KR20170044364A - 돼지의 eaa 유전자형 분석을 통한 산자수 조절 방법 - Google Patents
돼지의 eaa 유전자형 분석을 통한 산자수 조절 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, (a) 돼지의 혈액형을 판별하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 판별된 혈액형을 이용하여 이종 접합성 혈액형을 가지는 돼지와 동종 접합성 혈액형을 가지는 돼지를 교배하는 단계를 포함하는 돼지의 산자수 조절 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 돼지의 산자수 조절 방법에 따르면, 돼지의 혈액형을 분석하고, AO 타입 혈액형 및 OO 타입 혈액형을 가지는 돼지를 교배하여, AA 타입의 동종 접합성 배아의 형성을 억제함으로써, 임신 30일 경과한 이후 시점에서부터 발생하는 열성 치사 효과(recessive lethal effect)로 인한 태아의 사멸을 방지하여 돼지의 산자수를 획기적으로 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따른 돼지의 산자수 조절 방법에 따르면, 돼지의 혈액형을 분석하고, AO 타입 혈액형 및 OO 타입 혈액형을 가지는 돼지를 교배하여, AA 타입의 동종 접합성 배아의 형성을 억제함으로써, 임신 30일 경과한 이후 시점에서부터 발생하는 열성 치사 효과(recessive lethal effect)로 인한 태아의 사멸을 방지하여 돼지의 산자수를 획기적으로 증가시킬 수 있다.
Description
본 발명은 돼지의 EAA 유전자형을 분석하고, 적합한 혈액형을 가지는 돼지를 교배하여 돼지의 산자수를 조절하는 방법에 관한 것이다.
인간의 ABO 혈액형에 관련한 유전자는 포유류 종에 잘 보존되어 있다. 그러나, 이와 같은 유전자의 생물학적 중요성은 명확히 밝혀진 바 없다.
일반적으로, 적혈구 혈액형 항원과 이에 대하여 생성되는 항체는 수혈의학에 있어 가장 주된 관심사 가운데 하나이다. 이는 적혈구 혈액형 항원들이 수혈에 의하여 다른 개체(사람 또는 돼지)에게 노출되었을 때 항체 형성을 유발하여 용혈성 수혈부작용을 일으킬 수 있으므로 적혈구 항원과 이에 대한 항체의 존재유무는 수혈의 성공여부를 좌우하는 중요한 요인이 되기 때문이다.
수혈은 공여자의 혈액세포 또는 혈장성분을 환자에게 주입하는 치료행위로서혈액 안에 존재하는 수많은 동종항원(Alloantigen)들을 환자의 면역시스템에 노출시키는 일종의 장기이식(Organ transplantation)이라 할 수 있다.
ABO 혈액형은 적혈구 세포를 포함하는 세포 표면에 당전이효소에 의해 형성되는 올리고당(oligosaccharide)들로 인해 특이적 동종항체에 의해 판별될 수 있고, 수혈의학이나 이식의학에서 조직적합성을 평가할 수 있는 지표이다.
인간 아혈액형 ABO 유전자(histo-blood group ABO gene)의 오솔로그(ortholog)는 개, 고양이, 토끼, 가축 돼지, 양, 레트, 햄스터, 마모셋 등과 영장류를 포함하는 다양한 포유류에서 보고된 바 있다.
적혈구 항원 A(EAA)는 돼지에서 발견된 오솔로그이며, 유전자의 생성은 항원 결정기의 유무에 의존하는 인간-혈액형 A 항체와의 교차반응성의 유무에 의해 판별될 수 있다.
돼지의 조직을 사람에게 이식하는 이종간 이식은 기관 이식물(transplant)에 대한 인간 공여자의 부족으로 인하여 매우 큰 관심을 가지고 있다. 따라서 감염질환 및 혈액형의 프로화일에 대한 명확한 이해는 환자로 하여금 인간 혈액 공급과 관련된 많은 문제들을 회피하는데 도움을 줄 수 있다.
인간들은 A, B 및 O을 포함하는 3 종류의 주요 대립유전자를 가지고 있어 ABO 타입 혈액형을 가지고 있는 반면에, 돼지는 단지 A 및 O 대립유전자들을 가지고 있어 AO 타입 혈액형을 가지는 것으로 알려져 있다.
돼지의 적혈구 항원 A(EAA) 유전자는 돼지에서 인간의 ABO 유전자와, 둘 이상의 유전자가 같은 유전자에서 갈라져 나와 동일성을 갖는 오솔로그(ortholog)이다. 돼지에서 인간으로의 이종이식(xenotransplantation)에서 혈액형 O를 가지는 돼지를 사용하면 ABO 항원의 차이에 의해 유도되는 면역합병증(immune complications)을 극복하는데 도움을 줄 수 있다.
ABO 항원들은 주된 유전자 산물이 아니라 당전이효소(glycosyltransferase)라는 효소들의 효소학적 반응 산물들로서, ABO 혈액형은 뮤신 당단백질들의 글리칸 단위로 분비되어 존재하거나 적혈구 또는 다른 세포들의 표면에서 발현된 당단백질 및 당지질의 복합 탄수화물 구조들의 다형성(polymorphism)의 결과로서 나타난다.
인간에서 ABO 혈액형의 A[GalNAc alpha 1-3 (Fuc alpha 1-2) galactose] 및 B [Gal alpha 1-3 (Fuc alpha 1-2) galactose] 항원들은 ABO 혈액형 유전자의 각기 다른 대립 유전자형에 의해 코드되는 A 및 B 전이효소(transferase)에 의해 합성된다. 반면에, O 대립 유전자에 의해 코드되는 전이효소는 비기능성이며, 추가적인 변형이 없이 수용체 기질(H antigen : Fuc alpha 1-2 galactose)로서 잔류한다.
ABO 혈액형 유전자는 인간의 유전체 DNA에서 8개의 엑손과 20kb 이상의 스팬(span)으로 구성된다. 유전자는 각기 다른 종 사이에 잘 보존되어 있으며, 프레임시프트(frame shift) 또는 결실 등에 의한 엑손 8의 지점의 파괴는 인간 및 돼지에서 유전자의 기능상실 돌연변이를 유도할 수 있으며, 이를 통해 ABO 혈액형의 기능에서 엑손 8이 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.
다양한 연구에서 인간에서 A,B, O 대립유전자 및 유전자형 빈도의 차이점에 관해 나타내었으며, 다른 유전자 분포를 가지는 개체사이에서 질병의 위험에 연관성을 분석하기 위한 다양한 시도가 있었다.
그러나, 다른 종의 대립유전자 분포(allelic distribution)는 연구된 바 없으며, 특정 개체군에서 O 대립 유전자가 꽤 높은 빈도로 나타나지만, 종래에는 이와 같은 당전이효소의 비대립유전자를 운반하는 개체의 표현형적인 비정상(phenotypic abnomality)에 관해 보고된 바 없다. 따라서, 혈액형에 관여하는 유전자 기능의 생물학적 유사성에 관한 연구는 취약한 상태이다.
본 발명은 상기한 바와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 돼지 EAA 유전자의 대립 유전자 분포(allelic distribution)와 유전적 다양성을 분석하여 종돈 산업에 유용하게 활용할 수 있는 돼지의 산자수 조절 방법에 관한 기술 내용을 제공하고자 하는 것이다.
상기한 바와 같은 기술적 과제를 달성하기 위해서 본 발명은, (a) 돼지의 혈액형을 판별하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 판별된 혈액형을 이용하여 이종 접합성 혈액형을 가지는 돼지와 동종 접합성 혈액형을 가지는 돼지를 교배하는 단계를 포함하는 돼지의 산자수 조절 방법을 제공한다.
또한, 상기 단계 (a)는, (i) 돼지의 조직으로부터 유전체 DNA를 추출하는 단계; 및 (ii) 상기 단계 (i)에서 추출한 유전체 DNA 중에서 엑손 8을 주형으로 사용하고, 프라이머(primer)를 사용하여 상기 엑손 8을 증폭하는 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행해 상기 엑손 8의 증폭 생성 유무를 확인하는 단계;를 포함하는 방법을 통해 수행되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 엑손 8의 서열은 서열번호 1인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 프라이머는 Fa(5'-CGCCAGTCCTTCACCTACGAAC-3') 및 Ra(5'-CGGTTCCGAATCTCTGCGTG-3')쌍이고; Fo(5'-AATGTCCTTATGCTGGCCTGG-3') 및 Ro(5'-AACAACACACTCCTGAACAACAGA-3') 쌍이며; SFa(5'-CTGTCTCAGGCTTACATTCC-3') 및 Ra(5'-CGGTTCCGAATCTCTGCGTG-3') 쌍이고; SFo(5'-GTAGCTGTAGCCACTGGCCT-3') 및 Ro(5'-AACAACACACTCCTGAACAACAGA-3') 쌍이며; F8(5'-ATACGTGGTCTTCCTGAAGC-3') 및 R8(5'-TCATCGGTTCCGAATCTCTG-3')쌍인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 돼지는 랜드래이스(Landrace), 요크셔(Yorkshire), 듀록(Duroc), 버크셔(Berkshire), 한국 토종 돼지(Korean native pig, KNP), 란위(Lanyu), 메이산(Meishan), 오사보(Ossabaw), SNU 미니어처(SNU miniature pig) 및 NIH 미니어처(NIH miniature pig)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 품종에서 유래한 돼지인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 이종 접합성 혈액형은 AO 타입 혈액형이고, 상기 동종 접합성 혈액형은 OO 타입 혈액형인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 돼지의 산자수 조절 방법에 따르면, 돼지의 혈액형을 분석하고, AO 타입 혈액형 및 OO 타입 혈액형을 가지는 돼지를 교배하여, AA 타입의 동종 접합성 배아의 형성을 억제함으로써, 임신 30일 경과한 이후 시점에서부터 발생하는 열성 치사 효과(recessive lethal effect)로 인한 태아의 사멸을 방지하여 돼지의 산자수를 획기적으로 증가시킬 수 있다.
도 1은 복합 대립 유전자 특이적 PCR을 사용하여 AO 혈액형 유전자의 유전형질 분석 결과를 나타내는 이미지이다.
도 2는 AO 이형 접합체를 교배하여 AA(*로 표시), AO, OO 혈액형 유전자를 가지는 임신 30일 경과한 시점의 태아를 촬영한 실제 이미지이다.
도 3은 ESR1 유전자의 PCR-RFLP 결과를 나타내는 이미지이다.
도 2는 AO 이형 접합체를 교배하여 AA(*로 표시), AO, OO 혈액형 유전자를 가지는 임신 30일 경과한 시점의 태아를 촬영한 실제 이미지이다.
도 3은 ESR1 유전자의 PCR-RFLP 결과를 나타내는 이미지이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하도록 한다.
본 발명은, (a) 돼지의 혈액형을 판별하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 판별된 혈액형을 이용하여 이종 접합성 혈액형을 가지는 돼지와 동종 접합성 혈액형을 가지는 돼지를 교배하는 단계를 포함하는 돼지의 산자수 조절 방법을 제공한다.
상기 단계 (a)는 공지된 다양한 돼지의 혈액형 조사 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 돼지의 엑손 8(exon 8) 유전자를 PCR 방법을 이용해 증폭(amplification)시켜, 당전이효소의 발현유무를 판별하는 방법으로 돼지의 혈액형을 판별하도록 구성할 수 있다.
보다 상세히 설명하면, 상기 단계 (a)는, (i) 돼지의 조직으로부터 유전체 DNA를 추출하는 단계; 및 (ii) 상기 단계 (i)에서 추출한 유전체 DNA 중에서 엑손 8을 주형으로 사용하고, 프라이머(primer)를 사용하여 상기 엑손 8을 증폭하는 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행해 상기 엑손 8의 증폭 생성 유무를 확인하는 단계;를 포함하는 방법을 통해 돼지의 혈액형을 판별하도록 구성할 수 있다.
또한, 상기 엑손 8의 서열은 하기 서열번호 1로 표시할 수 있다.
[서열번호 1]
또한, 상기 프라이머는 Fa(5'-CGCCAGTCCTTCACCTACGAAC-3') 및 Ra(5'-CGGTTCCGAATCTCTGCGTG-3')쌍이고; Fo(5'-AATGTCCTTATGCTGGCCTGG-3') 및 Ro(5'-AACAACACACTCCTGAACAACAGA-3')쌍이며; SFa(5'-CTGTCTCAGGCTTACATTCC-3') 및 Ra(5'-CGGTTCCGAATCTCTGCGTG-3')쌍이고; SFo(5'-GTAGCTGTAGCCACTGGCCT-3') 및 Ro(5'-AACAACACACTCCTGAACAACAGA-3')쌍이며; F8(5'-ATACGTGGTCTTCCTGAAGC-3') 및 R8(5'-TCATCGGTTCCGAATCTCTG-3')쌍을 사용하여 상기 돼지의 엑손 8 유전자를 PCR 증폭시켜, 당전이효소의 발현 유무를 확인하여 돼지의 혈액형을 판별하도록 구성할 수 있다.
상기 단계 (b)에서는 판별된 돼지의 혈액형을 이용하여 이종 접합성(heterozygote) 혈액형을 가지는 돼지와 동종 접합성(homozygote) 혈액형을 가지는 돼지를 교배하여 동종 접합성 혈액형을 가지는 돼지 또는 이종 접합성 혈액형을 가지는 돼지 배아(embryo)가 형성되도록 구성하여 돼지의 산자수(little size)를 증가시키도록 구성할 수 있다.
상기 돼지는 야생 맷돼지와 아메리칸 기니 호그를 제외하고는 상업적으로 사용되는 모든 돼지의 산자수 증가를 위해 활용할 수 있으며, 상기 돼지는 랜드래이스(Landrace), 요크셔(Yorkshire), 듀록(Duroc), 버크셔(Berkshire), 한국 토종 돼지(Korean native pig, KNP), 란위(Lanyu), 메이산(Meishan), 오사보(Ossabaw), SNU 미니어처(SNU miniature) 또는 NIH 미니어처(NIH miniature)의 품종에서 유래한 돼지일 수 있다.
상기 이종 접합성 혈액형은 AO 타입 혈액형이고, 상기 동종 접합성 혈액형은 OO 타입 혈액형인 것을 특징으로 한다.
상기와 같이 돼지의 혈액형을 분석한 후, 특정 타입의 혈액형을 가지는 돼지를 교배하여 AA 타입의 동종 접합성 배아의 형성을 억제함으로써, 임신 30일 경과한 이후 시점에서부터 발생하는 열성 치사 효과로 인한 태아의 사멸을 방지하여 돼지의 산자수를 획기적으로 증가시킬 수 있다.
또한, 돼지의 혈액형 분석을 통한 열성 치사 효과를 토대로 인간의 ABO 혈액형 유전자의 생물학적 목적의 보다 깊이있는 이해를 제공할 수 있다.
이하, 바람직한 실시예 및 실험예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하도록 한다. 제시된 실시예 및 시험예는 본 발명의 구체적인 예시일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 목적으로 제공되는 것이 아니다.
<실시예>
(1) 동물 및 DNA 준비
622 두[한국 토종 돼지(KNP) 71 두, NIH 미니어처 돼지(NIH) 46 두, SNU 미니어처 돼지(SNU) 44 두, 듀록(Duroc) 31 두, 요크셔(Yorkshire) 33 두, 랜드래이스(Landrace) 41 두, 버크셔(Berkshire) 34두, 야생 멧돼지(Wild boar) 4두 및 요크셔와 랜드레이스의 교배종 318 두]의 돼지로부터 말초혈액 또는 귀 조직(ear tissue)을 수득하였다.
또한, 일리노이 대학교의 공동 연구기관으로부터 란위(Lanyu) 5 두, 오사보(Ossabaw) 5 두, 아메리칸 기니 호그(AGH) 2 두 및 메이산(Meishan) 돼지 4 두를 분양받았다. 적절한 교배(timed mating)를 위해 EAA 유전자의 유전형질 분석을 수행하였고, 선택된 AO 이형접합체(heterozygote)는 자연교배를 통해 육종하였다.
임신의 성공은 초음파스캐너를 이용하여 체크하였다. 임신한 돼지는 임신 30일 경과한 날에 마취시켜 제왕절개하여 태아를 수집하였다. 모든 실험은 건국대학교의 동물 실험 관련 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받아 수행하였다(승인 번호 : KU13101).
1 mL의 말초혈액 또는 0.5 g의 조직 전체를 용해 완충용액(lysis buffer)에서 55 ℃조건으로 6시간 동안 배양하고, 표준화된 절차에 따라 DNA를 분리하였다. 용해 완충용액은 0.5% SDS 및 20 mg/mL 농도의 proteinase K 10 μL을 포함하는 10 mM의 Tris-HCl(pH 8.0), 0.1 M의 EDTA(Promega, WI, USA)를 사용하였다.
(2)
EAA
및
ESR1
유전형질 분석(유전형질분석)
50 내지 100 ng DNA, 0.5 μM의 특이적 프라이머, 200 μM의 dNTPs, PCR 완충용액[10mM Tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2] 및 0.5 U의 Supertherm™ DNA 중합효소(JMR Holdings, Kent, UK)를 포함하는 20-μL 용액을 PCR 증폭 장치(Thermocycler 3000, Biometra, Gㆆttingen, Germany)를 이용하여 유전체 DNA를 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 증폭하였다. 또한, PCR 증폭을 위해 사용된 각각의 표적 특이적 프라이머는 하기의 표 1에 나타내었다.
또한, PCR 증폭된 생성물을 1X TAE 완충용액을 포함하는 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 확인하였다. 상기 겔을 에티디움브로마이드로 염색하고 자외선광하에서 가시화하였다.
배반포(blastocyte)의 AO 혈액형 유전자는 증폭-2차 PCR(Semi nested-PCR) 방법을 사용하여 유전형질을 분석하였다. 10 mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.2 μg/μL proteinase K, 0.9% TWEEN-20, 0.9% Triton X-100, 2 mM DTT, 및 5 mM EDTA 혼합물을 포함하는 5 μL의 용해 완충용액에 배반포기의 배아를 배양하였다. 배양은 65 ℃에서 10분 동안, 95 ℃에서 10분 동안 각각 배양하였다.
EAA 엑손 8의 1차 증폭을 위해, 배반포 용해액 1 μL를 주형 DNA로 사용하였으며, Fa 및 Ra와 Fo 및 Ro인 A 및 O 대립유전자 특이적 프라이머를 사용한 것을 제외하고는 유전체 PCR과 동일한 조건에서 PCR을 수행하였다(표 1 참조).
또한, 1차 증폭된 PCR 생성물 2 μL모두를 사용하여 2차 PCR을 수행하였으며, A 대립 유전자의 SFa 및 Ra와 O 대립 유전자인 SFo 및 Ro의 2차 프라이머를 사용하였다(표 1 참조).
PCR 조건은, 94 ℃에서 1분 동안 1차 및 2차 PCR을 각각 28 내지 35 사이클의 3단계 공정에 따라 95 ℃에서 3분 동안 1차 변형시키고, 71 ℃에서 1분 동안 어닐링하고, 각각의 프라이머로 72 ℃에서 1분 동안 신장 시킨 후, 72 ℃에서 10분 동안 최종배양하는 조건으로 PCR 증폭을 수행하였다.
EAA 로커스가 알려진 유전자형의 정보가 알려진 85 두의 돼지로부터 추출한 유전체 DNA를 사용하여 ESR1 유전형질 분석을 수행하였다. ESR1 유전형질 분석은 중합효소연쇄반응-제한효소절편길이다형성(PCR-RFLP) 방법을 사용하였다.
상기한 증폭 조건하에서 ESRF 및 ESRR 프라이머(표 1 참조)를 사용하여 120 bp의 PCR 증폭절(amplicon)을 수득하였다. 8 μL의 PCR 산물을 PvuII 제한효소 10U에 용해시키고, 37 ℃에서 3시간 동안 용해시킨 후, 4% 메타포어 겔(metapore gel, Lonza, Basel, Switzerland)에서 전기영동하였으며, 겔을 에티디움 브로마이드로 염색하여 가시화하였다.
(3) 체외수정(IVF)
도축장에서 난소(ovary) 및 정소(testis)를 수득하였으며, 정자는 도살장에서 돼지의 부정소미(porcine cauda epididymis)로부터 채취하여 TL-HEPES 배지에 보관하였다가 알부민, 젖산 및 피루빈산을 포함하는 Tyrode's 배지에 10분 동안 보관하여 swim-up 처리하였다(Sp-TALP). swim-up 처리한 정자세포를 수집하고 난모 세포와 수정을 위해 사용하였으며, 정자의 농도를 5 × 105 세포수/mL로 하여 수정하였다.
0.5 μg/mL의 에스트라디올(estradiol), 2.5 μg/mL의 난포 자극 호르몬(follicle-stimulating hormone, FSH), 5 IU/mL의 황체 형성 호르몬(luteinizing hormone, LH), 20 ng/mL의 황체 자극 호르몬(luteotropic hormone, LTH) 및 20%의 돼지 소낭액(porcine follicular fluid, pFF)이 공급된 성숙배지(Maturation medium M199)를 사용하여 37 ℃, 높은 습도의 5% 이산화탄소 및 95%의 공기 분위기에서 배양된 미성숙 난모 세포를 배양하였다.
배양 성숙된 난모 세포의 체외수정은 다음과 같이 하여 수행하였다. 난구세포(cumulus cell)를 0.1% 히알루로니다아제(hyaluronidase) 혼합용액에 노출시키고, 수정 배지(fertilization medium)로 3회 세척하였다. 수정배지는 1 mM의 벤조산나트륨카페인(caffeine sodium benzoate) 및 0.1%의 BSA를 포함하는 mTBM(modified Tris-buffered medium )를 사용하였다. 수정 배지 50 μL당 10 내지 15개의 난모 세포 그룹이 되도록 배치하였다.
정자 및 난자를 39 ℃, 높은 습도의 5% 이산화탄소 및 95%의 공기 분위기에서 6시간 동안 공동 배양(co-incubation)하였다. 공동 배양이 종료되는 시점에 임신이 추정되는 접합자(presumptive zygote)를 세척하여 표면에 부착된 정자를 제거하고, IVC 배지에서 7일 동안 연속 배양하였다.
(4)
EAA
엑손 8의 다형성 분석
EAA 엑손 8을 증폭시키기 위해서, F8 및 R8 프라이머를 사용하였다(표 7 참조).
PCR 조건은, 94 ℃에서 1분 동안 35 사이클의 3단계 공정에 따라 95 ℃에서 3분 동안 1차 변형시키고, 66 ℃에서 1분 동안 어닐링하고, 각각의 프라이머로 72 ℃에서 1분 동안 신장 시킨 후, 72 ℃에서 10분 동안 최종배양하는 조건으로 PCR 증폭을 수행하였다.
증폭절을 pGEM-T Easy vector에 클론화하였다. 결합 생성물(ligation product)을 DH10B 세포(Invitrogen, California, USA)로 전기천공 장치(MicroPulserTM, Bio-Rad, California, USA)를 이용하여 전기천공(electroporation)하였다. 클론화된 삽입부를 증폭하기 위해서 프라이머(T7-TAATACGACTCACTATAGGG 및 SP6-ATTTAGGTGACACTATAG)를 이용하여 콜로니 PCR을 수행하였다. 2 μL의 PCR 생성물을 4 U의 엑소누클레아제 I(exonuclease I, Fermentas, Baden-Wㆌrttemberg, Germany)과 0.8 U의 알칼리성 인산가수분해효소(shrimp alkaline phosphatase, USB corporation, Ohio, USA)를 포함하는 1.5X 반응 완충용액에서 37 ℃에서 3분 동안 배양하여 반응에서 활용되지 않은 dNTP를 탈인산화 시키고 프라이머를 제거하였다. 80 ℃에서 15분 동안 배양하여 반응을 종료시켰다. 염기서열 분석 반응(Sequencing reaction)은 ABI PRISM BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems, California, USA)를 사용하여 수행하였다. 자동화된 DNA 분석 장치(DNA analyzer, 3730XL, Applied Biosystems, California, USA)를 이용하여 생성물을 분석하였다. 염기서열 분석 결과는 매뉴얼대로 점검하였으며, 성공적인 결과는 CLUSTALW를 사용하여 배열하였다. 최소 3 세포주에서 각각의 샘플을 분석하였다. 독특한 단일염기 다형성은 추가적인 독립 실험을 통해 확인되었다. 확인된 염기서열은 Genbank에 등록하였다(수탁번호 : KR136272, KR136273, KR136274 및 KR136275).
(5) 태아의 변화 비교 분석
태아가 있는 자궁은 임신한 모돈으로부터 채취하였으며, 교배 30일 경과한 시점에서 모돈을 2%의 할로탄(halothane)으로 마취하였다. 5 개체군에서 총 71개체의 태아를 수집하였다. 수집된 태아는 인산완충식염수를 이용하여 세척하고, 10 %의 중성완충포르말린용액에 하룻밤 동안 보관하여 고정화하였고, 탈수시켰으며, 변화 비교 분석을 위한 제조업자의 프로토콜에 따라 자동화된 조직 처리기(Automatic Tissue processor, Leica, Nussloch, Germany)를 이용해서 파라핀에 이식시켰다.
이식된 조직을 마이크로톰(microtome)을 이용해 5 내지 7 μm의 두께로 조직 시편을 절단하고, 폴리라이신이 코팅된 유리 슬라이드의 상면에 위치시켰다. 파라핀을 제거하고, 수화시킨 후, 조직 시편을 헤마톡실린(Mayer's hematoxylin) 및 에오신(Eosin)으로 염색하였다.
(6) 12종의 돼지 품종에서
AO
혈액형 유전자의 대립 유전자 분포
12 품종의 순수 육종된 282의 돼지로부터 ABO(또는 EAA) 혈액형 유전자의 오솔로그에 관해 유전자형을 분석하였으며, 12종의 돼지 품종은 하기 표 2에 나타낸 바와 같은 돼지 품종을 사용하였다.
적혈구 항원 A의 로커스(EAA)에 의해 조절되는 돼지 AO 혈액형 시스템과 6번 염색체 상에 분리, 독립된 로커스에 의해 조절되는 돼지의 O 혈액형 시스템(EAO) 사이의 혼란을 피하기 위해서, 용어 'O'는 돼지의 ABO 이종 상동성 유전자의 기능상실 대립 유전자를 표시하기 위해 사용하였다.
상기한 282의 돼지로부터 ABO(또는 EAA) 혈액형 유전자의 오솔로그에 관해 유전자형을 분석하였으며, 분석 결과를 도 1(A)에 나타내었다. 말초 혈액 및 귀 조직으로부터 수득한 DNA를 사용하여 PCR 증폭 결과에 따르면, 1076 bp 및 340 bp의 절편들은 각각 O의 대립유전자 및 A의 대립유전자를 나타낸다. 상부에 유전자형은 B의 대립유전자를 나타낸다. 배반포로부터 추출한 DNA를 사용하여 2차 증폭 PCR을 수행하여 얻어진 PCR 생성물이다.
도 1(A)에 나타난 바와 같이, 12 품종의 돼지로 부터 AA, AO 및 OO형의 평균 유전자형 빈도는 각각 1.41%, 52.12%, 및 46.45%이었다. AA 동형접합체는 멧돼지(75%) 및 AGH(50%)를 제외하는 모든 품종에서 나타나지 않았다.
A 및 O 대립 유전자의 평균 대립유전자 빈도는 각각 0.27 및 0.73으로 나타났으나, AA 유전자형의 결핍을 설명하기에는 다소 불충분하였다. 각기 다른 돼지 품종들 사이에 A 및 O 대립 유전자 빈도는 중요한 차이점이 있다. 비록, 각각의 품종에서 활용 가능한 개체의 수가 다소 제한적이고, 다양했다.
랜드레이스 품종은 A 대립 유전자를 포함하지 않았으며, 랜드레이스 품종에서 O 대립 유전자가 고정화되었음을 암시하였다. 유사하게도, NIH 미니어처 돼지 빈도가 0.97로 나타났고, KNP 및 Lanyu 품중에서는 0.7이상으로 높게 나타났다. 반면에, 야생 멧돼지에서는 O 대립 유전자의 빈도가 0.25로 낮게 나타났다.
A0 이형 접합체의 빈도는 다른 품종들에 비해 Berkshire가 88.24%로 높게 나타났으며, SNU 미니어처 돼지는 88.64%, Duroc은 80.65%로 나타났다. 이와 같은 품종에서 OO 동형접합체의 빈도는 11.36 부터 19.35%까지의 범위로 나타났으며, AA 유전자형이 상실되었음을 암시하였다.
또한, POP 유전자 소프트웨어 패키지를 사용하여 대립 유전자 빈도, 관찰된 이종접합체 및 예측된 이종접합체를 분석하였으며 분석 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
표 3에 나타낸 바와 같이, 하디바인베르크 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)의 분석은 단지 몇 가지 개체를 포함하는 품종을 제외하고는 관찰되는 이형 접합체의 수가 상당히 초과하는 것으로 확인되었다(단, Het-O1는 관찰된 이종접합체, Het-E2는 예측 이종접합체, χ2은 카이 제곱 분석을 사용하여 측정된 하이바인베르크 평형으로부터의 P값을 나타내는 것임).
(7) 상업적 돼지 개체의
A0
×
A0
교배에서
AA
유전자형 결핍의 확인
EAA 유전자의 전이에서 멘델의 유전법칙으로부터의 편차(deviation)를 확인하기 위해서, KNP의 AO 이형접합체의 암수 돼지를 교배하였으며, 자손의 유전자형 분포를 평가하였다.
KNP의 산자수가 작아, 6 산자수로부터 38 자손이 생산되었고, EAA 유전자의 유전자형을 분석하였으며, 분석결과를 하기의 표 4에 나타내었다.
표 4에 나타난 바와 같이, 기대했던 대로, AA 유전자형을 가지는 돼지는 확인되지 않았다. 또한, Yorkshire 및 Landrace를 교배하여 육종된 318 두의 추가적인 자손(F1)의 EAA 유전형질 분석 결과, 순수 품종으로부터 얻어진 유전자형과 동일하며, 이와 같은 품종들의 상호 교배하였을 때에도, AA 유전자형이 이러한 품종에서 결함이 있다는 사실을 나타내었다.
(8)
EAA
유전자의
AA
동형접합체의 결실은 상업적 돼지 품종에서 제한되며, 야생 멧돼지는 영향을 받지 않았다.
야생 멧돼지를 포함하는 12종의 상업적 돼지 품종에서 유도된 638두의 동물들로부터 EAA 유전형질 분석의 결합된 분석은 AA 동형 접합체의 빈도가 야생 멧돼지 및 AGH에서만 높은 것으로 나타났다. AGH는 훌륭한 취식능력(foraging ability)을 가지는 것으로 알려져 있고, EAA 유전자의 치사효과를 조절하sms ditod 멧돼지와 동일한 특성을 공유하는 것으로 판단되었다. 상업적 돼지 품종에서는 AA 유전자형을 가지는 돼지가 나타나지 않았고, 임신 기간중에 배아 또는 태아의 상태에서 AA 유전자형의 치사효과 때문인 것으로 판단되었다.
(9) 배반포에서
AA
유전자형의 배아로의 성공적인 발달
AA 유전자형을 가지는 배아의 계발적 용량(developmental capacity)을 평가하기 위해서, AO 이형 접합체로부터 수득한 난모세포 및 정자로 체외수정을 수행하였다. 51개의 난소로부터 전체 418개의 난모세포를 수득하였으며 체외성숙(in vitro maturation)한 후, 하기의 표 5에 나타낸 바와 같이 체외수정을 실시하였다.
285개의 난모세포에서 2-세포 분리(two-cell cleavage)를 나타냈으며, 40개가 배반포기(blastocyte stage)로 성공적으로 발달되었다. 2-세포 단계에서 2-세포 분리의 비율은 68.18%이고, 배반포의 발달은 14.04%의 비율로 나타났고, 이는 종래에 알려진 정상의 돼지의 배아발달과 유사하였다. 배반포 사이에서 AA 배아의 존재유무를 확인하기 위해서 EAA 유전자의 유전형질을 분석하였으며, 분석결과를 도 1(B)에 나타내었다. 또한, 래인 1(lane) 및 3은 각각 1차 PCR 생성물의 A 대립유전자 및 O 대립유전자이고, 래인 2 및 4는 각각 2차 PCR 생성물의 A 대립유전자 및 O 대립유전자이다. 래인 5는 A 대립 유전자의 양성 조절(positive regulation)을 나타내는 것이며, L은 사이즈 마커를 나타낸다.
도 1(B)에 나타난 바와 같이, 배아 중 90% 이상의 배아(n = 28)가 AO 이형접합체인 것으로 확인되었다. 더욱이, 표 5에 나타낸 바와 같이, 1개의 배아가 AA 동형 접합체인 것으로 확인되었고, 2개의 배아가 OO 동형 접합체인 것으로 확인되었다. 이는 AA 유전자형을 가지는 수정란이 정상적으로 배반포기에서 발달된다는 사실을 시사하는 것이다.
(10) 돼지에서 혈액형
A
대립 유전자의 열성 치사 효과는 태아 발달 과정의 중반에서 후반의 기간(mid-to-late period) 동안에 발생한다.
AA 유전자형의 결함이 발생하는 원인 또는 메커니즘을 분석하기 위해서, AO 이형 접합체를 시기에 맞게 적절히 교배하고, 임신 30일 경과한 시점의 태아의 가능한 발달 비정상(developmental abnormality)을 분석하였다.
71 두의 태아 전체는 5두의 임신한 모돈으로부터 얻었으며, 혈액형 유전자의 대립유전자를 평가하기 위해서 유전자형을 분석하였고, 분석 결과를 하기의 표 6에 나타내었다.
표 6에 나타난 바와 같이, 상업적 돼지 품종에서는 관찰되지 않는 AA 동형접합체를 가지는 태아의 빈도는 21.1% (n = 15)인 것으로 확인되었다. 유전자형의 빈도가 AO 및 OO에서 각각 73.2% 및 5.6%인 것으로 확인되었다. 자궁에서 수집과정 중 발생하는 태아의 사멸과 사멸된 태아의 EAA 유전자의 특이적 증폭은 불가능하여 배제하였다. AA(*로 표시), AO 및 OO 유전자형을 가지는 태아들 사이에 용혈 작용(hemolysis) 등과 같이 적혈구 세포 관련 비정상을 포함하여 눈에 띄는 형태학적 차이점은 확인되지 않았다(도 2 참조).
또한, 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin) 염색 방법을 사용하여 임신 30일 경과한 태아의 유전자형을 변화비교 분석(histological analysis)을 수행하였다. AA 유전자형 및 다른 유전자형들 사이에 인식가능한 차이점은 확인되지 않았으며, 임신 4주 경과한 시점 이후에 AA 유전자형의 치사효과가 유도되는 것을 암시하였다.
(11) 돼지에서
AO
혈액형 유전자의 엑손 8의 유전적 다형성 분석
종래에 보고된 엑손 8에 위치한 뉴클레오티드 결실(nucleotide deletion)에 관해 분석 하기 위해서, 11 품종의 31두의 돼지의 엑손 8의 뉴클레오티드 변이(nucleotide variation)를 분석하였다. 11종의 돼지는 SNU, KNP, Berkshire, NIH, Duroc, Yorkshire, Meishan, Lanyu, Wild boar, Ossabaw, 및 AGH의 품종을 사용하였다.
인트론 7의 일부분을 엑손 8 전체와 함께 증폭시켰으며, 증폭절(amplicon)을 클론화하였으며, 염기서열 분석을 수행하였다. 확인된 돼지의 EAA 엑손 8의 유전적 다형성을 하기의 표 7에 나타내었다.
표 7에 나타난 바와 같이, 엑손 8의 뉴클레오티드의 34 (A 또는 G), 205 (A 또는 C), 277 (C 또는 T), 및 397 (A 또는 G)의 위치에서 4종의 동일 뉴클레오티드 치환(synonymous nucleotide substitution)이 확인되었고, 인트론 7에서 10 뉴클레오티드 치환이 확인되었다. 가능한 진화적 압력(evolutionary pressure)이 EAA 유전자에서 엑손 8의 아미노산 염기 서열의 변화를 방지한다는 사실을 암시하였다.
(12)
EAA
및
ESR1
사이에 연관 비평형(linkage disequilibrium)의 부재
돼지에서 산자수 측정을 위한 마커로 ESR1의 다형성을 사용하였다. 치사 대립유전자의 존재는 산자수에 부정적인 영향을 미쳤다. EAA 및 ESR1의 Sus scrofa 염색체 1에서 유전자 지도화 되었기 때문에, 산자수에서 ESR1 유전자의 효과가 영향을 미칠 수 있어 두 위치 사이에 유전적 결합의 존재 유무를 확인하였다.
9종의 돼지 품종에서 전체 85 두의 돼지의 EAA 유전자형을 PCR-RFLP 분석을 수행하였다. ESR1의 유전적 정보는 표 7 및 도 3에 나타내었다.
표 7에 나타난 바와 같이, A 대립유전자는 모든 품종에서 확인된 반면에 산자수에 긍정적인 영향을 주는 것으로 알려진 B 대립 유전자는 종래에 연구에서 보고된 것과 일치하는 대로 SNU, Yorkshire 및 Meishan를 포함하는 단지 몇몇 품종에서 확인되었다. 대부분의 유럽 돼지 품종에서는 B 대립 유전자가 확인되지 않았다.
비록, 분석에 사용된 샘플의 수가 제한적이어서 정확성에 영향을 미칠 수 있으나, 이와 같은 결과는 각 품종에서 ESR1의 대립유전자 분포의 패턴을 반영할 수 있다.
AO 혈액형 유전자 및 ESR1 유전자 사이에 유전적 연관 정도는 SNP Analyzer 2.0 소프트웨어를 이용하여 타이핑한 결과를 평가하였으며, 그 결과를 하기의 표 8에 나타내었다.
표 8에 나타난 바와 같이, 결합 불균형 값(linkage disequilibrium value)을 나타내는 'D'와 로커스 쌍 사이의 상관계수(correlation coefficient)를 나타내는 r2는 각각 0.17 및 0.015로 나타났다. 두 위치 사이에 결합 불균형 값의 부재를 나타낸다. 이와 같은 결과는, 두 유전자가 각기 다른 Sus scrofa 10.2로부터 300 Mb 이내에 두 유전자가 위치한다는 사실을 시사하는 것이다. 이와 같은 결과는 돼지의 산자수에 AO 혈액형의 영향이 혈액형 A 대립 유전자의 열성 치사효과에 기여한다는 사실을 시사하였다. 그리고, ESR1의 영향에는 독립적이라는 것을 시사하였다.
(13) 결론
돼지에서 발견된 인간의 RBC 혈액형 유전자 오솔로그에서 유전적 다양성은 돼지에서 AO 혈액형에서 변이와 연관되어 있다. 본 발명에서는, 다양한 돼지 품종을 교배하여 EAA 유전자의 대립 유전자 분포를 분석하고, 혈액형 A 대립 유전자의 분리(segregation)하여 모든 상업적 돼지 품종이 열성 치사 유전자의 패턴에 따른다는 사실을 확인하였다.
이와 같은 발견은 동물에서 ABO 혈액형 이종 상동성 유전자와 연관된 치사 표현형과의 관계를 최초로 밝혔다. 게다가, ABO 혈액형 유전자에 의해 코드되는 갈락토스전이효소(galactosyltransferase)의 가능한 생체내 기능에 관한 연구에 사용할 수 있음을 암시하였다.
본 발명에 따르면, 돼지에서 산자수와 함께 AO 혈액형 유전자의 관련성을 더욱 심도 깊게 이해할 수 있으며, AA 유전자형을 가지는 돼지 개체가 상업적 돼지 품종에서 자궁내에서 사멸되기 때문에, 종돈산업에 기여할 수 있다.
개체들 사이에 혈액형 빈도의 차이는 자연 선택 및 발견된 효과를 통한 어떠한 질병들에 대한 민감성에 기여할 수 있다. 인간에서 특정 질병이 혈액형들과 연관된 다양한 연구가 보고된 바 있다. 그러나, 단지 RHD 음성 혈액형을 가지는 엄마가 RHD 양성 혈액형을 가지는 태아를 임신하였을 때 나타나는 태아 및 신생아(HDFN)의 용혈성 질병이 혈액형에 관련한 치사율에 관해 알려져 있다.
질병 감수성에서 ABO 혈액형 항원의 영향은 말라리아, 소화성 궤양(peptic ulceration), 급성 위장염(acute gastroenteritis), 동맥 및 정맥 혈전색전증(ThromboEmbolism, VTE)에서, 세포막에 병원균의 결합 친화력의 차이에 의한 것으로 설명하였다. 그러므로, 돼지에서 치사 표현형은 인간의 ABO 이종 상동성 유전자에서 유전적 변이에 의해 야기된다. ABO 혈액형 유전자의 표현형적 변이에서 현재 이해가 적합하지 않다.
마우스 및 말에서 agouti coat color 유전자는 치사 대립 유전자의 고전적인 사례(classic example)이다. 인간에서 낭성 섬유증(cystic fibrosis), 겸상적혈구 빈혈증(sickle-cell anemia), 연골무형성증(achondroplasia) 및 남동부 아시아인의 난형적혈구증가증(Southeast Asian ovalocytosis)에 원인이되는 대립 유전자가 열성 치사인 것으로 알려져 있다.
AO 이형 접합체 교배하여 번식시킨 600 두 이상의 상업적 돼지로부터 임신 30일 경과한 시점의 태아에서 AA 동형접합체가 나타나며, 완전히 소멸한다. 그러므로, 본 발명에서는 EAA의 혈액형 A 대립 유전자가 돼지에서 열성 치사 대립 유전자로서 역할을 하며, 태아 발달의 중기에서 후기의 기간 동안이 위험 시간(critical time)이다.
치사 대립 유전자는 단지 상업적 돼지 품종에만 영향을 미치며, 멧돼지에서는 단지 한 두에서만 나타나 두그룹 사이에 환경 또는 유전적 차이가 있는 것을 확인하였다. 유전적 측면에서 차이점은 돼지의 국산화 유럽 및 아시아 돼지 품종에서 관찰된 치사율을 고려하여 돼지를 국산화 후에 즉각적으로 발생할 것이다. AA 유전자형은 A형 혈액형의 생성을 위한 H 기질을 인식하는 갈락토스 특이적 당전이효소인 GalNAc 알파 1-3 또는 Fuc 알파 1-2를 높은 농도로 생성하게 하는 것으로 예측된다. 그것은 또한, 태아 발달에서 비친화적인 영향으로 형태 변형이 발생해 다른 당단백질의 변형을 유도할 수 있다. 일례로, 용해성 E-셀렉틴(E-selectin)의 농도는 배아 생존에 중요한 요소이며, 다른 혈액형들과 비교할 때, O형 혈액형을 가지는 개체군에 더욱 높은 농도로 나타난다.
만약, 관찰된 치사율이 환경의 차이에 의해 유도된다면, 음식물이 흥미로운 지원자중 하나일 수 있다. AGH 동물이 그들의 훌륭한 취식 능력으로 인해 널리 알려져 있으며, 야생 멧돼지와 유사한 음식물을 섭취하여 AA 유전자형의 치사효과를 방지할 수 있을 지도 모른다. 만약 이와 같은 경우라면, 재생효율증가를 통해 치사효과를 방지할 수 있는 환경적 영양학적 인자를 검증하기 위해 중요하게 사용될 수 있다.
종돈산업에서 산자수는 가장 중요한 경제적 특성이다. 대립 유전자 A의 동종 접합성 치사효과를 고려할 때, 유전자는 돼지의 산자수에 연관되어 있음을 유추할 수 있다. 동물 사육에 활용하기 위해, OO 동형 접합체의 선택은 AO 이형 접합체의 교배와 비교할 때, 신생아의 수를 증가시킬 수 있다. 반면에, 자궁에서 AA 유전자형을 가지지 않는 태아의 수가 새로 태어나는 돼지의 적합한 숫자를 생산하기 위한 충분하다. 두 유전자로부터 결합된 이점의 평가를 통해 EAA 및 ESR1 유전자 사이에 결합 불균형은 중요하지 않음을 확인하였다.
결론적으로, 상업적 돼지 품종에서 AO 혈액형 유전자의 AA 유전자형의 결핍은 놀라운 발견이며, ABO 혈액형 유전자가 특정 조건하에서 돼지의 치사에 관여한다. 비록 ABO 혈액형이 대부분의 포유류에서 발견된다 하더라도, ABO 혈액형의 생물학적 중요성은 명확히 알려진 바 없다. 하지만, 본 발명을 이용하여 ABO 혈액형에 관련한 흥미로운 모델을 제공할 수 있을 것으로 예상된다. 본 발명에 따르면, 치사 인자의 제거를 통해 종돈 산업에 큰 이익을 제공할 수 있다.
Claims (6)
- (a) 돼지의 혈액형을 판별하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 판별된 혈액형을 이용하여 이종 접합성 혈액형을 가지는 돼지와 동종 접합성 혈액형을 가지는 돼지를 교배하는 단계;를 포함하는 돼지의 산자수 조절 방법. - 제1항에 있어서,
상기 단계 (a)는,
(i) 돼지의 조직으로부터 유전체 DNA를 추출하는 단계; 및
(ii) 상기 단계 (i)에서 추출한 유전체 DNA 중에서 엑손 8을 주형으로 사용하고, 프라이머(primer)를 사용하여 상기 엑손 8을 증폭하는 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행해 상기 엑손 8의 증폭 생성 유무를 확인하는 단계;를 포함하는 방법을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 돼지의 산자수 조절 방법. - 제2항에 있어서,
상기 엑손 8의 서열은 서열번호 1인 것을 특징으로 하는 돼지의 산자수 조절 방법. - 제2항에 있어서,
상기 프라이머는 Fa(5'-CGCCAGTCCTTCACCTACGAAC-3') 및 Ra(5'-CGGTTCCGAATCTCTGCGTG-3')쌍이고; Fo(5'-AATGTCCTTATGCTGGCCTGG-3') 및 Ro(5'-AACAACACACTCCTGAACAACAGA-3')쌍이며; SFa(5'-CTGTCTCAGGCTTACATTCC-3') 및 Ra(5'-CGGTTCCGAATCTCTGCGTG-3')쌍이고; SFo(5'-GTAGCTGTAGCCACTGGCCT-3') 및 Ro(5'-AACAACACACTCCTGAACAACAGA-3')쌍이며; F8(5'-ATACGTGGTCTTCCTGAAGC-3') 및 R8(5'-TCATCGGTTCCGAATCTCTG-3')쌍인 것을 특징으로 하는 돼지의 산자수 조절 방법. - 제1항에 있어서,
상기 돼지는 랜드래이스(Landrace), 요크셔(Yorkshire), 듀록(Duroc), 버크셔(Berkshire), 한국 토종 돼지(Korean native pig, KNP), 란위(Lanyu), 메이산(Meishan), 오사보(Ossabaw), SNU 미니어처(SNU miniature pig) 및 NIH 미니어처(NIH miniature pig)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 품종에서 유래한 돼지인 것을 특징으로 하는 돼지의 산자수 조절 방법. - 제1항에 있어서,
상기 이종 접합성 혈액형은 AO 타입 혈액형이고, 상기 동종 접합성 혈액형은 OO 타입 혈액형인 것을 특징으로 하는 돼지의 산자수 조절 방법.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020150143957A KR20170044364A (ko) | 2015-10-15 | 2015-10-15 | 돼지의 eaa 유전자형 분석을 통한 산자수 조절 방법 |
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