CN115418400A - Ahnak2的snp标志物在抗血栓药物治疗血栓疗效预测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了AHNAK2的SNP标志物在抗血栓药物治疗血栓疗效预测中的应用，具体的涉及到的SNP位点为rs2582513，本发明首次发现了rs2582513与利伐沙班治疗血栓疗效预测相关，进一步在健康受试者和NVAF患者中进行研究，发现rs2582513的基因型为GG时，受试者服用抗血栓药物后药效较差；当rs2582513的基因型为GA时，受试者服用抗血栓药物后药效较好；当rs2582513的基因型为AA时，受试者服用抗血栓药物后药效较好但出血事件概率升高。

Description

AHNAK2的SNP标志物在抗血栓药物治疗血栓疗效预测中的 应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及AHNAK2的SNP标志物在抗血栓药物治疗血栓疗效预测中的应用，具体涉及的SNP标志物为rs2582513。

背景技术

血栓的形成是心肌梗死、卒中、深静脉血栓、肺栓塞等心血管疾病的重要致病因素，抗血栓治疗一直是这类疾病抢救措施及预防策略的核心，其中抗凝血是抗血栓治疗的重要方法之一。自1914年肝素发现以来，抗凝药物在预防和治疗威胁生命的血栓栓塞事件中发挥重要作用。

利伐沙班是全球第一个高选择性直接抑制因子Xa的口服抗凝药，是拜耳公司历经10年研发的新型抗凝药物，为化学合成的小分子化合物，并是唯一的一种疗效始终优于依诺肝素的新型口服抗凝药。

直接口服抗凝药物，如利伐沙班，主要用于治疗血栓高危患者，如房颤和静脉血栓栓塞。利伐沙班抑制Xa因子，阻断凝血级联的共同途径。尽管利伐沙班降低了缺血性事件的发生率，但在临床应用中，它与出血事件的风险增加有关。既往研究报道，在使用利伐沙班的患者中，每年任何出血事件的发生率为14.9% ~ 20.7%，其中大出血事件发生率为3.0% ~3.6%，存在住院和死亡风险。

利伐沙班在大范围的个体（性别、年龄、种族、体重）中具有可预测的药代动力学特性。但影响利伐沙班生物标志物的数据有限，只有一些药物基因组学研究提示遗传多态性可能影响利伐沙班的药代动力学、药效学或临床结果。因此研究遗传多态性对NVAF患者临床个体化用药是十分必要的。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于抗血栓药物治疗血栓疗效预测的SNP标志物，通过检测SNP基因型来判断抗血栓药物治疗血栓的疗效。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了一种检测样本中SNP标志物的试剂在制备抗血栓药物治疗血栓疗效预测的产品中的应用。

进一步，所述SNP标志物包括AHNAK2基因的SNP位点rs2582513。

进一步，所述抗血栓药物包括溶栓药、抗凝药、抗血小板药中的一种或多种。

进一步，所述溶栓药包括尿激酶、阿替普酶、瑞替普酶或链激酶。

进一步，所述抗凝药包括肝素、华法林、阿加曲班、磺达肝癸钠、利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班或达比加群酯。

进一步，所述抗血小板药包括影响血小板活化扩增的药物或抑制血小板聚集的药物。

进一步，所述影响血小板活化扩增的药物包括血栓素A2抑制剂、二磷酸腺苷P2Y12受体拮抗剂、凝血酶受体拮抗剂、5-羟色胺受体拮抗剂中的一种或多种。

进一步，所述血栓素A2抑制剂包括阿司匹林。

进一步，所述二磷酸腺苷P2Y12受体拮抗剂包括噻吩吡啶类或非噻吩吡啶类。

进一步，所述噻吩吡啶类包括噻氯匹定、氯吡格雷或普拉格雷。

进一步，所述非噻吩吡啶类包括替卡格雷、坎格雷洛、替格瑞洛中的一种或多种。

进一步，所述凝血酶受体拮抗剂包括Vorapaxar(SCH-530348)或Atopaxar(E5555)。

进一步，所述5-羟色胺受体拮抗剂包括沙格雷酯或西酞普兰。

进一步，所述抑制血小板聚集的药物包括血小板糖蛋白或磷酸二酯酶抑制剂。

进一步，所述血小板糖蛋白包括阿西单抗或替罗非班。

进一步，所述磷酸二酯酶抑制剂包括双嘧达莫或西洛他唑。

进一步，所述血栓包括白色血栓如延续性血栓、混合血栓、红色血栓、透明血栓中的一个或多个。

进一步，所述混合血栓包括红细胞为主的血栓、球形血栓或层状血栓。

进一步，所述产品包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序、系统中的一种或多种。

进一步，当rs2582513的基因型为GG时，受试者服用前面所述的抗血栓药物后药效较差。

进一步，当rs2582513的基因型为GA时，受试者服用前面所述的抗血栓药物后药效较好。

进一步，当rs2582513的基因型为AA时，受试者服用前面所述的抗血栓药物后药效较好但出血事件概率升高。

进一步，所述试剂包括通过直接测序、单碱基延伸、等位基因特异性探针杂交、等位基因特异性引物延伸、等位基因特异性扩增、等位基因特异性核苷酸掺入、5 '核酸酶消化、分子信标测定、寡核苷酸连接测定、大小分析和单链构象多态性方法检测rs2582513基因型的试剂。

进一步，所述试剂包括通过以下方法中使用到的试剂：基于PCR的检测方法、Southern杂交方法、Northern杂交方法、点杂交方法、荧光原位杂交方法、DNA微阵列方法、PCR ASO探针法、高通量测序平台方法、芯片法。

进一步，所述样本包括骨髓、血液、血细胞、腹水、组织或细针活检样本、含有细胞的体液、游离漂浮核酸、痰液、唾液、尿液、脑脊液腹膜液、胸膜液、粪便、淋巴、皮肤拭子、口服拭子、鼻拭子、洗涤物或灌洗物、吸出物、刮屑、骨髓标本、组织活检标本、手术标本中的一种或多种。

进一步，所述样本为血液。

本发明提供了一种用于抗血栓药物治疗血栓疗效预测的产品，所述产品包括检测样本中SNP位点rs2582513基因型的试剂。

进一步，所述SNP位点rs2582513为AHNAK2基因的SNP位点rs2582513。

进一步，所述抗血栓药物包括溶栓药、抗凝药、抗血小板药中的一种或多种。

进一步，所述溶栓药包括尿激酶、阿替普酶、瑞替普酶或链激酶。

进一步，所述抗凝药包括肝素、华法林、阿加曲班、磺达肝癸钠、利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班或达比加群酯。

进一步，所述抗血小板药包括影响血小板活化扩增的药物或抑制血小板聚集的药物。

进一步，所述影响血小板活化扩增的药物包括血栓素A2抑制剂、二磷酸腺苷P2Y12受体拮抗剂、凝血酶受体拮抗剂、5-羟色胺受体拮抗剂中的一种或多种。

进一步，所述血栓素A2抑制剂包括阿司匹林。

进一步，所述二磷酸腺苷P2Y12受体拮抗剂包括噻吩吡啶类或非噻吩吡啶类。

进一步，所述噻吩吡啶类包括噻氯匹定、氯吡格雷或普拉格雷。

进一步，所述非噻吩吡啶类包括替卡格雷、坎格雷洛、替格瑞洛中的一种或多种。

进一步，所述凝血酶受体拮抗剂包括Vorapaxar(SCH-530348)或Atopaxar(E5555)。

进一步，所述5-羟色胺受体拮抗剂包括沙格雷酯或西酞普兰。

进一步，所述抑制血小板聚集的药物包括血小板糖蛋白或磷酸二酯酶抑制剂。

进一步，所述血小板糖蛋白包括阿西单抗或替罗非班。

进一步，所述磷酸二酯酶抑制剂包括双嘧达莫或西洛他唑。

进一步，所述血栓包括白色血栓如延续性血栓、混合血栓、红色血栓、透明血栓中的一个或多个。

进一步，所述混合血栓包括红细胞为主的血栓、球形血栓或层状血栓。

进一步，所述产品包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序、系统中的一种或多种。

进一步，所述试剂为针对rs2582513的核酸亲和配体。

进一步，所述核酸亲和配体包括引物或探针。

进一步，所述探针包括DNA、RNA、DNA RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。

进一步，所述探针是可以完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合的任何长度。

进一步，所述探针的长度包括10、13、15、20、25、30、40、50、60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。

进一步，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。

进一步，所述探针自身互补序列少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

进一步，所述产品包括处理样本的试剂。

进一步，所述试剂包括通过数字成像技术、蛋白免疫技术、染料技术、核酸测序技术、核酸杂交技术、色谱技术、质谱技术检测样本中生物标志物或其功能片段的存在、不存在和/或量的试剂。

进一步，所述样本包括骨髓、血液、血细胞、腹水、组织或细针活检样本、含有细胞的体液、游离漂浮核酸、痰液、唾液、尿液、脑脊液腹膜液、胸膜液、粪便、淋巴、皮肤拭子、口服拭子、鼻拭子、洗涤物或灌洗物、吸出物、刮屑、骨髓标本、组织活检标本、手术标本中的一种或多种。

进一步，所述样本为血液。

进一步，所述产品还包括记载了前面所述的抗血栓药物治疗血栓疗效预测步骤的产品说明书，所述预测步骤包括：

1）来自样本的核酸与检测rs2582513基因型的试剂接触；

2）确定rs2582513的基因型；

3）基于所述基因型预测受试者使用前面所述的抗血栓药物治疗血栓的疗效。

进一步，所述rs2582513的基因型为GG时，受试者服用前面所述的抗血栓药物后药效较差。

进一步，当rs2582513的基因型为GA时，受试者服用前面所述的抗血栓药物后药效较好。

进一步，当rs2582513的基因型为AA时，受试者服用前面所述的抗血栓药物后药效较好但出血事件概率升高。

定义

术语“SNP”(单核苷酸多态性)是指DNA中的单个碱基位置，在该单个碱基位置上存在一个群体的不同的等位基因或替代的核苷酸。该SNP位置通常前接和后接所述等位基因的高度保守序列(例如，在种群中小于1/100或1/1000的成员中不同的序列)。对于在每个SNP位置的等位基因，个体可以是纯合的或杂合的。本发明的SNP位点以“rs-”方式命名，本领域技术人员能够根据上文的rs-命名，从适合的数据库和相关的信息系统如单核苷酸多态性数据库(dbSNP)中确定其确切的位置、核苷酸序列。

术语“SNP位点的核酸亲和配体”指能够结合如上文定义的SNP位点或其附近序列的核酸分子。作为非限制性的实施方式，可以是例如RNA、DNA、PNA、CAN、HNA、LNA或ANA分子或者本领域技术人员已知的任何其他合适的核酸形式。

术语“血栓”是指血流在心血管系统血管内面剥落处或修补处的表面所形成的小块。在可变的流体依赖型中，血栓由不溶性纤维蛋白，沉积的血小板，积聚的白细胞和陷入的红细胞组成。

术语“溶栓药”是指促进纤维蛋白溶解而溶解血栓的药。体内纤维蛋白溶解过程是一系列蛋白酶催化连锁反应，第一阶段为血浆或组织中激活剂的活化并转化为纤溶酶原激活剂；第二阶段为纤溶酶原转化为纤溶酶；纤维蛋白或纤维蛋白原被分解。溶栓酶可直接或间接作用于纤溶系统各环节。纤溶系统由纤溶酶原、纤溶酶、激活酶原和抑制物组成。

术语“抗凝药”是指防止或减少血液凝固、延长凝血时间的化学物质。若用于称呼天然物质则称为抗凝素、抗凝物、抗凝血素。抗凝剂包含多种不同的药物，主要的用途是避免血栓形成；其次就是当病人需要连接往一些医疗仪器，又或需要接受输血，又或其血液需要送往化验时，亦会加入抗凝血素，以免血液凝固。

术语“抗血小板药”是指用来抑制血小板的环氧化酶生长的药物。抗血小板药物包括影响血小板活化扩增的药物、抑制血小板聚集的药物。影响血小板活化扩增的药物包括血栓素A2抑制剂如阿司匹林，二磷酸腺苷P2Y12受体拮抗剂（噻吩吡啶类如噻氯匹定、氯吡格雷、普拉格雷，非噻吩吡啶类如替卡格雷、坎格雷洛、替格瑞洛），凝血酶受体拮抗剂如Vorapaxar(SCH-530348)、Atopaxar(E5555)，5-羟色胺受体拮抗剂如沙格雷酯、西酞普兰；抑制血小板聚集的药物包括血小板糖蛋白如阿西单抗、替罗非班，磷酸二酯酶抑制剂如双嘧达莫、西洛他唑。

在本发明上下文中，所使用的术语“探针”是指能够选择性结合特定预期目标生物分子的任何分子，可间接地或直接地、共价地或非共价地结合至本文公开的任何底物和/或反应产物和/或蛋白酶的任何分子或与其相关，并且其相关或结合可使用本文公开的方法检测。本发明上下文中的探针包括荧光探针、抗体或基于吸光度的探针。如果是基于吸光度的探针，发色团pNA(对硝基苯胺)可用作检测和/或定量本文公开的靶核酸序列的探针；也可以是包含荧光分子或底物的核酸序列，该荧光分子或底物在暴露于酶时变为发荧光的，并且该核酸序列与一种核酸序列的片段互补。

一般实时荧光定量PCR检测过程中，探针会被设计成熔解温度超过正向和反向引物10℃，这使得探针在退火及延伸过程中会完全结合在PCR产物上。典型的，例如Taqman探针，会在具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶的作用下，在延伸过程中发生探针的水解，使得探针中的荧光基团和猝灭基团远离，从而破坏荧光基团和猝灭基团间的共振能量传递，使得荧光基团发出的荧光可以被仪器检测到，同时随着PCR产物的逐渐增多，荧光信号会在一定时间内呈现指数级别的上升，最后在荧光定量PCR仪上呈现“S”型的扩增曲线。用于实时荧光定量PCR的反应试剂包括但不限于：目标基因靶序列的正反向引物、Taqman荧光探针、优化的PCR缓冲液、三磷酸脱氧核苷酸以及具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶等。

术语“核酸”意指DNA和RNA两者，两者均以任何可能的构型存在，即以双链(ds)核酸的形式，或以(ss)核酸的形式，或者以其组合形式(部分ds或ss)。这样的核酸对应于任选地包含至少一种修饰的核苷酸的至少两个连续的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。

核酸也可以在核苷酸件的键的水平上被修饰(如硫代磷酸、H-磷酸酯、烷基磷酸酯)，在主链的水平上被修饰(例如α-寡核苷酸)或PNA或2′-O-烷基核糖)。这些修饰中的每一种可以联合发生，只要在核酸中存在至少一种磷酸酯。所述核酸可以是天然的或合成的、寡核苷酸、多核苷酸、核酸片段、核糖体RNA、信使RNA、转移RNA、通过酶促扩增技术获得的核酸。所述酶促扩增技术例如是PCR(聚合酶链式反应)及其RT-PCR衍生形式、PCR(修复链反应)、3SR(自动维持序列扩增)、NASBA(依赖核酸序列的扩增)、TMA(转录介导的扩增)。

术语“引物”指天然存在的寡核苷酸(例如限制性片段)或合成产生的寡核苷酸，其能够用作引物延伸产物合成的起始点，当处于适当的条件(例如缓冲液、盐、温度和pH)以及存在核苷酸和用于核酸聚合的试剂(例如依赖DNA或依赖RNA的聚合酶)的条件下，所述引物延伸产物与核酸链(模板或靶序列)互补。

术语“样本”可以是哺乳动物的组织、细胞或者体液的样本。所述样本包括但不限于体液(例如血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液、汗液、精液、粪便、痰、眼泪、粘液、羊水等)、渗出液、骨髓、腹水、骨盆冲洗液、胸膜液、脊髓液、淋巴液、眼液、鼻、喉或生殖器拭子的提取物、消化组织的细胞悬浮液、或粪类物质的提取物、以及来自人、动物(例如非人哺乳动物)的组织和器官样本，以及由此衍生出的加工样本。

在本发明的上下文中，所使用的术语“受试者”，是指任何动物，还指人类和非人类的动物。非人类的动物包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物，如非人灵长类动物（特别是高等灵长类动物）、绵羊、狗、啮齿类动物（如小鼠或大鼠）、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛、和任何家畜或宠物；以及非哺乳动物，如两栖类，爬行动物等。在优选的实施方式中，所述受试者为人。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了SNP位点rs2582513的基因型与抗血栓药物治疗血栓的疗效相关，通过检测rs2582513的基因型，可以判断抗血栓药物治疗血栓的疗效。

附图说明

图1是研究设计流程图；

图2是AHNAK2基因多态性对凝血酶原时间比值的影响趋势图；

图3是AHNAK2基因多态性对凝血酶原时间比值预测的ROC曲线图；

图4是AHNAK2基因多态性对1个月出血事件的影响趋势图；

图5是AHNAK2基因多态性对出血事件预测的ROC曲线图。

具体实施方式

本发明通过广泛而深入的研究，首次发现了rs2582513的基因型在抗血栓药物治疗血栓的疗效的显著性差异，通过检测rs2582513的基因型可以判断受试者使用抗血栓药物治疗血栓的疗效。

受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，简称ROC曲线)：是根据一系列不同的二分类方式(分界值或决定阈)，以敏感性(真阳性率)为纵坐标，1-特异性(假阳性率)为横坐标绘制的曲线。ROC曲线下面积是重要的试验准确度指标，ROC曲线下面积越大，试验的诊断价值越大。

实施例1 健康人服用利伐沙班后药效学、药物动力学、生物指标结果分析

1、研究对象和样本收集

基于全国多中心的临床生物等效性试验，研究中心包括北京大学第一医院、北京回龙观医院、辽宁中医药大学附属医院、青岛大学附属医院、南昌大学第一附属医院的一期临床试验中心。研究认为为18-45岁、身体质量指数在18-26 kg/m²之间的中国健康受试者。所有受试者在研究开始前至少4周没有服用任何药物。健康受试者在服药前一天进入研究，他们被随机分配到测试剂组或参照组，不同组别间无显著性差异（p<0.05），结果如表1所示。除利伐沙班15 mg剂量组和10 mg剂量组的年龄外，各剂量组健康受试者的人口统计学特征无差异。

受试者在空腹和餐后条件下接受单剂量的利伐沙班，包括10、15和20 mg。所有受试者均在利伐沙班给药48 h或72 h后出院。图1显示了利伐沙班在健康志愿者中的研究设计。

本研究是根据临床实践指南和赫尔辛基宣言进行，由独立的伦理委员会和北京大学第一医院及所有参与研究的分中心医院机构审查委员会批准(批件号:2016[1235])。临床试验在Clinical Trials中注册号为NCT03161496。在研究开始前，向所有受试者简要介绍研究的目的、持续时间和潜在风险，并提供书面知情同意书。

2、研究方法

2.1 血样采集

药效学（pharmacodynamics，PD）参数的检测采样时间分别为给药后0、3、8、12 h。在2.7 mL柠檬酸钠（3.2% v/v）试管中采集血液样本，在采样60分钟内，室温下2500 g离心15 min。血浆样本在取样后6个月内转移到-70℃低温保存，等待进行检测分析。

2.2 PD分析方法

使用Sysmex®CS-2100i全自动多参数止血分析仪（Sysmex，日本）检测PD参数（活化部分凝血酶活时间（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶原时间（prothrombin time，PT））。采用经验证的凝血法检测试剂盒（Thromborel-S®和Actin®，西门子医疗诊断产品有限公司，德国）测定PT和APTT。

2.3 基因检测分析方法

采用盐析法从外周血中提取基因组DNA，进行全外显子组测序。测序库是通过对KAPA库制备试剂盒（KAPA Biosystems Inc.，美国）的修改构建而成。使用Bioruptor（Diagenode，Lie 'ge，Belgium）将1 μg的基因组DNA剪切到平均200 bp的片段大小。片段用amprexp珠（Beckman Coulter Inc.，美国）纯化。测序库进行最小PCR循环，并使用量子比特2.0荧光计（Thermo Fisher Scientific，美国）进行定量。使用Roche NimbleGen SeqCapEZ外显子组扩增试剂盒V3 （Roche NimbleGen Inc.，瑞士）将测序库合并为池进行溶液相杂交。捕获的测序库使用安捷伦2100生物分析仪（安捷伦科技公司，美国）进行分析，使用量子比特2.0荧光仪（Thermo Fisher Scientific，美国）测量DNA浓度，然后发送测序，使用HiSeq 3000平台（Illumina，Inc.，美国）生成2×150 bp的对端解读。除了表型差异外，质量控制步骤还发现了低阅读深度和覆盖率、性别不匹配、潜在亲缘关系和群体分层。

对于常见的单核苷酸多态性（MAF>0.01），采用加性遗传模型，基于卡方检验进行初级单核苷酸多态性关联分析。采用全基因组显著性阈值p<1×10^-5校正多重检测。采用PLINK v 1.90进行全基因组关联分析。采用Epacts v 3.2.6软件（https://genome.sph.umich.edu/wiki/EPACTS）进行基因检测，筛选罕见SNP (0.001 < MAF <0.05)。选择至少2个Epacts模型中p < 0.01的基因作为候选基因，按照以下标准进行筛选：1000个基因组中变异MAF < 1%、1000个基因组东亚血统人群、ExAC和ExAC东亚血统人群；该变异位于外显子区域；CADD phred评分至少为15分，这意味着可能存在破坏性变异。

2.4 数据统计分析

所有统计分析均使用统计软件包社会科学21.0软件（IBM，Armonk，美国）进行。使用Pearson相关分析检验变量之间的相关性。采用Logistic回归方法评估PG和PD参数的显著性差异，分别采用粗模型和经基线特征调整的模型。P< 0.05为差异有统计学意义。连续变量和分类变量以平均值±标准差（SD）、频率和百分比表示。采用差异基因超几何分布检验计算p值，采用Benjamini-Hochberg多重检验计算误检率。

3、研究结果

研究发现AHNAK2基因上SNP位点rs2582513显著影响利伐沙班的PT比值（p=0.0003）。SNP位点rs2582513不同基因型为GG/GA/AA，其携带者的基因分布情况为40/139/110，结果如表2所示。

与AHNAK2基因rs2582513的GA、AA携带者相比，40位携带AHNAK2基因rs2582513的GG位点受 试者的PT比值下降，p值为0.0003，具有统计学意义。研究结果表明AHNAK2基因rs2582513的 GG基因携带者服用利伐沙班后PT改变较小，提示高凝状态，临床用药时需根据用药目的进 行酌情增加药物剂量，结果如图2所示。

采用ROC曲线分析AHNAK2基因上的SNP rs2582513对凝血酶原的预测，发现AUC值为0.93，敏感性为1.0，特异性为0.66，预测基因突变为G基因携带者，可对药效学有预测意义，结果如图3所示。

实施例2 NVAF患者服用利伐沙班后药效学、药物动力学、生物指标结果分析

1、研究对象选择

本研究纳入包括18岁以上接受血栓预防的非瓣膜性房颤（non-valvular atrialfibrillation，NVAF）患者。排除标准如下：

1）免疫缺陷性疾病、病毒性肝炎、严重肝功能异常或肾功能异常患者；

2）利伐沙班治疗前14天内接受p-糖蛋白抑制剂联合治疗的患者，包括全身吡咯类抗真菌药物酮康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑，人免疫缺陷病毒蛋白酶抑制剂利托那韦，或诱导剂利福平、苯妥英、苯巴比妥、卡马西平；

3）利伐沙班是否有过敏、活动性出血、过去6个月有颅内或胃肠道出血史、30天内有无大手术等禁忌症；

4）不愿意按时服药或按规定献血。

该研究方案经北京大学第一医院独立伦理委员会和所有临床注册号为NCT03161496的分中心医院批准。这项研究遵守了《赫尔辛基宣言》中概述的道德原则。所有参与本研究的患者均签署了知情同意书。

2、研究方法

2.1 基因检测

随访期间采集基因血样，提取DNA进行基因分型。采用SureSelectXT目标富集系统和Illumina NovaSeq 6000测序仪（Illumina，美国）进行全外显子组测序检测SNP。基因分型后对样本和遗传标记进行严格的质量控制。缺失率<10%、次要等位基因频率>5%、Hardy-Weinberg平衡p值>10^-6的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）被纳入进一步分析。

2.2 研究结局事件

在临床患者入组后1个月、6个月、1年和2年通过电话或常规门诊进行随访。主要安全结果为出血事件，包括出血学术研究联盟划分的大出血和小出血。次要终点是中风或全身栓塞事件。中枢神经系统以外的部位出现全身性栓塞，导致四肢、肾脏和其他内脏器官急性缺血，诊断依据是突然出现的局部疼痛，伴有寒冷、无脉的四肢或血尿，并通过血管造影、超声检查或计算机断层扫描确诊。

2.3 数据统计分析

连续变量用平均值和标准差表示，而分类变量用百分数表示。所有统计分析均使用R软件（http://www.R-project.org）和statistical Package for Social Sciences软件，版本21.0（IBM，Armonk，美国）分析。使用卡方检验，P值<0.05表示可能偏离总体分布。采用Cox比例风险模型计算风险比，确定预后因素及亚组间差异。

3、研究结果

2017年6月至2021年7月共纳入257例NVAF患者。入组时50.97%(131/257)的患者进行了射频导管消融。纳入患者的基线特征如表3所示。

本研究探索了遗传变异对NVAF患者服用利伐沙班后临床结局（出血、栓塞等事件）的影响。研究发现AHNAK2基因上的SNP rs2582513显著影响利伐沙班的用药后1个月时的出血事件（p=0.03）。

SNP位点rs2582513不同基因型为GG/GA/AA，其携带者的基因分布情况为42/116/98，结果如表4所示。

与AHNAK2基因rs2582513的GA、GG携带者相比，98位携带AHNAK2基因rs2582513的AA位点NVAF患者的出血事件发生率高（10% vs. 20%），p值为0.03，具有统计学意义，结果如图4所示。

采用ROC曲线分析AHNAK2基因上的SNP rs2582513对出血事件的预测，发现AUC值为0.85，敏感性为0.86，特异性为0.56，预测基因突变为A基因携带者，可对药效学有预测意义，结果如图5所示。

本研究在健康人群中证实AHNAK2基因rs2582513的A基因突变者服用利伐沙班后PT改变增加，提示有出血风险；在NVAF患者中的出血事件临床结局中也证实，AHNAK2基因rs2582513的AA基因携带者服用利伐沙班后1个月的出血事件更高。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.检测样本中SNP标志物的试剂在制备抗血栓药物治疗血栓疗效预测的产品中的应用，其特征在于，所述SNP标志物包括AHNAK2基因的SNP位点rs2582513。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗血栓药物包括溶栓药、抗凝药、抗血小板药中的一种或多种，所述溶栓药包括尿激酶、阿替普酶、瑞替普酶或链激酶，所述抗凝药包括肝素、华法林、阿加曲班、磺达肝癸钠、利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班或达比加群酯，所述抗血小板药包括血栓素A2抑制剂、二磷酸腺苷P2Y12受体拮抗剂、凝血酶受体拮抗剂、5-羟色胺受体拮抗剂、血小板糖蛋白、磷酸二酯酶抑制剂中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血栓包括白色血栓、混合血栓、红色血栓、透明血栓中的一个或多个，所述白色血栓包括延续性血栓，所述混合血栓包括红细胞为主的血栓、球形血栓或层状血栓。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序、系统中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，当rs2582513的基因型为GG时，受试者服用抗血栓药物后药效较差；当rs2582513的基因型为GA时，受试者服用抗血栓药物后药效较好；当rs2582513的基因型为AA时，受试者服用抗血栓药物后药效较好但出血事件概率升高。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括通过直接测序、单碱基延伸、等位基因特异性探针杂交、等位基因特异性引物延伸、等位基因特异性扩增、等位基因特异性核苷酸掺入、5 '核酸酶消化、分子信标测定、寡核苷酸连接测定、大小分析和单链构象多态性方法检测rs2582513基因型的试剂。

7.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述样本为血液。

8.一种用于抗血栓药物治疗血栓疗效预测的产品，其特征在于，所述产品包括检测样本中SNP位点rs2582513基因型的试剂，所述SNP位点rs2582513为AHNAK2基因的SNP位点rs2582513，所述试剂包括针对rs2582513的核酸亲和配体，所述核酸亲和配体包括引物或探针。

9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，所述抗血栓药物包括溶栓药、抗凝药、抗血小板药中的一种或多种，所述溶栓药包括尿激酶、阿替普酶、瑞替普酶或链激酶，所述抗凝药包括肝素、华法林、阿加曲班、磺达肝癸钠、利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班或达比加群酯，所述抗血小板药包括血栓素A2抑制剂、二磷酸腺苷P2Y12受体拮抗剂、凝血酶受体拮抗剂、5-羟色胺受体拮抗剂、血小板糖蛋白、磷酸二酯酶抑制剂中的一种或多种，所述血栓包括白色血栓、混合血栓、红色血栓、透明血栓中的一个或多个，所述混合血栓包括红细胞为主的血栓、球形血栓或层状血栓，所述白色血栓包括延续性血栓。

10.根据权利要求8或9所述的产品，其特征在于，所述产品还包括记载了抗血栓药物治疗血栓疗效预测步骤的产品说明书，所述预测步骤包括：

1）来自样本的核酸与检测rs2582513基因型的试剂接触；

2）确定rs2582513的基因型；

3）基于所述基因型预测受试者使用抗血栓药物治疗血栓的疗效，所述rs2582513的基因型为GG时，受试者服用抗血栓药物后药效较差；当rs2582513的基因型为GA时，受试者服用抗血栓药物后药效较好；当rs2582513的基因型为AA时，受试者服用抗血栓药物后药效较好但出血事件概率升高。

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