Trp Ala Glu Gly Val Trp Gly 370 375 380 Arg Pro Phe Ile Leu Ser Glu Ala Glu Phe Asp Cys Tyr Gly Pro Tyr 385 390 395 400 Cys Ala Asn Tyr Leu Asp Ala Ile Thr Val Val Asn Glu Gln Met Pro 405 410 415 Ile Leu Met Arg Gly Gln Glu Leu Ser Pro Gly Glu Arg Pro Cys Leu 420 425 430 Asp Pro Gln Arg Glu Leu Gln Ala Phe Met Ile Lys Pro Ile Gln Arg 435 440 445 Ile Thr Lys Tyr Gly Leu Leu Leu Asp Ala Ile Leu His Ala Thr Ala 450 455 460 Lys His Glu Tyr Pro Phe Arg Pro Glu Leu Glu Glu Ala Ser Ala Ala 465 470 475 480 Val Lys Arg Ile Ala Ala Gly Ile Asn Glu Val Thr Asp Phe Lys Ala 485 490 495 Lys Gln Ala Thr Val Arg Glu Leu Ile Glu Arg Val Asp Asp Trp Lys 500 505 510 Gly His Asp Val Asp Lys Phe Gly Pro Leu His Ile Asp Asp His Phe 515 520 525 Thr Val Thr Lys Ala Asp Gln Pro Arg Glu Tyr His Val Phe Leu Phe 530 535 540 Glu Lys Met Met Leu Cys Cys Lys Glu Ile Thr Pro Glu Lys Lys Lys 545 550 555 560 Gln Asn Lys Asn Ser Ser Met Leu Arg Lys Asp Arg Gly Thr Ser Lys 565 570 575 Ser Gly Pro Leu Asp Lys Lys Lys Leu Ala Leu Lys Gly Arg Ile Phe 580 585 590 Val Ser Asn Ile Lys Glu Ala Thr Ile Leu Pro Thr Glu Pro Gly Asp 595 600 605 Ala Tyr Gly Val Ala Arg Leu Leu Ile Gly Trp Thr Ile Pro Leu Arg 610 615 620 Asn Gln Asp Gly Tyr His Asp Asp Gln Glu Asp Ser Phe Val Met Ile 625 630 635 640 Gly Lys Ser Glu Glu Gln Met Arg Lys Trp Ser Glu Lys Val Met Glu 645 650 655 Leu Ala Asn Asn Glu Arg Lys Ile Gln Glu Asp Met Arg Ala Ala Arg 660 665 670 Met Lys Ala Gly Arg Phe Ser Gly Ser Glu Arg Gln Tyr Tyr Gln His 675 680 685 Ser Phe Phe Gly Pro Pro Thr Pro Ala Thr Glu His Pro Pro Met Thr 690 695 700 Pro Phe Asn Met Pro Pro Leu Pro Asn Gly Ser Ala Thr Pro Tyr Tyr 705 710 715 720 Ser Glu Asp Glu Asp Pro Glu Gly Leu Arg Ser Gly Arg Thr Thr Pro 725 730 735 Ser Ile Leu Gly His His Pro Tyr Ala Tyr Ser Gly Gln Pro Ser Ala 740 745 750 Ser Arg Arg Val Gln Ser Gln Gln Ser Met Thr Ser Val Met Pro Thr 755 760 765 Glu Leu Arg Ala Arg Ala Met Thr Glu Asp Gln Tyr Gly Pro Ser Met 770 775 780 Thr Gln Trp Arg Thr Gln Gln Pro Met Ala Pro Pro Leu Pro Arg Leu 785 790 795 800 Thr Ser Ala Met Ser Gly Met Ser Val Ala Ser Glu Leu Ser Phe Gly 805 810 815 Ser Gly Pro Asn Asn Ile Gly Ile Arg Thr Gly Met Val Arg Gln Met 820 825 830 Ser Ser Thr Arg Leu Pro Arg Ala Thr Glu Val Asp Glu Ala Glu Glu 835 840 845 Asn Pro Val Asp Thr Arg Asp Ser Tyr Gly Arg Tyr Gly Ser Leu Arg 850 855 860 Gly Ile Met Arg Ala Pro Ser His Ala Met Pro Ser Val Pro His Pro 865 870 875 880 Pro Pro Leu Arg Asn Arg Ser Ala Ser Ser Pro Asn Val Tyr Gln Gln 885 890 895 Pro Thr Val Thr Gly Ala Ala Ser Leu Pro Tyr Thr Ala Gly Pro Asn 900 905 910 Gly Thr Trp Thr Thr Ser Pro Leu Ala Ser Thr Leu Gln Met Ser Thr 915 920 925 His Pro Tyr Val Gln Ser Thr Pro Val Pro Gly Phe Gly Pro Ser Ser 930 935 940 Ser Thr Thr Leu Val Gly Gly Thr Ala Tyr Phe Asn Lys Arg Met Ser 945 950 955 960 Asn Glu Lys Arg Ser Ser Gly Glu Ser His His Ser Thr Thr Thr Thr 965 970 975 Asp Thr Ser Asp Gln Thr Ser Pro Ala Thr Pro Tyr Gly Ser Gly Asn 980 985 990 Gly Asp Ile Arg Gly Pro Ser Arg Gln Asn Ser Gly Asp Asn Val Ser 995 1000 1005 Gly Ser Val Leu Val Lys Leu Arg Phe Gly Asn Asp Gln Phe Ile Leu 1010 1015 1020 Gly Val Ser Gln Gly Ile Asp Phe Ile Thr Leu Tyr Gln Lys Ile His 1025 1030 1035 1040 Lys Lys Ile Arg Leu Cys Ser Ser Ser Asn Arg Pro Thr Asn Glu His 1045 1050 1055 Asp Lys Leu Gln Ile Arg Tyr Val Asp Asn Asp Gly Asp Glu Ile Gln 1060 1065 1070 Val Lys Phe Asp Ser Asp Val Glu Leu Met Phe Glu Asp Ala Arg Asp 1075 1080 1085 Gln Ala Gly His Ile Asn Leu Ile Ala Arg Trp Ala Glu Asp Arg Arg 1090 1095 1100 Gly Thr Pro Gln Gly Glu Ile Tyr 1105 1110 <210> 4 <211> 432 <212> PRT <213> Cryptococcus neoformans serotype A H99 strain <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(432) <223> an amino acid sequence of Gpa1(CNAG_04505.2) <400> 4 Met Gly Gly Cys Met Ser Thr Pro Glu Ala Pro Arg Lys Ala Ala Glu 1 5 10 15 Thr Lys Gln Val Pro Ser Thr Ser Thr Thr Ser Arg Pro Pro Gln Ala 20 25 30 Ser Thr Ser Ala Thr Ala Thr Ala Ala Gly Ala Ser Thr Ser Pro Pro 35 40 45 Asn Gly Thr Ala Asn Gly Ile Lys Gly Asp Thr Thr Ala Ala Asn Arg 50 55 60 Thr Gly Ala Ser Ala Gly Gln Gly Ile Val Ala Ala Leu Ala Ser Thr 65 70 75 80 Glu Pro Pro Gly Ala Gln Asp Ser Lys Gly Asn Lys Asp Arg Ser Asn 85 90 95 Gln Ile Asp Arg Gln Leu Glu Asp Asp Gln Lys Lys Phe Arg Lys Glu 100 105 110 Cys Lys Ile Leu Leu Leu Gly Ser Gly Glu Ser Gly Lys Ser Thr Ile 115 120 125 Val Lys Gln Met Lys Ile Ile His Gln Asn Gly Tyr Ser Lys Asp Glu 130 135 140 Leu Leu Ser Phe Arg Gly Val Ile Tyr Lys Asn Val Leu Asp Ser Ala 145 150 155 160 Gln Ala Leu Ile Met Ala Met Arg Lys Ile Gly Val Asp Pro Glu Asp 165 170 175 Ala Asn Asn Arg Ser Tyr Ala Asp Arg Ile Leu Glu Tyr Arg Met Asp 180 185 190 Ala Asp Leu Asn Ala Val Ile Pro Ser Glu Ile Leu Tyr Asn Ile Glu 195 200 205 Ser Leu Trp His Asp Pro Val Ile Pro Ser Val Met Asp Arg Ser Ser 210 215 220 Glu Phe Tyr Ile Met Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Phe Ala Asn Ile Arg 225 230 235 240 Lys Ile Ala Gly Pro Asp Tyr Val Pro Asp Glu Ala Asp Val Leu Arg 245 250 255 Ala Arg Thr Lys Thr Thr Gly Ile Ser Glu Thr Arg Phe Asn Met Gly 260 265 270 Gln Leu Ser Ile His Met Phe Asp Val Gly Gly Gln Arg Ser Glu Arg 275 280 285 Lys Lys Trp Ile His Cys Phe Glu Ala Val Thr Ser Ile Ile Phe Cys 290 295 300 Val Ala Leu Ser Glu Tyr Asp Gln Val Leu Leu Glu Glu Ser Gly Gln 305 310 315 320 Asn Arg Met Gln Glu Ser Leu Val Leu Phe Glu Ser Val Ile Asn Ser 325 330 335 Arg Trp Phe Leu Arg Thr Ser Val Ile Leu Phe Leu Asn Lys Ile Asp 340 345 350 Leu Phe Lys Gln Lys Leu Pro Lys Val Pro Leu Val Gln Tyr Phe Pro 355 360 365 Glu Tyr Thr Gly Gly Ala Asp Ile Asn Lys Ala Ala Lys Tyr Ile Leu 370 375 380 Trp Arg Phe Thr Gln Thr Asn Arg Ala Arg Leu Ser Val Tyr Pro His 385 390 395 400 Leu Thr Gln Ala Thr Asp Thr Ser Asn Ile Arg Leu Val Phe Ala Ala 405 410 415 Val Lys Glu Thr Ile Leu Gln Asn Ala Leu Arg Asp Ser Gly Ile Leu 420 425 430 <210> 5 <211> 2250 <212> PRT <213> Cryptococcus neoformans serotype A H99 strain <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(2250) <223> an amino acid sequence of Cac1(CNAG_03202.2) <400> 5 Met Pro Met Phe Arg Arg Ser Ala Ser Ser His Ser Thr Ser Asp Ala 1 5 10 15 Ala Ala Pro Pro Thr Ile Thr Asn Val Thr Glu Gly Ser Pro Val Ser 20 25 30 Ser Gly Ser Ile Thr Arg Gln Lys Arg Ser Arg Ser His Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser Pro Ala Ser Thr Phe Ser Ser Arg Phe Gly Ile Ser Arg His 50 55 60 Leu Ser His Gln Phe Gln Gln Pro His Glu Gln Glu Gln Gly Gln Val 65 70 75 80 Pro Pro Pro Glu Lys Pro Ala Thr Arg Glu Val Pro Val Ser Leu Glu 85 90 95 Pro Glu Ile Tyr Gly Ser Glu Ala Gly Glu Asp Ser Asn Phe Gly Gln 100 105 110 Glu Pro Ala Gly Glu Gln Leu Ile Pro Glu Thr Arg Ser Ser Ser Arg 115 120 125 Gln Ser Arg Arg Ser Ser Arg Glu Leu Ser Val Gln Thr Ile Glu Pro 130 135 140 Ser Ser Asp Asp Glu Ile Arg Ser Pro Glu Lys Arg Arg Val Ser Pro 145 150 155 160 Leu Met Lys Arg Leu Gly Glu Glu Pro Pro Phe Met Leu Pro His Pro 165 170 175 Ser Leu Ser Asp Ser Thr Tyr Gln Ala Tyr Pro Gly Val Val Ile Gly 180 185 190 Ser Phe Ala Gly Gly Gly Pro Asp Thr Leu Phe Gly Asn Gly Met Gln 195 200 205 Leu Glu Gly Thr Val Asp Asp Ile Leu Asp Pro Asn Ala Ala Arg Gln 210 215 220 Glu Asp Arg Gly Asn Gln Val Pro Ala Gly Ala Asn Ile Ala Pro Trp 225 230 235 240 Leu Met Asp Asp Gly Pro Pro Ser Arg Ser Glu Asn Pro Ser Pro Ala 245 250 255 Leu Ser Glu Thr Gln Glu Arg Pro Val Lys Gly Pro Ala Ala Ala Leu 260 265 270 Arg Glu Lys Asp Pro Arg Lys Thr Ser Thr Val Leu Asn His Phe Ser 275 280 285 Ser Val Pro Ser Leu Pro Lys Ile Arg Arg His Gly Arg Ala Ala Thr 290 295 300 Thr Thr Pro Asp Gln Thr Pro Arg Gly Ser Thr His Ser Gln Ser Asn 305 310 315 320 Leu Ala Ser Ser Ser Ser Ser Leu Asn Asn Glu Ser Arg Glu Ser Arg 325 330 335 Ala Gly Ser Asp Asp Ser Ile Gln Thr Thr Leu Thr Gln Lys Gly Arg 340 345 350 Arg Gln Ser Pro Gly Glu Trp Gly Gln Ala Ser Ala Val Pro Pro Pro 355 360 365 Ser Lys Gly Thr Arg Pro Gly Arg Phe Gly Ser Thr Ala Ser Ile Ile 370 375 380 Ser Gly Thr Gly Ser Val Gly Glu Lys Lys Lys Ser Leu Phe Gly Gly 385 390 395 400 Leu Leu Lys Arg Lys Thr Asn Pro Asn Leu Ser Leu Asn Pro Ile Ser 405 410 415 His Asp Phe Thr Thr Ser Glu His Arg Gly Ser Ala Gly Ser Ile Pro 420 425 430 Leu Ser Ala Ser Ser Ser Lys Leu Ser Ser Cys Ser Leu Ser Ser Leu 435 440 445 Pro Ser Lys Ser Pro Pro Phe Thr Ser Pro Pro Glu Ala Phe Ser Arg 450 455 460 Gln Phe Leu Pro Ala Asn Tyr Val His Glu Gly Ala Val Ser Pro Leu 465 470 475 480 Gln Glu Ile Ser Glu Ser Pro Phe His Leu Asp Met Asn Leu Asp Asp 485 490 495 Met Glu Gly Ile Ile Asp Pro Ala Lys Ala Gly Leu Pro Ser Thr Val 500 505 510 Ala Tyr Arg Pro Ser Ala Ser Ser Glu Val Thr Thr Asp Ser Ser Ala 515 520 525 Ser Glu Ser Met Arg Leu Glu Glu Ala Leu Asn Gln Thr Ser Ser Phe 530 535 540 Gly Thr Ser Val Ser Gly Ala Ser Arg Gly Ser Asp Gly Thr Lys Met 545 550 555 560 Pro Gly Arg Ile Val Leu Gly Glu Ala Glu Arg Leu Pro Thr Pro Phe 565 570 575 Thr Gly Thr Asp Pro Phe Gln Gln His Arg Glu Ser Ala Ser Thr Thr 580 585 590 Gly Ser Asp Gly Lys Pro Phe Ser Pro Pro Ser Pro His Thr Leu Ser 595 600 605 Pro Lys His His Leu Pro Ser Ser Ser Ala Asn Gln Pro Arg Arg Pro 610 615 620 Ser Ala Leu Arg Asn Val Glu Thr Gly Gln Val Asp Glu Thr Pro Gln 625 630 635 640 Leu Ser Ala Ser Glu Gly Ser Ile Gln Pro Ile Ser Pro Ser Trp Ala 645 650 655 Gly Gly Ser Gly Ile Thr Val Phe Asn Asp Pro Phe Ser Thr Ser Arg 660 665 670 Gln Arg Gln Glu Gln Pro Pro Asn Ser Ala Gly Leu Ser Pro Ser Thr 675 680 685 Thr Ala Tyr Pro Ser Ala Val Thr Gln Pro Gly Pro Ser Thr Ala Arg 690 695 700 Phe Leu Ile Thr Ala Gly Ser Thr Thr Pro Ser Ala Ala Trp Ala Ala 705 710 715 720 Pro Glu Ser Trp Gly Val Glu Ala Asp Glu Ala Pro Ala Glu Glu Ile 725 730 735 Thr Ser Ser Asp Glu Asp Asp Trp Ala Gly Leu Gly Val Glu Glu Val 740 745 750 Ala Ser Ala Ser Pro Thr Ser Asp Thr Leu Pro Ser Pro Pro Thr Ser 755 760 765 Pro Arg Ala Ser Ser Leu Pro Ser Pro Lys Arg Ala Pro Pro Phe Gly 770 775 780 Phe Lys Ser Gln Gln Arg Ala Lys Pro Gly Thr Ser Gly Thr Thr Asp 785 790 795 800 Ser Thr Thr Ser Ala Ala Gly Arg Arg Lys Gly Lys Arg Val Gly Ser 805 810 815 Ser Gly Arg Pro Ala Thr Gly Arg Pro Gly Thr Ser Gly Ser Ala Tyr 820 825 830 Asn Pro Ser Ser Leu His Trp Ile Arg Ile Tyr Arg Ala Asp Lys Ser 835 840 845 Tyr Met Leu Tyr Asn Leu Pro Leu Asn Thr Ser Thr Gly Glu Leu Leu 850 855 860 Ala Leu Leu Ala Ala Gln Ala Glu Gln Gly Met Val Arg Gly Lys Asn 865 870 875 880 Val Ala Ile Asn Met Lys Leu Tyr Ile Cys Glu Arg Gly Gln Asn Arg 885 890 895 Met Leu Leu Pro Ser Glu Lys Pro Leu Thr Ile Gln His Arg Arg Leu 900 905 910 Leu Gln Leu Gly His Thr Glu Ala Asp His Leu Asp Glu Leu Gly Lys 915 920 925 Asn Asp Met Ala Val Leu Cys Arg Phe Ile Tyr Gln Ala Pro Ile Leu 930 935 940 Pro Ile Met Asp Pro Glu Glu Glu Ser Ser Tyr Asp Ser Phe Glu Phe 945 950 955 960 Ile Asp Ile Ala Ser Arg Asp Leu Gln Thr Ile Pro Ile Phe Leu His 965 970 975 Leu His Ala His Asp Ile Ile Ile Leu Asn Ile Ser Lys Asn Pro Met 980 985 990 Thr Asp Ile Pro Leu Asp Phe Ile Gln Ala Cys Thr Ser Leu Lys Glu 995 1000 1005 Leu Arg Met Ser Asn Met Ala Leu Lys Arg Val Pro Ile Ser Ile Arg 1010 1015 1020 Ala Ser Thr Thr Leu Ala Arg Leu Asp Val Ser Cys Asn Arg Ile Ala 1025 1030 1035 1040 Asp Leu Glu Ser Val Ala Leu His Glu Val Glu Thr Leu Val Ser Leu 1045 1050 1055 Lys Val Gln Asn Asn Lys Leu Thr Ser Met Pro Ser Tyr Phe Ala Gln 1060 1065 1070 Met Lys Ser Leu Lys Tyr Leu Asn Ile Ser Asn Asn Lys Phe Glu Thr 1075 1080 1085 Phe Pro Ser Val Val Cys Glu Met Ser Asn Leu Val Asp Leu Asp Val 1090 1095 1100 Ser Phe Asn Asn Ile Ala Glu Leu Pro Ala Lys Met Ser Asp Leu Lys 1105 1110 1115 1120 Ser Leu Glu Lys Leu Gly Leu Tyr Ser Asn Asp Ile Ser Lys Phe Pro 1125 1130 1135 Glu Ser Phe Cys Thr Leu Ala Asn Leu Arg Ile Leu Asp Val Arg Arg 1140 1145 1150 Asn Lys Ile Thr Asp Leu Ser Ala Val Tyr Ala Leu Pro Asn Leu Ala 1155 1160 1165 Thr Leu Gln Ala Asp Asn Asn Asn Ile Val Thr Leu Asp Ala Gln Leu 1170 1175 1180 Gly Ala Asn Val Arg Gln Phe Ser Val Pro His Asn Ser Val Thr Arg 1185 1190 1195 1200 Phe Thr Leu Ala Pro Pro Pro Asn Met Ala Val Val Thr Tyr Met Leu 1205 1210 1215 Thr Asn Leu Asp Leu Ser His Gly Lys Ile Ser Thr Leu Ala Asp Glu 1220 1225 1230 Ala Phe Ser Gly Leu Thr Asn Leu Val Thr Leu Asn Leu Asn Phe Asn 1235 1240 1245 Gln Phe Thr Lys Leu Pro Ala Thr Leu Gly Arg Leu Thr Ser Leu Glu 1250 1255 1260 Val Phe Ser Cys Thr Asp Asn Met Leu Asn Leu Val Pro Ala Gly Phe 1265 1270 1275 1280 Gly Lys Leu Gln Arg Leu Arg Met Ile Asn Leu His Asn Asn Asn Leu 1285 1290 1295 Lys Ser Leu Pro Glu Asp Leu Trp Ala Cys Gly Ala Leu Glu Val Phe 1300 1305 1310 Asn Ala Ser Ser Asn Leu Leu Asp Ser Phe Ile Pro Pro Pro Ala Asp 1315 1320 1325 Ile Glu Ser Val Val Gly Arg Val Gly Ser Gly Thr Ser Gln Thr Ser 1330 1335 1340 Asn Gly Arg Lys Lys Tyr Ser Val Pro Pro Ile Gly Leu Ser Ile Arg 1345 1350 1355 1360 Lys Leu Phe Leu Ala Asp Asn Arg Leu Asn Asp Asp Val Phe His Trp 1365 1370 1375 Ile Ser Leu Met Pro Ser Leu Arg Ile Ile Asn Leu Ser Phe Asn Asp 1380 1385 1390 Ile Tyr Glu Leu Thr Asn Leu Pro Ser Glu Asp Leu Glu Lys Leu Gln 1395 1400 1405 Ser Leu Lys Val Leu His Leu Asn Gly Asn Lys Leu Gln Thr Leu Pro 1410 1415 1420 Ser Glu Leu Gly Ala Ile Lys Thr Leu Gln His Leu Asp Val Gly Ser 1425 1430 1435 1440 Asn Val Leu Lys Tyr Asn Ile Ala Asn Trp Pro Tyr Asp Trp Asn Trp 1445 1450 1455 Asn Trp Asn Thr Ser Leu Arg Tyr Leu Asn Leu Ser Gly Asn Lys Arg 1460 1465 1470 Leu Glu Ile Lys Pro Thr Ser Ala His Glu Met Ser His Ala Ser Ser 1475 1480 1485 Phe Arg Lys Glu Leu Ser Asp Phe Thr Ala Leu Thr Gln Leu Arg Val 1490 1495 1500 Leu Gly Leu Met Asp Val Thr Leu Arg Ile Pro Ser Leu Pro Asp Glu 1505 1510 1515 1520 Ser Glu Glu Lys Arg Val Arg Thr Ser Phe Ser Asp Ile Asn Asn Met 1525 1530 1535 Ala Tyr Gly Ile Ser Asp Met Leu Gly Ser Ile Asp Asn Leu Ala Met 1540 1545 1550 Phe Asp Leu Val Val Pro His Phe Arg Gly Lys Glu Asn Glu Cys Leu 1555 1560 1565 Phe Gly Met Phe Gly Arg Val Thr Thr Thr Leu Gln Gly Gly Lys Ile 1570 1575 1580 Ala Lys Tyr Val Gln Glu Ile Phe Ala Glu Thr Leu Thr Ala His Leu 1585 1590 1595 1600 His Gln Leu Glu Pro Gly Glu Glu Pro Ser Glu Ala Leu Arg Arg Thr 1605 1610 1615 Phe Leu Leu Gly Asp Arg Lys Ala Phe Glu Phe Phe Ser Asp Lys Leu 1620 1625 1630 Gln Leu Glu Lys Glu Arg Lys Pro Ser Trp Thr Ser Phe Ala Ser Phe 1635 1640 1645 Asp Ser Met Phe Arg Gly Trp Thr Pro Gly Val Asn Ser Val Leu Arg 1650 1655 1660 Thr Gly Ala Ser Gly Ala Val Val Tyr Leu Val Asp Lys Val Leu His 1665 1670 1675 1680 Val Gly Ser Ile Gly Asp Thr Leu Val Val Leu Ser Arg Lys Gly Asp 1685 1690 1695 Ala Glu Leu Leu Ser Lys Arg His Asp Pro Thr Asp Arg Glu Glu Ser 1700 1705 1710 Ala Arg Ile Arg Lys Ala Glu Ala Trp Val Ser Thr Lys Gly Phe Val 1715 1720 1725 Asn Asp Asp Lys Asp Leu Asp Ile Ser Arg Ala Phe Gly Tyr Trp His 1730 1735 1740 Glu Cys Pro Ala Val Asn Ala Ala Pro Glu Ile Arg Thr Arg Arg Leu 1745 1750 1755 1760 Gln Glu Ser Asp Glu Phe Val Ile Ile Gly Asn His Ala Leu Trp Gln 1765 1770 1775 Phe Cys Ser Tyr Gln Thr Ala Val Asp Ile Ala Arg Thr Glu Arg Asp 1780 1785 1790 Asp Pro Met Met Ala Ala Gln Lys Leu Arg Asp Phe Ala Ile Ser Tyr 1795 1800 1805 Gly Ala Glu Gly Asn Val Met Val Met Val Val Asn Val Ser Asp Leu 1810 1815 1820 Phe Leu Ala Lys Gly Gly Arg Ala Arg Gly Pro Ser Lys Gln Thr Ala 1825 1830 1835 1840 Thr Asp Ala Asn Ala Asp Val Glu Gly Tyr Ala Val Ala Lys Arg Gln 1845 1850 1855 Val Arg Arg Arg Tyr Asp Glu Val Gly Asp Arg Thr Leu Asn Arg Leu 1860 1865 1870 Gln Gln Glu Ile Glu Pro Pro Val Gly Gln Val Ala Ile Val Phe Thr 1875 1880 1885 Asp Ile Val Asn Ser Thr His Leu Trp Glu Thr Asn Pro Ala Met Pro 1890 1895 1900 Thr Ala Ile Lys Met His His Asn Leu Met Arg Arg Gln Leu Arg Leu 1905 1910 1915 1920 Asp Gly Gly Tyr Glu Val Lys Thr Glu Gly Asp Ser Phe Met Val Ser 1925 1930 1935 Phe Gln Ser Val Ala Ser Ala Leu Leu Trp Ser Phe Asn Cys Gln Ile 1940 1945 1950 Gly Leu Leu Gln Gln Glu Trp Pro Arg Glu Leu Leu Glu Ala His Asp 1955 1960 1965 Gly Lys Val Val Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Ile Val Gln Arg Gly Leu 1970 1975 1980 Arg Val Arg Met Gly Val His Trp Gly Ala Pro Glu Cys Glu Lys Asp 1985 1990 1995 2000 Pro Ile Thr Arg Arg Met Asp Tyr Tyr Gly Pro Met Val Asn Arg Ala 2005 2010 2015 Ala Arg Ile Asn Ala Ser Ala Asp Gly Gly Gln Leu Met Ala Ser Gln 2020 2025 2030 Asp Val Leu Asn Glu Ile Ala Pro Leu Met Glu Tyr Leu Asn Ser Ser 2035 2040 2045 Asp Glu Gln Val Leu Asn Asp Leu Gln Gly Asp Leu Lys Arg Glu Val 2050 2055 2060 Met Glu Leu Arg Arg Ile Gly Leu Glu Val Arg Asp Met Gly Asp Arg 2065 2070 2075 2080 Lys Leu Lys Gly Leu Glu Val Pro Glu Arg Leu His Leu Leu Tyr Pro 2085 2090 2095 Lys Thr Leu Ala Gly Arg Leu Glu Ile Ser Asn Glu Ile Arg Ala Glu 2100 2105 2110 Val Glu Val Asn Asp Ala Arg Lys Ser Ala Glu Arg Gln Arg Ser Val 2115 2120 2125 Asp Ile Asp Gln Val Tyr Gln Leu Ser Asp Ile Ala Leu Arg Leu Glu 2130 2135 2140 Ala Val Cys Cys Tyr Asn Pro Thr Pro Ser Ser Pro Gly Asp Thr Pro 2145 2150 2155 2160 Thr Ala Gly Val Met Arg Leu His Pro Pro Ala Ser Tyr Leu Gly Pro 2165 2170 2175 Ser Ile Arg Glu Asp Met Asn Asp Glu Glu Leu Trp Thr Ile Ile Glu 2180 2185 2190 Ser Leu Val Gly Arg Ile Glu Asn Val Met Ser Thr Leu Tyr Leu Lys 2195 2200 2205 Asn Phe Gly Glu Phe Ser Ala Val Leu Ala Ala Leu Glu Ser Ala Thr 2210 2215 2220 Lys Ile Asp Gln Lys Leu Ile Val His Ala Leu Ala Leu Met Asn Glu 2225 2230 2235 2240 Ala Met Gly Lys Asp Glu Glu Asn Ala Ile 2245 2250 <210> 6 <211> 499 <212> PRT <213> Cryptococcus neoformans serotype A H99 strain <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(499) <223> an amino acid sequence of Aca1(CNAG_05218.2) <400> 6 Met Ala Thr Ser Gln Gly Ile His Ser Ile Ser Thr Ile Leu Arg Leu 1 5 10 15 Glu Asp Ile Ala Val Thr Gln Ala Pro His Gly Ser Ser Val Lys Ser 20 25 30 Pro Ala Pro Ala Ser Asp Thr Pro Thr Gly Val Ala Pro Pro Ala Pro 35 40 45 Pro Pro Pro Pro Ala Pro Glu Ala Pro Lys Ala Ala Glu Met Thr Gln 50 55 60 Pro Ala Gln Ser Pro Ala Ser Lys Val Tyr Gln Asp Glu Ile Ile Asn 65 70 75 80 Gly Ala Leu Asn Asp Phe Leu Ser Lys Ser Lys Glu Val Gly Gly Leu 85 90 95 Val Ala Glu His Ser Ala Leu Ile Gly Pro Leu Cys Glu Ala Gln Leu 100 105 110 Ser Phe Leu Gln Phe Ala Ser Asn His Ala Lys Pro Ala Thr Pro Asn 115 120 125 Ala Leu Ala Pro Leu Leu Glu Pro Gln Gly Lys Ala Ile Glu Ala Ile 130 135 140 Met Glu Thr Lys Asp Lys Leu Ser Arg Ser Lys Glu Gly Arg Glu Trp 145 150 155 160 Gly Val Cys Phe Asn Val Leu Gly Glu Gly Val Pro Ala Trp Gly Trp 165 170 175 Val Gln Val Glu Pro Thr Pro Ala Pro Tyr Val Gly Glu Met Lys Asn 180 185 190 Ala Ala Gln Phe Trp Ser Asp Arg Val Ile Lys Gln Tyr Lys Glu Thr 195 200 205 Asn Ala Ser Ala Val Ala Trp Ala Lys Ser Phe Ile Ala Leu Ile Ala 210 215 220 Ala Leu Glu Ser Tyr Val Lys Gln Trp His Thr Thr Gly Val Val Trp 225 230 235 240 Asn Pro Lys Gly Ser Pro Ala Pro Pro Ser Met Pro Lys Ala Ser Ala 245 250 255 Ser Ala Pro Ser Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ala Pro Ala 260 265 270 Ala Pro Thr Ser Gly Ser Gly Ala Ala Ala Leu Leu Ala Asp Leu Asn 275 280 285 Arg Gly Gly Ala Val Thr Ser Gly Leu Arg Lys Val Asp Ser Ser Gln 290 295 300 Met Thr His Lys Asn Pro Ser Leu Arg Ser Ala Gly Thr Val Ser Asp 305 310 315 320 Asn Ala Lys Lys Gly Pro Pro Leu Lys Pro Lys Pro Gly Ala Lys Pro 325 330 335 Ala Lys Lys Pro Ala Lys Ile Glu Leu Glu Asp Gly Asn Lys Trp Ile 340 345 350 Ile Glu Asn Gln Glu Asp Asn Lys Ser Ile Lys Ile Asp Asn Thr Glu 355 360 365 Leu His His Thr Val His Ile Phe Gly Cys Val Asn Ser Val Val Gln 370 375 380 Ile Ser Gly Lys Ile Asn Ala Val Thr Met Ala Gly Cys Lys Lys Thr 385 390 395 400 Ser Val Val Leu Asp Thr Ala Val Ser Ser Phe Ser Ile Thr Ser Ser 405 410 415 Pro Ser Phe Glu Val Gln Ile Ile Gly Ser Ile Pro Thr Ile Gln Ile 420 425 430 Asp Thr Thr Asp Ser Gly Gln Val Tyr Leu Ser Lys Asp Cys Met Glu 435 440 445 Val Val Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Ser Ser Ile Asn Ile Ser Val 450 455 460 Pro Thr Gly Glu Asp Gly Asp Phe Val Glu Arg Pro Val Pro Glu Gln 465 470 475 480 Met Lys Ser Arg Ile Ile Asp Gly Lys Leu Val Thr Glu Ile Val Glu 485 490 495 His Ser Gly <210> 7 <211> 515 <212> PRT <213> Cryptococcus neoformans serotype A H99 strain <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(515) <223> an amino acid sequence of Pka1(CNAG_00396.2) <400> 7 Met Phe Gln Lys Val Ser Asp Lys Phe His Arg Lys Gln Gln Ser Ser 1 5 10 15 Thr Ser Pro Gly Lys Thr Gln Gln Val Pro Asn Ser Pro Ser Ser Val 20 25 30 Leu Ala Lys Ala Asn Ser Gln Ala Gln Gln Ala Tyr Ser Ser Gln Asp 35 40 45 His Ser Pro Met Glu Gly Ile Gln Ser Asp Ser Thr His Ile Gln Gln 50 55 60 Pro Met Ala Thr Gln Lys Ala Pro Ile Val Gly Pro Ser Thr Ser Thr 65 70 75 80 Ser Leu Ser Thr Val Pro Val Gln Asp Gly Thr Leu Pro Leu Thr Pro 85 90 95 Gly Ala Gln Gly Met Leu Ala Gly Thr Thr Asp Gly His Arg Gln Val 100 105 110 Gln Ser Pro Val Ser Arg Ser Ser Ser Ala Gly Glu Asp Lys Met Arg 115 120 125 Glu Lys Ala Arg Asp Ala Gln Glu Gln Ala Ala Gln Ala Gln Ala Asn 130 135 140 Leu His Arg Val Thr Gln Gln Ala Arg Val Ala Ala Ile Asn Ala Ala 145 150 155 160 Ala Thr Gln Ala Ala Leu Glu Thr Ala Thr Gln Leu Pro Ala Thr Ala 165 170 175 Arg Val Pro Thr Ser Gly Thr Gly Ala Glu Pro Gly Gln Ala Arg Arg 180 185 190 Lys Thr Ala Gly Arg Tyr Ala Leu Ser Asp Phe Leu Ile Glu Arg Thr 195 200 205 Leu Gly Thr Gly Ser Phe Gly Arg Val His Leu Val Arg Ser Arg His 210 215 220 Asn Gly Arg Phe Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Lys Glu Lys Val Ile 225 230 235 240 Lys Met Lys Gln Val Glu His Thr Asn Ser Glu Arg Glu Met Leu Val 245 250 255 Arg Val Arg His Pro Phe Leu Val Asn Leu Trp Gly Thr Phe Gln Asp 260 265 270 Val Asn Asn Leu Tyr Met Val Met Asp Phe Val Ala Gly Gly Glu Leu 275 280 285 Phe Ser Leu Leu Arg Lys Ser Gln Arg Phe Pro Asn Ser Val Ala Lys 290 295 300 Phe Tyr Ala Ala Glu Val Ala Leu Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser Leu 305 310 315 320 Asp Ile Ile Tyr Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu Gly Ala 325 330 335 Asp Gly His Val Lys Val Thr Asp Phe Gly Phe Ala Lys Tyr Val Pro 340 345 350 Asp Ile Thr Trp Thr Leu Cys Gly Thr Pro Asp Tyr Leu Ala Pro Glu 355 360 365 Val Val Gln Ser Lys Gly Tyr Asn Lys Ser Val Asp Trp Tyr Ala Leu 370 375 380 Gly Val Leu Ile Phe Glu Met Leu Ala Gly Tyr Pro Pro Phe Phe Thr 385 390 395 400 Glu Asp Gly Asn Pro Met Lys Leu Tyr Glu Lys Ile Ile Ala Gly Lys 405 410 415 Val Arg Tyr Pro Thr Tyr Phe Asp Val Leu Ala Lys Glu Leu Leu Lys 420 425 430 Asn Leu Leu Ile Gly Asp Leu Thr Lys Arg Tyr Gly Asn Leu Arg Ala 435 440 445 Gly Ser Ser Asp Ile Phe Ala His Gly Trp Phe Ala Glu Val Asp Trp 450 455 460 Asp Lys Leu Tyr Arg Arg Glu Ile Pro Ala Pro Tyr Val Pro Lys Ile 465 470 475 480 Asp Gly Glu Gly Asp Ala Ser Gln Phe Asp Arg Tyr Gln Glu Ala Asp 485 490 495 Val Ser Ala Tyr Gly Lys Val Gly Asn Gly Pro Tyr Asp His Phe Phe 500 505 510 Val Glu Phe 515 <210> 8 <211> 83 <212> PRT <213> Cryptococcus neoformans serotype A H99 strain <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(83) <223> an amino acid sequence of Hsp12(CNAG_03143.2) <400> 8 Met Ser Asp Ala Gly Arg Gln Ser Phe Thr Asp Lys Ala Gly Ala Ala 1 5 10 15 Met Lys Pro Asp Ser Glu Lys Ser Tyr Leu Glu Gln Ala Lys Asp Thr 20 25 30 Ile Gly Gly Lys Ala Asp Ser Ala Ala Ser Thr Gly Gln Pro Gln Ser 35 40 45 Gln Lys Ser Tyr Thr Gln Glu Ile Gly Asp Ala Phe Ser Gly Asn Lys 50 55 60 Asn Asp Asn Gln Glu Ser Leu Thr Asp Lys Ala Lys Asn Ala Phe Gly 65 70 75 80 Ala Asn Gln <210> 9 <211> 70 <212> PRT <213> Cryptococcus neoformans serotype A H99 strain <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(70) <223> an amino acid sequence of Hsp122(CNAG_01446.2) <400> 9 Met Ser Asp Ala Gly Arg Gln Ser Leu Ala Asp Lys Ala Ser Ser Ser 1 5 10 15 Met Lys Pro Asp Ser Glu Lys Ser Tyr Val Glu Gln Ala Ser Asp Phe 20 25 30 Ile Ser Gly Lys Leu Asp Ser Ala Ala Ser Ala Val Gln Pro Gln Gln 35 40 45 Glu Lys Ser Thr Thr Gln Lys Ile Gly Asp Ala Val Ser Gly Asp Asn 50 55 60 Arg Asn Arg Asp Val Ala 65 70

Claims (19)

1. 크립토코쿠스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)의 Ras1, Ras2, Cdc24, Gpa1, Cac1, Aca1, Pka1, Hsp12 및 Hsp122로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질에 대한 저해제를 포함하고,

   상기 저해제는 상기 단백질에 대한 항체이며,

   폴리엔계 또는 아졸계 항진균제와 순차적 또는 동시에 투여되는 것을 특징으로 하는 항진균용 의약 조성물.
2. 제1항에 있어서,

   상기 저해제는 Cac1 또는 Pka1 단백질에 대한 저해제인 항진균용 의약 조성물.
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,

   상기 폴리엔계 항진균제는 암포테리신 B, 나타마이신, 리모시딘, 필리핀, 니스타틴 및 캔디신으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항진균제인 항진균용 의약 조성물.
5. 제1항에 있어서,

   상기 폴리엔계 항진균제는 암포테리신 B인 항진균용 의약 조성물.
6. 제1항에 있어서,

   상기 아졸계 진균제는 케토코나졸, 플루코나졸, 이트라코나졸 및 보리코나졸로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항진균제인 항진균용 의약 조성물.
7. 제1항에 있어서,

   상기 항진균용 의약 조성물은 크립토코쿠스 네오포만스의 Ssk1, Tco2, Ssk2, Pbs2 및 Hog1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질에 대한 저해제와 순차적으로 또는 동시에 투여되는 것인 항진균용 의약 조성물.
8. 크립토코쿠스 네오포만스의 RAS1, RAS2, CDC24, GPA1, CAC1, ACA1, PKA1, HSP12 및 HSP122로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 저해제를 포함하고,

   상기 저해제는 상기 유전자에 대한 안티센스올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이들을 포함하는 벡터이며,

   폴리엔계 또는 아졸계 항진균제와 순차적 또는 동시에 투여되는 것을 특징으로 하는 항진균용 의약 조성물.
9. 제8항에 있어서,

   상기 저해제는 CAC1 또는 PKA1 유전자에 대한 저해제인 항진균용 의약 조성물.
10. 삭제
11. 제8항에 있어서,

    상기 폴리엔계 항진균제는 암포테리신 B, 나타마이신, 리모시딘, 필리핀, 니스타틴 및 캔디신으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항진균제인 항진균용 의약 조성물.
12. 제8항에 있어서,

    상기 폴리엔계 항진균제는 암포테리신 B인 항진균용 의약 조성물.
13. 제8항에 있어서,

    상기 아졸계 진균제는 케토코나졸, 플루코나졸, 이트라코나졸, 및 보리코나졸로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항진균제인 항진균용 의약 조성물.
14. 제8항에 있어서,

    상기 항진균용 의약 조성물은 크립토코쿠스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)의 SSK1, TCO2, SSK2, PBS2 및 HOG1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 저해제와 순차적으로 또는 동시에 투여되는 것인 항진균용 의약 조성물.
15. 제1항, 제2항, 제4항 내지 제9항 및 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항진균용 의약 조성물; 및

    폴리엔계 항진균제, 아졸계 항진균제 및 크립토코쿠스 네오포만스의 Ssk1, Tco2, Ssk2, Pbs2 및 Hog1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자에 대한 저해제로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항진균제를 포함하는 항진균 복합 제제.
16. 크립토코쿠스 네오포만스의 Ras1, Ras2, Cdc24, Gpa1, Cac1, Aca1, Pka1, Hsp12 및 Hsp122로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고,

    상기 후보물질이 상기 단백질의 활성을 저해하는지를 판단하는 것을 포함하는

    폴리엔계 또는 아졸계 항진균제에 대한 진균의 감수성을 증가시키는 의약의 스크리닝 방법.
17. 제16항에 있어서,

    상기 단백질은 Cac1 또는 Pka1 단백질인 방법.
18. 크립토코쿠스 네오포만스의 RAS1, RAS2, CDC24, GPA1, CAC1, ACA1, PKA1, HSP12 및 HSP122로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 후보물질과 접촉시키고,

    상기 후보물질이 상기 유전자의 발현을 저해하는지를 판단하는 것을 포함하는

    폴리엔계 또는 아졸계 항진균제에 대한 진균의 감수성을 증가시키는 의약의 스크리닝 방법.
19. 제18항에 있어서,

    상기 유전자는 CAC1 또는 PKA1 유전자인 방법.

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