KR101895861B1

KR101895861B1 - miR-130a C＞T, miR-150 G＞A 및 miR-155 T＞A 단일염기다형성의 한국인 허혈성 뇌졸중(뇌경색) 발병 위험도 연관성

Info

Publication number: KR101895861B1
Application number: KR1020180089006A
Authority: KR
Inventors: 김남근; 김옥준; 김정오; 최건호; 고기한
Original assignee: 의료법인 성광의료재단
Priority date: 2018-07-31
Filing date: 2018-07-31
Publication date: 2018-09-07
Also published as: KR20180089360A

Abstract

본 발명은 한국인의 허혈성 뇌졸중 위험도와 마이크로 알엔에이 다형성의 연관성에 관한 것으로, 구체적으로 한국인의 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke) 발생 위험을 예측하는데 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검자의 DNA 시료로부터 miR-34a C>A(rs6577555), miR-130a C>T(rs731384), miR-150 G>A(rs73056059) 및 miR-155 T>A(rs767649) 중에서 선택된 단일염기다형성을 판별하는 방법 및 이를 위한 키트, 그리고 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검자의 DNA 시료로부터 miR-34a C>A(rs6577555) 및 miR-150 G>A(rs73056059) 중에서 선택된 단일염기다형성을 판별하는 방법 및 이를 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 상기 4가지의 miRNA 다형성을 바탕으로 한국인의 허혈성 뇌졸중의 발생 위험을 예측하고, 예후를 예측하는데 유용한 정보를 제공할 수 있다. 특히, 본 발명의 키트를 사용할 경우 보다 용이하게 상기와 같은 정보를 제공할 수 있다.

Description

miR-130a C＞T, miR-150 G＞A 및 miR-155 T＞A 단일염기다형성의 한국인 허혈성 뇌졸중(뇌경색) 발병 위험도 연관성{Association of miR-130a C＞T, miR-150 G＞A and miR-155 T＞A SNP with the risk of ischemic stroke in a Korean population}

본 발명은 한국인의 허혈성 뇌졸중(뇌경색) 위험도와 마이크로 알엔에이 다형성의 연관성에 관한 것으로, 구체적으로 한국인의 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke; 뇌경색) 발생 위험을 예측하는데 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검자의 DNA 시료로부터 miR-34aC>A (rs6577555), miR-130aC>T (rs731384), miR-150G>A (rs73056059) 및 miR-155T>A (rs767649) 중에서 선택된 단일염기다형성을 판별하는 방법 및 이를 위한 키트, 그리고 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검자의 DNA 시료로부터 miR-34aC>A (rs6577555) 및 miR-150G>A (rs73056059) 중에서 선택된 단일염기다형성을 판별하는 방법 및 이를 위한 키트에 관한 것이다.

뇌졸중(stroke)은 전세계적으로 두 번째 많은 사망의 원인이며, 이러한 사망의 약 84%가 허혈성 뇌졸중이 원인이다. 한국에서 뇌졸중은 암 다음 두 번째로 빈번히 발생하는 사망의 원인이며, 심장질환보다 더 많이 발생한다. 뇌졸중의 위험요소로는 고혈압, 당뇨병, 노화, 흡연, 고지혈증, 고호모시스테인혈증(hyperhomocysteinemia) 및 혈관의 혈전성향증(thrombophilia)이 잘 알려져 있으며, 몇몇 다른 질환이 허혈성 뇌졸중을 일으킬 수 있다. 허혈성 뇌졸중의 가장 일반적인 원인은 머리에서의 동맥 폐쇄(arterial occlusion)로, 동맥 폐쇄는 주로 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 점진적 콜레스테롤 침적(gradual cholesterol deposition) 또는 혈전증(thrombosis)으로 인해 발생한다. 혈관 폐색(occlusion)은 주로 혈전증으로 인해 발생(53%)하거나 색전증으로 인해 발생(31%)한다. 혈전 형성은 지나친 혈소판 생성으로 인해 발생할 수 있으며, 혈소판과 허혈성 뇌졸중 사이의 관계에 관해 많은 연구가 이루어지고 있다. 혈소판은 정상적인 지혈작용과 혈전증에 모두 관여한다. 혈소판은 골수(bone marrow)에 있는 그들의 전구세포인 거핵세포(megakaryocytes, MKs)의 세포질 내에서 형성된다.

마이크로RNA(microRNAs, miRNAs, miRs)는 내생적 생리적으로 유전자의 발현을 조절하는 작은 내생적 비-암호화 RNA 분자에 속한다. miRNA는 mRNA의 3'-비번역 부위에 결합하여 단백질의 발현을 억제함으로써 유전자의 발현을 효율적으로 조절한다. miRNA는 신진대사, 조혈작용(hematopoiesis) 및 면역기능과 같은 몇몇 생리적, 병리학적인 과정에서 중요한 역할을 한다. 게다가, 이전 연구에서 일시적인 miRNA 조절이 대뇌동맥(cerebral artery)에서 허혈의 진행과 관련성이 있을지 모른다는 결과가 보고되었다. 그리고 최근 연구를 통해 miRNA 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)과 허혈성 뇌졸중 사이에 유의적인 연관성이 있는 것으로 나타났다. Edelstein 등이 거핵세포의 조절된 기능에 관하여 이전에 조사했던 것과 같이, 다양한 miRNA가 이 과정 뿐만 아니라 혈소판 발생에서도 중요한 역할을 수행한다.

이에 본 발명자는 허혈성 뇌졸중의 발병률과 miRNA의 연관성을 조사하여 이를 허혈성 뇌졸중의 예측 또는 진단에 이용하고자 하였고, 거핵세포의 형성과 관련된 4가지 miRNA 다형성, 즉 miR-34a C>A(rs6577555), miR-130a C>T(rs731384), miR-150 G>A(rs73056059) 및 miR-155 T>A(rs767649)와 허혈성 뇌졸중 위험성의 관계를 한국인을 대상으로 조사하였다.

이의 결과, 상기 4가지 miRNA 다형성이 각각 특정한 조건에서 허혈성 뇌졸중과 유의적인 연관성이 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

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따라서 본 발명의 주된 목적은 허혈성 뇌졸중 발생 위험 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여 miRNA 다형성을 이용하는 방법 및 이를 위한 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 허혈성 뇌졸중 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여 miRNA 다형성을 이용하는 방법 및 이를 위한 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 한국인의 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke) 발생 위험 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검자의 DNA 시료로부터 miR-34a C>A(rs6577555), miR-130a C>T(rs731384), miR-150 G>A(rs73056059) 및 miR-155 T>A(rs767649) 중에서 선택된 단일염기다형성을 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 있어서, 다음 1) 내지 6) 중 하나 이상에 해당하는 경우 피검자를 허혈성 뇌졸중 고위험군으로 분류하고, 7)에 해당하는 경우 안전군으로 분류할 수 있다.

1) 피검자가 miR-34a CA / miR-150 GA 조합형인 경우

2) 피검자가 miR-150 GA / miR-155 TA 조합형인 경우

3) 피검자가 miR-34a A / miR-130a C / miR-150 A 일배체형인 경우

4) 피검자가 miR-34a A / miR-150 A 일배체형인 경우

5) 피검자가 miR-34a A / miR-150 A 일배체형인 경우

6) 피검자가 miR-150 A / miR-155 A 일배체형인 경우

7) 피검자가 miR-34a A / miR-130a T / miR-150 G / miR-155 A 일배체형인 경우

본 발명의 방법에 있어서, 피검자의 나이, 성별, 당뇨병을 앓고 있는지의 여부, 고지혈증을 앓고 있는지의 여부, 고혈압을 앓고 있는지의 여부, 흡연 여부, 혈액 중 호모시스테인 레벨 및 혈액 중 엽산 레벨 중에서 선택된 정보를 더 조사하는 것이 바람직하며, 이 정보를 바탕으로 다음 8) 내지 22) 중 하나 이상에 해당하는 경우 피검자를 허혈성 뇌졸중 고위험군으로 분류할 수 있다.

8) 피검자가 63세 이상이며 miR-34a CA 또는 AA 유전자형인 경우

9) 피검자가 여성이며 miR-34a CA 또는 AA 유전자형인 경우

10) 피검자가 당뇨병을 앓고 있지 않으며 miR-34a CA 또는 AA 유전자형인 경우

11) 피검자가 고지혈증을 앓고 있으며 miR-150 GA 또는 AA 유전자형인 경우

12) 피검자가 고혈압을 앓고 있으며 miR-34a CA 또는 AA 유전자형인 경우

13) 피검자가 고지혈증을 앓고 있으며 miR-34a CA 또는 AA 유전자형인 경우

14) 피검자가 흡연자이며 miR-34a CA 또는 AA 유전자형인 경우

15) 피검자의 혈액 중 호모시스테인 레벨이 13.92μmol/ℓ 이상이며 miR-34a CA 또는 AA 유전자형인 경우

16) 피검자가 고혈압을 앓고 있으며 miR-130a CT 또는 TT 유전자형인 경우

17) 피검자가 당뇨병을 앓고 있으며 miR-130a CT 또는 TT 유전자형인 경우

18) 피검자의 혈액 중 엽산 레벨이 3.56nmol/ℓ 이하이며 miR-130a CT 또는 TT 유전자형인 경우

19) 피검자가 고혈압을 앓고 있으며 miR-150 GA 또는 AA 유전자형인 경우

20) 피검자가 흡연자이며 miR-150 GA 또는 AA 유전자형인 경우

21) 피검자가 당뇨병을 앓고 있으며 miR-155 TA 유전자형인 경우

22) 피검자가 고지혈증을 앓고 있으며 miR-155 TA 유전자형인 경우

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 miR-34a C>A(rs6577555), miR-130a C>T(rs731384), miR-150 G>A(rs73056059) 및 miR-155 T>A(rs767649) 중에서 선택된 단일염기다형성을 검출하는 수단을 포함하는 한국인의 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke) 발생 위험 예측용 키트를 제공한다.

본 발명의 허혈성 뇌졸중 발생 위험 예측용 키트에 있어서, a) 상기 miR-34a C>A 단일염기다형성을 검출하는 수단은 miR-34a C>A 단일염기다형성 부위를 포함하는 연속된 50 내지 10,000bp 부위를 증폭하기 위한 프라이머 및 상기 miR-34a C>A 단일염기다형성 부위의 염기가 시토신 또는 아데닌인 경우 중 어느 한 경우의 DNA를 절단할 수 있는 제한효소를 포함하여 이루어지는 프라이머-제한효소 세트;이고, b) 상기 miR-130a C>T 단일염기다형성을 검출하는 수단은 miR-130a C>T 단일염기다형성 부위를 포함하는 연속된 50 내지 10,000bp 부위를 증폭하기 위한 프라이머 및 상기 miR-130a C>T 단일염기다형성 부위의 염기가 시토신 또는 티민인 경우 중 어느 한 경우의 DNA를 절단할 수 있는 제한효소를 포함하여 이루어지는 프라이머-제한효소 세트;이며, c) 상기 miR-150 G>A 단일염기다형성을 검출하는 수단은 miR-150 G>A 단일염기다형성 부위를 포함하는 연속된 50 내지 10,000bp 부위를 증폭하기 위한 프라이머 및 상기 miR-150 G>A 단일염기다형성 부위의 염기가 구아닌 또는 아데닌인 경우 중 어느 한 경우의 DNA를 절단할 수 있는 제한효소를 포함하여 이루어지는 프라이머-제한효소 세트;이고, d) 상기 miR-155 T>A 단일염기다형성을 검출하는 수단은 miR-155 T>A 단일염기다형성 부위를 포함하는 연속된 50 내지 10,000bp 부위를 증폭하기 위한 프라이머 및 상기 miR-155 T>A 단일염기다형성 부위의 염기가 티민 또는 아데닌인 경우 중 어느 한 경우의 DNA를 절단할 수 있는 제한효소를 포함하여 이루어지는 프라이머-제한효소 세트;인 것이 바람직하고, 상기 a)의 프라이머는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 포함하여 이루어지며, 상기 a)의 제한효소는 BanII이고, 상기 b)의 프라이머는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 포함하여 이루어지며, 상기 b)의 제한효소는 NlaIII이고, 상기 c)의 프라이머는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 포함하여 이루어지며, 상기 c)의 제한효소는 BccI이고, 상기 d)의 프라이머는 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 포함하여 이루어지며, 상기 d)의 제한효소는 Tsp45I인 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 한국인의 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke) 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검자의 DNA 시료로부터 miR-34a C>A(rs6577555) 및 miR-150 G>A(rs73056059) 중에서 선택된 단일염기다형성을 판별하고, 피검자가 소혈관질환(small-vessel disease, SVD) 또는 대혈관질환(large-artery disease, LAD)을 앓고 있는지의 여부를 조사하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 있어서, 소혈관질환(small-vessel disease, SVD)을 앓고 있는 피검자 중에서 miR-34a C>A 단일염기다형성이 CC 유전자형인 경우가 CA 또는 AA 유전자형인 경우보다 장기간 생존 가능성이 높고, 대혈관질환(large-artery disease, LAD)을 앓고 있는 피검자 중에서 miR-150 G>A 단일염기다형성이 GG 유전자형인 경우가 GA 유전자형인 경우보다 장기간 생존 가능성이 높은 것으로 분류할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 miR-34a C>A(rs6577555) 및 miR-150 G>A(rs73056059) 중에서 선택된 단일염기다형성을 검출하는 수단을 포함하는 한국인의 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke) 예후 예측용 키트를 제공한다.

본 발명의 허혈성 뇌졸중 예후 예측용 키트에 있어서, a) 상기 miR-34a C>A 단일염기다형성을 검출하는 수단은 miR-34a C>A 단일염기다형성 부위를 포함하는 연속된 50 내지 10,000bp 부위를 증폭하기 위한 프라이머 및 상기 miR-34a C>A 단일염기다형성 부위의 염기가 시토신 또는 아데닌인 경우 중 어느 한 경우의 DNA를 절단할 수 있는 제한효소를 포함하여 이루어지는 프라이머-제한효소 세트;이고, b) 상기 miR-150 G>A 단일염기다형성을 검출하는 수단은 miR-150 G>A 단일염기다형성 부위를 포함하는 연속된 50 내지 10,000bp 부위를 증폭하기 위한 프라이머 및 상기 miR-150 G>A 단일염기다형성 부위의 염기가 구아닌 또는 아데닌인 경우 중 어느 한 경우의 DNA를 절단할 수 있는 제한효소를 포함하여 이루어지는 프라이머-제한효소 세트;인 것이 바람직하고, 상기 a)의 프라이머는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 포함하여 이루어지며, 상기 a)의 제한효소는 BanII이고, 상기 b)의 프라이머는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 포함하여 이루어지며, 상기 b)의 제한효소는 BccI인 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면 상기 4가지의 miRNA 다형성을 바탕으로 한국인의 허혈성 뇌졸중의 발생 위험을 예측하고, 예후를 예측하는데 유용한 정보를 제공할 수 있다. 특히, 본 발명의 키트를 사용할 경우 보다 용이하게 상기와 같은 정보를 제공할 수 있다.

도 1은 miR-34a C>A 다형성에 따른 소혈관질환(small-vessel disease, SVD) 환자의 생존에 관한 콕스의 비례적 위험 회귀 그래프를 나타낸 것이다. A는 miR-34a C>A 다형성(CC vs. CA, P=0.016)의 생존 그래프이고, B는 miR-34a C>A 다형성(CC vs. CA+AA, P=0.019)의 생존 그래프이다.
도 2는 miR-150 G>A 다형성에 따른 대혈관질환(large-artery disease, LAD) 환자의 생존에 관한 콕스의 비례적 위험 회귀 그래프를 나타낸 것이다. miR-150 G>A 다형성(GG vs. GA, P=0.009)의 생존 그래프이다.

본 발명에서 한국인의 허혈성 뇌졸중 발생 위험 예측 및 예후 예측에 이용하는 miR-34a C>A, miR-130a C>T, miR-150 G>A 및 miR-155 T>A 단일염기다형성은 미국 국립생물정보센터의 단일염기다형성 데이터베이스(NCBI dbSNP, http://http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)에 각각 rs6577555, rs731384, rs73056059 및 rs767649로 등록되어 있다.

miR-34a C>A 단일염기다형성은 서열번호 9로 표시되는 부분에서 26번째 염기로 구분할 수 있는데, 이 염기가 시토신(cytosine) 또는 아데닌(adenine)일 수 있다. 이 단일염기다형성이 양쪽 염색체 모두 시토신인 경우 miR-34a CC 유전자형이며, 양쪽 염색체 모두 아데닌인 경우 miR-34a AA 유전자형이고, 한쪽 염색체가 시토신이고 다른 한쪽 염색체가 아데닌인 경우 miR-34a CA 유전자형이다.

miR-130a C>T 단일염기다형성은 서열번호 10으로 표시되는 부분에서 26번째 염기로 구분할 수 있는데, 이 염기가 시토신 또는 티민(thymine)일 수 있다. 이 단일염기다형성이 양쪽 염색체 모두 시토신인 경우 miR-130a CC 유전자형이며, 양쪽 염색체 모두 티민인 경우 miR-130a TT 유전자형이고, 한쪽 염색체가 시토신이고 다른 한쪽 염색체가 티민인 경우 miR-130a CT 유전자형이다.

miR-150 G>A 단일염기다형성은 서열번호 11로 표시되는 부분에서 26번째 염기로 구분할 수 있는데, 이 염기가 구아닌(guanine) 또는 아데닌일 수 있다. 이 단일염기다형성이 양쪽 염색체 모두 구아닌인 경우 miR-150 GG 유전자형이며, 양쪽 염색체 모두 아데닌인 경우 miR-150 AA 유전자형이고, 한쪽 염색체가 구아닌이고 다른 한쪽 염색체가 아데닌인 경우 miR-150 GA 유전자형이다.

miR-155 T>A 단일염기다형성은 서열번호 12로 표시되는 부분에서 26번째 염기로 구분할 수 있는데, 이 염기가 티민 또는 아데닌일 수 있다. 이 단일염기다형성이 양쪽 염색체 모두 티민인 경우 miR-155 TT 유전자형이며, 양쪽 염색체 모두 아데닌인 경우 miR-155 AA 유전자형이고, 한쪽 염색체가 티민이고 다른 한쪽 염색체가 아데닌인 경우 miR-155 TA 유전자형이다.

상기와 같은 단일염기다형성 판별은 중합효소연쇄반응-제한단편길이다형성(PCR-RFLP) 방법 또는 염기서열 분석방법을 수행하여 이루어질 수 있다.

중합효소연쇄반응-제한단편길이다형성(polymerase chain reaction- restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP) 방법은 중합효소연쇄반응을 수행하여 대상 유전자 또는 DNA 부위를 증폭하고, 특정 제한효소로 처리하였을 때 제한효소가 인식하여 소화가 이루어지는지 또는 제한효소가 인식하지 못하여 소화가 이루어지지 않는지를 구분함으로써 염기의 다형성, 결실, 부가 또는 치환을 구분하는 방법이다. 이때 DNA의 증폭여부 및 제한효소에 의한 소화 여부는 아가로스겔을 사용한 전기영동을 통해 확인할 수 있다.

염기서열 분석방법으로는 공지의 맥삼-길버트(Maxam-Gilbert) 또는 생어(Sanger)의 방법을 이용할 수 있다.

상기 PCR-RFLP 방법으로 다형성을 판별하는 경우에는 다음의 증폭용 프라이머 및 제한효소를 사용할 수 있다.

a) miR-34a C>A SNP 판별 : 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머, BanII 제한효소

b) miR-130a C>T SNP 판별 : 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머, NlaIII 제한효소

c) miR-150 G>A SNP 판별 : 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머, BccI 제한효소

d) miR-155 T>A SNP 판별 : 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머, Tsp45I 제한효소

상기 a)의 프라이머 및 제한효소를 사용할 경우, 중합효소연쇄반응을 통해 202bp의 DNA 단편이 증폭되며, 제한효소를 처리하면 miR-34a CC의 경우 180bp 및 22bp의 DNA 단편, miR-34a AA의 경우 202bp의 DNA 단편, miR-34a CA의 경우 202bp, 180bp 및 22bp의 DNA 단편이 생성된다.

상기 b)의 프라이머 및 제한효소를 사용할 경우, 중합효소연쇄반응을 통해 203bp의 DNA 단편이 증폭되며, 제한효소를 처리하면 miR-130a CC의 경우 203bp의 DNA 단편, miR-130a TT의 경우 179bp 및 24bp의 DNA 단편, miR-130a CT의 경우 203bp, 179bp 및 24bp의 DNA 단편이 생성된다.

상기 c)의 프라이머 및 제한효소를 사용할 경우, 중합효소연쇄반응을 통해 164bp의 DNA 단편이 증폭되며, 제한효소를 처리하면 miR-150 GG의 경우 138bp 및 26bp의 DNA 단편, miR-150 AA의 경우 164bp의 DNA 단편, miR-150 GA의 경우 164bp, 138bp 및 26bp의 DNA 단편이 생성된다.

상기 d)의 프라이머 및 제한효소를 사용할 경우, 중합효소연쇄반응을 통해 294bp의 DNA 단편이 증폭되며, 제한효소를 처리하면 miR-155 TT의 경우 155bp 및 139bp의 DNA 단편, miR-155 AA의 경우 294bp의 DNA 단편, miR-155 TA의 경우 294bp, 155bp 및 139bp의 DNA 단편이 생성된다.

상기 각 단일염기다형성의 조합에 따른 일배체형은 조합된 각 다형성이 동형접합일 경우 별도의 분석방법을 수행하지 않아도 결정할 수 있으나, 그렇지 않을 경우 연속적인 염기서열 분석방법을 수행하여 결정할 수 있다.

본 발명에 의하면 상기와 같은 방법으로 miRNA의 SNP를 판별하고 이를 바탕으로 한국인의 허혈성 뇌졸중 발생 위험을 예측하기 위한 정보를 제공할 수 있다. 이는 허혈성 뇌졸중 환자 및 대조군 집단의 비교 분석을 통해 확인된 유의적인 차이에 기인한 것이다.

또한 피검자의 나이, 성별, 당뇨병을 앓고 있는지의 여부, 고지혈증을 앓고 있는지의 여부, 고혈압을 앓고 있는지의 여부, 흡연 여부, 혈액 중 호모시스테인 레벨, 혈액 중 엽산 레벨 등의 추가 정보를 miRNA의 SNP 정보와 함께 고려하는 방법으로도 허혈성 뇌졸중 발생 위험을 예측하기 위한 정보를 제공할 수 있다. 이는 허혈성 뇌졸중 환자 및 대조군 집단의 계층화 분석, 유전자-환경 결합 분석 등을 통해 확인된 유의적인 차이에 기인한 것이다. 상기와 같은 추가 정보는 설문조사, 의사의 진단, 혈액검사 등의 방법을 통해 얻을 수 있다.

본 발명의 한국인의 허혈성 뇌졸중 발생 위험 예측용 키트는 상기와 같은 SNP 판별을 용이하게 수행할 수 있도록 하여 이를 바탕으로 한국인의 허혈성 뇌졸중 발생 위험을 예측할 수 있도록 하는 것으로, 상기 4가지 miRNA SNP 중에서 선택된 SNP를 검출하는 수단을 포함하는 것을 특징으로 한다. miRNA SNP 검출 수단으로는 miRNA의 SNP를 검출하기 위해 통상적으로 사용되는 탐침(probe), 예를 들어 PCR용 프라이머, PCR-RFLP용 프라이머 및 제한효소, DNA-DNA hybridization용 프로브가 있다. 본 발명에서는 이중에서도 PCR-RFLP용 프라이머 및 제한효소를 검출 수단으로 하는 것이 바람직하며, 특히 miR-34a C>A SNP 검출 수단으로는 상기 a)의 프라이머 및 제한효소, miR-130a C>T SNP 검출 수단으로는 상기 b)의 프라이머 및 제한효소, miR-150 G>A SNP 검출 수단으로는 상기 c)의 프라이머 및 제한효소, miR-155 T>A SNP 검출 수단으로는 상기 d)의 프라이머 및 제한효소가 바람직하다.

본 발명의 예후 예측용 키트는 miR-34a C>A 및 miR-150 G>A 중에서 선택된 SNP를 검출하는 수단을 포함하는 것을 특징으로 한다. 이때 검출 수단 또한 상기와 같은 프라이머, 제한효소, 프로브일 수 있고, miR-34a C>A SNP 검출 수단으로는 상기 a)의 프라이머 및 제한효소, miR-150 G>A SNP 검출 수단으로는 상기 c)의 프라이머 및 제한효소가 바람직하다.

본 발명의 발생 위험 예측용 키트 및 예후 예측용 키트에는 상기와 같은 검출 수단 이외에도 miRNA의 SNP 검출에 사용되는 시약, 기구 등이 더 포함될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

<실시예 1>

1-1. 연구 집단 선정

596명의 허혈성 뇌졸중 환자(평균 나이 ± SD: 63.67±10.42세, 254명의 남성, 342명의 여성)를 연구 집단으로 구성하였다. 허혈성 뇌졸중은 뇌 자기공명영상(magnetic resonance imaging, MRI) 기록을 통해 빠르게 악화되는 신경학적 증상과 동시에 발생하는 급성 경색에 기초하여 진단하였다. 이에 더해 404명의 대조군 집단(평균 나이 ± SD: 63.66±10.47세, 173명의 남성, 231명의 여성)을 포함시켰다. 연구 대상은 2000년 7월 1일에서 2008년 2월 28일 사이에 분당 차병원(한국, 성남) 신경학과에 위탁되어 등록되었다. 대조군 집단은 일반적인 건강검사를 위해 병원에 방문한 사람들로부터 모집되었다. 대조군 집단의 제외기준은 다음과 같다 : 뇌졸중의 가족력 또는 등록기간 중 비-특이적 어지럼증의 경험, 비-기질성두통, 또는 불안증세가 있는 사람. 모든 대조군 집단은 뇌 이미지화와 같은 검사(~75% MRI)를 받았고, 어떠한 기질적인 뇌 병변도 발견되지 않았다. 인구학적 데이터 및 혈관 위험 요소에 관한 의학적인 정보를 수집하기 위해 인터뷰를 실시하였다. 이전에 뇌출혈 경험이 있는 사람 또는 병력이 불완전한 사람은 본 연구에서 제외하였다. 허혈성 뇌졸중 환자를 다음과 같이 3그룹으로 분류하였다 : 대혈관질환(large-artery disease, LAD)이 있는 환자 202명, 소혈관질환(small-vessel disease, SVD)이 있는 환자 143명, 심인성질환(cardioembolism, CE)이 있는 환자 57명, 원인불명인 환자 194명.

허혈성 뇌졸중은 뇌 MRI에 기초하여 뇌의 임상적으로 관련된 부위에 뇌경색의 흔적이 있는 뇌졸중(빠르게 진행되는 병소적 및/또는 전반적인 뇌 기능 상실의 임상적인 증상 및 징후로 특정)으로 정의된다. 임상적인 징후 및 신경촬영 데이터를 기초로, 두 명의 신경학자가 다음과 같은 TOAST(Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment) 임상시험 기준을 사용하여 허혈성 뇌졸중을 3가지 병인학적 서브그룹으로 분류하였다 : i) 서브타입 1: LAD, 동맥의 세력권에 연관된 증상과 함께, MRI를 통해 직경 15㎜ 이상의 경색손상이 확인된 경우 및 뇌혈관 조영검사를 통해 주요 뇌동맥 또는 분지 피질 동맥의 유의적인(>50%) 협착이 확인된 경우; ii) 서브타입 2 : SVD, MRI를 통해 직경 15㎜ 미만 5㎜ 초과의 경색손상이 확인된 경우, 및 뇌 외피 기능 장애의 흔적 또는 색전증의 심장성 원인이 없는 전통적인 열공증후군(classic lacunar syndrome); iii) 서브타입 3 : CE, 심장병 평가를 통해 심장-유래 색전에 따른 것으로 보이는 동맥 폐쇄가 확인된 경우. 앞에서 설명한 방법에 기초하여 고혈압, 당뇨병, 고지혈증, 호모시스테인 레벨, 엽산 레벨, 비타민 B12 레벨, 콜레스테롤, 혈소판(PLT) 수치, 프로트롬빈 시간(PT), 활성 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT), 피브리노겐 레벨, 안티트롬빈 레벨, BUN 레벨 및 요산 레벨을 포함하는 임상적인 변수를 측정하였다.

1-2. 유전적인 분석

G-DEX 혈액 추출 키트(Intron Inc., Seongnam, Korea)를 사용하여 혈액 백혈구로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 기록 조사를 통해 프로모터 부위의 SNP를 포함하여 miRNA 중 4가지의 SNP(miR-34a rs6577555C>A, miR-130a rs731384C>T, miR-150 rs73056059G>A 및 miR-155 rs767649T>A)를 결정하였다. 모든 SNP 서열은 HapMap 데이터베이스(www.hapmap.org) 및 dbSNP-(www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)를 통해 얻었다. 뉴클레오티드 치환은 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하는 PCR-RFLP(polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism) 분석을 통해 결정하였다.

miR-34a rs6577555C>A 다형성을 위한 PCR은 다음의 프라이머를 사용하여 수행하였다 : 5'-CCT GGT TAA CAT AGC CAG AGC-3' (forward) 및 5'-GCA GAC ATG CTG ACT TTT CAA-3' (reverse). DNA는 35 사이클(denaturation at 95℃ for 30 sec, annealing at 56℃ for 30 sec, and extension at 72℃ for 35 sec) 이상 증폭하였다. PCR 산물은 BanII 제한효소로 37℃로 16시간 처리하여 소화시키고, 3.5% 아가로스 겔 전기영동으로 확인하였다.

miR-130a rs731384C>T 다형성을 확인하기 위해서는 5'-GAT GCT CAG TCC TCA AAG AAC A-3' (forward) 및 5'-TGA GGC CTA GAG CTC TGC TTT AT-3' (reverse) 프라이머를 사용하였다. DNA는 35 사이클(denaturation at 95℃ for 30 sec, annealing at 58℃ for 30 sec, and extension at 72℃ for 35 sec) 이상 증폭하였다. PCR 산물은 NlaIII(New England Biolabs)로 37℃로 16시간 처리하여 소화시키고 3% 아가로스 겔 전기영동으로 확인하였다.

miR-150 rs73056059G>A 다형성에는 5'-GTT CCT GCC AGA GGA AGT G-3' (forward) 및 5'-CCT CTG GAG TCC ACA CTC CAT-3' (reverse) 프라이머를 사용하였다. DNA는 35 사이클(denaturation at 95℃ for 30 sec, annealing at 60℃ for 35 sec, and extension at 72℃ for 40 sec) 이상 증폭하였다. 증폭산물은 BccI(New England Biolabs)으로 37℃로 16시간 처리하고 4% 겔 전기영동으로 확인하였다.

miR-155 rs767649T>A 다형성에는 5'-CCT GTA TGA CAA GGT TGT GTT TG-3' (forward) 및 5'-GCT GGC ATA CTA TTC TAC CCA TAA-3' (reverse) 프라이머를 사용하였다. DNA는 35 사이클(denaturation at 95℃ for 35 sec, annealing at 56℃ for 30 sec, and extension at 72℃ for 35 sec) 이상 증폭하였다. PCR 산물은 Tsp45I(New England Biolabs)로 37℃로 16시간 처리하고 3% 아가로스 겔 전기영동으로 확인하였다.

1-3. 통계학적 분석

임상적인 특징을 Student's unpaired t-test를 사용하여 비교하였다. 허혈성 뇌졸중과 4개의 miRNA 유전자형 사이의 연관성은 Fisher's exact test를 사용한 승산비(odd ratio) 계산 및 95% 신뢰구간(confidence intervals, CIs)을 바탕으로 분석하였다. miRNA 다형성의 조정된 ORs(AORs)는 성별, 나이, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증 및 흡연을 기초로 하는 다중 로지스틱 회귀 분석(multiple logistic regression analysis)을 사용하여 결정하였다. 각 다형성의 유전자형 분포는 하디-바인베르크 평형 편차(Hardy-Weinberg equilibrium deviation)로 평가하였고, 그룹 간의 유전자형과 대립유전자 빈도 차이는 χ2 test로 평가하였다. P<0.05 값은 통계학적으로 유의적인 차이를 나타내기 위해 고려되었다. 계층화 분석은 막힌 혈관의 크기에 기초한 뇌졸중 서브그룹을 구분하기 위해 사용되었다. ANOVA(One-way analysis of variance)는 다른 유전자형 사이의 평균 호모시스테인 농도 레벨 비교를 위해 수행하였다. Stats Direct Statistical Software(version 2.4.4; StatsDirect Ltd., Altrincham, UK)를 조정된 OR 및 95% CI를 계산하기 위해 사용하였다. 생존 곡선은 콕스의 비례적 위험 회귀(Cox proportional hazards regression)를 사용하여 만들었고, 그룹 간의 차이의 유의성은 log-rank test를 사용하여 평가하였다. 콕스의 회귀 모델은 다양한 마커들의 독립적인 예후 중요성을 분석하기 위해 사용되었고, 결과는 나이, 성별, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증 및 흡연에 따라 조정되었다. 위험률(Hazard ratios, HRs)은 95% CI와 함께 나타내었다. 또한 miRNA 프로모터 부분에서 잠재적인 전사인자 결합 부위를 동정하기 위해 온라인 생물정보학 도구인 Alibaba 2.1(Grabe 2002)를 사용하여 in silico 분석을 수행하였다.

1-4. 결과

허혈성 뇌졸중 그룹 및 대조군 그룹의 인구학적 특징 및 임상적인 변수를 표 1에 나타내었다. 허혈성 뇌졸중 그룹을 대조군 그룹에 비교해보면, 뇌졸중 환자는 고혈압과 당뇨병이 유의적으로 높은 발생률을 갖고, 호모시스테인 및 피브리노겐 레벨이 유의적으로 높으며, 엽산 레벨 및 aPTT가 유의적으로 낮다(모두 P<0.05)(표 1 참조).

SD, 표준편차; PLT, 혈소판(platelet); PT, 프로트롬빈 시간(prothrombin time); aPTT, 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(activated partial thromboplastin time); BUN, 혈액요소질소(blood urea nitrogen)

^a P-value는 연속변수(continuous variables)를 위한 two-sided t-test 및 범주변수(categorical variable)를 위한 Chi-square test에 의해 계산되었음

4개의 miRNA 다형성(miR-34a rs6577555C>A, miR-130a rs731384C>T, miR-150 rs73056059G>A and miR-155 rs767649T>A) 및 이들과 허혈성 뇌졸중의 연관성을 조사하였다. 모든 관찰된 다형성 빈도는 하디-바인베르크 평형과 일치하였다. 처음에는 허혈성 뇌졸중 및 대조군 그룹 사이에서 어떠한 다형성 빈도 차이도 발견할 수 없었다(표 2 참조). 하지만 허혈성 뇌졸중 그룹을 서브그룹으로 계층화하고 분석한 결과, miRNA 다형성과 각각의 뇌졸중 서브타입 사이의 연관성을 관찰할 수 있었다. LAD는 miR-150 GA 유전자형(GG vs. AA: AOR, 1.922; 95% CI, 1.003-3.681)과 유의적으로 연관성이 있었다. CE 또한 miR-150(GG vs. AA: AOR, 2.996; 95% CI, 1.293-6.939)과 유의적인 연관성이 있었다. 반면 이들 차이는 FDR(false discovery rate)을 위해 P-값이 조정되면 소멸되었다(표 2 참조). miR-34a C>A, miR-130a C>T 및 miR-155 T>A 다형성은 뇌졸중 환자와 대조군 사이에서 유의적인 차이가 없었다.

나이, 성별, 고혈압, 당뇨병, 고지혈증, 흡연, 엽산 레벨 및 호모시스테인 레벨에 따른 계층화 분석을 수행하였다. miR-34a CA+AA 유전자형은 63세 이상(AOR, 1.443; 95% CI, 1.010-2.062), 여성(AOR, 1.459; 95% CI, 1.026-2.076) 및 당뇨병이 없는 환자(AOR, 1.360; 95% CI, 1.013-1.827)에서 출현율이 증가하는 것으로 나타났다. miR-150 GA+AA 유전자형 또한 고지혈증 환자(AOR, 6.060; 95% CI, 1.358-27.04)에서 출현율이 증가하는 것으로 나타났다(표 3 참조).

[표 2 설명]

AOR, 조정된 승산비(adjusted odd ratio); 95% CI, 95% 신뢰구간(confidence interval); LAD, 대혈관질환(large-artery disease); SVD, 소혈관질환(small-vessel disease); CE, 심인성질환(cardioembolism); N/A, 해당없음(not applicable)

^a 나이, 성별, 고혈압, 당뇨병, 고지혈증 및 흡연에 따라 조정되었음

^b Benjamini-Hochberg 방법을 사용하여 다중 가설을 테스트하기 위한 FDR(false discovery rate)-조정된 P-값

[표 3 설명]

AOR, 조정된 승산비(adjusted odd ratio); 95% CI, 95% 신뢰구간(confidence interval)

^a 나이, 성별, 고혈압, 당뇨병, 고지혈증, 흡연과 같은 위험 요소에 기초하여 조정된 승산비

^c 엽산 3.56nmol/L는 허혈성 뇌졸중 환자와 대조군에서 하위 15% cut-off 엽산 레벨임

^d 호모시스테인 13.92μmol/L는 뇌졸중 환자와 대조군에서 상위 15% cut-off 호모시스테인 레벨임

유전자-환경 결합 분석에서 몇몇 유전자형이 허혈성 뇌졸중의 위험성 관련 임상적 인자들과 연관성이 있는 것으로 나타났다. miR-34a CA+AA 유전자형은 고혈압(AOR, 3.088; 95% CI, 2.089-4.566), 고지혈증(AOR, 1.570; 95% CI, 1.010-2.443), 흡연자(AOR, 1.651; 95% CI, 1.023-2.665) 및 높은 호모시스테인 레벨(AOR, 2.230; 95% CI, 1.236-4.024)을 나타내는 환자에서 뇌졸중 출현율이 높은 것으로 나타났다. miR-130a CT+TT 유전자형 또한 고혈압(AOR, 2.390; 95% CI, 1.483-3.850), 당뇨병(AOR, 2.205; 95% CI, 1.043-4.661) 및 낮은 엽산 레벨(AOR, 4.702; 95% CI, 1.341-16.49)을 갖는 환자에서 뇌졸중 출현율이 높은 것으로 나타났다. miR-150 GA+AA 유전자형은 고혈압(AOR, 2.871; 95% CI, 1.416-5.824), 고지혈증(AOR, 7.215; 95% CI, 1.655-31.45) 및 흡연(AOR, 3.594; 95% CI, 1.267-10.20)하는 환자에서 뇌졸중 출현율이 높은 것으로 나타났다. miR-155 TA 유전자형은 당뇨병(AOR, 2.945; 95% CI, 1.659-5.228) 및 고지혈증(AOR, 1.734; 95% CI, 1.049-2.865) 환자에서 뇌졸중 출현율이 높은 것으로 나타났다(표 4 참조).

[표 4 설명]

^a 엽산 3.56nmol/L는 허혈성 뇌졸중 환자와 대조군에서 하위 15% cut-off 엽산 레벨임

^b 호모시스테인 13.92μmol/L는 뇌졸중 환자와 대조군에서 상위 15% cut-off 호모시스테인 레벨임

허혈성 뇌졸중 환자와 대조군을 비교하는 MDR(multifactor dimensionality reduction) 방법을 사용하여 대립유전자 조합 분석을 수행하였다(표 5 참조). 다음 대립유전자 조합은 뇌졸중의 출현율과 유의적인 연관성이 있는 것으로 나타났다 : miR-34a C>A / miR-130a C>T / miR-150 G>A / miR-155 T>A의 A-T-G-A 대립유전자 조합(OR, 0.052; 95% CI, 0.003-0.921), miR-34a C>A / miR-130a C>T / miR-150 G>A의 A-C-A 대립유전자 조합(OR, 4.285; 95% CI, 1.255-14.62), miR-34a C>A / miR-150 G>A의 A-A 대립유전자 조합(OR, 3.814; 95% CI, 1.106-13.15), 및 miR-150 G>A / miR-155 T>A의 A-A 대립유전자 조합(OR, 1.970; 95% CI, 1.013-3.831). 또한 유전자형 조합 분석을 수행하였다. miR-34a CA / miR-150 GA 유전자형(AOR, 5.470; 95% CI, 1.580-18.932) 및 miR-150 GA / miR-155 TA 유전자형(AOR, 3.265; 95% CI, 1.426-7.474)은 모두 허혈성 뇌졸중의 출현율의 증가와 연관성이 있었다(표 6 참조).

* 95% CI, 95% 신뢰구간(confidence interval)

^a Fisher's exact test

[표 6 설명]

^b 모든 다른 것의 빈도를 참조하여 계산된 각 특정 유전자형의 ORs 및 95% CIs

miR-130a 유전자형은 피브리노겐 레벨과 연관성이 있었고(CC vs. CT vs. TT: CC, 411.65±124.83; CT, 462.34±147.50; TT, 429.80±94.44; P<0.001), miR-150 우성 모델(GG vs. GA+AA)은 혈소판 수치의 증가와 유의적인 연관성이 있었다(GG vs. GA+AA: GG, 244.44±66.30; GA+AA, 266.53±58.58; P=0.002). miR-155 열성 모델(TT+TA vs. AA)은 비타민 B12(TT+TA vs. AA: TT+TA, 748.94±631.87; AA, 716.23±580.51; P=0.030) 및 피브리노겐 레벨(TT+TA vs. AA: TT+TA, 423.93±177.56; AA, 400.34±117.63; P=0.036)과 연관성이 있었고, miR-155 유전자형은 안티트롬빈 레벨(TT vs. TA vs. AA: TT, 97.42±39.69; TA, 91.92±17.99; AA, 92.29±16.25; P=0.049)과 연관성이 있었다(표 7 참조).

[표 7 설명]

SD, 표준편차; PLT, 혈소판(platelet); PT, 프로트롬빈 시간(prothrombin time); aPTT, 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(activated partial thromboplastin time)

^a ANOVA를 사용하여 계산되었음

^b Kruskal-Wallis test를 사용하여 계산되었음

^c Mann-Whitney test를 사용하여 계산되었음

miRNA 다형성과 허혈성 뇌졸중 환자의 생존 사이의 연관성을 도 1 및 2에 나타내었다. 콕스의 비례적 분석으로 miR-34a CA 유전자형이 SVD 서브그룹에서 생존과 유의적인 연관성이 있는 것으로 나타났다(CC vs. CA, P=0.016)(도 1A 참조), (CC vs. CA+AA, P=0.019)(도 1B 참조). miR-150 GA 유전자형은 LAD 서브그룹에서 생존과 연관성이 있었다(GG vs. GA, P=0.009)(도 2 참조).

<110> SUNGKWANG MEDICAL FOUNDATION <120> Association of miR-130a C>T, miR-150 G>A and miR-155 T>A SNP with the risk of ischemic stroke in a Korean population <130> PA-D18202 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for miR-34a C>A <400> 1 cctggttaac atagccagag c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for miR-34a C>A <400> 2 gcagacatgc tgacttttca a 21 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for miR-130a C>T <400> 3 gatgctcagt cctcaaagaa ca 22 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for miR-130a C>T <400> 4 tgaggcctag agctctgctt tat 23 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for miR-150 G>A <400> 5 gttcctgcca gaggaagtg 19 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for miR-150 G>A <400> 6 cctctggagt ccacactcca t 21 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for miR-155 T>A <400> 7 cctgtatgac aaggttgtgt ttg 23 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for miR-155 T>A <400> 8 gctggcatac tattctaccc ataa 24 <210> 9 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 ccagcctggt taacatagcc agacccccac cttcagcaac tgtctctaca a 51 <210> 10 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 cttgatgctc agtcctcaaa gaaaacggct attagcaatc cccaaagtct g 51 <210> 11 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 cagtagagaa ccagcaaggg gcaaagaggg agtgtggact ccagagggag g 51 <210> 12 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 atataacaca ttatcaaaaa cactgatcac ttttctgagt gctctaatca gg 52

Claims

한국인의 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke) 발생 위험 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검자의 DNA 시료로부터 miR-130a C>T(rs731384), miR-150 G>A(rs73056059) 및 miR-155 T>A(rs767649)의 단일염기다형성을 판별하는 방법.