KR101892582B1 - Eaa 유전자 인트론 7의 다형성을 이용한 돼지 혈액형 감별 방법 - Google Patents

Eaa 유전자 인트론 7의 다형성을 이용한 돼지 혈액형 감별 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지 EAA 유전자 인트론 7에 특이적인 프라이머 셋트, 이를 이용하는 돼지 AA, AO 및 OO 혈액형 감별 방법, 및 상기 프라이머 셋트를 포함하는 돼지 AA, AO 및 OO 혈액형 감별용 킷트를 제공한다.
본 발명은 돼지 EAA 유전자 인트론 7의 다형성을 이용하여, 인트론 7에 특이적인 한 쌍의 프라이머 셋트를 이용한 PCR에 의해 돼지 AA, AO 및 OO 혈액형을 한 번에 감별할 수 있으며, 노이즈 밴드도 발생하지 않아 간편성과 정확성을 높였다.

Description

EAA 유전자 인트론 7의 다형성을 이용한 돼지 혈액형 감별 방법{Porcine Blood Genotyping Method Using Polymorphism of EAA Intron 7}
본 발명은 EAA 유전자 인트론 7의 다형성을 이용한 돼지 혈액형 감별 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 EAA 유전자 인트론 7에 특이적인 돼지 혈액형 감별용 프라이머 셋트, 이를 이용한 돼지 AA, AO 및 OO 혈액형 감별 방법 및 상기 프라이머 셋트를 포함하는 돼지 AA, AO 및 OO 혈액형 감별용 킷트에 관한 것이다.
ABO 혈액형에 관련된 유전자는 인간을 비롯한 포유류에 잘 보존되어 있다. 인간들은 A, B 및 O을 포함하는 3종류의 주요 대립유전자를 가지고 있어 ABO 타입 혈액형을 가지고 있는 반면에, 돼지는 단지 A 및 O 대립유전자들을 가지고 있어 AO 타입 혈액형을 가지는 것으로 알려져 있다.
ABO 항원은 적혈구 세포의 표면상에 있는 글리코실트랜스퍼라제 (glycosyltransferase)에 의해 형성된 다당류인데, 인간에서 ABO 혈액형의 A [GalNAc alpha 1-3 (Fuc alpha 1-2) galactose] 및 B [Gal alpha 1-3 (Fuc alpha 1-2) galactose] 항원들은 ABO 혈액형 유전자의 각기 다른 대립 유전자형에 의해 코드되는 A 및 B 전이효소(transferase)에 의해 합성된다. 반면에, O 대립 유전자에 의해 암호화되는 전이효소는 비기능성이어서, 이의 수용체 기질(H antigen : Fuc alpha 1-2 galactose)은 추가 변형 없이 남아있다. 돼지 적혈구 항원 A 유전자 (EAA)는 인간의 ABO 유전자에 대한 상동체(orthologue)이다.
일반적으로 혈액형 감별은 수혈 및 이종 간의 장기 이식에서 매우 중요하다. 상이한 적혈구 항원들은 수혈에 의하여 다른 혈액형의 사람 또는 돼지에게 노출되었을 때 항체 형성을 유발하여 용혈성 수혈 부작용을 일으킬 수 있고, 또한 혈액형 감별에 의해 ABO 혈액형을 갖는 이종 개체들 간의 기관 이식에서 조직적합성에 의한 면역 거부 반응을 회피할 수 있다.
장기 이식에 대한 수요는 많은데 이식해줄 인간 공여자가 부족한 문제점을 보완하기 위해, 돼지의 장기를 인간에게 이식하는 이종간 이식이 관심을 끌고 있다. 돼지 EAA 유전자는 인간의 ABO 유전자에 대한 상동체이므로, O형 혈액형을 갖는 돼지의 장기를 인간에게 이식하는 경우, ABO 항원의 차이에 의해 유도되는 면역합병증을 극복하는데 도움을 줄 수 있다.
ABO 혈액형 유전자는 인간의 유전체 DNA에서 8개의 엑손을 가지며, 게놈 상에 20kb 이상에 걸쳐 전개되어 있으며, 많은 다른 종에서도 보존되어 있다. 특히, 격자 이동(frame shift) 또는 결실 등에 의한 엑손 8의 부분적인 단절은 인간 및 돼지에서 유전자의 기능상실 돌연변이를 유도할 수 있어, ABO 혈액형의 기능에서 엑손 8이 중요한 역할을 한다는 사실이 밝혀진 바 있다.
기존에 대한민국 등록특허 제10-2009-0055679호에서는 EAA 엑손 8의 다형성을 이용한 돼지의 AO 및 OO형 혈액형 감별 방법이 특허등록된 바 있다. 또한 Animal Genetics 42:325-328 (2011)에서는, A 및 O 대립 형질에 각각 EAA 엑손 8- 특이적 프라이머 및 EAA 인트론 7-특이적 프라이머의 프라이머 셋트를 사용하여, 각각 특이적 PCR 산물의 존재 여부에 따라 돼지 혈액형을 판단하는 방법이 보고되었다. 그러나 상기 방법들은 혈액형 특이적 밴드들의 사이즈 차이가 크지 않고 노이즈 밴드가 발생하는 등 만족스러운 결과를 얻지 못해, 더욱 간편하고 정확도 높은 돼지 혈액형 감별 방법이 요구되었다.
한편, 돼지에서 혈액형 A 및 O의 유전적 차이를 이해하는데 매우 중요한 EAA 인트론 7에 대한 전체 유전자 정보는, 최근 업데이트된 돼지 게놈 어셈블리 Sscrof11.1(The_Swine_Genome_Sequencing_Consortium, 2017)에도 명확히 기재되어 있지 않아, EAA 인트론 7의 서열 분석 및 특성 분석이 요구되었다.
대한민국 특허출원 제10-2009-0055679호 대한민국 특허출원 제10-2015-0143957호
Transplantation Proceedings, 42, 21462148 (2010.07) Animal Genetics 42:325-328 (2011)
본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위해, 돼지 EAA 유전자 인트론 7의 다형성을 이용한 돼지 AA, AO 및 OO 혈액형 감별 방법을 제공하고자 하였다. 특히, 본 발명자들은 EAA 인트론 7의 전체 서열을 분석한 결과 OO형 형질의 경우 인트론 7의 내부에 약 560bp의 결실이 발견된 점에 착안하여, 상기 결실 다형성 부위를 포함하는 구간이 증폭되도록 특이적인 프라이머 셋트를 선별한 후, 이를 이용하여 생성된 PCR 증폭 산물을 비교하여 돼지 AA, AO 및 OO 혈액형을 감별하고자 하였다.
본 발명은 서열번호 1의 순방향 프라이머(GCTTCTTGATGGATTGACAC) 및 서열번호 2의 역방향 프라이머 (GATCCAGAAGTTCCTTCAGC)로 이루어진 돼지 혈액형 감별용 프라이머 셋트를 제공한다.
본 발명은 또한 서열번호 1의 순방향 프라이머 및 서열번호 3의 역방향 프라이머 (GTAGACTGCAGACTTGGCTT)로 이루어진 돼지 혈액형 감별용 프라이머 셋트를 제공한다.
일 실시예에서, 상기 서열번호 1 내지 3의 프라이머들은 돼지 EAA 유전자의 인트론 7에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.
일 실시예에서, 상기 돼지 혈액형은 AA, AO 및 OO형일 수 있다.
본 발명은 또한 이하의 단계들을 포함하는 돼지 AA, AO 및 OO 혈액형 감별 방법을 제공한다:
(ⅰ) 돼지 시료로부터 유전체 DNA를 추출하는 단계;
(ⅱ) 상기 단계 (ⅰ)에서 수득한 돼지 유전체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 1의 순방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 셋트, 또는 서열번호 1의 순방향 프라이머 및 서열번호 3의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 셋트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)에서 수득한 PCR 산물을 분석하여 돼지 혈액형을 감별하는 단계.
일 실시예에서, 상기 단계 (ⅱ)에서 제1항의 프라이머 셋트를 사용하는 경우, AA형 혈액형은 1500~1700 bp의 단일 밴드를 갖는 PCR 산물이 수득되고; AO형 혈액형은 1500~1700 bp 및 800~900 bp의 2개의 밴드를 갖는 PCR 산물이 수득되고; OO형 혈액형은 800~900bp의 단일 밴드를 갖는 PCR 산물이 수득될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 단계 (ⅱ)에서 상기 제2항의 프라이머 셋트를 사용하는 경우, AA형 또는 AO형 혈액형은 1500~1600 bp의 단일 밴드를 갖는 PCR 산물이 수득되고; OO형 혈액형은 PCR 산물이 나타나지 않을 수 있다.
본 발명은 또한 1의 순방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 셋트, 또는 서열번호 1의 순방향 프라이머 및 서열번호 3의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 셋트를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 AA, AO 및 OO 혈액형 감별용 키트를 제공한다.
본 발명은 돼지 EAA 유전자 인트론 7의 다형성을 이용하여 간편하고 정확도 높은 돼지 AA, AO 및 OO 혈액형 감별방법을 제공할 수 있다. 본 발명의 EAA 유전자 인트론 7에 특이적인 프라이머 셋트를 이용하여 PCR을 수행하는 경우, A 및 O 대립 형질에 특이적인 PCR 산물을 수득할 수 있고 노이즈 밴드도 발생하지 않아 혈액형 감별의 정확성을 높일 수 있었다. 또한 본 발명의 한 쌍의 프라이머 셋트만으로 AA, AO 및 OO 혈액형을 한 번에 감별할 수 있어, 간편성도 구비하였다.
도 1은 결실 접합부 근처에서 EAA A와 EAA O 대립 형질 사이에 게놈 구조 및 반복 요소 분포를 비교한 모식도이다. 프라이머 결합 위치 및 중간영역(interval)의 크기(bp)는 각 대립 형질에 대한 다이아그램(diagram)의 상부 및 하부에 각각 나타나있다. O 대립 형질의 결실 접합부 근처에 있는 20개 뉴클레오티드에 대해서는, 콤마(동일한 뉴클레오티드들을 나타냄)를 포함하는 직사각형 내에 표시하였고, 중단점은 수직 화살표로 나타내었다. 인트론 7의 대립 형질 A 위쪽의 수평 화살표는 다양한 반복 요소(표 3)의 위치를 나타낸다. 회색 박스 내의 NNNN은 560 bp로 추정되는 서열 분석 실패 위치를 나타내었다. A과 O 대립 형질의 뉴클레오티드 보존률은 하부에 나타내었다. 100%, 50% 및 0%의 보존 수준은 각각 완전 일치, 불일치 및 갭(gap)을 나타낸다. 갭의 위치는 갭 분획(gap fraction)으로 나타내었다.
도 2a 내지 2g는 EAA 유전자의 엑손 7과 엑손 8 사이의 중간 영역에 대해 EAA A 대립형질과 O 대립형질의 뉴클레오티드 서열을 정렬한 결과로, CLC 메인 워크벤치 프로그램(main workbench program)을 사용하여 작성되었다. EAA A 대립형질의 뉴클레오티드 서열 중 2216~2845 bp에 걸쳐서 서열분석 실패 부위를 확인할 수 있으며, 3260~3660 bp의 사이에 프라이머 F2, R3 및 R1의 결합 부위를 관찰할 수 있었다.
도 3은 프라이머 F2 및 R3를 사용하여 A 및 O 대립 형질을 PCR 증폭한 결과이다. AO 혈액형의 경우 1584 및 853 bp 크기의 2개의 밴드가 관찰되며, OO 혈액형의 경우 853bp의 단일 밴드만이 관찰되었다. M은 PCR 산물의 크기를 추정하기 위한 사이즈 마커이며, n/c는 음성 대조군이다.
도 4는 프라이머 F2 및 R1을 사용하여 A 및 O 대립 형질을 PCR 증폭한 결과이다. AO 혈액형에서는 A 대립형질 특이적인 1558bp의 단일 밴드를 관찰할 수 있었고, 레인 1에는 비교예로 상기 프라이머 F2 및 R3를 사용했을 때의 OO 혈액형의 경우로써, 853bp의 단일 밴드를 관찰할 수 있었다. M은 PCR 산물의 크기를 추정하기 위한 사이즈 마커이다.
도 5는 비교예의 방법에 의한 결과로, 상단은 엑손 8에 특이적인 F8 및 R8 프라이머의 프라이머 셋트를 사용한 결과이고, 하단은 인트론 7 특이적인 Fg 및 Rg 프라이머의 프라이머 셋트를 사용한 결과이다.
도 6은 비교예의 방법에 의해 OO 혈액형에서 노이즈 밴드가 발생한 경우를 나타내는 사진이다.
본 발명은 서열번호 1의 순방향 프라이머 (GCTTCTTGATGGATTGACAC) 및 서열번호 2의 역방향 프라이머 (GATCCAGAAGTTCCTTCAGC)로 이루어진 돼지 혈액형 감별용 프라이머 셋트를 제공한다.
본 발명은 또한 서열번호 1의 순방향 프라이머 및 서열번호 3의 역방향 프라이머 (GTAGACTGCAGACTTGGCTT)로 이루어진 돼지 혈액형 감별용 프라이머 셋트를 제공한다.
일 실시예에서, 상기 서열번호 1 내지 3의 프라이머들은 돼지 EAA 유전자의 인트론 7에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.
상기 서열번호 1 내지 3의 프라이머는 EAA 인트론 7의 내부 서열 중에서 결실 다형성 부위를 포함하는 PCR 산물이 수득될 수 있도록 선별된 것이다.
일 실시예에서, 상기 돼지 혈액형은 AA, AO 및 OO형일 수 있다.
AO 및 OO형 혈액형 감별은 상기 설명한 바와 같이, 수혈, 이종간 장기 이식 등의 면에서 매우 중요하며, 일부 개량종 돼지의 경우 AA형 동형 접합자 개체에서 열성 치사 현상이 나타나기도 하나, 야생종 돼지의 경우 그렇지 않으므로 돼지 육종, 질병 관리 등을 위해서 AA형 감별도 중요하다.
본 발명은 또한 (ⅰ) 돼지 시료로부터 유전체 DNA를 추출하는 단계; (ⅱ) 상기 단계 (ⅰ)에서 수득한 돼지 유전체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 1의 순방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 셋트, 또는 서열번호 1의 순방향 프라이머 및 서열번호 3의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 셋트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)에서 수득한 PCR 산물을 분석하여 돼지 혈액형을 감별하는 단계를 포함하는 돼지 AA, AO 및 OO 혈액형 감별 방법을 제공한다.
즉, 본 발명은 돼지 적혈구 A 항원 유전자(EAA)의 인트론 7의 다형성을 이용한 혈액형 감별 방법으로, 기존의 EAA 엑손 8의 다형성을 이용한 방법보다 간편하고 정확도가 높다.
일 실시예에서, 상기 단계 (ⅱ)에서 서열번호 1의 순방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 셋트를 사용하는 경우, AA형 혈액형은 1500~1700 bp, 바람직하게는 1584bp의 단일 밴드를 갖는 PCR 산물이 수득되는 것으로 감별하고; AO형 혈액형은 1500~1700 bp, 바람직하게는 1584bp의 밴드와, 800~900 bp, 바람직하게는 853bp의 밴드를 모두 갖는 PCR 산물이 수득되는 것으로 감별하고; OO형 혈액형은 800~900bp, 바람직하게는 853bp의 단일 밴드를 갖는 PCR 산물이 수득되는 것으로 감별할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 단계 (ⅱ)에서 상기 서열번호 1의 순방향 프라이머 및 서열번호 3의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 셋트를 사용하는 경우, A형 대립형질에 특이적인 1500~1600 bp, 바람직하게는 1558bp의 단일 PCR 산물이 수득될 수 있다. 따라서, AA 및 AO형 혈액형은 1500~1600 bp, 바람직하게는 1558bp의 단일 PCR 산물이 수득되며; OO형 혈액형은 PCR 산물이 수득되지 않는다.
다만, AA형의 경우 AO형보다 특이적 PCR 산물의 양이 많으므로 더욱 뚜렷한 밴드를 얻을 수 있을 것이며, 상기 F2 및 R3의 프라이머 셋트를 사용한 결과와 F2 및 R1의 프라이머 셋트를 사용한 결과를 서로 비교하게 되면, 돼지 혈액형 감별의 정확성을 더욱 높일 수 있을 것이다.
기존의 돼지 혈액형 감별 방법으로는, EAA O 대립 형질에서 엑손 8이 결실된 점에 착안하여, 엑손 8을 주형으로 PCR을 수행한 후, A 대립 형질에 특이적인 PCR 산물의 유무로 돼지 혈액형을 감별하는 방법이 특허 등록된 바 있었다. 또한, A 및 O 대립 형질에 각각 EAA 엑손 8 특이적 프라이머 셋트 및 EAA 인트론 7 특이적 프라이머 셋트를 사용하여, 각각 특이적 PCR 산물의 존재 여부에 따라 돼지 혈액형을 판단하는 방법도 보고되었다. 그러나, 상기 방법들은 PCR 산물들의 사이즈 차이가 크지 않거나 또는 원치않는 노이즈 밴드가 나타나는 등의 단점이 있었다.
이에 비해 본 발명은 한 쌍의 프라이머 셋트만을 사용하여 AA, AO 및 OO 혈액형에 대해 특이적 PCR 산물들이 확실히 구별할 수 있으며, 노이즈 밴드도 없으므로, 간편하고 정확성이 높은 장점이 있다.
본 발명은 또한 서열번호 1의 순방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 셋트, 또는 서열번호 1의 순방향 프라이머 및 서열번호 3의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 셋트를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 AA, AO 및 OO 혈액형 감별용 키트를 제공한다. 상기 키트는 서열번호 1 내지 3의 프라이머 외에도, PCR 증폭을 위한 Taq DNA 중합효소, dNTP, PCR 버퍼, DMSO 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 서열번호 1의 순방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 셋트를 사용하는 경우, 한 쌍의 프라이머 셋트로 간편하게 AA, AO 및 OO형 혈액형을 명확히 구별할 수 있으며, 서열번호 1의 순방향 프라이머 및 서열번호 3의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 셋트에 의해 얻은 결과와 서로 비교하는 경우, 돼지 혈액형 감별의 정확도를 더욱 높일 수 있을 것이다.
이하에서, 바람직한 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 이하의 실시예 및 비교예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 권리범위를 한정하기 위한 것이 아니다.
<실시예>
본 발명에서는 돼지 EAA 인트론 7의 구체적인 정보를 얻기 위하여, 우선 전체적인 서열 분석을 하고, 이로부터 다형성을 탐지할 수 있는 적절한 프라이머 서열들을 선별하였다. 그 후, 상기 프라이머들을 이용하여 PCR을 수행함으로서 돼지 AA, AO 및 OO 혈액형을 감별하고자 하였다. 또한, 인트론 7을 더욱 특성화하기 위해 상기 프라이머 셋트를 사용하여 반복 서열 분석을 실시하였다. 이하에서 구체적으로 설명한다.
<재료 및 방법>
실험 동물 및 DNA 준비
각각 4마리의 한국 토종 돼지(KNP), SNU 미니 돼지(miniature), 두록 (Duroc), 요크셔(Yorkshire) 및 버크셔(Berkshire) 돼지, 및 3마리의 NIH 미니 돼지 및 한 마리의 멧돼지를 포함하는 31마리의 동물로부터, 말초 혈액 또는 귀 조직을 모아 EAA 인트론 7의 분석에 사용하였다.
총 1㎖의 말초 혈액 또는 0.5g의 조직을 0.5% SDS 및 10㎕의 20mg/㎖ 프로테이나제 K (Promega사)를 포함하는 용해 완충 용액(lysis buffer solution)(10 mM의 Tris-HCl(pH 8.0), 0.1 M의 EDTA)에 첨가하여, 55℃에서 6시간 동안 배양하고, 표준 실험 방법에 따라서 DNA를 분리하였다. 모든 실험은 건국대학교 실험동물운영회(IACUC)의 IACUC 승인 번호 KU13101에 따라 실시하였다.
EAA 인트론 7 및 엑손 8의 다형성 분석
EAA 인트론 7의 원거리(long range) PCR은 50ng 게놈 DNA, 1 μM의 각 프라이머(EAA-e7F1 및 EAA-7-end-R)(표 1), 1.6 mM dNTPs, 1×PCR 버퍼 (2.5 mM MgCl2 함유), 0.5㎕의 DMSO(시그마-알드리치사) 및 2.5 U의 LA Taq DNA 중합효소(TaKaRa)를 포함하는 50㎕ 반응 용액을 T3000 유전자증폭장치(Thermocycler, Biometra사 제)를 사용하여 증폭시킴으로써 실시하였다. 증폭 조건은 94℃에서 5분간의 초기 변성한 후, 98℃에서 10초간의 변성, 53℃에서 20초간 어닐링 및 68℃에서 10분간 신장 조건을 35 사이클 반복하고, 68℃에서 15분간 최종 신장하는 것으로 구성된다.
Figure 112017095151496-pat00001
PCR 산물은 1×TAE 버퍼 중에서 1% 아가로스 겔 상에 전기영동하여 확인하였다. 겔은 EtBr(ethidium bromide)로 염색하여, UV 광 하에 시각화하였다.
대립 형질 특이적 다형성을 분석하기 위해, 앰플리콘(amplicon)은 pGEM-T 이지 벡터(Promega)에 클로닝되었다. 라이게이션 산물은 MicroPulserTM (Bio-Rad)를 사용하여, DH10B 세포(Invitrogen)로 일렉트로포레이션(electroporation)되었다. 플라스미드는 3㎖ 배양액에서, ExprepTM 플라스미드 SV 키트 (GeneAll)를 제조자의 실험 방법에 따라 사용하여 분리되었다. 서열 분석 반응은 ABI PRISM BigDye™ Terminator Cycle 서열 분석 키트(Applied Biosystems)와 서열 분석용 프라이머(표 2)를 사용하여 실시하였다. 그 산물은 자동 DNA 분석기(ABI 3730XL, Applied Biosystems) 상에서 분석하였다. 직접 서열 분석을 위하여, 5㎕의 각 산물은 1.5×반응 버퍼 중에서 4 U의 엑소뉴클레아제 Ⅰ(Fermentas) 및 0.8 U의 새우 알칼라인 포스파타제 (USB Corporation)과 함께 37℃에서 30분 동안 배양하여, 프라이머를 분해시키고, 반응에 소모되지 않은 dNTP를 탈인산화하였다. 반응은 80℃에서 15분 배양함으로서 중단된다. 서열 분석 결과는 수동으로 조사되었고, 성공적인 결과들은 CLC 메인 워크벤치(버전 7.3, Qiagen)를 사용하여 함께 정렬하였다. 각 반응을 위해 3개 이상의 콜로니를 분석하였다.
Figure 112017095151496-pat00002
EAA 유전자 형질 분석
EAA를 위한 유전자 형질 분석용 프라이머인 EAA F2 (서열번호 1) 및 EAA R3 (서열번호 2)는, EAA A와 O 대립 형질 간의 서열 변이를 나타내는 위치에 대하여 CLC 주요 워크벤치(버전 7.3, Qiagen)를 사용하여 고안되었다. 유전형 분석 PCR은 Thermocycler 3000 (Biometra)를 사용하여, 50ng의 게놈 DNA, 0.5 μM의 각 프라이머, 200μM dNTPs, PCR 버퍼 [10mM Tris(pH 8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2], 및 0.5 U의 Supertherm™ DNA 중합 효소(JMR Holdings)를 포함하는 20㎕ 반응으로 실시하였다. PCR 조건은 95℃에서 3분 동안 초기 변성 단계를 거친 후, 94℃에서 1분 동안 변성, 62℃에서 1분 동안 어닐링, 및 72℃에서 1분 동안 신장을 35 사이클 반복하고, 72℃에서 10분 동안 최종 배양하는 것으로 종결된다. PCR 산물은 1×TAE 버퍼 중의 1.5% 아가로스 겔에 25분 동안 100V에서 전기영동하여 확인하였다. 겔은 EtBr로 염색하여, UV광 하에 시각화하였다.
반복 요소의 서열 정렬 및 분석
서열 분석 결과는 수동으로 조사하였고, 성공적인 결과들은 CLC 메인 워크벤치(버전 7.3, Qiagen)를 사용하여 함께 정렬하였다. 반복 요소는 RepeatMasker 웹 서버(RepeatMasker)에 의해 식별되었다. EAA 인트론 7(MF115718)의 A 대립 형질 서열은 돼지에 대한 DNA 근원 선별을 위해, 반복 요소의 Repbase7 유래 RepeatMasker 라이브러리(RMLib: 20160829)에 대해 디폴트 감도로 BLAST 탐색을 수행하였다.
<결과 및 논의>
EAA 인트론 7의 서열 결정
돼지의 A0 혈액형 시스템에서 0 대립 형질은, EAA 인트론 7의 3' 측으로부터 개시하는 엑손 8의 완전 결실로 비기능성이 된다 (도 1). 그러나, EAA 인트론 7의 전체 서열 정보 및 구조는 공개된 데이터베이스 상에서는 입수할 수 없었고, 단지 결실 접합부 주위의 부분적인 뉴클레오티드 서열만이 보고되어 있는 상태였다. 따라서, 결실부를 포함하는 인트론 7을 완전히 특성화하기 위하여, 본 발명자는 다양한 전략을 사용하여 전체 EAA 인트론 7의 서열 정보를 분석하고, 최종적으로 EAA_e7 F1 및 EAA-7-end-R 프라이머와 돼지 게놈 DNA를 사용하는 원거리 PCR을 실시하여, EAA 엑손 7과 8 사이의 7 kb 이하의 PCR 증폭 산물을 얻었다. 그 후, 앰플리콘은 20개 프라이머(표 3)를 사용하여 순방향 및 역방향으로 서열을 결정하였다. 그 후, 결과들을 모아 2140 내지 2700 bp 위치에 약 560 bp의 갭을 포함하는 EAA 인트론 7(수탁 번호 MF115718)에 상응하는 6054 bp 서열(도 2a 내지 2g)을 생성하였고, 서열 분석 반응은 티미딘 잔기의 전개에 의해 단절되었다(도 1). 그러나, 다양한 서열 분석 조건을 사용하여 반복 시도를 한 후에도, 상기 갭의 서열 정보는 결정할 수 없었다.
EAA 유전자 형질 분석 방법의 개선
본 발명자는 인트론 7의 A 및 O 대립 형질-특이적 서열들에 의한 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 셋트, 및 서열번호 1과 서열번호 3의 프라이머 셋트를 사용하여 EAA에 대한 새로운 유전자 형질 분석 방법을 고안하였다.
서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 셋트를 사용한 경우, A 및 O 대립 형질로부터 각각 1584 및 853 bp 크기의 PCR 산물이 생성되어, AA 및 OO 동형 접합체로부터 각각 1584 및 853 bp의 PCR 증폭 산물이 관찰되었다. AO 이형접합체에서는 상기 2개의 PCR 증폭 산물이 모두 관찰되었다(도 3).
또한 서열번호 1과 서열번호 3의 프라이머 셋트를 사용한 경우, A 대립 형질로부터 1558 bp 크기의 PCR 산물이 생성되어, AO 대립형질의 경우 약 1558 bp의 PCR 증폭 산물은 탐지되었고(도 4), 비록 도시되지는 않았지만, AA 동형 접합자의 경우에도 약 1558 bp의 PCR 증폭 산물은 탐지되었다. 그러나, OO 대립형질의 경우 PCR 증폭 산물은 탐지되지 않았다.
본 발명의 방법은 상기에서 기술한 기존의 방법들에서 나타나는 PCR 산물들의 사이즈 차이가 크지 않거나 또는 원치않는 노이즈 밴드가 나타나는 등의 단점을 극복할 수 있고, 특히 AO 이형접합체에 대한 혈액형 분석의 정확성 및 간편성을 개선시킬 수 있다.
EAA 인트론 7 중의 반복 서열 LINE1의 풍부함
본 발명자는 EAA A 대립 형질의 인트론 7을, EAA O 대립 형질 (수탁 번호 MF362993)의 분석으로부터 이미 결정되어 있는 4.85 kb 서열의 나머지 인트론 7과 비교하였다 (도 1 및 표 3).
Figure 112017095151496-pat00003
몇몇 대립 형질 특이적 다형성을 제외하고는, O 대립 형질의 결실 부위에 앞서 2개의 서열들 간에 거의 완전 일치가 관찰되었다. EAA 인트론 7의 결실의 발생을 뒷받침하기 위한 메커니즘을 이해하기 위하여, 본 발명자는 그 위치 상에서 반복 요소의 분석을 실시하였다. 반복 요소가 많은 것은 염색체 재배열의 증가에 영향을 미칠 수 있다고 보고되었다.
흥미롭게도, 43.7%의 EAA 인트론 7이 LINE1 요소와 일치하는 것으로 나타났고 (표 4), 이는 돼지에서 LINE1의 평균 빈도 (16.59%)보다 상당히 높은 값이다. 인트론 7 내의 반복 요소의 위치는 도 1에서 수평 화살표로 나타내었다. 인트론 7 내에서 반복 서열의 비율이 높아지게 되면, 염색체 응축 등의 이유로 상기 인트론 7의 부분적인 서열 분석 실패에도 간접적으로 영향을 주는 것으로 사료된다.
Figure 112017095151496-pat00004
이하에서 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 비교예를 들어 설명한다.
<비교예>
EAA 엑손 8 및 인트론 7 특이적인 2쌍의 프라이머 셋트를 이용한 돼지 혈액형 감별
돼지의 혈액형 혈액형 대립 유전자는 A 및 O만 존재하는데, A 대립 형질과와는 달리 O 대립 형질은 엑손 8에 결실이 나타난다. 따라서, 비교예에서는 엑손 8의 다형성을 이용한 PCR 증폭으로 A 및 O형 혈액형을 감별하고자 하였다.
A형 감별에 사용된 프라이머 셋트는 돼지 EAA 유전자의 엑손 8에 특이적인 프라이머 F8(CGCCAGTCCTTCACCTACGAAC) 및 R8 (CGGTTCCGAATCTCTGCGTG)로 이루어지며, 340bp의 PCR 산물을 얻었다(도 5 상단). O형의 경우, EAA 유전자의 인트론 7에 특이적인 프라이머 Fg (AATGTCCTTATGCTGGCCTGG) 및 Rg (AACAACACACTCCTGAACAACAGA)의 프라이머 셋트를 사용하여, 1076bp의 PCR 산물을 얻었다(도 5 하단). 따라서, 도 5에서 AO형은 4-12, 4-13, 4-3 및 4-8이고, OO형은 4-62a, L1, 4b-49, 4-33a인 것을 알 수 있었다.
노이즈 밴드의 발생
도 6에서 나타나는 바와 같이, 일부 OO형 샘플(4-14, 4b-34, 4b-50)의 경우 A 대립형질에 특이적인 F8 및 R8 프라이머를 사용한 경우에 300bp 부근의 노이즈 밴드가 나타났으며, 그 원인은 파악되지 않았다.
비교예의 방법은 각각 상이한 영역인 엑손 8과 인트론 7을 증폭하므로, 프라이머 결합 부위에 대한 프라이머의 친화도(primer affinity) 차이에 따라 PCR 증폭 결과에 영향이 있을 수 있으나, 상기 실시예의 방법은 인트론 7의 동일 영역을 증폭하므로 상기와 같은 영향이 없어 정확도를 높일 수 있는 것으로 사료된다.
따라서, 본 발명의 실시예에서 사용된 방법은 비교예의 방법에 비해 한 쌍의 프라이머 셋트로도 돼지 혈액형 감별이 가능하여 간편하며, 노이즈 밴드가 없이 정확도가 높은 장점이 있는 것으로 나타났다.
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Claims (8)

  1. 서열번호 1의 순방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 돼지 혈액형 감별용 프라이머 셋트.
  2. 서열번호 1의 순방향 프라이머 및 서열번호 3의 역방향 프라이머로 이루어진 돼지 혈액형 감별용 프라이머 셋트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 서열번호 1 내지 3의 프라이머들은 돼지 EAA 유전자의 인트론 7에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 프라이머 셋트.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 돼지 혈액형은 AA, AO 및 OO형인 것을 특징으로 하는 프라이머 셋트.
  5. 이하의 단계들을 포함하는 돼지 AA, AO 및 OO 혈액형 감별 방법:
    (ⅰ) 돼지 시료로부터 유전체 DNA를 추출하는 단계;
    (ⅱ) 상기 단계 (ⅰ)에서 수득한 돼지 유전체 DNA를 주형으로 하여 제1항 또는 제2항의 프라이머 셋트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)에서 수득한 PCR 산물을 분석하여 돼지 혈액형을 감별하는 단계.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 단계 (ⅱ)에서 제1항의 프라이머 셋트를 사용하는 경우,
    AA 혈액형은 1500~1700 bp의 단일 밴드를 갖는 PCR 산물이 수득되고, AO 혈액형은 1500~1700 bp 및 800~900 bp의 2개의 밴드를 갖는 PCR 산물이 수득되며, OO 혈액형의 경우 800~900bp의 단일 밴드를 갖는 PCR 산물이 수득되는 것을 특징으로 하는 돼지 혈액형 감별 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 단계 (ⅱ)에서 제2항의 프라이머 셋트를 사용하는 경우,
    AA 또는 AO 혈액형은 1500~1600 bp의 단일 밴드를 갖는 PCR 산물이 수득되고, OO 혈액형은 PCR 산물이 나타나지 않는 것을 특징으로 하는 돼지 혈액형 감별 방법.
  8. 제1항의 프라이머 셋트 또는 제2항의 프라이머 셋트를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 AA, AO 및 OO 혈액형 감별용 키트.
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