KR101917877B1 - 항암제 유발 말초신경병증 통증의 치료, 완화 또는 예방용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사이코사포닌 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염 및 시호 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 함유하는, 신경병증 통증의 치료, 완화 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 TRPA1 활성을 억제함으로써 신경병증 통증에 대해 매우 뛰어난 치료, 예방 및 완화 효능을 갖는다.

Description

항암제 유발 말초신경병증 통증의 치료, 완화 또는 예방용 조성물{COMPOSITION FOR TREATING, ALLEVIATING OR PREVENTING PERIPHERAL NEUROPATHIC PAIN INDUCED BY ANTICANCER AGENT}

본 발명은 사이코사포닌 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 시호 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 함유하는, 신경병증 통증 치료, 완화 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

통증은 신체가 침해성 요인에 반응하여 나타나는 생리기전이며, 이는 크게 통각수용성 통증과 신경병증 통증으로 구분할 수 있다. 상기 신경병증 통증은 체성감각신경계(somatosensory system)의 손상 또는 병적 요인 등에 의해 발생하는데, 해부학적으로 말초성 통증과 중추성 통증으로 구분할 수 있으며, 그 원인에 근거하여 유전성, 대사성, 외상성, 혈관성, 면역학적, 감염성, 독성에 의한 통증으로 분류할 수 있다. 이처럼 다양한 원인이 있기 때문에 신경병증 통증을 하나의 병변이나 특정 부위의 손상만으로 설명하기 어려우며, 증상을 초래하는 기전을 고려하여 치료제를 선택해야 한다.

상기 말초성 신경병증 통증(말초신경병증 통증이라고도 지칭됨)은 말초신경의 손상 또는 질병에 의해 나타나는 증상으로, 감각 소실과 같은 음성적 증상과 실제 통증(이질통, 통각과민)을 느끼는 양성적 증상이 나타난다. 상기 이질통(allodynia)이란 정상적인 상황에서는 통증을 유발하지 않는 미세한 자극(예: 옷깃 스침)에 의해 심한 통증을 느끼는 상태이며, 여기에는 냉이질통과 기계적 이질통 등이 포함된다. 상기 통각과민(hyperalgesia)이란 정상상태에서 통증을 유발하는 자극에 대하여 훨씬 더 민감하게 통증반응을 일으키는 상태이다. 따라서, 말초신경병증 통증의 치료는 신경의 과흥분을 억제하는 기전이 이용되어야 한다.

현재 말초신경병증 통증의 치료제로서 사용되는 약물은 항우울제, 항경련제, 국소진통제, NMDA 수용체 길항제, 마약성 진통제 등이 있으며, 일차적으로 아미트리프틸린(삼환계 항우울제), 가바펜틴, 프레가발린(항경련제), 세로토닌-노르에피네프린 재흡수억제제(항우울제) 등이 많이 처방된다. 그러나, 마약성 진통제는 약물 오남용의 우려와 다양한 부작용을 유발할 수 있는 단점이 있다. 또한, 항경련제와 항우울제는 모든 환자에게 효과적인 것은 아니며, 단지 30% 이하의 환자만이 평균 50% 정도의 진통 효과를 경험하는 것으로 보고되고 있다. 따라서, 마약성 진통제의 부작용을 회피하고 진통 효능이 미흡한 항우울제 및 항경련제를 대체할 수 있는 새로운 통증 치료제 개발이 절실히 요구된다.

현재 임상 진행 중인 약물의 작용기전 현황을 보면 오피오이드 수용체를 표적으로 하는 약물이 46%로 가장 많고, 다음으로 프로스타글란딘-엔도퍼옥사이드 신타제(prostaglandin-endoperoxide synthase) (21%), 전압 작동 이온 채널(voltage-gated ion channel) (17%) 순으로 나타난다. 이 외에도 solute carrier family 6, Transient Receptor Potential (TRP) 양이온 채널, 칸나비노이드 수용체 등이 통증 치료약물의 표적으로 이용되고 있다.

상기 TRP 양이온 채널은 다양한 조직(신경, 피부, 심장, 호흡기관, 신장 등)에 발현되는 막 단백질이며, 활성화되었을 때 양이온의 세포 내 유입을 일으킴으로써 세포를 자극한다. 현재까지 여러 가지 자극원에 반응하는 다양한 형태의 TRP 막 단백질이 존재하며 대표적으로 TRPA, TRPC, TRPV, TRPM 등이 알려졌다. 이 중에서 통증과 관련된 것은 TRPA1으로, 조직 손상과 염증 반응시 생성되는 케토알데하이드, 사이클로펜탄 프로스타글란딘, 활성산소 등에 의해 활성화되어 통증을 유발시킨다고 보고되고 있다. 유전적 요인에 의한 TRPA1 기능항진으로 초래되는 유전병(Familial episodic pain syndrome)은 TRPA1이 통증과 밀접한 연관이 있음을 알려주는 좋은 예이다. 이에 따라, TRPA1 길항제를 신경병증 통증 치료제로 개발하려는 임상시험이 진행 중이며, 특히 GRC17536 약물은 임상2상 시험에서 당뇨에 의해 발생하는 신경병증성 통증에 효과가 있음이 확인되었다.

이에 본 발명자들은 신경병증 통증에 유용한 후보 물질을 발굴하기 위하여 예의 노력한 결과, 사이코사포닌 및 이의 염과 시호 추출물이 TRPA1 활성을 억제하고 신경병증 통증 치료 효과가 있음을 확인하였으며, 이에 기초하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

일본공개특허공보 JP 2016-204310 A (2016.12.08)

Xin Zhou, et al. Attenuation of Neuropathic Pain by Saikosaponin a in a Rat Model of Chronic Constriction Injury. Neurochem. Res. 39, 2136-2142 (2014.08.09)

본 발명의 일 목적은 신경병증 통증 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 신경병증 통증 완화 또는 예방용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태는 사이코사포닌 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 시호 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 함유하는, 신경병증 통증 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.

본 명세서에서, 용어 "사이코사포닌(saikosaponin)"은 트리테르페노이드계의 사포닌 배당체를 의미한다. 상기 사이코사포닌에는 예를 들어 사이코사포닌 A, 사이코사포닌 B1, 사이코사포닌 B2, 사이코사포닌 B3, 사이코사포닌 B4, 사이코사포닌 C, 사이코사포닌 D, 사이코사포닌 E, 사이코사포닌 F, 사이코사포닌 G, 사이코사포닌 H, 사이코사포닌 I 등이 포함된다. 각각의 사이코사포닌 화합물들의 구조는 당업계에 이미 잘 알려져 있다.

본 발명에서 사용되는 사이코사포닌은 바람직하게는 사이코사포닌 A, B1, B2, C, D, E 또는 F이며, 더 바람직하게는 사이코사포닌 D이다. 예를 들어, 상기 사이코사포닌 D는 하기 화학식 1의 구조식을 가지며, (3β,4α,16α)-13,28-에폭시-16,23-디하이드록시올리언-11-엔-3-일-6-디옥시-3-O-β-D-글루코피라노실-β-D-갈락토피라노시드라고도 명명된다.

[화학식 1]

또한, 본 발명의 약학 조성물은 사이코사포닌 화합물 뿐만 아니라 사이코사포닌의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 상기 사이코사포닌 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은 사이코사포닌 또는 이의 이성질체가 가질 수 있는 임의의 모든 유기 또는 무기 부가염을 나타내며, 사이코사포닌과 동등하거나 유사한 수준의 신경병증 통증 치료 효과를 나타내는 한 제한되지 않는다.

용어 "시호(柴胡, Bupleuri Radix)"는 학명이 Bupleurum falcatum L.이며, 쌍떡잎 식물 산형화목 미나리과의 여러해살이 풀이다. 본 발명에 따른 조성물에 있어서, 시호는 재배한 것, 채취한 것 또는 시판되는 것 등이 제한 없이 사용될 수 있다.

용어 "시호 추출물"은 시호로부터 수득한 추출물을 의미한다. 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 시호 추출물은 시호의 뿌리, 줄기, 가지, 꽃, 잎 및 열매로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추출한 것일 수 있으며, 바람직하게는 시호의 뿌리를 추출한 것일 수 있다. 상기 시호 추출물은 바람직하게는 사이코사포닌 A, B1, B2, C, D, E 및 F 중 하나 이상을 포함하는 것이며, 특히 바람직하게는 사이코사포닌 D를 포함하는 것이다.

용어 "추출물"은 생약을 적절한 추출용매로 추출하고 추출용매를 증발시켜 농축한 제제를 의미하는 것으로, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물일 수 있다. 본 발명에 따른 시호 추출물은 당업계에 공지된 일반적인 추출방법을 이용하여 제조할 수 있으며, 예를 들어 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 유효성분으로서 포함되는 사이코사포닌 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 시호 추출물은 TRPA1(Transient receptor potential cation channel, subfamily A, member 1) 길항제 활성을 나타낸다.

용어 "신경병증 통증"은 신경계의 일차적 병변이나 기능장애로 오는 통증을 의미한다. 상기 신경병증 통증에는 통각과민, 감각과민, 신경병증, 당뇨병성 신경병증, 신경염, 신경통, 작열통, 이질통, 말초신경병증 통증 등이 포함될 수 있다. 상기 신경병증 통증은 바람직하게는 말초신경병증 통증일 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 신경병증 통증은 항암제에 의해 유발되는 말초신경병증 통증이다.

용어 "치료"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 신경병증 통증의 증상이 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다. 또한, 용어 "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 신경병증 통증의 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따른 약학 조성물 내의 사이코사포닌 또는 이의 염 또는 시호 추출물의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라 적절히 조절 가능하다. 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9 중량%, 0.1 내지 90 중량%, 1 내지 80 중량%, 1 내지 70 중량%, 1 내지 60 중량%, 또는 1 내지 50 중량%로 함유할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 예를 들어 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 투여 제형일 수 있다. 또다르게는, 본 발명에 따른 약학 조성물은 당업자에게 잘 알려진 기술을 이용하여 국소 투여를 위한 적합한 투여 제형으로 제형화될 수 있고, 국소 투여 제형은 외용제, 발포정, 좌제 등을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 약학 조성물은 상기 추출물을 당해 기술분야에서 잘 알려지고 일반적으로 사용되는 기제(base)와 혼합하여 외용제로 제형화될 수 있다. 상기 외용제는 에멀젼, 겔, 연고, 크림, 패치, 리니먼트, 파우더, 에어로졸, 스프레이, 로숀, 세럼, 페이스트, 폼, 점적제, 현탁액, 및/또는 팅크를 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 환제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들어 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 개체에 투여된다. 본 발명에서 사용된 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 구체적으로 신경병증 통증으로 고통받는 환자가 갖는 통증의 정도에 따라 본 발명의 조성물을 0.1 내지 100 mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한, 그 투여량은 투여 경로, 통증의 정도, 성별, 체중, 나이, 특히 환자의 통증 정도 등에 따라 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 또다른 양태는 사이코사포닌 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염 및 시호 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 함유하는, 신경병증 통증 완화 또는 예방용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 식품 조성물에 있어서 상기 사이코사포닌 및 이의 염, 시호 추출물 및 신경병증 통증은 특별한 언급이 없는 한, 각각 상기 약학 조성물에서 언급한 바와 같다.

용어 "개선"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 신경병증 통증의 정도가 적어도 감소 또는 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.

상기 식품은 건강기능성 식품일 수 있다. 용어 "건강기능성 식품"이란, 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 의미한다. 여기서 "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나므로, 본 발명의 식품 조성물은 신경병증 통증 치료 효과를 증진 또는 개선시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

본 발명에 따른 식품 조성물의 유효 성분인 사이코사포닌 또는 시호 추출물의 양은 사용 목적(예방, 개선 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 사이코사포닌 또는 시호 추출물은 원료 조성물 중 0.001 내지 20 중량%, 0.001 내지 15 중량% 또는 0.001 내지 10 중량%의 양으로 포함될 수 있다. 건강음료의 경우 100 mL를 기준으로 0.01 내지 2 g, 구체적으로 0.02 내지 2 g, 보다 구체적으로 0.3 내지 1 g을 가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물을 제조하는 과정에서 식품 조성물에 첨가되는 사이코사포닌 또는 시호 추출물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있다.

상기 식품 조성물은 환제, 정제, 과립, 분말, 캡슐, 액상의 용액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형일 수 있다.

또한, 상기 식품의 종류는 특별한 제한되지 않는다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물 등과 같은 천연 감미제, 또는 사카린, 아스파르탐 등과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물이 음료 조성물일 경우 필수 성분으로서 상기 추출물을 지시된 비율로 함유하는 외에는 액체 성분에 특별한 제한점은 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 TRPA1 활성을 유의적으로 억제하며, 신경병증 통증에 대해 치료, 예방 및 완화 효과를 제공한다.

도 1은 TRPA1 발현 세포주가 TRPA1 항진제(agonist) 폴리고디알(polygodial)에 반응하는 것을 보여주는 그래프이다.
도 2는 TRPA1 발현 세포주에서 TRPA1 길항제(antagonist)로 알려진 A967970 화합물의 폴리고디알에 의한 Ca²⁺ 이동 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 TRPA1 발현 세포주에서 사이코사포닌 D 화합물의 폴리고디알에 의한 Ca²⁺ 이동 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 TRPA1 발현 세포주에서 사이코사포닌 화합물들의 폴리고디알에 의한 Ca²⁺ 이동 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 TRPA1 발현 세포주에서 시호 추출물의 폴리고디알에 의한 Ca²⁺ 이동 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 항암제(빈크리스틴) 유도 신경병증성 모델을 구축하는 실험 일정과 사이코사포닌 및 시호 추출물의 진통효능 검증을 위한 실험설계도를 나타낸다. VCR: 빈크리스틴; EXT: 시호 추출물.
도 7은 빈크리스틴 유도 신경병증성 통증 모델에서 사이코사포닌 D의 생체내 진통 효능을 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 8은 빈크리스틴 유도 신경병증성 통증 모델에서 시호 뿌리 추출물의 생체내 진통 효능을 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: TRPA1 억제제 스크리닝

TRPA1 길항제(antagonist)를 발굴하기 위하여, TRPA1 항진제(agonist) 폴리고디알에 의한 Ca²⁺ 이동을 억제하는 화합물을 다음과 같이 스크리닝하였다.

1-1. TRPA1 억제제 스크리닝 시스템 구축

(1) TRPA1 발현 안정 세포주의 제작

HEK293 세포를 60 ㎜ 배양용기에 5x10⁵ cells/㎖가 되도록 분주하고, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 하루 동안 배양하였다(배지 조성: DMEM + 10% FBS + 1% 페니실린-스트렙토마이신). TRPA1(Human) DNA 5 ㎍ 및 FuGENE HD 7.5 ㎕를 2개의 Opti-MEM 배지에 각각 넣고 상온에서 5분간 반응시킨 후, 혼합하여 15분간 더 반응시켰다. 이에 따라 수득한 반응액을 상기 세포 배양액에 첨가하고 48시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 트립신 처리하여 6-웰 플레이트로 이동시킨 후, G418을 800, 500, 250, 125, 62.5, 0 ㎍/㎖ 농도로 처리하고 2주간 세포를 배양하였다. 그 결과, G418의 농도가 500㎍/㎖일 때, HEK293 세포는 사멸하고 TRPA1 세포주만 살아있었다.

TRPA1 세포주가 성장 및 증식하면 384-웰 플레이트에 0.5~2 cells/well이 되도록 분주한 후, 단클론 선별을 수행하였다. 단클론으로 선별된 TRPA1 세포에 대해 myc 항체로 면역형광 염색을 실시하여, 발현 여부를 확인하였다.

(2) TRPA1 발현 안정 세포주의 TRPA1 항진제 반응 여부 테스트

TRPA1 발현 안정 세포주가 TRPA1 항진제에 반응하는지 여부를 테스트하기 위하여, Fluo-4 Direct^TM Calcium assay를 이용하였다. TRPA1은 양이온 채널이므로 자극원에 반응하여 Ca²⁺와 같은 양이온을 세포 내로 유입시킴으로써 세포를 자극한다. 이와 같이 세포 내로 유입된 Ca²⁺ 양이온과 Fluo-4 Direct^TM이 결합하여 형광을 나타내는 성질을 이용하는 기법이 Fluo-4 Direct^TM Calcium assay이다.

실험 방법은 구체적으로 다음과 같다.

96-웰 블랙 클리어 플레이트에 HEK293 세포 또는 TRPA1 발현 세포주를 4x10⁴ cells/well, 100 ㎕를 분주하고 상온에서 1,000 rpm으로 1분 동안 원심분리한 후, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 48시간 동안 배양하였다. Fluo-4 Direct^TM Calcium assay 키트에 포함되어 있는 프로베네시드 77mg 1 바이알에 Fluo-4 Direct^TM Calcium assay 버퍼 1 ㎖를 넣고, 교반하였다(최종 농도 250 mM 프로베네시드). Fluo-4 Direct^TM Calcium assay 시약에 10 ㎖의 Fluo-4 Direct^TM Calcium assay 버퍼와 200 ㎕의 250 mM 프로베네시드를 넣은 후, 잘 혼합하였다 (2 X Fluo-4 Direct^TM calcium 시약). 세포에 2 X Fluo-4 Direct^TM calcium 시약을 100 ㎕씩 넣고, 37℃ 인큐베이터에서 1시간 동안 반응시킨다. 그 후, Flexstation의 Calcium assay 프로토콜에 따라 측정한 결과, TRPA1 발현 세포주가 TRPA1 항진제(agonist) 폴리고디알 화합물에 반응하여 Ca²⁺ 이온이 이동한다는 것이 확인되었다 (도 1).

1-2. TRPA1 억제제 스크리닝 시스템 검증

앞서 구축된 TRPA1 억제제 스크리닝 시스템을 검증하기 위하여, 폴리고디알 화합물에 의한 Ca²⁺ 이동이 대조약물(길항제 A967970, 10 μM)에 의해 억제되는지 여부를 시험하였다. 그 결과, A967970 화합물이 농도 의존적으로 폴리고디알 화합물의 활성을 억제하는 것이 관찰되었으며, 이에 따라 TRPA1 억제제 스크리닝 시스템이 유효하다는 것이 검증되었다 (도 2).

또한, 96-웰 플레이트에서 A967970 화합물의 효과가 일정하게 나타나는지 여부를 확인하기 위하여 플레이트의 모든 웰에 100 μM의 A967970 화합물을 각각 처리하였다. 그 결과, 웰마다 값이 균질하게 도출되었으며, Z' factor가 0.830으로 HTS에 적합한다는 점이 확인되었다.

1-3. TRPA1 억제제 스크리닝 수행

상기에서 구축된 TRPA1 억제제 스크리닝 시스템 및 Fluo-4 Direct^TM Calcium assay 실험법을 사용하여 천연물 유래 표준품 2,880개 화합물을 테스트하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다.

96-웰 블랙 클리어 플레이트에 TRPA1 발현 세포주를 4x10⁴ cells/well, 100 ㎕를 분주하고 상온에서 1,000 rpm으로 1분 동안 원심분리한 후, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 48시간 동안 배양하였다. 스크리닝에 사용하는 화합물을 최종농도 10 μM으로 첨가하였으며, 3분간 반응시킨 후 2 X Fluo-4 Direct^TM calcium 시약을 100 ㎕씩 첨가하고 37℃ 인큐베이터에서 1시간 동안 반응시켰다. Flexstation의 Calcium assay 프로토콜 [Fluorescence at EX. 495 nm /Em. 516, 140s read, 67번 read, 25s 항진제 [폴리고디알, 250 nM], 25 ㎕ injection(Flexstation)]을 이용하여 형광세기를 측정하였다.

250 nM의 폴리고디알을 처리한 값을 0% 억제율로 설정하고, 10 μM의 A967970을 처리한 값을 100% 억제율로 설정하여, 각 화합물들의 결과 값을 비교하였다. HTS 결과 Z' factor는 평균 0.7이 산출되었다. 2,880종의 표준품 중에서 사이코사포닌 D의 억제 활성이 가장 우수하였으며, 농도별 활성을 측정한 결과 IC₅₀ 값은 1.74±0.13 μM로 나타났다 (도 3).

실시예 2: 사이코사포닌의 활성 분석

실시예 1에서 활성이 확인된 사이코사포닌 D에서 출발하여, 사이코사포닌 A, B1, B2, C, E, F에 대해 실시예 1의 방법에 따라 TRPA1 억제 여부를 시험하였다. 그 결과, 사이코사포닌 A, B1, B2, C, E, F도 TRPA1 억제 활성을 유의적인 수준으로 나타낸다는 점이 확인되었다 (도 4).

실시예 3: 시호 추출물의 활성 측정

사이코사포닌 계열 화합물은 시호에 존재한다고 보고되고 있으므로, 본 발명자들은 시호 추출물의 TRPA1 억제 여부를 테스트하였다.

3-1. 시호 추출물의 제조

시호의 뿌리를 세척한 후 50℃의 열풍건조기에서 1일간 건조하였다. 건조된 시료는 분쇄기를 통해 분쇄한 후, 추출 시료로 사용하였다.

3-2 시호 추출물의 TRPA1 억제 테스트

시호 추출물의 TRPA1 억제 활성을 확인하기 위하여, 실시예 1의 방법에 따라 시호추출물이 폴리고디알 화합물에 의한 Ca²⁺ 이동을 억제하는지 여부를 테스트하였다.

Fluo-4 Direct^TM Calcium assay를 이용하여 측정한 결과, 시호의 뿌리 추출물이 농도 의존적으로 TRPA1 항진제(agonist) 폴리고디알 화합물의 활성을 억제하는 것이 관찰되었다. 이때, IC₅₀ 값은 35.87±3.31 μg/mL로 확인되었다 (도 5).

실시예 4: 신경병증성 통증 모델을 이용한 생체내 테스트

4-1. 실험 설계

시료의 진통 효능을 생체내 테스트하기 위하여 항암제(빈크리스틴: VCR) 유도 신경병증성 모델(Linglu et al., 2014)을 사용하였다. 양성 대조약물은 가바펜틴(gabapentin)과 프레가발린(pregabalin)을 사용하였다. 사이코사포닌 D 및 시호 뿌리 추출물의 진통 효과를 검증하기 위한 실험 설계를 도 6에 도식적으로 나타냈다.

4-2. Von Frey Test

기계적 통증을 측정하는 대표적인 도구인 Von Frey 필라멘트(Bioseb, USA)를 이용하여 통증 반응을 측정하였다. 신경병증이 유도된 생쥐를 알루미늄망 위에 올려 놓고 유리 용기로 가두고 안정화시킨 후, Von Frey 필라멘트를 사용하여 생쥐의 뒷발바닥을 찔러서 회피하는 통증 반응 강도(g)를 측정하였다. 통증 반응 측정과 결과 값 환산은 SUDO 측정법에 따랐다(Bonin et al., 2014).

4-3. 통계학적 분석

통계처리에 사용한 모든 실험 결과는 Prsim 7.0(Graphpad Inc.) 프로그램을 사용하여 평균±표준오차(means±SEM)로 나타냈으며, 통계학적 분석은 양측검정(two-tailed) Students t-test와 분산분석(one-way ANOVA)을 이용하였다. 분산분석에서 각 그룹 사이의 통계적 유의성이 p<0.05일 때 Tukey's 사후 검정(post-hoc test)을 수행하였다.

4-4. 사이코사포닌 D의 진통 효능 검증

빈크리스틴(Vincristine, VCR) 항암제로 유도되는 신경병증성 통증 모델에서 사이코사포닌 D 화합물을 여러 농도로 투여하여 진통 반응을 Von Frey test로 평가하였다. VCR(0.1 mg/kg)을 하루 한번 7일간 복강내 주사하였으며, VCR 투여 3일째부터 사이코사포닌 D(STX, 5 및 20 mg/kg)를 하루 한번 12일간 경구 투여하였다. 통증 평가는 VCR 투여 후 3일, 7일 및 14일째에 수행하였다. VCR 투여 3일째부터 통증이 유발되었으며, STX 투여군에서 14일째에 유의적으로 통증 반응이 억제되었다. 대조약물로 사용한 가바펜틴(10 mg/kg) 투여군에서도 통증 반응이 감소되었다 (도 7).

4-5. 시호 뿌리 추출물의 진통 효능 검증

빈크리스틴(VCR) 항암제로 유도되는 신경병증성 통증 모델에서 시호 뿌리 추출물을 여러 농도로 투여하여 진통 반응을 Von Frey test로 평가하였다. VCR(0.1 mg/kg)을 하루 한번 7일간 복강내 주사하여 신경병증성 통증모델을 유도하였다. VCR 투여 3일째부터 추출물(EXT, 50 및 200 mg/kg)을 하루 한번 12일간 경구 투여하였다. 통증 평가는 VCR 투여 후 3일, 7일 및 14일째에 수행하였다. VCR 투여 3일째부터 통증이 유발되었다. 시호 추출물 투여군에서 7일과 14일째에 각각 유의적으로 통증 반응이 억제되었으며, 대조약물로 사용한 프레가발린(10 mg/kg) 투여군에서도 통증 반응이 감소되었다. VCR 유도 통증 반응은 14일까지 유지되었으며 시호 추출물과 프레가발린을 투여한 후 시간 경과에 따라 통증 반응이 감소되었다(도 8).

Claims (12)

1. 사이코사포닌 D 및 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 시호 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물로서,
   상기 조성물은 TRPA1(Transient receptor potential cation channel, subfamily A, member 1) 길항제 활성을 가지며 항암제 유발 말초신경병증 통증을 치료 또는 예방하기 위한 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 시호 추출물은 시호 뿌리 추출물인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
3. 사이코사포닌 D 및 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 시호 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식품 조성물로서,
   상기 조성물은 TRPA1(Transient receptor potential cation channel, subfamily A, member 1) 길항제 활성을 가지며 항암제 유발 말초신경병증 통증을 완화 또는 예방하기 위한 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
4. 제3항에 있어서,
   상기 시호 추출물은 시호 뿌리 추출물인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
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